Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

In Vitro Uppfödning av solitära bin: ett verktyg för att bedöma Larval riskfaktorer

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57876
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1,5
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias, 5USDA-ARS, Vegetable Crop Research Unit

Summary

Fungicid sprayer på blommande växter kan utsätta solitära bin för höga halter av pollen-burna fungicid rester. Med hjälp av laboratoriebaserade experiment med in vitro--uppfödda bee larver, denna studie undersöker de interaktiva effekterna av att konsumera fungicid-behandlade pollen från växter som värd och icke-värd.

Abstract

Solitära bin ger avgörande pollinering tjänster för vilda och hanterade grödor, har artrika gruppen till stor del förbisetts i bekämpningsmedel förordning studier. Risken för exponering för bekämpningsmedelsrester till fungicid sannolikt särskilt hög om sprayen inträffar på eller nära värdväxter medan Bina samlar pollen för att etablera sina bon. För arter av Osmia som förbrukar pollen från en utvald grupp av växter (oligolecty), kan oförmåga att använda pollen från icke-värdväxter öka deras riskfaktor för fungicid-relaterad toxicitet. Detta manuskript beskriver protokoll som används för att framgångsrikt bakre oligolectic mason bin, Osmia ribifloris sensu lato, från ägg till prepupal skede inom cell kultur plattor under standardiserade laboratorieförhållanden. Den i vitro-uppfödda bin används därefter för att undersöka effekterna av fungicid exponering och pollen källa på bee fitness. Baserat på en 2 × 2 fullt korsade faktoriell design, undersöker experimentet fungicid exponering och pollen källa huvudsakliga och interaktiva effekter på larval fitness, kvantifieras av prepupal biomassa, larval utvecklande tid och efterlevande. En stor fördel med denna teknik är att använda i vitro-uppfödda bina minskar naturlig bakgrund variabilitet och tillåter samtidig manipulering av flera experimentella parametrar. Protokollet beskrivs presenterar ett mångsidigt verktyg för hypoteser testning som rör sviten av faktorer som påverkar binas hälsa. För bevarandeinsatser uppfyllas med betydande, varaktig framgång, kommer att sådana insikter i det komplexa samspelet mellan fysiologiska och miljömässiga faktorer som driver bee nedgångar visa sig vara kritiska.

Introduction

Den globala förlusten i bisamhällena med tanke på sin roll som den dominerande gruppen av insekter pollinatörer1, och utgör ett hot mot livsmedelssäkerheten och ekosystemens stabilitet2,3,4,5,6 ,7. De minskande trenderna i både hanterade och vilda bisamhällena har tillskrivits flera delade riskfaktorer inklusive livsmiljö fragmentering, framväxande parasiter och patogener, förlust av genetisk mångfald och införandet av invasiva arter3 ,4,7,8,9,10,11,12. I synnerhet har den dramatiska ökningen av användningen av bekämpningsmedel, (t.ex. neonicotinoids) varit direkt knuten till skadliga effekter bland bina13,14,15. Flera studier har visat att synergism mellan neonicotinoids och ergosterol biosyntes-hämmande (EBI) svampmedel kan leda till hög dödlighet över flera bee arter16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. ändå, fungicider, länge anses vara 'bee-safe', fortsätta att sprayas på-bloom grödor utan mycket kontroll23. Födosökande bina har dokumenterats för att rutinmässigt föra tillbaka pollen laster förorenade med fungicid rester24,25,26. Konsumtionen av sådana fungicid-ladenpollen kan orsaka hög dödlighet bland larval bin27,28,29,30, och en svit av subletala effekter bland vuxna bin16 , 31 , 32 , 33 , 34. en nyligen genomförd studie tyder på att fungicider kan orsaka bee förluster genom att ändra mikrobiell gemenskapen inom hive-lagrade pollen, därmed störa de kritiska symbios mellan bin och pollen-burna mikrober35.

Även om solitära bin är mycket viktiga för pollineringen av flera vilda och jordbrukets växter36,37,har38, denna mångskiftande grupp av pollinatörer fått mycket mindre uppmärksamhet i bekämpningsmedel uppföljningsstudier. Boet av en vuxen ensam kvinna innehåller 5-10 förseglade barnaskara chambers, var fylld med en ändlig massa maternellt-samlat pollen och nektar, och ett enda ägg39. Efter kläckningen lita larver på tilldelade pollen tillhandahållandet, och den associerade pollen-burna bakterieflora att erhålla tillräcklig näring40,41. Eftersom de saknar fördelarna med en social livsstil, kan solitära bin vara mer utsatta för bekämpningsmedel exponering42. Till exempel, medan brister i sociala bin efter en spray kan kompenseras till några förlänga med arbetstagare och döden av en enda vuxen ensam hona nya framväxande barnaskara, och slutar alla reproduktiv aktivitet43. Sådana skillnader i känslighet belysa behovet av att införliva olika bee taxa i ekotoxikologiska studier för att säkerställa ett adekvat skydd för hanterade och vilda bin som är likadana. Men bortsett från en handfull studier, undersökningar om effekterna av fungicid exponering har främst fokuserat på sociala bin18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.

Solitära bin tillhör släktet Osmia (figur 1) har använts över hela världen som effektiva pollinatörer av flera viktiga frukt och mutter grödor39,50,51,53, 53. som med andra hanterade pollinerare grupper24,54,55,56,57,58, vuxen Osmia bin är rutinmässigt utsatt för fungicider som sprutas på i-bloom grödor44. Vuxna honor födosöka på nyligen besprutade grödor kan samla in och lagerför deras avels chambers med fungicid-lastad pollen, som senare utgör den enda kosten för utveckla larverna. Konsumera förorenade pollen bestämmelserna kan därefter utsätta larverna till fungicid rester42. Risken för exponering kan vara högre bland oligolectic arter som födosöker endast på några närbesläktade värd växter59,60,61. Vissa megachilid bin, tycks till exempel prioriterat fodergrödor för låg kvalitet korgblommiga växter pollen, som ett sätt att minska parasitism62. Dock har i vilken utsträckning som fungicider påverka larval fitness bland oligolectic solitära bin inte empiriskt kvantifierats. Målet med denna studie är att utveckla ett protokoll för att testa huvudsakligen och interaktiva effekter av fungicid exponering och pollen källa på fitness av in vitro- uppfödda solitära bin. För att undersöka, ägg av O. ribifloris sensu lato (s.l.) kan erhållas kommersiellt (tabell av material). Denna population är idealisk på grund av dess betydelse som en infödd pollinerare och dess stark förkärlek för den nektar-rika Mahonia aquifolium (Oregon druva) finns inom den regionen53,63,64 (Figur 2).

