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Biochemistry

HEK कोशिकाओं से Mitoribosome का तेजी से अलगाव

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/57877
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Science for Life Laboratory, Department of Biochemistry and Biophysics, Stockholm University

Summary

Mitochondria विशेष ribosomes कि उनके बैक्टीरियल और cytoplasmic समकक्षों से हट गया है । यहां हम बताएंगे कि कैसे mitoribosomes HEK कोशिकाओं में अपने मूल डिब्बे से प्राप्त किया जा सकता है । विधि निलंबन कोशिकाओं और mitoribosomes के फलस्वरूप शुद्धि से mitochondria का अलगाव शामिल है ।

Abstract

मानव mitochondria ribosomes (mitoribosomes) के एक समर्पित सेट है कि 13 ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण mitochondrial जीनोम द्वारा इनकोडिंग परिसरों के आवश्यक प्रोटीन घटकों का अनुवाद अधिकारी । मानव mitoribosomes द्वारा संश्लेषित सभी प्रोटीन के बाद से अभिंन झिल्ली प्रोटीन हैं, मानव mitoribosomes अनुवाद के दौरान mitochondrial भीतरी झिल्ली को सीमित कर रहे हैं । cytosolic ribosome mitoribosome 55S के एक अवसादन गुणांक है की तुलना में, आधा rRNA सामग्री, कोई 5 एस rRNA और ३६ अतिरिक्त प्रोटीन । इसलिए, एक उच्च प्रोटीन-आरएनए अनुपात और एक असामान्य संरचना मानव mitoribosome अपने cytosolic समकक्ष से काफी अलग बनाते हैं ।

जीवन को mitoribosome के केंद्रीय महत्व के बावजूद, मानव कोशिका रेखाओं से अक्षुण्ण परिसर को शुद्ध करने के लिए कोई प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं थे. परंपरागत रूप से, mitoribosomes mitochondria-रिच पशु ऊतकों कि सामग्री शुरू करने के किलोग्राम की आवश्यकता से अलग थे । हम कारण है कि mitochondria विभाजन में HEK293-व्युत्पंन मानव पोषक तत्व युक्त अभिव्यक्ति माध्यम में उगाया कोशिकाओं को एक सक्रिय mitochondrial अनुवाद होता है, और, इसलिए, के संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सामग्री का एक उपयुक्त स्रोत हो सकता है mitoribosome । इसकी संरचना की जांच करने के लिए, हम HEK कोशिकाओं से बरकरार mitoribosomes के बड़े पैमाने पर शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है । साथ ही, हम सेल lysis के लिए पारंपरिक यांत्रिक कतरनी आधारित तरीकों के लिए एक तेजी से, कम श्रम गहन और अधिक कुशल विकल्प के रूप में नाइट्रोजन cavitation विधि का परिचय । यह mitoribosome है कि उच्च संकल्प के लिए अपने संरचनात्मक दृढ़ संकल्प के लिए अनुमति दी, बरकरार मानव mitoribosome और उसकी विधानसभा मध्यवर्ती की संरचना खुलासा की तैयारियों में हुई । यहां, हम इस काम पर अनुवर्ती और एक अनुकूलित और अधिक लागत प्रभावी विधि केवल ~ 1010 प्रसंस्कृत HEK कोशिकाओं की आवश्यकता होती है । विधि मानव mitoribosomal अनुवाद परिसरों, म्यूटेंट, गुणवत्ता नियंत्रण सभाओं और mitoribosomal उपइकाईयों मध्यवर्ती को शुद्ध करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । शुद्धि रैखिक दस गुना यदि आवश्यक हो, और भी कोशिकाओं के अंय प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

mitochondrial प्रोटीन संश्लेषण की प्रक्रिया 13 आवश्यक मीट्रिक टन-mRNAs है कि एक विशेष झिल्ली से जुड़े mitoribosome श्वसन श्रृंखला के उत्प्रेरक कोर के रूप में अनुवाद कर रहे है पर आधारित है । बदल mitochondrial जीनोम और प्रोटीन के लिए की जरूरत है सह-अनुवाद झिल्ली में डालने के लिए काफी mitochondrial ribosomes1की वास्तुकला के आकार का है । हाल ही में स्तनधारी mitoribosome के उच्च संकल्प संरचनाओं जीवाणु समकक्ष2,3के लिए एक हड़ताली अलग समग्र रूप दिखाया । विशेष रूप से, ३६ mitochondria-विशिष्ट प्रोटीन जोड़ रहे हैं, योगदान ~ 1 एमडीए अतिरिक्त आणविक द्रव्यमान, जबकि मीट्रिक टन-rRNA दोहरा द्वारा कम और अत्यधिक हट गया है । संरचनात्मक rearrangement था लगभग सभी महत्वपूर्ण कार्यात्मक सुविधाओं है कि पहले आम तौर पर स्वीकार किए जाते थे बदल सार्वभौमिक4संरक्षित किया जाना है ।