Figure 1
Figur 1. Ett högupplöst foto av en vuxen Osmia ribifloris. Foto kredit Dr Jim Cane, forskning entomolog, USDA-ARS vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Phragmite häckande vass i Osmia ribifloris (s.l.) med en häckande hona i förgrunden. Kammaren partitioner och terminal pluggar för vassen är tillverkade av masticeras blad. Foto kredit Mr Kimball Clark, NativeBees.com vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Det första syftet med denna studie är att utvärdera effekten av konsumerar fungicid-behandlade pollen på larval fitness (mätt utvecklingstid och prepupal biomassa). Medan exponering för den allmänt tillämpade fungicid propikonazol har kopplats till ökad dödlighet hos vuxna bin över flera arter 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, dess inverkan på larval bin är mindre känd. Det andra syftet med denna studie är att utvärdera effekterna av konsumera icke-host pollen på larval fitness. Tidigare studier visar att larver av oligolectic bina misslyckas med att utveckla när de tvingas att konsumera icke-host pollen68. Sådana resultat kan tillskrivas variationer i bee fysiologi69, pollen biokemi70och den nyttiga mikrobiomet är associerad med naturliga pollen bestämmelser71. Det tredje målet med denna studie är att utvärdera fungicid behandling och kost pollen interaktiva effekter på larval fitness.

Många biologiska egenskaper inklusive moderns storlek, är etablering takt, födosökande strategi och pollen kvantiteten72,73,74,75 kända att påverka larval fitness hos solitära bin. Dessa faktorer kan införa betydande variabilitet mellan vassen, som utgör en utmaning utveckla försvarbart experimentell design vid bedömningen av larval hälsa. Dessutom, med tanke på att larver utveckling sker inuti slutna häckande vassen, effekterna av sådana variationer på avkomman är svårt att visualisera och kvantifierade utan att använda icke-dödliga metoder (figur 3). För att övervinna denna utmaning, testas alla hypoteser inom denna studie via larver som föds upp utanför deras häckande vassen. Experimentell design representerar en fullt korsade 2 × 2 faktoriell uppställningar, med varje faktor bestående av 2 nivåer; Faktor 1: Fungicid exponering (fungicid; Ingen fungicid); Faktor 2: Pollen källa (värd pollen, icke-host pollen). Bina höjs från ägg till prepupal scenen inom sterila rundbottnade cell kultur plattor under kontrollerade laboratorieförhållanden. Vart är individuellt välfyllda med en standardiserad mängd pollen bestämmelse och ett ägg. Efter kläckningen, larven livnär sig på tilldelade pollen inom brunnen, slutför larval development och initierar förpuppningen. Tidigare studier har visat att oförklarliga dödligheten är lägre bland bina upp inom denna artificiell uppfödning miljö än som uppstått i den vilda49,76. Användning av in vitro-uppfödda bina har flera fördelar över fältet-baserade studier: 1) det minimerar störande effekterna av naturliga variationer och okontrollerad faktorer som vanligtvis förknippas med fält-baserade studier; (2) det tillåter flera nivåer av manipulation för varje faktorer av intresse för provas samtidigt mellan behandlingsgrupperna; (3) antalet replikat kan vara förutbestämd, och experimentella faktorer för varje replikat kan manipuleras individuellt; 4) larval svar variabler kan enkelt visualiseras och inspelade självständigt utan störande intilliggande larver; 5) protokollet kan ändras för att rymma mer komplexa experimentell design som involverar flera faktorer och svar variabler.

Figure 3
Figur 3. Innehållet inom en naturlig häckande reed av Osmia ribifloris (s.l.). Närbild av (A) en dissekerade reed visar enskilda chambers, pollen bestämmelser, och partitioner och (B) nymalen skördas pollen bestämmelser och associerade äggen (märkt med en svart cirkel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbered propikonazol lösningar för fungicid exponering experiment

  1. Förbereda 0,1 x svampborttagningslösning genom upplösning lämpliga volymer av kommersiellt tillgängliga propikonazol 14,3% i sterilt vatten dagen i experimentet. Se till att endast nylagade svampborttagningslösning används för alla behandlingar.
  2. Tillsätt 23 µL 0,1 x svampborttagningslösning per gram pollen bestämmelse att erhålla den högsta koncentrationen av propikonazol som tidigare rapporterats från bee-insamlade pollen24 (0.361 PPM eller µg aktiva ingrediensen g-1 pollen).

2. skörda ägg och värd Pollen bestämmelser från Osmia vass

  1. Med en steriliserad skalpell, dissekera nymalen ansluten häckande vass i Osmia, dela den i två delar längs längden av röret att exponera de enskilda rummen.
    Obs: Varje boet kan innehålla mellan 8 och 14 kammare och ett ägg i en kammare.
  2. Inspektera vassen visuellt för att identifiera avdelningar innehållande manliga ägg baserat på tidigare publicerade riktlinjer77. Använd en steriliserad böjd nål för att ta bort varje pollen bestämmelse tillsammans med associerade ägget från häckande rörbladet och placera i en ren väger båten.
  3. Försiktigt separera ägget från att använda en ren fin pensel och den färska vikten för pollen tillhandahållande och ägg med hjälp av en standard laboratorium balans. Beräkna den genomsnittliga vikten av bestämmelserna om manliga pollen.
  4. De efterföljande stegen med minsta fördröjning att minska risken för skador från exponering för överskott temperatur och uttorkning till ägget.