नए प्रमुख तत्वों mitoribosomal उपइकाईयों में से हर एक के द्वारा अधिग्रहीत किया गया है, उदाहरण के लिए, छोटे उपइकाई अपने ' प्रमुख क्षेत्र में एक आंतरिक GTPase प्रोटीन mS29 शामिल है । अंय अनुवाद सिस्टंस में GTPase गतिविधि नहीं मिली है, और संरचना इंगित करती है कि GTPase में उपइकाई असेंबली2में कोई भूमिका हो सकती है । 5 एस rRNA कि सभी ज्ञात राइबोसोमल बड़ी उपइकाईयों का एक मील का पत्थर माना जा रहा था, केंद्रीय अवधि के मूल के गठन, स्तनधारी mitoribosome में लापता है और2के बजाय एक अभिंन इमारत ब्लॉक के रूप में मीट्रिक टन tRNA-वैल को अपनाया है । बान और सहकर्मियों ने दिखाया कि सुअर का mitoribosome के पास एमटी-tRNA-Phe है और न – वैल5। Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk, और सहकर्मियों ने इन आंकड़ों पर फ़ॉलो किया और पाया कि समझौता मीट्रिक टन के साथ रोगियों से mitoribosomes-tRNA-वैल स्थिरता सिद्धांत में कर सकते है मीट्रिक टन-tRNA-Phe6,7। क्यों mitoribosomes इन विशिष्ट तत्वों को शामिल किया है और क्या रास्ते और ट्रांसकारकों इन अद्वितीय विधानसभाओं के लिए आवश्यक है अज्ञात रहते हैं ।

कुल मिलाकर, मानव mitoribosome की उच्च जटिलता, नई प्रोटीन घटकों, और मीट्रिक टन के अद्वितीय संघ-tRNA एक संरचनात्मक तत्व के रूप में अभी तक अज्ञात mitochondria-विशिष्ट ट्रांसकारकों की भागीदारी मतलब है । हालांकि, क्योंकि इस प्रणाली की सुविधाओं के कई mitochondria के लिए अद्वितीय हैं, जो परंपरागत रूप से8की जांच करने के लिए मुश्किल है, थोड़ा आणविक और गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र के बारे में जाना जाता है । इलेक्ट्रॉन क्रायो द्वारा उच्च संकल्प एकल कण विश्लेषण के विकास के साथ-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM)20, अवसर अब व्यापक विधानसभा, कार्रवाई और मानव के गुणवत्ता नियंत्रण अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए पैदा mitoribosome । मानव mitoribosome विधानसभा मध्यवर्ती के पहले संरचना की हमारी रिपोर्ट मान्यता है कि यह कैसे मानव mitoribosome गठन किया है और पता चलता है कि क्रायो-EM नए ट्रांसकी पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कल्पना करने के लिए संभव है प्रदान करता है अभिनय विधानसभा कारक9.

इस प्रारंभिक प्रयास पर विस्तार करने के लिए, हम विस्तार में मानव mitoribosome शुद्धि के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन । प्रोटोकॉल के पहले भाग में, निलंबन कोशिकाओं से अत्यधिक शुद्ध अक्षुण्ण mitochondria के एक बड़े पैमाने पर अलगाव का वर्णन किया गया है । यह प्रक्रिया 9 ज की आवश्यकता है और आसानी से संशोधित किया जा सकता है और विभिंन प्रकार के कक्ष और तराजू के लिए अनुकूलित । इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम नाइट्रोजन cavitation का उपयोग कोशिकाओं को तोड़ने के लिए खुला है । mitoribosomes को शुद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल का दूसरा भाग विकसित किया गया । इस प्रक्रिया के लिए 7 एच की आवश्यकता है और जैव रासायनिक और संरचनात्मक अध्ययन के लिए mitoribosomes की एक पर्याप्त राशि पैदावार । एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में शुद्ध mitochondria का उपयोग उच्च गुणवत्ता वाले अंतिम तैयारी प्रदान करता है और अंय mitochondrial अणुओं को extrapolated जा सकता है ।

Protocol

सभी स्तनधारी सेल संस्कृति काम एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर किया जाना चाहिए । कोशिकाओं के साथ संपर्क करें, तो बाँझ उपकरण का उपयोग. nitrile दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं और अच्छा ऊतक संस्कृति अभ्यास का पालन करें ।