3. Förbered värd växt Pollen bestämmelser

  1. Inspektera visuellt maternellt insamlade värd-växt pollen grävdes från häckande kamrarna att säkerställa att inga parasiter är närvarande78. För att minska eventuella potentiella maternell bias, kombinera de pollen bestämmelserna till en enda massa i en steril petriskål och blanda väl med en steriliserad nål.
  2. Dela den sammanlagda massan i nya pollen bestämmelser, som garanterar att vikten av varje rekonstituerad bestämmelse är ungefär lika med den genomsnittliga vikten av en naturligt tilldelade manliga bestämmelse (menar ± SE, 0,35 ± 0,01 g, N = 42).
    Obs: Eftersom Osmia sp. allokerar mindre pollen bestämmelser till manlig avkomma, detta resulterar i lägre kroppsvikt av manliga larverna jämfört kvinnor77. För att undvika någon sådan bias som följd av kön-specifika skillnader, Använd endast manliga ägg i experimenten.

4. Förbered icke-värdväxt Pollen bestämmelse

  1. Pulverisera kommersiellt tillgängliga honey bee-insamlade pollen till ett fint pulver som använder en standard laboratorium boll-kvarn.
  2. Baserat på fukthalten i maternellt-samlat värd pollen bestämmelser (~ 20%), återfukta pollen pulver använder lämpliga volymer av 40% steriliserade socker lösningen79 och blanda grundligt för att bilda en deg-konsistens.
  3. Dela i enskilda pollen samlas, varje väger ungefär samma som den genomsnittliga vikten av en naturligt tilldelade manliga bestämmelse.
    Obs: Vattenhalt av maternellt insamlade värden pollen bestämmelser kan standardiseras i förväg genom att jämföra pollen bestämmelser från 30 slumpmässigt utvalda manliga chambers80färska och torra vikt. För att få det torra väger, pollen bestämmelser bör frystorkade i en lyophilizer (1,5 Pa för 72 h).

5. Förbered rundbottnade Cell kultur plattor

  1. Rad enskilda brunnar i sterila 48-väl kultur plattan med Ånghärdad tin koppar (5 × 9 cm). Med steril pincett, försiktigt flair ut den övre kanten av kapseln så att det kan rymma pollen tillhandahållande.
  2. Placera en enda massa värd eller icke-värd pollen tillhandahållande inuti den tin cup med sterila verktyg baserat på behandlingsgruppen.
    Obs: För att undvika korskontaminering, använda separata plattor för behandling och kontrollgrupper.

6. Tillsätt fungicider

  1. Göra en centralt placerad depression inom pollen massan med hjälp av en steril träpinne. Använd en ny pinne för varje pollen bestämmelse.
  2. Lägg till lämpliga mängder svampborttagningslösning (för behandling) eller sterilt vatten (för kontroller) i depressionen. Nypa den öppning av depression med steril pincett för att minimera kontaktyta mellan fungicid / sterilt vatten och ägg.
  3. Se till att den faktoriella uppbyggnaden av experimentell design uppfyller som skildras i den schematiska framställningen (figur 4).

Figure 4
Figur 4. Schematisk framställning av den experimentella setup. Experimentet representerar en fullt-korsade 2 × 2 faktoriell uppställningar. Faktor 1 representerar fungicid exponering och består av 2 nivåer: ingen fungicid (N = 10), och (ii) fungicid (N = 10). Faktor 2 representerar Pollen källa och består av 2 nivåer: a Host pollen (N = 8), och (ii) icke-host pollen (N = 8). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

7. bakre och iaktta larver

  1. Placera ett slumpmässigt valda manliga ägg på ovansidan av pollen tillhandahållande använder en ren fin pensel. När äggen har placerats på alla bestämmelser, sätt tillbaka locket av cell kultur plattan, säkra den med märkning tejp på hörnen.
  2. Placera plattorna på en ren bricka och täck den med en mörk duk att hindra kontakt med direkt ljus. Plats en 6 Tja tallrik innehållande 30 mL sterilt vatten inom facket att förhindra uttorkning. Lämna inkubation brickor ostört inuti en inkubator i rumstemperatur.
  3. Iaktta plattor dagligen under en dissekera Mikroskop utan att ta bort locket på plattorna. Säkerställa att larverna är vid liv genom att kontrollera rörelsen. Om ingen rörelse upptäcks, kassera den tin cup som innehåller döda larverna och återstående pollen tillhandahållande. Tillåt alla överlevande larver att utveckla ostört inom väl plattorna tills de når prepupal scenen.
  4. Ta bort larven från tin cup när den når den prepupal skede41. Använd en borste för att rengöra någon avföring från silkeskokong. Försiktigt skära igenom den silkeskokong med dissekera Mikroskop och extrahera prepupa med gummi pincett.
  5. Hantera prepupa försiktigt för att säkerställa att verktygen inte tränga igenom den mjuka kroppen. Spela in prepupa (prepupal biomassa) och utvecklande tiden från ägg till prepupal scenen (larval utvecklande tid) färsk vikt.
    Obs: Alla döda larven ska kasseras omedelbart för att förhindra oönskad mikrobiell tillväxt på kadaver och överblivna pollen bestämmelse. Detta minskar risken för infektion till återstående friska larver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Larval fitness kvantifierades med hjälp av tre mått a larver utvecklande tid, (ii) prepupal biomassa och (iii) procent efterlevande. En tvåvägs ANOVA utfördes med fungicid exponering (två nivåer: inga fungicid, fungicid) och Pollen källa (två nivåer: värd pollen, icke-host pollen) som oberoende variabler och larver utvecklande tid som den beroende variabeln. Den huvudsakliga effekten fungicid exponering (F1,28 = 1.24, P = 0,28) var icke-signifikant mellan de fungicid-behandlade (medelvärde ± SE) (28.14 ±1.98 d, N = 14), och obehandlat (25.39 ± 1,65 d, N = 18) grupper. Den huvudsakliga effekten för pollen källa anges dock en betydande skillnad mellan utvecklande tid för larverna upp på värd pollen (20.00 ± 0,50 d, N = 16) och icke-host pollen (33.19 ±0.81 d, N = 16) (F1,28 = 179.83, P < 0,001). Bonferroni korrigerade Post-hoc jämförelser anges att larver utvecklande tid inte varierar betydligt mellan fungicid-behandlade och obehandlade grupper upp på värd (P = 0,57) och icke-värd (P = 0,32) pollen. Larval utvecklande tid var dock betydligt kortare för larverna upp på värd pollen jämfört med icke-host pollen för både fungicid-behandlade (P < 0,001) och obehandlade (P < 0,001) pollen. Effekten interaktion (fungicid exponering × Pollen källa) var inte signifikant (F1,28 = 0,09, P = 0,77). Analysen upprepades med prepupal biomassa som den beroende variabeln. Den huvudsakliga effekten fungicid exponering visade en signifikant skillnad (F1,28 = 4.66, P = 0,04) mellan de fungicid-behandlade (0,123 ±0.01 g, N = 14), och obehandlat (0.149 ± 0,01 g, N = 18) grupper. Den huvudsakliga effekten för Pollen källa (F1,28 = 56.30, P < 0,001) anges en betydande skillnad mellan larvaena upp på värd pollen (0.170 ± 0,01 g, N = 16) och icke-host pollen (0,105 ±0.01 g, N = 16) . Bonferroni korrigerade Post-hoc jämförelser anges att prepupal biomassa inte varierar betydligt mellan fungicid-behandlade och obehandlade grupper upp på värd (P = 0,22) och icke-värd (P = 0,08) pollen. Prepupal biomassa var dock betydligt högre bland larverna upp på värd pollen jämfört med icke-host pollen för både fungicid-behandlade (P < 0,001) och obehandlade (P < 0,001) pollen. Effekten interaktion (fungicid exponering × Pollen källa) var inte signifikant (F1,28 = 0,132, P = 0,72). Figur 5 och figur 6 är grafiska representationer av resultat från den ovan nämnda analysen. Oberoende prover t-test visade en signifikant effekt av pollen källa på larval efterlevande (N = 18, t9 = -2,45, P =0,04).

Figure 5
Figur 5. Stapeldiagrammet visar mätvärden för larval fitness baserat på larval utvecklingsmässiga tid och prepupal biomassa. Larval fitness mätvärden är grupperade baserat på (A) och (B) Pollen källa; och (C) och (D) fungicid exponering. (Medelvärde ± 1 SE). P < 0,001 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Interaktion tomt för larval fitness mätvärden. Interaktiva effekter av fungicid exponering och Pollen källa på (A) larval utvecklande tid, och (B) prepupal biomassa. (Medelvärde ± 1 SE). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Pearsons korrelation användes för att utforska förhållandet mellan larval utvecklande tid och prepupal biomassa (figur 7). En signifikant negativ korrelation noterades över alla behandlingsgrupper (r =-0.83, P < 0,001, N = 32), och över fungicid behandlingar (ingen fungicid: r = -0,76, P < 0,001, N = 18; Fungicid: r =-0.92, P < 0,001, N = 14). Det fanns en signifikant negativ korrelation för larverna upp på icke-host pollen (r = -0,64, P < 0,01, N = 16), inget sådant förhållande observerades för larverna upp på värd-pollen (r = -0,01, P = 0,98, N = 16).

Figure 7
Figur 7. Förhållandet mellan larval utvecklande tid och prepupal biomassa. Pearson korrelation mellan utvecklings- och prepupal biomassa över (A) alla behandlingsgrupper (P < 0,001) (B) Pollen källa (värd pollen: P = 0,98, icke-host pollen: P < 0,01); (C) fungicid exponering (ingen fungicid: P < 0,001, fungicid: P < 0,001). För paneler är (B) och (C), trendlinjer färg-matchas med symboler i figur legenden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1
Animerad figur 1. Femte scenen larval instar av O. ribifloris inom en enda väl platta som rundbottnade. Larven noteras att har börjat snurra en silken kokong inför förpuppningen. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Uppfödning bin utanför deras naturliga häckande vassen, under laboratorieförhållanden, tillåter testning av flera hypoteser som rör larval fitness. I den utsträckning som oidentifierade faktorer fortsätter att orsaka bidödligheten, riskerar bedömning studier kan in vitro- experiment hjälp identifiera potentiella hot och informera förvaltningsmetoder för denna art-rik grupp av vilda pollinatörer 12 ,38,49,76,81,82.

I allmänhet är kortare utvecklings gånger och högre prepupal biomassa associerade med högre larval fitness. Över alla behandlingar, var varaktigheten av larval utveckling negativt korrelerade med prepupal biomassa. Det fanns dock betydande skillnader mellan varaktigheten av larval development och prepupal biomassa över de fyra grupperna. Larverna som inte fick någon fungicider och var tillåtet att konsumera värd pollen hade kortast larval utvecklande tid och högsta prepupal biomassa. Däremot de larver som konsumeras fungicid-behandlade icke-host pollen, tog längst tid att fullfölja larval utvecklingen, och hade lägst prepupal biomassa. Trenderna för larval efterlevande var dock mindre tydlig, med dödlighet att noteras endast för de fungicid-behandlade gruppen upp på värd pollen. Dekonstruerar main och interaktion effekterna av fungicid exponering och Pollen källa avslöjat att: (i) den huvudsakliga effekten av att konsumera fungicid-behandlade pollen hade en betydande negativ inverkan på prepupal biomassa, men inte larval utvecklingsmässiga varaktighet. Medan en tidigare studie visat akut oral toxicitet i vuxen Osmia vid högre koncentrationer, tyder dessa resultat på att peroral exponering för propikonazol i betydligt lägre koncentration kan påverka fitness genom att minska prepupal biomassa23 . (ii) den huvudsakliga effekten av att konsumera icke-host pollen har en negativ effekt på larval fitness. Dessa resultat överensstämmer med tidigare publicerade studier som tyder på pollen kvalitet (dvs. förekomst av toxiner, skyddande föreningar, brist på viktiga näringsämnen), och skillnader i bee fysiologi kan begränsa bin från utnyttja icke-host pollen68 . Det är också troligt att avsaknad av välgörande bakterieflora normalt förvärvas från värd-pollen och/eller bee gröda kan förvärra denna effekt. (iii) det fanns ingen signifikant interaktion mellan fungicid exponering och Pollen källa på larval fitness. I både fungicid-behandlade och obehandlade grupper hade larverna konsumerar icke-host pollen betydligt lägre prepupal biomassa och längre larval utvecklande tid jämfört med larver upp på värd pollen. Oavsett pollen källa hade larverna konsumerar fungicid-behandlade bestämmelserna betydligt lägre prepupal biomassa jämfört med larver upp på obehandlade pollen. Bortsett från de betydande huvudsakliga effekterna, interaktiva effekten av båda faktorerna överensstämde till additiva modellen, dvs., de negativa effekterna av fungicid exponering och pollen typ på larval konditionen var inte synergistisk. Osäkerhet som följer av samspelet mellan olika faktorer som påverkar binas hälsa (som detaljerad här), begränsa effektiviteten i strategier för pollinerare. Genom att hjälpa förutsäga de interaktiva effekterna av flera riskfaktorer, kan resultaten från liknande laboratoriebaserade experiment hjälpa kringgå denna långvariga utmaning i bee bevarandeinsatser.