1. सेल संस्कृति

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में HEK293S निलंबन कोशिकाओं को बनाए रखने के 10% टेट्रासाइक्लिन मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 μg/एमएल blasticidin और २०० μg/एमएल Azithromycin, ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2के साथ पूरक ।
  2. 9 x T175 कुप्पी तक स्केल करें । ९०% पर प्रवाह, फसल कोशिकाओं और उंहें स्पिन नीचे ५०० x जी पर 5 मिनट के लिए 5% टेट्रासाइक्लिन-मुक्त FBS के साथ पूरक Freestyl में छर्रों कोशिकाओं resuspend । एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और एक वेंट मिलाते कुप्पी में १.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें ।
    नोट: यह आम तौर पर एक १,००० मिलीलीटर वेंट कुप्पी में ३०० मिलीलीटर की एक प्रारंभिक मात्रा के अनुरूप होगा ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर एक मिलाना मशीन में १२० rpm (५० मिमी व्यास मिलाते) में कोशिकाओं को गर्मी ।
  4. 2 दिनों के बाद कोशिकाओं गिनती और कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए आगे बढ़ना अगर सेल घनत्व ३.० x 106 कोशिकाओं/ 2 x १५० एमएल सेल संस्कृति में 2 x २५० एमएल शंकु बोतलों में 5 मिनट के लिए ५०० ग्राम नीचे कताई द्वारा कोशिकाओं भाजित । 2 x 10 मिलीलीटर ताजा मीडिया और एक 2 एक्स 1, 000 मिलीलीटर के हस्तांतरण में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित एक अंतिम सेल के घनत्व के लिए उपयुक्त मात्रा युक्त कुप्पी वेंट १.५ x 106 सेल/एमएल, जैसे 2 एक्स ३०० एमएल ३.० x 106 कोशिकाओं के एक प्रारंभिक सेल घनत्व से एमएल/
  5. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर एक मिलाना मशीन में १२० rpm (५० मिमी व्यास मिलाते) में कोशिकाओं को गर्मी ।
  6. दो दिनों के बाद कोशिकाओं गिनती और कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए आगे बढ़ना अगर सेल घनत्व ३.० x 106 कोशिकाओं/ नीचे 4 x १५० एमएल सेल संस्कृति 4 x २५० एमएल शंकु बोतलों में ५०० ग्राम में 5 मिनट के लिए नीचे कताई द्वारा कोशिकाओं को विभाजित करें । 2 x 10 मिलीलीटर ताजा मीडिया और 2 x २,००० मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण में कोशिकाओं को निलंबित कर दिया एक अंतिम सेल घनत्व के लिए उपयुक्त मात्रा युक्त कुप्पी वेंट किया १.५ एक्स 106 सेल/एमएल, जैसे ३.० x 106 कोशिकाओं के एक प्रारंभिक सेल घनत्व से 2 x ७०० मिलीलीटर/एमएल ।
  7. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर एक मिलाना मशीन में १२० rpm (५० मिमी व्यास मिलाते) में कोशिकाओं को गर्मी ।
  8. दो दिनों के बाद कोशिकाओं गिनती और कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए आगे बढ़ना अगर सेल घनत्व ३.० x 106 कोशिकाओं/ 2 x २८०० मिलीलीटर में 2 x ७०० मिलीलीटर सेल संस्कृति डालने की कुप्पी वेंट और 2 एक्स ३०० मिलीलीटर ताजा मीडिया के साथ टॉपिंग 2 एक्स 1 एल के एक खंड तक पहुंचने के लिए कोशिकाओं भाजित ।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर एक मिलाकर मशीन में १२० rpm (५० मिमी व्यास मिलाते) में कोशिकाओं को गर्मी ।
  10. के बाद 24 एच कोशिकाओं की गणना और कोशिकाओं फसल अगर सेल घनत्व ३.०-४.० x 106 कोशिकाओं के बीच है/