I området i närheten finns det flera kritiska steg inom detta protokoll som kan påverka resultatet av experimentet. När så är möjligt, är det tillrådligt att använda ekologiska pollen som är fria från bekämpningsmedelsrester. Med pollen från okända källor ökar risken för kontaminering med olika jordbrukskemikalier, vilket kan förvirra experimentella resultat. Det är viktigt att få nybakade inkopplad Osmia häckande vass så att endast okläckta ägg eller mycket unga larver används i studien. Detta säkerställer att Larverna föds upp nästan helt på den avsedda pollen behandling typ. Häckande röret bör vara dissekeras använder en grunda snitt, varvid bestämmelserna om pollen och ägg kan skadas under skörd. När äggen har tagits bort måste de hanteras försiktigt för att förhindra skador och behöll i väga båtar i en sval mörk hygienisk miljö (t.ex., biosäkerhet skåp) tills de överförs. Detta hålltid bör hållas till ett minimum (< 30 min) för att säkerställa att kvaliteten på ägget inte äventyras. Alla bör utföras i en biosäkerhet skåp att säkerställa en ren arbetsmiljö och minska risken för kontaminering. För att säkerställa deras effektivitet, bara använda nygjord fungicid lösningar för behandlingar. Med tanke på att pollen är hydrofoba, fungicid lösningen / sterilt vatten bör införas i den depression som görs inom pollen bestämmelser. Detta maximerar volymen av flytande genomsyrar genom tillhandahållande. Det är dock viktigt att depressionen inte punkteras hela djupet av bestämmelsen, eftersom det skulle resultera i förlust av volym från den lösning som ansluter sig till kapsel golvet. De individuella behandlingar och kontroller bör utföras i separata plattor med att minska risken för korskontaminering från flyktiga föreningar eller pollen-burna bakterieflora. Bitar av vikta tejp bör kopplas till kanterna på plattan så att tillräcklig luftspalt när locken är på plats. Under dagliga observationer, ska plattorna hanteras varsamt för att minimera störningar för larverna. Observationer bör göras under lupp med minsta ljusintensitet och locken bör inte tas bort såvida inte att kassera döda larver. Vid oväntade omfattande dödlighet, måste både larver och deras pollen bestämmelser inspekteras visuellt för att leta efter tecken på infektion och angrepp. De plattor som innehåller replikerar den äventyras bör genast kasseras, arbetsytan desinficeras, och verktyg steriliseras för att förhindra smittspridning.

Trots dess breda finns det vissa begränsningar med denna metod. Till exempel, medan det är bästa praxis att använda ekologiska pollen när det finns tillgängligt, är höja växter inom växthus inställningen att ge tillräckliga mängder ren oförstörd pollen logistiskt oöverkomliga. I sådana fall användas vilda-insamlade pollen, förutsatt att det är screening för förekomst av bekämpningsmedelsrester. En annan strategi för att minska risken för kontamination när wild-insamlade pollen är att få pollen från en källa som är mindre sannolikt att ha varit sprayad (t.ex., orörda ostörda områden ligger långt från jordbruket gårdar). Den värd pollen som används i denna studie erhölls från häckande vassen som placerades i naturliga skogar och gräsmarker kring foten av bergskedjan Wasatch nära Kaysville, Utah. Med tanke på att denna region domineras av vilda, ohanterad naturskogar långt ifrån någon kommersiell jordbruks områden, och att dessa bin inte flyga så långt som honungsbin när födosök83,84,85, det är ytterst osannolikt att skulle de insamlade pollen har sprutats. Således, bekämpningsmedelsrester inom pollen samlas här är sannolikt att vara trivial. Födosökande i sådana vilda landskap, är den adulta honan mindre sannolikt att stöta på förorenade pollen, minskar risken för exponering bland larverna. Kommersiellt tillgängliga honungsbinas pollen som används i denna studie samlas från naturliga skogsområden i norra Wisconsin och Michigan. Offentligt tillgänglig information och personlig kommunikation med leverantören saluförs som livsmedel, och anger att kuporna inte behandlas kemiskt och pollen säljs i dess naturliga, råa form utan några modifieringar86. Det är därför rimligt att anta att föroreningar lasten i kommersiellt tillgängliga honungsbinas pollen skulle vara minimal. För studier som inte erhåller pollen från ohanterade områden med vilda Naturlig vegetation, är det tillrådligt att ha direkta empiriska bevis från pollen kemi analys för att säkerställa att pollen som används i risk analyser är främmande gratis. En annan begränsning innebär de manipulationer som infördes genom artificiell uppfödning miljön. Trots ansträngningar, det är inte logistiskt möjligt att replikera den exakta mikromiljö inom ett naturligt häckande reed (t.ex., fukt, syrekoncentration, den tredimensionella strukturen av enskilda kammare), vilket skulle kunna påverka larver Fitness till okänd grader. Defensibly simulera vad som kännetecknar den naturliga kosten, skall preliminära data från häckande vassen erhållas före in vitro- kost manipulation studier. Även om den icke-host pollen som används i denna studie erhålls från områden där Oregon druva är frånvarande eller sällsynta87, kan det finnas spår av värd pollen blandat inom kommersiellt tillgängliga pollen, som potentiellt påverkar resultaten. En annan nackdel med denna teknik är att hantera stress under försöksperioden kan orsaka negativa effekter på bin. Slutligen, medan det är vanligt att stöta okläckta ägg i naturen63, under laboratorieförhållanden det är svårt att få klarhet i huruvida felet att kläcka berodde på hantering av stress, experimentell behandling eller ett resultat av naturliga orsaker. Eftersom dessa faktorer kan införa okända grader av bias i studien, måste man använda försiktighet medan tolka resultaten.