2. Mitochondria अलगाव

  1. आवश्यक बफ़र्स
    नोट: मात्रा 2 एल कोशिकाओं से एक तैयारी के लिए दिया जाता है । mitochondrial आइसोलेशन बफ़र (MIB), सुक्रोज/mannitol बफ़र (SM4), प्रायोगिक बफ़र (MIBSM), resuspension बफ़र (SEM) के लिए समय से आगे निम्न स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    1. 0.5 एल MIB बफर बनाओ: 50mM HEPES-कोह, पीएच ७.५, 10 मिमी KCl, 1.5 मिमी MgCl2, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी EGTA, 1mM डीटीटी, चिढ़ाने अवरोधकों ।
    2. १०० एमएल SM4 बफर बनाओ: २८० मिमी सुक्रोज, ८४० मिमी mannitol, ५० मिमी HEPES-KOH, पीएच ७.५, 10 मिमी KCl, १.५ मिमी MgCl2, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी EGTA, 1m मीटर डीटीटी, चिढ़ाने अवरोधकों.
    3. १६० मिलीलीटर MIBSM बफर बनाएं: १२० एमएल MIB बफर + ४० एमएल SM4 बफर ।
    4. 4 ° c पर २०० मिलीलीटर पंजाबियों स्टोर ।
    5. 5 एमएल SEM बफर बनाओ: २५० मिमी सुक्रोज, 20 मिमी HEPES-KOH, पीएच ७.५, 1 मिमी EDTA ।
    6. 20 मिमी HEPES-कोह, पीएच ७.५, 1 मिमी EDTA और ६०%/३२%/23% और 15% सुक्रोज, क्रमशः युक्त stepwise सुक्रोज ढाल के लिए 4 x 10 मिलीलीटर स्टॉक समाधान बनाओ ।
  2. Mitochondria अलगाव
    नोट: यह जल्दी से काम और प्रक्रिया में बर्फ पर सब कुछ रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. पहले से उपयोग करने के लिए नाइट्रोजन cavitation चैंबर को शांत ।
    1. फसल 2 x 1 L कोशिकाओं (3-4 x केंद्रापसारक ट्यूब प्रति 109 कोशिकाओं) 7 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा ।
    2. supernatant ध्यान से खिचड़ी भाषा और 2 x १०० मिलीलीटर पंजाब में जल्दी से छर्रों कोशिकाओं resuspend । कक्षों को पूल ।
    3. 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १,२०० x g पर resuspend कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    4. supernatant ध्यान से खिचड़ी भाषा और गोली (~ 20 जी) वजन ।
    5. १२० मिलीलीटर MIB बफर में गोली resuspend ।
    6. कोशिकाओं को धीरे से 10 मिनट के लिए एक ठंडे कमरे में सरगर्मी से प्रफुल्लित करने की अनुमति दें ।
    7. बर्फ पर नाइट्रोजन cavitation चैंबर प्लेस और नाइट्रोजन cavitation चैंबर के लिए फूल कोशिकाओं स्थानांतरण । जोड़ें ४५ एमएल SM4 बफर (1/3 resuspend कोशिकाओं के अंतिम खंड के बारे में १४० मिलीलीटर, एक अंतिम एकाग्रता की उपज ७० mm सुक्रोज और २१० mm mannitol) ।
    8. नाइट्रोजन cavitation चैंबर जकड़ना और जब तक दबाव ५०० साई तक पहुंच नाइट्रोजन के साथ भरें । नल बंद करें और 20 मिनट के लिए बर्फ पर अलग रखें ।
    9. धीरे नाइट्रोजन cavitation चैंबर में दबाव जारी है और lysate (लगभग १८५ एमएल) इकट्ठा ।
    10. लीजड ड सामग्री के लिए सेल मलबे और 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ८०० x g पर नाभिक हटाने के केंद्रापसारक ।
    11. इसे जाली के माध्यम से एक चोंच में बर्फ पर रखा में डाल कर supernatant लीजिए. गोली मत छोड़ना ।
    12. ९० मिलीलीटर MIBSM बफर (1/2 पिछले मात्रा) में गोली resuspend । Homogenize Teflon/ग्लास Dounce homogenizer का उपयोग कर और 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक दोहराएं ।
    13. इसे जाली के माध्यम से एक चोंच में बर्फ पर रखा में डाल कर supernatant लीजिए. इस supernatant को supernatant से स्टेप 2.2.11 से जुडा है ।
    14. 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १,००० x g पर संयुक्त supernatants केंद्रापसारक ।
    15. इसे जाली के माध्यम से एक चोंच में बर्फ पर रखा में डाल कर supernatant लीजिए.
    16. गोली त्यागें और 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १०,००० x g पर क्रूड mitochondria युक्त supernatant केंद्रापसारक ।
      नोट: गोली आम तौर पर दो भागों से मिलकर बनता है: ढीला और तंग होगा ।
    17. ध्यान से तंग भाग परेशान बिना ढीला गोली बाहर धोने । 10 मिलीलीटर MIBSM बफर में तंग गोली resuspend ।
    18. एक प्रोटीन एकाग्रता एक वाणिज्यिक प्रोटीन परख किट या इसी तरह की विधि का उपयोग परख प्रदर्शन । 2 एल शुरू संस्कृति से ठेठ एकाग्रता पैदावार कर रहे हैं ~ 2 मिलीग्राम/एमएल ।
    19. RNase मुक्त DNase के २०० इकाइयों जोड़ें और 20 मिनट के लिए ठंडे कमरे में एक रोलर पर बारी से समान रूप से जीनोमिक डीएनए को हटाने के लिए DNase मिश्रण छोड़ दें ।
    20. 15 मिनट, 4 ° c के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक और 2 एमएल SEM बफर में गोली resuspend । Homogenize धीरे एक छोटी सी Teflon/ग्लास Dounce homogenizer का उपयोग कर किसी भी शेष समुच्चय resuspend । टूटना से बचने के लिए पांच से अधिक अप-एंड-डाउन का प्रदर्शन न करें । बर्फ पर रखो ।
    21. सुक्रोज ढाल 14 मिलीलीटर SW40 ट्यूबों में ध्यान से pipetting ६०% सुक्रोज शेयर बफर के ट्यूब के तल में १.५ मिलीलीटर तैयार करते हैं । ध्यान से ६०% बैंड के शीर्ष पर ३२% सुक्रोज शेयर बफर के ४.५ मिलीलीटर इसे परेशान किए बिना जोड़ें । 23% सुक्रोज शेयर बफर के १.५ मिलीलीटर के साथ और फिर 15% सुक्रोज शेयर बफर की १.५ मिलीलीटर के साथ दोहराएं ।
    22. पूरे mitochondrial निलंबन (लगभग 3 एमएल) सुक्रोज ढाल के शीर्ष पर लोड ।
    23. SW40 रोटर में १३९, ०६५ एक्स जी में ६० मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    24. ध्यान से ब्राउन बैंड ३२% और ६०% सुक्रोज एक स्थानांतरण पिपेट, आमतौर पर 2-3 एमएल का उपयोग कर के इंटरफेस के लिए पलायन इकट्ठा ।
    25. स्नैप-फ्रीज तरल नाइट्रोजन में शुद्ध mitochondria और दुकान पर-८० ° c ।

३. Mitoribosome तयारी

  1. आवश्यक बफ़र्स
    नोट: lysis बफ़र, सुक्रोज कुशन/ग्रेडिएंट और resuspension बफ़र के लिए निंन स्टॉक समाधानों को समय से पहले तैयार करें ।
    1. 10 मिलीलीटर lysis बफर बनाओ: 25 मिमी HEPES-KOH, पीएच ७.५, १५० mm KCl, 50mM MgOAc, 2% पॉलीथीन ग्लाइकोल octylphenyl ईथर, 2 मिमी डीटीटी, चिढ़ाने अवरोधकों ।
    2. 10 मिलीलीटर सुक्रोज तकिया बफर बनाओ: 1 एम सुक्रोज (३४% डब्ल्यू/वी), 20 मिमी HEPES-कोह, पीएच ७.५, १०० मिमी KCl, 20 मिमी MgOAc, 1% पॉलीथीन ग्लाइकोल octylphenyl ईथर, 2 मिमी डीटीटी ।
    3. 5 मिलीलीटर resuspension बफर बनाओ: 20 मिमी HEPES-कोह, पीएच ७.५, १०० मिमी KCl, मिमी MgOAc, 2 मिमी डीटीटी
    4. 15%-30% रैखिक सुक्रोज ग्रेडिएंट्स TLS-५५ में पुनर्निलंबन बफ़र के साथ बनाएं
  2. Mitoribosome शुद्धिकरण
    1. बर्फ पर जमी mitochondria को फिर से ठंढ ।
    2. lysis बफ़र के 2 खंड जोड़ें,उदाहरण के लिए 3 एमएल mitochondria के लिए 6 मिलीलीटर lysis बफर जोड़ें । ट्यूब को कई बार पलटने से तुरंत मिक्स कर लें ।
    3. एक छोटी सी Teflon के साथ Homogenize/ग्लास dounce homogenizer lysis को पूरा करने के लिए बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए और मशीन की सहायता के लिए ।
    4. लीजड ड सामग्री (लगभग 9 मिलीलीटर) ३०,००० x g पर 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अघुलनशील सामग्री को दूर करने के लिए । supernatant ध्यान से गोली से खिचड़ी भाषा और गोली त्यागें ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ३०,००० x g पर केंद्रापसारक supernatant का स्पष्टीकरण सुनिश्चित करने के लिए दोहराएं । supernatant ध्यान से गोली से खिचड़ी भाषा और गोली त्यागें ।
    6. तैयार सुक्रोज तकिया में TLA १२०.२ ट्यूबों (अल्ट्रा स्पष्ट): ०.४ मिलीलीटर सुक्रोज तकिया प्रति ट्यूब । लीजड ड सामग्री के प्रति मिलीलीटर एक ट्यूब तैयार करते हैं ।
    7. परत लीजड ड mitochondria सुक्रोज कुशन पर: लगभग 1 मिलीलीटर ट्यूब प्रति, एक lysate में जिसके परिणामस्वरूप: तकिया का अनुपात 2.5:1 ।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर tla 120.2 रोटर में ४५ मिनट के लिए २३१, ५५० एक्स जी पर नमूना केंद्रापसारक ।
    9. supernatant त्यागें और १०० µ एल के साथ क्रमिक रूप से कुल्ला ट्यूबों अवशिष्ट सुक्रोज को हटाने के लिए resuspension बफर ।
    10. कुल १०० में छर्रों resuspend µ एल resuspend बफर.
    11. 30 एस के लिए धीमी गति पर भंवर शेष समुच्चय को भंग करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर microtube में 10 मिनट के लिए १७,९४९ x g पर केंद्रापसारक ।
    12. ध्यान से supernatant इकट्ठा और केंद्रापसारक दोहराने ।
    13. एक२६०पर mitoribosome अवशोषण उपाय ।
      नोट: ठेठ उपज है 7 एक२६०, एक२६०के साथ: १.३ के एक२८० अनुपात ।
    14. एक एकल रैखिक सुक्रोज ढाल ट्यूब पर पूरे नमूना लोड । 4 ° c में १२० मिनट के लिए २१३, ६२६ x g पर TLS-५५ रोटर में केंद्रापसारक ।
    15. Fractionate ढाल, एक२६० और पूल न्यूक्लिक एसिड चोटी के साथ इसी अंश में ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित एक साथ ।
      नोट: ठेठ एक२६०: चोटी के एक२८० अनुपात है > 1.6 ।
    16. यदि आवश्यक हो, तो विकल्प की एक विधि का उपयोग कर बफ़र Exchange । रूपांतरण का उपयोग करके अंतिम एकाग्रता की गणना 1 A२६० = ०.१ मिलीग्राम/एमएल ।
    17. स्नैप resuspension बफ़र में शुद्ध mitoribosome नमूना फ़्रीज करें और-८० ° c पर संग्रह ।

Representative Results

विभाजन और अत्यधिक व्यवहार्य कोशिकाओं सक्रिय mitoribosomes की शुद्धि के लिए एक आवश्यक प्रारंभिक बिंदु है । यह प्रोटोकॉल किसी भी HEK293 निलंबन कक्षों पर लागू होता है । हम घर में सेल लाइन T501, जो छुरा टेट्रासाइक्लिन-inducible नियंत्रण के तहत एक ट्रांसपोर्टर व्यक्त कर रहा है प्रयोग कर रहे हैं । माता-पिता के सेल लाइन HEK293S-GnTI- कोशिकाओं (सामग्री की मेज)10है । सेल वृद्धि और फ्रीस्टाइल २९३ अभिव्यक्ति माध्यम में विस्तार के दौरान न्यूनतम घनत्व १.५ x 106 सेल/एमएल में रखा जाना चाहिए, हर दो दिनों की एक दोहरीकरण दर सुनिश्चित करने के लिए, जबकि अधिक से अधिक सेल घनत्व ~ 5 x 106 सेल/ एमएल. 3 x 106 सेल/एमएल के ऊपर एक सेल घनत्व तक पहुंचने पर कोशिकाओं को गोली और एक नए सिरे से, एक विस्तारित मात्रा में पहले से गरम मीडिया में resuspend है १.५ x 106 सेल/एमएल के ंयूनतम सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए । इस बंटवारे की प्रक्रिया के लिए एक वांछित सेल मास तक हर 2-3 दिन बार किया जाता है हासिल की है । अंतिम सेल घनत्व 3 की सीमा में भिंन हो सकते है-4.5 x 106 सेल/एमएल, और कम से 2 एल mitochondria के अलगाव के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में की आवश्यकता है । सेल व्यवहार्यता आम तौर पर बनाए रखा जाना चाहिए > 90%, और अंतिम संस्कृति है कि काटा है के लिए > 95% । एंटीबायोटिक दवाओं के साथ बड़े पैमाने पर सेल संस्कृति का उपचार अनुशंसित नहीं है ।

अंतर केंद्रापसारक की श्रृंखला के बाद, चरण 2.2.20 के बाद mitochondrial निलंबन की मात्रा 3-5 मिलीलीटर की श्रेणी में आम तौर पर है । mitochondria तो सुक्रोज ढाल पर अलग कर रहे है (चित्रा 1) अंय organelles से । stepwise सुक्रोज ढाल ऐसे तैयार है कि ढाल की मात्रा और mitochondrial निलंबन की मात्रा एक साथ अपने अधिक से अधिक मात्रा के लिए केंद्रापसारक ट्यूब को भरने । यहां विशेष देखभाल के लिए भूरे रंग के बैंड को इकट्ठा करने की जरूरत है ६०%/३२% अंतरफलक के आसपास बफर से ंयूनतम संक्रमण के साथ । इस क्रम में लगातार प्रोटीन रखने के लिए महत्वपूर्ण है: mitochondria solubilization के निंनलिखित कदम में डिटर्जेंट अनुपात । यह इस स्तर पर mitochondrial प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करने की सलाह दी है, और 15-20 मिलीग्राम कुल mitochondrial प्रोटीन की एक विशिष्ट उपज से आशा की जाती है ~ 10 10 कल्चरल HEK कोशिकाओं.

सफल mitochondria अलगाव पर, वे octylphenyl ईथर ग्लाइकोल पॉलीथीन के अलावा द्वारा लीजड ड हैं, और mitoribosomes एक सुक्रोज तकिया (चित्रा 2) के माध्यम से अलग कर रहे हैं । hydrophobic झिल्लीदार पदार्थ से mitoribosomes अलग करने के लिए, छर्रों बफर में resuspend कर रहे है डिटर्जेंट युक्त नहीं है, और hydrophobic परिसरों केंद्रापसारक द्वारा गोली लगी हैं । इस प्रक्रिया को दोहराया है, और mitoribosomes की शुद्धि डिग्री एक२६०/एक२८० अनुपात है, जो ~ १.३ होने की उंमीद है द्वारा quantified है । ठेठ उपज है 7 a२६० से एक 2 एल शुरू संस्कृति । इस mitoribosomal अंश में अतिरिक्त बड़े घुलनशील mitochondrial कॉम्प्लेक्स भी होते हैं, जैसे पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज और ग्लूटामेट डिहाइड्रोजनेज । mitoribosomes घुलनशील mitochondrial परिसरों से अलग करने के लिए, supernatant एक सुक्रोज घनत्व ढाल के लिए लागू किया जाता है । mitoribosome युक्त भागों आम तौर पर ट्यूब के नीचे तीसरे पर स्थित हैं । सुक्रोज ढाल के अंश तो एक स्वचालित पिस्टन के साथ या तो किया जा सकता है सावधानी से एक पिपेट के साथ ५० µ l अंश लेने के द्वारा या एक 21 जी सुई के साथ ट्यूब नीचे छिद्रण द्वारा और बूंदें इकट्ठा ।

दो प्रमुख mitoribosomal आबादी ढाल में पहचाने जाते हैं: monosome 55S और बड़ी उपइकाई 39S, के रूप में चित्र 3 और चित्रा 4में सचित्र । बड़ी उपइकाई अंश की उपस्थिति का पता चलता है कि कोशिकाओं को एक अत्यधिक सक्रिय विभाजन राज्य11में काटा जाता है । monosome और बड़ी उपइकाई चोटियों के बीच अनुपात बदल सकता है । एक अतिरिक्त नीचे के करीब स्थित पीक प्रदूषित cytoplasmic ribosomes 80 के दशक के साथ तैयारियों में दिखाई दे सकता है । कृपया ध्यान दें कि झूल बाल्टी रोटर TLS-५५ का उपयोग कर छोटे सुक्रोज ढाल 0.4-1 A२६०के एक ऑप्टिकल घनत्व पर mitoribosomes के ~ 1 मिलीलीटर की तेजी से शुद्धि के लिए अनुमति देता है । monosome और बड़ी उपइकाई चोटियों के जुदाई थोड़ा भिंन पर निर्भर करता है, लेकिन हो सकता है वहां आमतौर पर दो चोटियों के कुछ ओवरलैप । इसलिए, जो भागों को इकट्ठा करने के लिए, और पूल ध्यान में रखा जाना चाहिए ताकि monosome के उच्चतम अनुपात, या वैकल्पिक रूप से बड़ी उपइकाई, नमूने में सुनिश्चित करने के लिए । उच्च संकल्प क्रायो के लिए EM अध्ययन, दो mitoribosomal आबादी के बीच जुदाई बिल्कुल आवश्यक नहीं है ( silico आपरेशनों में अतिरिक्त के कारण) । हालांकि, अगर बेहतर जुदाई आवश्यक है, यह बड़ा ट्यूबों और इसी रनिंग टाइंस का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।

Figure 1
चित्रा 1 : एक सुक्रोज ढाल पर mitochondria की शुद्धि । एक 2 एल शुरू संस्कृति से सेलुलर organelles अंतर केंद्रापसारक के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित की एक श्रृंखला के माध्यम से fractionated थे, और mitochondria एक सतत सुक्रोज ढाल पर अलग किया गया । शुद्ध mitochondria 32%/60% अंतरफलक पर कम बैंड में पाए जाते हैं ।

Figure 2
चित्रा 2 : एक सुक्रोज तकिया पर mitoribosomes की शुद्धि । एक 2 एल शुरू संस्कृति से क्रूड mitoribosomes 1 मीटर सुक्रोज तकिया के माध्यम से तलछट हैं । छर्रों एक डिटर्जेंट मुक्त बफर में resuspend कर रहे हैं, और mitoribosomes प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में दो केंद्रापसारक द्वारा स्पष्ट कर रहे हैं । अवशोषण की तैयारी की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए दर्ज की गई है और ठेठ एक२६०/एक२८० अनुपात ~ १.३ (सही पैनल) certifies एक mitoribosome अमीर अंश । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : एक सुक्रोज ढाल पर mitoribosomes के ठीक शुद्धिकरण । एक 2 एल शुरू संस्कृति से अवशोषित ट्रेस । अंशों को शीर्ष से ग्रैडिएंट के नीचे तक क्रमांकित कर रहे हैं । दो प्रमुख mitoribosomal आबादी की पहचान कर रहे हैं: बड़ी उपइकाई (पीक 1) और monosome 55S (पीक 2) । आबादी के बीच अनुपात बदल सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : इलेक्ट्रॉन micrograph, 2d कक्षाएं, और 3 डी पुनर्निर्माण । बायां पैनल: monosome पीक 2 से १.२३ a/पिक्सेल के एक नपे आवर्धन पर नमूने के साथ एक micrograph । मध्य पैनल: एक प्रतिनिधि के बाद प्रसंस्करण डेटा (2d वर्गों) बरकरार monosomes खुलासा । दायां पैनल: 3d पुनर्निर्माण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

शुरू सामग्री के स्रोत के बारे में, हालांकि mitochondria के एक अमीर स्रोत होने के लिए जाना जाता है कि पशु ऊतकों की अपेक्षाकृत आसान उपलब्धता, यह mitoribosomes3,5,12के लिए एक लोकप्रिय विकल्प बनाता है, 13, वे आनुवंशिक रूप से संशोधित नहीं किया जा सकता है और आसानी से प्रयोगशाला में reproduced । इसलिए, वहां homogeneously संस्कृति मानव कोशिका लाइनों को शामिल प्रोटोकॉल के विकास के लिए एक स्पष्ट व्यावहारिक जरूरत है । ऊतकों और प्रसंस्कृत कोशिकाओं के साथ काम प्रोटोकॉल के बीच प्रमुख अंतर lysis और homogenization की विधा है । एक monolayer के रूप में उगाई गई संस्कृति कोशिकाओं के लिए, एक ठेठ विधि Teflon/ग्लास dounce homogenization14है । मूल तैयारी प्रोटोकॉल जबकि कुशल छोटे तराजू15के लिए विकसित किया गया । एक सीधे ५०० मिलीलीटर की क्षमता के साथ एक homogenizer रोजगार स्केलिंग संभव11है, तथापि, यह ~ मैनुअल श्रम के 2 एच ८०% lysis को प्राप्त करने की आवश्यकता है । इस organelles के कारण लंबे समय से प्रतीक्षा कर रहा है, गैर सजातीय lysis भारी सामग्री के लिए एक बड़े पोत के नीचे डूब, एकाधिक स्ट्रोक की आवश्यकता के कारण नमूना के हीटिंग के लिए कम तीन मुद्दों: का एकीकरण शुरू की । इसलिए, lysis का एक बेहतर तरीका नाइट्रोजन cavitation, जो एक दबाव पोत16,17से संपीड़न पर आधारित है का उपयोग करता है । इस विधि में, कोशिकाओं को पहले ठंड कमरे में फूल रहे है ताकि कोशिकाओं को नरम और उंहें और अधिक lysis के लिए अतिसंवेदनशील बनाने के लिए । के रूप में वे नाइट्रोजन cavitation डिवाइस में रखा जाता है एक बफर सुक्रोज युक्त और mannitol क्रम में एक आसमाटिक दबाव है कि mitochondria बरकरार रखने में मदद मिलेगी बनाए रखने के लिए जोड़ा गया है । नाइट्रोजन cavitation डिवाइस तो ऑक्सीजन मुक्त नाइट्रोजन की एक बड़ी मात्रा है, जो कोशिकाओं में घुल के साथ दबाव है । के रूप में दबाव जारी किया है नाइट्रोजन कोशिका झिल्ली के rupturing में जिसके परिणामस्वरूप समाधान से बाहर बुलबुले । इस विधि के रूप में कतरनी तनाव और घर्षण शामिल यांत्रिक अनुमन्य तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है: 1) कोशिकाओं पर किसी भी बाह्य शारीरिक तनाव से बचा जाता है; 2) एक adiabatic विस्तार है कि नमूना ठंडा, organelles को कोई गर्मी नुकसान सुनिश्चित करता है; 3) सेल घटकों निष्क्रिय नाइट्रोजन गैस से ऑक्सीकरण से सुरक्षित हैं; 4) सस्पैंड माध्यम का कोई पीएच परिवर्तन; 5) प्रक्रिया वर्दी और reproducible है क्योंकि एक ही विघटनकारी बलों प्रत्येक कोशिका के भीतर और नमूने भर में लागू कर रहे हैं; 6) प्रक्रिया तेज है और 20-30 मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है ।

प्रसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतकों से mitochondria का अलगाव साहित्य में बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है, और यह एक सज्जन कोशिका व्यवधान पर आधारित है अंतर केंद्रापसारक की एक श्रृंखला के बाद । वर्तमान में प्रयुक्त प्रोटोकॉल के अधिकांश पिछली सदी के मध्य में विकसित मूल प्रक्रियाओं का पालन करें18. जहाँ आधारभूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण सही हैं, वहाँ अनेक भ्रांतियां हैं जो साहित्य में उजागर हुई हैं और न पाई गई हैं. mitoribosomes के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए, हम व्यवस्थित सामांय सिद्धांतों की जांच की और निष्कर्ष है कि: 1 मिलीग्राम का समावेश)2 + और+ बफर में कश्मीर महत्वपूर्ण नहीं है । यह तर्क दिया गया है कि KCl एक जेल19बनाने से cytoplasmic प्रोटीन को रोकने में मदद करता है, तथापि, एक पर्याप्त कमजोर पड़ने के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित प्रदान की, इस घटना नहीं होती है । इसके अलावा, 2 मिलीग्राम का बहिष्करण+ cytoplasmic ribosomes20द्वारा संदूषणों को कम करने के लिए उपयोगी है; 2) hypo-आसमाटिक वातावरण से जारी organelles की रक्षा के लिए मध्यम करने के लिए कोशिकाओं की अधिकतम संभव मात्रा अनुपात रखने की कोई जरूरत नहीं है. हमारे प्रोटोकॉल में आसमाटिक समर्थन पर्याप्त रूप से सुक्रोज-युक्त बफ़र्स द्वारा प्रदान किया गया है, और mitochondria आइसोलेशन बफ़र के साथ कक्षों की कमजोर पड़ने (चरण 2. II .5) बड़े पैमाने पर तैयारी में organelles की कुशल जुदाई के लिए महत्वपूर्ण है ।

mitochondria अलगाव बफर का पीएच शारीरिक मूल्यों, अर्थात् ७.५, जो भी निंनलिखित mitoribosome तैयारी के लिए इष्टतम पीएच है के करीब है । बंधन एजेंटों EDTA और EGTA अलगाव मीडिया के लिए जोड़ रहे है chelate को दूषित आयनों, और वे मुक्त मैग्नीशियम और कैल्शियम, क्रमशः chelate । यह चर्चा है कि EDTA के शामिल किए जाने के भीतरी mitochondrial झिल्ली14की क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इसलिए एकाग्रता 1 मिमी करने के लिए एक एहतियात के रूप में सीमित है । हम कोई अंतर नहीं देखा है जब सुक्रोज घनत्व ढाल के अंतिम शोधन कदम में 5 mM EDTA का उपयोग कर ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल mitoribosome के शुद्धिकरण के लिए HEK293S-व्युत्पन्न मानव कोशिकाओं का उपयोग करता है । तैयारी की गुणवत्ता प्राप्त नमूना जैव रासायनिक और संरचनात्मक रूप से परमाणु संकल्प की जांच करने के लिए अनुमति देता है । यह एक मानव mitoribosomal अनुवाद परिसरों, गुणवत्ता नियंत्रण विधानसभाओं, और mitoribosomal उपइकाईयों मध्यवर्ती करने के लिए विधि लागू करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, के बाद से कैंसर की कोशिकाओं OXPHOS क्षमता और ऊंचा mitochondrial प्रोटीन अनुवाद आसंन stromal ऊतक21के साथ की तुलना में परिलक्षित किया है, mitoribosomes22कैंसर के लिए दवा लक्ष्य स्थापित कर रहे हैं । इसलिए, अवरोधकों की उपस्थिति में mitoribosomes के विशिष्ट शुद्धिकरण के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग चिकित्सा अनुप्रयोगों होगा । इसके अलावा, mitoribosomal उत्परिवर्तनों वंशानुगत mitochondrial रोगों23से जोड़ा गया है । चूंकि इन उत्परिवर्तनों संरचना पर प्रत्यक्ष प्रभाव है, यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण उनके संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी हो जाएगा । प्रोटोकॉल का विस्तार किया जा सकता है और मानव mitochondria और उसके चिकित्सा के महत्व में अनुवाद की मौलिक समझ से निपटने के वैज्ञानिक सवालों की एक किस्म के लिए लागू होता है ।

Disclosures

कोई

Acknowledgments

इस काम के लिए स्वीडिश फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था सामरिक अनुसंधान (भावी नेताओं अनुदान FFL15:0325), राग् Söderberg फाउंडेशन (चिकित्सा M44 में फैलोशिप/स्वीडिश अनुसंधान परिषद (शुरू अनुदान NT × 2015-04107), FEBS दीर्घकालिक फैलोशिप (एसए) , H2020-MSCA-ITN-२०१६ परियोजना ७२१७५७ (बनाम) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate Thermo Scientific 31966-021
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific 16000-044
Blasticidin S HCl Thermo Scientific R210-01
Zeocin selection reagent Thermo Scientific R25001 100 mg/ml
Freestyle 293 Expression medium Thermo Scientific 12338026
T175 tissue culture flask with vented cap Sarstedt 83.3912.002
Shaker flasks with vented cap Thermo Scientific 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800
250 ml conical bottle tubes, sterile Corning 430776
Eve automated cell counter NanoEnTek E1000
Nitrogen cavitation cell disruption vessel Parr Instruments 4635, 4639 safety volume: 40ml, 600ml respectively
Dnase (RNA-free) HT Biotechnology N401a
Teflon/glass dounce homogenizers Cambridge Glassblowing Limited Size designed upon request
SW40 tubes for mitochondria gradient Beckman 344060 Polypropylene, thin wall
Transfer pipettes Sarstedt 86.1171
TLA 120.2 tubes for cushion Beckman 343778 Polycarbonate, thick wall
TLS-55 tubes for gradient Beckman 347356 Ultra-clear
Gradient Station IP BioComp 153-002

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References

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जैव रसायन अंक १४० Mitochondria अनुवाद ribosome क्रायो-EM प्रोटीन संश्लेषण जैव रसायन
HEK कोशिकाओं से Mitoribosome का तेजी से अलगाव
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Aibara, S., Andréll, J., Singh, … More

Aibara, S., Andréll, J., Singh, V., Amunts, A. Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells. J. Vis. Exp. (140), e57877, doi:10.3791/57877 (2018).

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