Genom att kontrollera för faktorer som bevisligen kan bias experimentella resultat (t.ex. moderns födosök effektivitet75, kön-specifika variationer77och kosten pollen68,72), beskrivna protokollet ger betydande förbättringar över tidigare publicerade tekniker76, och erbjuder en mer rigorös ram för hypoteser testning. Till exempel med i vitro-uppfödda bin gör utredningar om sex-specifika Svaren till xenobiotiska behandling, som annars skulle vara svårt för att studera bland vilda populationer av hålighet-kapsling bin49,88. Potentialen för att manipulera och testa flera samverkande faktorer (t.ex., kost kvalitet och kvantitet, kost-associerade bakterieflora, exponering för synergistisk bekämpningsmedel), kan ge värdefulla insikter i de viktigaste bestämningsfaktorerna för bee fitness. Flexibiliteten i protokollet tillåter lätt ändringar (t.ex. med hjälp av olika storlek plattor för att rymma larver av olika storlekar, ändra typ och mängd av diet), vilket gör den mottaglig för användning med flera andra arter av solitära bin och getingar 76. När denna studie utvärderade fitness baserat på utveckling och efterlevande i utfodring skede, insekter kan inkuberas fram uppkomsten att få ytterligare uppgifter om uppkomsten kurs, mat-till-organ omvandling och efter uppkomsten livslängd 49. denna information kan hjälpa till att bedöma de subletala effekterna av behandlingar i toxicitet analyser. Med ökande intresse för funktionen av det pollen-microbiom, kan laboratoriebaserade studier identifiera känsliga kontra resistenta bee arter utifrån deras pollen bakterieflora71. Skillnader i fungicid känslighet över bee grupper kan utforskas genom att sekvensera bakterieflora inom hive-lagrade pollen. Detta kan hjälpa fastställa rollen av den pollen mikrobiomet i ger olika grader av resistens mot xenobiotiska stressfaktorer. Framtida studier kan också hjälpa till att identifiera skillnader mellan den naturliga bakterieflora av värd- och icke-host pollen, som kan tjäna som en underliggande faktor som driver oligolectic beteende inom Välj bee art.

In vitro- uppfödning av larval solitära bin kan hjälpa kontroll för den naturliga variationen upplevt i naturen, därmed avgränsar betydelsen av enskilda och samverkande faktorer påverkar bee fitness. Denna tillgänglig och billig teknik utökar de entomologer toolkit genom att tillåta för manipulering av flera parametrar, som enkelt kan modifieras till adress specifika forskningsmål. Om bevis från in vitro- försök kan hjälpa till att identifiera at-risk populationer, kommer att inverkan på bee bevarandestrategier vara betydande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Kimball Clark och Tim Krogh för att tillhandahålla Osmia häckande vassen, Meredith Nesbitt och Molly Bidwell för stöd i labbet, Drs. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter och tre anonyma granskare för deras värdefulla synpunkter som förbättrat manuskriptet. Detta arbete stöds av USDA-Agricultural Research Service avsatt medel (nuvarande forskning Information System #3655-21220-001), Wisconsin Department of Agriculture, handel och konsumentskydd (#197199), National Science Foundation (under Bidrag nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office av vetenskap BER DE-FC02-07ER64494).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. P Roy Soc Lond B Bio. 274 (1608), 303-313 (2007).
  2. Biesmeijer, J. C. J., et al. Parallel declines in pollinators and insect-pollinated plants in Britain and the Netherlands. Science. 313 (5785), 351-354 (2006).
  3. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evol. 25 (6), 345-353 (2010).
  4. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. P Natl Acad Sci USA. 108 (2), 662-667 (2011).
  5. Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vunerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
  6. Fontaine, C., Dajoz, I., Meriguet, J., Loreau, M. Functional diversity of plant-pollinator interaction webs enhances the persistence of plant communities. Plos Biol. 4 (1), 0129-0135 (2006).
  7. Kluser, S., Peduzzi, P. Global pollinator decline: a literature review. , UNEP/GRID Europe. (2007).
  8. Brown, M. J. F., Paxton, R. J. The conservation of bees: a global perspective. Apidologie. 40 (3), (2009).
  9. Lebuhn, G., et al. Detecting insect pollinator declines on regional and global scales. Conserv Biol. 27 (1), (2013).
  10. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. , Suppl 103. S80-S95 (2010).
  11. Pettis, J. S., Delaplane, K. S. Coordinated responses to honey bee decline in the USA. Apidologie. 41 (3), 256-263 (2010).
  12. Sandrock, C., Tanadini, L. G., Pettis, J. S., Biesmeijer, J. C., Potts, S. G., Neumann, P. Sublethal neonicotinoid insecticide exposure reduces solitary bee reproductive success. Agr Forest Entomol. 16 (2), (2014).
  13. Van der Sluijs, J. P., Simon-Delso, N., Goulson, D., Maxim, L., Bonmatin, J. M., Belzunces, L. P. Neonicotinoids, bee disorders and the sustainability of pollinator services. Curr Opin Env Sust. 5 (3), (2013).
  14. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), (2015).
  15. Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity - USA. Apidologie. 41 (3), (2010).
  16. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  17. Glavan, G., Bozic, J. The synergy of xenobiotics in honey bee Apis mellifera: mechanisms and effects. Acta Biol. Slov. 56, 11-27 (2013).
  18. Biddinger, D. J., et al. Comparative toxicities and synergism of apple orchard pesticides to Apis mellifera (L.) and Osmia cornifrons (Radoszkowski). PLoS ONE. 8 (9), e72587 (2013).
  19. Thompson, H. M., Fryday, S. L., Harkin, S., Milner, S. Potential impacts of synergism in honeybees (Apis mellifera) of exposure to neonicotinoids and sprayed fungicides in crops. Apidologie. 45 (5), 545-553 (2014).
  20. Jansen, J. -P., Lauvaux, S., Gruntowy, J., Denayer, J. Possible synergistic effects of fungicide-insecticide mixtures on beneficial arthropods. IOBC-WPRS Bulletin. 125, 28-35 (2017).
  21. Robinson, A., Hesketh, H., et al. Comparing bee species responses to chemical mixtures: Common response patterns? PLoS ONE. 12 (6), (2017).
  22. Sgolastra, F., Medrzycki, P., et al. Synergistic mortality between a neonicotinoid insecticide and an ergosterol-biosynthesis-inhibiting fungicide in three bee species. Pest Management Science. 73 (6), 1236-1243 (2017).
  23. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  24. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PloS one. 5 (3), e9754 (2010).
  25. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PloS one. 8 (7), e70182 (2013).
  26. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  27. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PloS one. 9 (1), e77547 (2014).
  28. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  29. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. P Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1809), 20150299-20150299 (2015).
  30. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  31. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J Exp Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  32. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), e0135688 (2015).
  33. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pestic Biochem Phys. 51 (1), 1-11 (1995).
  34. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of pyrethroid insecticide toxicity to honey bees (Hymenoptera: Apidae) by cytochrome P450 monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (4), 1046-1050 (2006).
  35. Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L. A., Currie, C. R., Zalapa, J. E., Hittinger, C. T. Empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health. JoVE. (128), e54631 (2017).
  36. Batra, S. W. T. Solitary bees. Sci Am. 250 (2), 120-127 (1984).
  37. Linsley, E. G. The ecology of solitary bees. Hilgardia. 27 (19), 543-599 (1958).
  38. Garibaldi, L. A., et al. Wild Pollinators Enhance Fruit Set of Crops Regardless of Honey Bee Abundance. Science. 339 (6127), 1608-1611 (2013).
  39. Bosch, J., Kemp, W. P. How to manage the blue orchard bee. , Sustainable Agriculture Network. Washington, DC. (2001).
  40. Keller, A., Grimmer, G., Steffan-Dewenter, I. Diverse microbiota identified in whole intact nest chambers of the red mason bee Osmia bicornis (Linnaeus 1758). PLoS ONE. 8 (10), e78296 (2013).
  41. Bosch, J., Kemp, W. P. Development and Emergence of the Orchard Pollinator Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Environmental Entomology. 29 (1), 8-13 (2000).
  42. Brittain, C., Potts, S. G. The potential impacts of insecticides on the life-history traits of bees and the consequences for pollination. Basic and Applied Ecology. 12 (4), 321-331 (2011).
  43. Arena, M., Sgolastra, F. A meta-analysis comparing the sensitivity of bees to pesticides. Ecotoxicology. 23 (3), 324-334 (2014).
  44. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Foraging and nesting behavior of Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae) in the presence of fungicides: cage studies. J Econ Entomol. 101 (3), 647-653 (2008).
  45. Huntzinger, A. C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide tests on adult alfalfa leafcutting bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  46. Tsvetkov, N., et al. Chronic exposure to neonicotinoids reduces honey bee health near corn crops. Science. 356 (6345), 1395-1397 (2017).
  47. Mao, W., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Disruption of quercetin metabolism by fungicide affects energy production in honey bees (Apis mellifera). P Natl Acad Sci. 114 (10), 2538-2543 (2017).
  48. Blacquière, T., Smagghe, G., Van Gestel, C. A. M., Mommaerts, V. Neonicotinoids in bees: A review on concentrations, side-effects and risk assessment. Ecotoxicology. 21 (4), 973-992 (2012).
  49. Sgolastra, F., Tosi, S., Medrzycki, P., Porrini, C., Burgio, G. Toxicity of spirotetramat on solitary bee larvae, Osmia cornuta (Hymenoptera: Megachilidae), in laboratory conditions. Journal of Apicultural Science. 59 (2), 73-83 (2015).
  50. Mader, E., Spivak, M., Evans, E. Managing Alternative Pollinators. , Sustainable Agriculture Research and Education (SARE), US Dept. of Agriculture. (2010).
  51. Bosch, J., Kemp, W. P. Developing and establishing bee species as crop pollinators: the example of Osmia spp.(Hymenoptera: Megachilidae) and fruit trees. B Entomol Res. 92 (1), 3-16 (2002).
  52. Sampson, B. J., Rinehart, T. A., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Werle, C. T. Phenotypic variation in fitness traits of a managed solitary bee, Osmia ribifloris (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 108 (6), 2589-2598 (2015).
  53. Sampson, B. J., Cane, J. H., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Spiers, J. M. Biology and management potential for three orchard bee species (Hymenoptera: Megachilidae): Osmia ribifloris Cockerell, O. lignaria (Say) and O.chalybea Smith with emphasis on the former. Acta Hort. 810, 549-555 (2009).
  54. Hladik, M. L., Vandever, M., Smalling, K. L. Exposure of native bees foraging in an agricultural landscape to current-use pesticides. Sci Total Environ. 542, 469-477 (2016).
  55. Long, E. Y., Krupke, C. H. Non-cultivated plants present a season-long route of pesticide exposure for honey bees. Nat Commun. 7, (2016).
  56. Krupke, C. H., Hunt, G. J., Eitzer, B. D., Andino, G., Given, K. Multiple routes of pesticide exposure for honey bees living near agricultural fields. PLoS ONE. 7 (1), e29268 (2012).
  57. Stoner, K. A., Eitzer, B. D. Using a hazard quotient to evaluate pesticide residues detected in pollen trapped from honey bees (Apis mellifera) in Connecticut. PLoS ONE. 8 (10), e77550 (2013).
  58. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  59. Steffan-Dewenter, I., Klein, A. -M., Gaebele, V., Alfert, T., Tscharntke, T. Bee diversity and plant-pollinator interactions in fragmented landscapes. Specialization and generalization in plant-pollinator interactions. , 387-410 (2006).
  60. Kremen, C., Ricketts, T. Global perspectives on pollination disruptions. Conserv Biol. 14 (5), 1226-1228 (2000).
  61. Memmott, J., Waser, N. M., Price, M. V. Tolerance of pollination networks to species extinctions. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1557), 2605-2611 (2004).
  62. Spear, D. M., Silverman, S., Forrest, J. R. K. Asteraceae pollen provisions protect Osmia mason bees (Hymenoptera: Megachilidae) from brood parasitism. The American Naturalist. 187 (6), 797-803 (2016).
  63. Rust, R. W. Biology of Osmia (Osmia) ribifloris Cockerell (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 59, 89-94 (1986).
  64. Torchio, P. F. Osmia ribifloris, a native bee species developed as a commercially managed pollinator of highbush blueberry (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 63 (633), 427-436 (1990).
  65. Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees - A risk assessment. PLoS ONE. 9 (4), e94482 (2014).
  66. Kasiotis, K. M., Anagnostopoulos, C., Anastasiadou, P., Machera, K. Pesticide residues in honeybees, honey and bee pollen by LC-MS/MS screening: Reported death incidents in honeybees. Sci Total Environ. 485 (1), 633-642 (2014).
  67. Stanley, J., Sah, K., Jain, S. K., Bhatt, J. C., Sushil, S. N. Evaluation of pesticide toxicity at their field recommended doses to honeybees, Apis cerana and A. mellifera through laboratory, semi-field and field studies. Chemosphere. 119, 668-674 (2015).
  68. Praz, C. J., Müller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen? Ecology. 89 (3), 795-804 (2008).
  69. Sedivy, C., Müller, A., Dorn, S. Closely related pollen generalist bees differ in their ability to develop on the same pollen diet: Evidence for physiological adaptations to digest pollen. Funct Ecol. 25 (3), 718-725 (2011).
  70. Williams, N. M. Use of novel pollen species by specialist and generalist solitary bees (Hymenoptera: Megachilidae). Oecologia. 134, (2003).
  71. Graystock, P., Rehan, S. M., McFrederick, Q. S. Hunting for healthy microbiomes: determining the core microbiomes of Ceratina, Megalopta, and Apis bees and how they associate with microbes in bee collected pollen. Conserv Genet. 18 (3), 1-11 (2017).
  72. Bosch, J., Vicens, N. Relationship between body size, provisioning rate, longevity and reproductive success in females of the solitary bee Osmia cornuta. Behav Ecol Sociobiol. 60 (1), 26-33 (2006).
  73. Bosch, J., Vicens, N. Body size as an estimator of production costs in a solitary bee. Ecol Entomol. 27 (2), 129-137 (2002).
  74. Radmacher, S., Strohm, E. Factors affecting offspring body size in the solitary bee Osmia bicornis (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 41 (2), 169-177 (2010).
  75. Seidelmann, K. Open-cell parasitism shapes maternal investment patterns in the Red Mason bee Osmia rufa. Behav Ecol. 17 (5), (2006).
  76. Becker, M. C., Keller, A. Laboratory rearing of solitary bees and wasps. Insect Science. 23 (6), 918-923 (2016).
  77. Bosch, J. The nesting behaviour of the mason bee Osmia cornuta (Latr) with special reference to its pollinating potential (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 25, 84-93 (1994).
  78. Krunić, M., Stanisavljević, L., Pinzauti, M., Felicioli, A. The accompanying fauna of Osmia cornuta and Osmia rufa and effective measures of protection. B Insectol. 58 (2), 141-152 (2005).
  79. Elliott, S. E., Irwin, R. E., Adler, L. S., Williams, N. M. The nectar alkaloid, gelsemine, does not affect offspring performance of a native solitary bee, Osmia lignaria (Megachilidae). Ecol Entomol. 33 (2), 298-304 (2008).
  80. Toby Mordkoff, J. The Assumption(s) of Normality. , Available from: http://www2.psychology.uiowa.edu/faculty/mordkoff/GradStats/part 1/I.07 normal.pdf (2016).
  81. Hendriksma, H. P., Härtel, S., Steffan-Dewenter, I. Honey bee risk assessment: New approaches for in vitro larvae rearing and data analyses. Methods Ecol and Evol. 2 (5), 509-517 (2011).
  82. Aupinel, P., et al. Improvement of artificial feeding in a standard in vitro method for rearing Apis mellifera larvae. B Insectol. 58 (2), 107-111 (2005).
  83. Beekman, M., Ratnieks, F. L. W. Long-range foraging by the honey-bee, Apis mellifera L. Funct Ecol. 14 (4), 490-496 (2000).
  84. Gathmann, A., Tscharntke, T. Foraging ranges of solitary bees. J Anim Ecol. 71 (5), 757-764 (2002).
  85. Greenleaf, S. S., Williams, N. M., Winfree, R., Kremen, C. Bee foraging ranges and their relationship to body size. Oecologia. 153 (3), 589-596 (2007).
  86. Bee Pollen Supplement - Bee Rescued. , Available from: https://beerescued.com/product/bee-rescued-bee-pollen-supplement/ (2018).
  87. Holly-Leaf Oregon-Grape (Mahonia aquifolium) Species Details and Allergy Info, Teton county, Wyoming. , Available from: http://www.pollenlibrary.com/Local/Specie/Mahonia+aquifolium/in/Teton County/WY/ (2018).
  88. Cane, J. H., Griswold, T., Parker, F. D. Substrates and Materials Used for Nesting by North American Osmia Bees (Hymenoptera: Apiformes: Megachilidae). Annals of the Entomological Society of America. 100 (3), 350-358 (2007).

Tags

Miljövetenskap fråga 137 bee nedgång kost manipulation fungicid exponering pollen preferens larval fitness mason bin
<em>In Vitro</em> Uppfödning av solitära bin: ett verktyg för att bedöma Larval riskfaktorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dharampal, P. S., Carlson, C. M.,… More

Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter