Summary
Protokollen præsenteret her tillader reproduktion af en udbredt grå stof demyelination af begge kortikale halvkugler i voksne mandlige Dark Agouti rotter. Metoden består af intracerebral implantation af et kateter, subklinisk immunisering mod myelin oligodendrocyt glycoprotein og intracerebral injektion af en proinflammatorisk cytokinblanding gennem det implanterede kateter.
Abstract
Multipel sklerose (MS) er den mest almindelige immunmedierede sygdom i centralnervesystemet (CNS) og fører gradvist til fysisk handicap og død, forårsaget af hvide stoflæsioner i rygmarven og lillehjernen samt ved afmyelinering i gråt stof. Mens konventionelle modeller af eksperimentel allergisk encephalomyelitis er egnede til undersøgelse af cellemedieret betændelse i spinal og cerebellar hvidt stof, undlader de at adressere grå stofpatologier. Her præsenterer vi forsøgsprotokollen for en ny rottemodel af kortikal demyelinering, der gør det muligt at undersøge de patologiske og molekylære mekanismer, der fører til kortikale læsioner. Afmyelinationen fremkaldes af en immunisering med lavdosis myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG) i en ufuldstændig Freunds adjuvans efterfulgt af et kateter-medieret intracerebral levering af proinflammatoriske cytokiner. Kateteret muliggør desuden flere runder af demyelination uden at forårsage injektionsinduceret traume samt intracerebral levering af potentielle terapeutiske lægemidler, der gennemgår en præklinisk undersøgelse. Metoden er også etisk gunstig som dyrs smerte og angst eller handicap er kontrolleret og relativt minimal. Den forventede tidsramme for gennemførelsen af hele protokollen er omkring 8 - 10 uger.
Introduction
MS er en immunmedieret, inflammatorisk sygdom i CNS, som primært skader myelinplader, men i sidste ende fører til axonal tab og permanent neuronal skade. MS er den mest almindelige immunmedierede sygdom i CNS med en anslået prævalens på omkring 2,3 millioner mennesker på verdensplan, ifølge National MS Society1, og udgør en stor personlig og socioøkonomisk byrde. Den gennemsnitlige alder af sygdommen debut er 30 år og fører til tab af produktive år ved at forårsage alvorlige handicap. MS er i øjeblikket uhelbredelig, og de nuværende behandlingsmetoder har til formål at håndtere symptomerne under et akut tilbagefald i relapserende remitterende MS og at ændre sygdomsforløbet for at reducere tilbagefaldsfrekvensen ved immunmodulatorisk behandling2,3. Ingen behandlingsmulighed har endnu vist sig effektiv for de progressive type4, med undtagelse af et nyligt klinisk forsøg med B-celle nedbrydende behandling, som viste sig at være effektiv i en undergruppe af primære progressive MS (PPMS) patienter med aktivinflammation 5. Selv om der er identificeret flere potentielle genetiske6- og miljørisikofaktorer7, er MS's ætiologi dog stadig ukendt.
MS er kendetegnet ved store inflammatoriske demyelinerende plaques i, og diffuse skader på det hvide stof8,9. Focal læsioner har været forbundet med en omfattende T-celle medieret angreb, oligodendrocyt ødelæggelse, reaktiv astrogliose, og axonal degeneration, der fører til en motor neuron tilbagegang. Grå stof afmyelination og atrofi har fået anerkendelse som yderligere histopatologiske træk ved sygdommen9,10,11. Sidstnævnte er blevet foreslået at bidrage til den neurologiske dysfunktion og kognitiv tilbagegang hos patienter12,13. Der er skelnet mellem tre mønstre af kortikal demyelination, nemlig i) leukocortical, sammenhængende med de hvide stoflæsioner (34%), ii) små, perivaskulære (16%) og iii) subpial (50%). I modsætning til fokale hvide stoflæsioner er disse grå stoflæsioner blevet rapporteret at mangle et T-celle medieret angreb og er i stedet karakteriseret ved en forbedret mikroglial aktivering, apoptose og neuronalt tab12.
Hidtil har det ikke været muligt at sammenfatte humane MS i en enkelt dyremodel, hovedsagelig på grund af sygdommens kompleksitet. En række MS dyremodeller, der hver simulerer forskellige aspekter af sygdompatogenese og progression, er i stedet blevet udviklet14,15. Nuværende dyremodeller efterligner tre forskellige sygdomsprocesser: i) fokale inflammatoriske læsioner, ii) diffus skade på hvidt stof og iii) diffus patologi af gråt stof.
Dyreforsøg af MS hvide stof plaques er for det meste blevet udført i gnaver encephalomyelitis (EAE) modeller. Forsøgsdyr er aktivt immuniseret med en emulsion, der indeholder en myelin antigen [normalt myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG)16,17, myelin grundlæggende protein (MBP)18, eller proteolipid protein (PLP)19], sammen med en komplet Freund's adjuvans (CFA)20. Sygdommen kan også passivt induceres ved en adoptivoverførsel af myelinspecifikke T-celler21. Sygdomsforløbet afhænger af den kombination af antigen/musestamme, der anvendes. MOG35-55 i C57BL/6, for eksempel, resulterer i en monofasisk kronisk sygdom22, mens PLP139-151 i schweiziske Jim Lambert (SJL) mus fører til et tilbagefald-remitterende sygdomsforløb23 på en kønsspecifik måde24. Rotte MOG35-55, yderligere,fremkalder en encephalitogen T-celle respons, mens human MOG35-55 inducerer B-celle-afhængig inflammation i C57BL/6 mus25. Forskellige EAE-modeller giver et fremragende værktøj til at studere cellemedieret betændelse primært i rygmarven og cerebellum, men forhjernstrukturer som cortex, corpus callosum og subkortikale strukturer forbliver stort set skånet26. Hverken diffus skade på hvidt stof eller afmysorering af gråt stof er desuden tilstrækkeligt gentaget i EAE-modellerne26,27. Kortikal afmyelinering i forbindelse med aktiv EAE-induktion er blevet rapporteret i marmosets28,29 og i visse Lewis rotteunderstammer, i sidstnævnte tilfælde tilskrives de fremherskende kombinationer af MHC-klasse I og klasse II-isotyper og alleler30.
Den cuprizone model31 er et nyttigt redskab til at studere diffust hvidt stof demyelination og grå stof patologi med en omfattende demyelination af kortikale, sub-kortikale32, og hippocampal33 regioner, samt corpus callosum34 og kaudale putamen35. Cuprizone forgiftning, som i princippet resulterer i metabolisk stress-induceret apoptose af oligodendrocytter, efterligner nogle egenskaber ved kortikale demyelinerende læsioner af MS hjerner såsom en mikroglia aktivering, astrogliose, og en relativ mangel på infiltrere perifere immunceller. Manglen på neuronal apoptose og thalamic atrofi, samt den komplette opløsning af demyelination med en robust remyelination observeret ved ophør af kosten cuprizone tilskud32, dog begrænse cuprizone forgiftning brug som en præklinisk MS model. Giftig afmyelinering kan også fremkaldes ved en fokal injektion af lysolecithin eller ethidiumbromid i de hvide stofkanaler36,37, men disse metoder anvendes sjældent. Giftige demyelinationsmodeller er særligt velegnede til analyse af de komplekse remyelinationsmekanismer, såsom kravet om oligodendrocyt stamceller og astrocytter38,39. Detaljerede oplysninger om EAE og forgiftningsmodeller findes i to nylige gennemgange15,40.
Den cytokin-inducerede demyelination blev oprindeligt udviklet til at studere spinal hvide stoflæsioner i EAE41. Senere blev det modificeret til at studere kortikale grå stof patologier i MS. Dark Agouti (DA) eller Lewis rotter er først primet af en sub-klinisk immunisering med MOG1-12542,43 eller MOG1-11644 i en ufuldstændig Freund's adjuvans (IFA). I modsætning til klassiske EAE-modeller udviser disse primede dyr ikke kliniske symptomer på fokale inflammatoriske læsioner i rygmarven. I stedet opnås en inflammatorisk respons og demyelination i hjernen efterfølgende ved en intracerebral administration af en proinflammatorisk cytokinblanding [tumornekrosefaktor alpha (TNFα) og interferon gamma (IFNγ)], når dyrene har opnået en stabil titer af anti-MOG antistoffer i blodet.
Undersøgelser af Merkler et al. 42 og Gardner m.fl. 44 har bevist effekten af en subpiel kortikal demyelinationsinduktion ved hjælp af en subklinisk MOG-immunisering og en intracerebral eller subarachnoidal cytokininindsprøjtning. Den rapporterede varighed af afmyelineringen var imidlertid for kort en fuldstændig remyelination i 14 dage eller mindre, hvilket begrænsede vinduet for enhver farmakologisk intervention test. Begge modeller, desuden udnytte en traumatisk injektion modus, som i sig selv kan forårsage en injektion traumer og en blod-hjerne barriere (BBB) sammenbrud og dermed føre til en ukontrolleret rekruttering af inflammatoriske celler i parenchyma. Begge undersøgelser viste desuden afmyelination, der er begrænset til et begrænset område, i ipsilateral cortex eller i nærheden af stedet for cytokininjektionen.
For at overvinde disse begrænsninger implanterede vi et kateter i højre parietal cortex af DA rotter, med kateterspidsen placeret lige over corpus callosum. For at muliggøre en fuld genopretning af BBB-integriteten fik dyrene en hvileperiode på 2 uger efter kateterets implantation. Derefter blev rotterne sub-klinisk immuniseret med 5 μg rekombinant MOG1-125 i IFA. Efter opnåelsen af en stabil anti-MOG antistoftitre efter ca. 4 uger blev 2 μL cytokinblanding injiceret via kateteret inden for 10 minutter ved hjælp af en programmerbar sprøjtepumpe. Denne procedure fremkaldte en udbredt kortikal demyelination af både ipsi- og kontralaterale hjernehalvdele på 15 dage med en delvis remyelinering omkring 30 dage efter cytokinindsprøjtningen43. Flere demyelinationsfaser kunne desuden fremkaldes ved gentagen indgift af proinflammatoriske cytokiner gennem kateteret, og global hjerneatrofi, et fælles træk ved progressive MS-undertyper45, kunne induceres så tidligt som efter den anden demyelinationsfase43. Det er vigtigt, at det implanterede kateter også kan bruges til at teste farmakologiske indgreb.
Nedenstående protokol giver en detaljeret forklaring af de eksperimentelle trin for en reproducerbar generation af udbredt kortikal demyelination på begge hjernehalvdele af DA-rotter ved hjælp af et intracerebralkateter.
Protocol
Alle de her beskrevne metoder er blevet godkendt af de lokale myndigheder (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (det østrigske ministerium for videnskab og forskning); Licensnummer: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). De voksne da-rotter (10 - 12 uger) havde til huse i en 12/12 timers lys/mørk cyklus med fri adgang til mad og vand.
1. Materialeforberedelse
BEMÆRK: Operationen udføres under aseptiske forhold. Før du starter, skal du sørge for, at alle kirurgiske instrumenter, herunder boret, rengøres med et passende desinfektionsmiddel.
- Der fremstilles en bedøvelsesblanding: 0,02 mg fentanyl, 0,4 mg/mL midazolam og 0,2 mg/mL med medetomidin (endelige koncentrationer i blandingen).
BEMÆRK: Se det respektive diskussionsafsnit for alternativ bedøvelse. - Der fremstilles en modgiftsblanding: 0,07 mg flumazenil og 0,42 mg atipamezol (endelige koncentrationer i blandingen).
- Saml kateteret og kateterhætten med indløbet og skruen. Kateteret skæres op til 2 mm med skalpel (Figur 1).
BEMÆRK: Brug ikke en saks til dette, da de klemmer og forvrænger kateterets cirkulære tværsnitsform.
2. Kirurgisk forberedelse
- Bedøve rotten ved en intraperitoneal (i.p.) administration af bedøvelsesblandingen (1,5 mL/kg legemsvægt).
- Barber rottens hoved mellem ørerne ved hjælp af den elektriske barbermaskine. Placer et homeothermic tæppe på den stereotaktiske ramme, før du placerer dyret, for at undgå hypotermi under hele operationen.
- Immobiliser rottens hoved i den stereotaktiske ramme ved hjælp af ørestængerne og bidepladen, hvilket sikrer, at hovedet er vandret og stabilt. Kontroller stabiliteten ved at trykke på kraniet med finger eller pincet.
BEMÆRK: En løs fiksering og ikke-vandret placering i den stereotaktiske ramme kan forårsage en afvigelse fra de påtænkte koordinater. - Påfør smørende øjendråber for at forhindre hornhinde tørhed under operationen. Dæk øjnene med et uigennemsigtigt materiale for at forhindre kirurgisk lyseksponering.
- Rengør det barberede område ved at skifte anvendelse af 70% ethanol og 10% povidone-jod kompleks.
BEMÆRK: Følg alle forholdsregler under operationen for at undgå infektion. Operationen udføres under aseptiske tilstande. Hvis asepsis brydes, skal det forurenede materiale udskiftes.
3. Kateterimplantation
- Lav et langsgående snit på ca. 2 cm længde midt i hovedhuden. Brug bulldog klemmer til at holde huden ud til siderne. Du kan finde en oversigt over disse trin i Figur 2.
- Fjern blodet ved hjælp af en bomuldsspidset applikator.
- Fjern kraniet periosteum. Rengør vævet med bomuld-tip applikatoren og eksponere kraniet knoglen. Lad kraniet tørre i ca. 1 minut.
- Identificer de anatomiske vartegn, Lambda, Bregma og mediale sutur. Når boret er installeret på den stereotaktiske ramme, skal borespidsen placeres ved Bregma som udgangspunkt. Flyt 2 mm posterior fra Bregma og flytte ~ 2,4 mm sideværts til mediale sutur.
- Bor et hul med en diameter på 0,5 mm til kateteret på denne position. Pust forsigtigt alt knoglestøv væk.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at dura mater forbliver intakt under boringen. For at sikre dette, 1) bruge en boremaskine, der kan installeres på stereotaktisk ramme, 2) inspicere hullet ofte under boringen, og 3) bore ned i små trin, hvis for meget tryk påføres kraniet, vil boret spidsen fortsætte ind, og beskadige hjernen, når kraniet er fuldt trængt. - Bor yderligere 3 huller (~1,3 mm i diameter) til ankerskruerne et par millimeter væk fra det første hul. Blæs forsigtigt knoglestøv væk.
BEMÆRK: Vælg ankerskrueplaceringer, der giver tilstrækkelig plads til kateterets top (~2 mm i diameter) og ankerskruetoppene (~1 mm). - Fjern knoglestøvet ved at vande med ca. 1- 2 mL steril fosfatbufferet saltvand (PBS) eller fysiologisk saltvand ved hjælp af en sprøjte. Gør kraniet rent. Stram ankerskruerne med 2 - 3 hele sving.
BEMÆRK: Ankerskruerne er nødvendige for at stabilisere opsætningen ved at holde tandcementen og dermed kateteret på plads. Når du strammer en ankerskrue, skal du sørge for, at den ikke let kan fjernes ved forsigtigt at løfte den opad med tang. Da implantationen af kateteret selv forårsager vævstraumer, vil yderligere duraskade, mens du borer efter eller strammer ankerskruerne, føre til flere traumatiske skader og muligvis hæmme sammenligneligheden inden for en gruppe. Stram først ankerskruerne, og sæt kateteret sidst ind. - Sæt det 2 mm lange kateter gennem det første hul vinkelret på kraniets overflade. Mens du stadig holder kateteret i, anvende lidt dental cement og lad det polymerisere med en kort (~ 5 s) eksponering for dental hærdning lys til at stabilisere kateteret, så brugen af begge hænder i næste trin.
ADVARSEL: Når du arbejder med et dentalhærdningslys, skal du undgå at se direkte på spidsen eller på det lys, der reflekteres fra applikationsområdet, da den høje intensitet af dette lys kan forårsage nethindeskader. Brug passende beskyttelsesbriller. - Påfør mere dental cement omkring kateteret, forankre skruerne, og størkne dental cement med dental hærdning lys (~ 15 - 30 s). Bekræft hærdningen af cementen med spidsen af en pincet.
4. Lukning af såret og antagonisering af anæstesi
- Luk hovedhuden med genorbable suturer, forreste og bageste til kateteret.
BEMÆRK: Da der vil være en ujævn set-up over kraniet i slutningen af implantationen, gøre såret lukning i overensstemmelse hermed. At løfte huden for meget vil resultere i ubehag for dyret. - Modgiftsblandingen injiceres subkutant (1,5 mL/kg kropsvægt) med en 1 mL sprøjte med en 26 G nål.
- Enrofloxacin (2,5%) gives ved subkutan injektion (7,5 mg/kg legemsvægt) til profylaktisk antibiotikabehandling. Carprofen (1 mg/mL; 5 mg/kg legemsvægt) og buprenorphin (1,2 mg/kg) gives for smertelindring ved subkutan injektion.
5. Postoperativ pleje og medicin
- Returner dyret til det modificerede bur og hold det under observation i 1 - 3 timer med en anvendelse af infrarødt lys for at undgå hypotermi. Konstant observere og flytte dyret hvert 5. til 10. minut, indtil det er postoperativt opsving. Vær særlig omhyggelig med at undgå konstant lyseksponering for øjnene indtil genopretning.
- Der gentages enrofloxacin (7,5 mg/kg legemsvægt) og karprofen (1 mg/mL; 5 mg/kg legemsvægt) ved subkutane injektioner dagen efter operationen. Buprenorphin er ikke nødvendig for at blive opdateret, da den tidligere behandling er effektiv i 72 timer.
6. Forberedelse af immuniseringsblanding (tidligst 14 dage efter kateterimplantation)
Bemærk: Placer sprøjterne på is under tilberedningsproceduren.
- Tilslut to 10 mL Luer lås tip glas sprøjter til de korte arme af en 3-vejs stophane og lukke den tredje stikkontakt med den lange arm.
- Sørg for, at tilslutningerne er sikre og utætte: Der tilsættes ca. 4 mL steril PBS til den åbne sprøjte, mens stemplet holdes 2. Sæt stempel 1 ind, og skub begge stempler frem og tilbage, mens du kontrollerer for lækage. Hvis der ikke sker lækage, skal pbs kasseres og stempel 1 fjernes igen.
- 1 mL IFA og 50 μg rMOG1-125 sammen, og blandingen justeres til et slutvolumen på 2 mL med steril PBS (pH 7.4) i et egnet rør.
BEMÆRK: På grund af tab af emulsion på sprøjtespidserne eller væggene under præparatet skal der forberedes et større volumen end beregnet til administrationen. Det er ligeledes mere praktisk at forberede sig på mere end 1 dyr på én gang. - Den fortyndede IFA- og rMOG1-125-blanding anbringes i den åbne sprøjte. Stemplet indsættes forsigtigt, samtidig med at der opretholdes et løst tryk på det modsatte stempel (Figur 3A).
- Inoculumet emulgeres ved at køre det fra den ene sprøjte til den anden ved at skubbe stemplerne frem og tilbage, indtil den er hvid og tyktflydende (Figur 3B).
- Fastgør en 1 mL Luer-låsesprøjte til den åbne korte arm af 3-vejs stophanen, og fyld den med inoculum (Figur 3C). Alle inoculum distribueres til 1 mL sprøjter. Hold den på is indtil injektionen. Administrationen af blandingen på dagen for præparatet.
7. Immunisering
- Bedøve rotten med isofluoran i et kammer (~2 min, blandet med ilt 2 L/min) og derefter opretholde anæstesi gennem en maske (blandet med ilt 1,5 L/min).
- Der injiceres 200 μL inoculum subkutant ved halebasen med en 21 G nål.
BEMÆRK: Injektionen skal gives langsomt, da opløsningen er tyktflydende.
8. Bestemmelse af antistoftitler
- Træk ~200 μL blod tilbage 4 uger efter immuniseringen for at bestemme anti-MOG antistoftitlerne.
- Brøndene på en 96-brøndsplade belægges med MOG (5 μg/mL i PBS) og inkuberes i 1 time ved 37 °C.
- Bloker pladen med 1% kvæg serum albumin (BSA) i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Pladen inkuberes med rotteserum (1:50), og den skal standarderes i 2 timer ved 37 °C. Pladen vaskes 3x med 200 μL PBS/Polysorbat 20.
- Inkubere pladen med peberrod peroxidase-konjugeret anti-rotte IgG sekundære antistof (1:10,000). Pladen vaskes 3x med 200 μL PBS/Polysorbat 20.
- Der tilsættes 100 μL peroxidase substratopløsning pr. brønd og inkuberes i 20 - 30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Den optiske massefylde måles ved en bølgelængde på 405 nm, og antistoftitlen beregnes ud fra den optiske massefylde ved hjælp af en standardkurve.
9. Intracerebral cytokin injektion
- Længden af stikbeholderen (2 mm) justeres. (Se figur 4 for forberedelsestrinnene).
- Fyld en 1 mL sprøjte med cytokinblandingen (500 ng/μL TNF-alpha, 300 U/μL rekombinant rotte IFN-gamma i steril PBS). Tilslut sprøjten til en stikbeholder. Fyld kanylen med cytokinblandingen. Undgå bobler.
- Sprøjten monteres på den programmerbare sprøjtepumpe, og den skal indsprøjtes 0,2 μL/min. (figur 5A). Start pumpen og holde det i orden for at undgå en luftboble dannelse på spidsen af kanylen.
BEMÆRK: Injektionshastigheden skal tage hensyn til den indvendige diameter af den specifikke sprøjte, der anvendes. derved skal sprøjtediameteren registreres under opsættet pumpe. - Bedøve rotten med isoflurane i et kammer (~ 2 min, blandet med 2 L/min ilt) og derefter opretholde anæstesi gennem en maske (blandet med 1,5 L/min ilt) (Figur 5B og 5C). Påfør smørende øjendråber, da dyret vil blive bedøvet i mindst 30 minutter.
- Fjern kateterets hætte med indløbet. Sæt stikkantaen i kateteret, og skru og stram den(Figur 5D og 5E).
BEMÆRK: Det må ikke overspændes, da det vil ødelægge kateterets øverste spids. - Injektionen skal fortsætte i 10 minutter (det samlede injektionsvolumen er 2 μL). Stop pumpen. Lad kanylen inde i kateteret i 20 minutter, så den injicerede volumen kan spredes helt.
- Skru stikbeholderen af, og fjern den langsomt for at undgå en vakuumeffekt.
- Fastgør kateterets hætte igen med indløbet, og skru det. Lad dyret komme sig efter anæstesi i et bur.
Representative Results
Kortikal afmyelination kunne vurderes på forskellige tidspunkter efter en cytokinindsprøjtning ved immunohistochemistry for proteolipid protein (PLP) (Figur 6). Figur 6A viser intakt PLP immunoreaktivitet på dag 15 i et MOG-immuniseret kontroldyr, der kun modtog steril PBS gennem det implanterede kateter. På dag 1 efter cytokinindsprøjtningen kunne afmyelinering allerede påvises hos MOG-primede dyr, om end kun i nærheden af det katetrede område (figur 6B). PLP immunoreaktivitet forbliver intakt i den kontralaterale cortex 1-dages post-cytokin injektion. På dag 3 kunne der observeres en gradvis stigning i tabet af PLP-immunoreaktiviteten, som spredes i ipsilateral cortex (Figur 6C). Kontralateral kortikal demyelinering kan også påvises på dag 3(Figur 6D), men den er ret begrænset til området under ankerskruerne, muligvis på grund af et lavstrømsområde med interstitiel væske forårsaget af ankerskruerne43. Fraværet af en lignende observation i de PBS-injicerede kontroldyr udelukker muligheden for traumeinduceret afmyelinering, der stammer fra ankerskruen.
Mellem dag 9 - 15 påvirker afmyelination store dele af cortex på begge halvkugler (Figur 6E, 6Fog 6G). Dette falder sammen med en observation af langsom adfærd, men uden et statistisk signifikant fald i motoriske færdigheder i en rotarod test43. Den kortikale demyelination opretholdes i op til 30 dage efter cytokinindsprøjtningen på begge halvkugler (Figur 6H og 6I) med kun en delvis remyelination. Figur 6J viser en kvantificering af PLP-tabet i det kortikale grå stof efter intracerebral cytokininindsprøjtningen. Det skal bemærkes, at PLP-immunoreaktivitet endnu ikke er blevet vurderet efter perioder på over 30 dage. dermed er den øjeblikkelige opløsning af remyelination, hvis der er nogen, endnu ikke vurderet ved yderligere eksperimenter. En anden indgift af cytokinblanding gennem det implanterede kateter 30 dage efter den første injektion resulterer i markant hjerneatrofi på dag 15 (Figur 7).
Figur 1: Forberedelse af kateteret ( A og B) Førerkantaen og attrapn kanylen (kateterhætte med indløb) samles og skrues. (C) Derefter skæres kateteret til 2 mm i størrelse ved hjælp af en skalpel. Den mikroskopiske observation viste, at brugen af saks til dette formål fordrejer kanylespidsens cirkulære form og dermed skal undgås. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kateterets implantation( A) Operationen starter med et langsgående snit og fjernelse af periosteum. (B, C) Dette panel viser, at kateterets sted er markeret med 2 mm bagdel fra Bregma og 2,4 mm sideværts til højre fra sagittal suturen. samt stederne til hullerne beregnet til de tre ankerskruer med passende afstand fra kateteret og Lambda. (D) Efter boring af kateterets hul (en diameter på 0,5 mm med rund borespids) og hullerne til ankerskruerne (1,3 mm i diameter med en snoet borespids) strammes ankerskruerne. (E, F) Derefter indsættes kateteret, og hele opsætningen stabiliseres med polymeriserende tandcement. (G) Såret er syet med to eller tre knob foran og bagest til kateteret. B = Bregma; L = Lambda; C = Kateter; S1, S2 og S3 = steder til hullerne til de tre ankerskruer. Skalalinjerne = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forberedelse af rMOG/IFA-emulsion. (A) Blandingen af rMOG, PBS og IFA emulgeres ved at trykke på inoculumet fra en sprøjte til en anden ved at skubbe stemplerne frem og tilbage (B), indtil det er hvidt og tyktflydende. (C) Derefter fordeles inoculumet til 1 mL sprøjter til injektionen. 5 μg rMOG anvendes i 200 μL PBS/IFA-blanding til subklinisk immunisering af en rotte På grund af tabene ved sprøjternes spidser og vægge under forberedelsen skal der dog fremstilles et større volumen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Forberedelse af stikbeholderen. (E) Det indre skæres i samme størrelse som guidebeholderen ved hjælp af en skalpel (F), og skabelonvejledningen skrues derefter af. (G) Den anden ende af stikbeholderen fastgøres til en 1 mL sprøjte, som indeholder injektionsblandingen, med en 20 G nål. Skalalinjerne = 3 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Intracerebral injektion. (A) En programmerbar sprøjtepumpe justeres for en injektionshastighed på 2 μL/min,og 1 mL sprøjten fyldt med cytokinblanding (eller steril PBS til styringen) monteres på pumpen. (B) Dyret bedøves først i kammeret ved hjælp af 5% isofluran med en iltstrøm på 2 L/min, og derefter (C) anæstesi opretholdes gennem masken ved hjælp af 2,5% isoflurane med en iltstrøm på 1,5 L/min. (D) Kateterhætten med indløbet (attrapnågen) skrues af, og injektionsbeholderen indsættes gennem det implanterede kateter. Da injektionens volumen er meget lille, bør investigator være forsigtig med at undgå luftbobler på spidsen af kanylen. Derfor er det vigtigt at starte indføringen, mens pumpen er i drift, og kun når der er en voksende væskeboble ved spidsen. Den ekstra volumen vil ikke gå ind i hjernen alligevel, da det nedbrydes på toppen af kateteret før indsættelsen. (E) Derefter strammes stikbeholderen, og pumpen er ladt i drift i 10 minutter. Efter 10 minutters injektion stoppes pumpen, og kanylen efterlades inde i 15 - 20 minutter for at give mulighed for diffusion af det injicerede volumen til interstitiel væske. Skalastængerne = 5 cm, medmindre andet er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: PLP immunoreaktivitet i koronar hjernesektioner. (A) Dette panel viser en kontrolhjerne (MOG-primet) med en PBS-injektion (dag 15), hvilket ikke resulterer i en kortikal demyelinering. (B) Allerede på dag 1 efter cytokinindsprøjtningen er afmyelination tydelig i kateteret. (C) Der observeres et bredere tab af PLP-immunoreaktivitet i ipsilateral cortex på dag 3, (D) samt på kontralateral side. Udbredt tab af PLP immunoreaktivitet observeres på begge halvkugler på dag 15, da(E)dette panel viser den ipsilaterale cortex og (F) dette panel viser den kontralaterale cortex. (G) Der gives et overblik over begge halvkugler, idet der vises et udbredt tab af PLP på dag 15. På dag 30, som (H) dette panel viser ipsilateral cortex og (I) dette panel viser for kontralaterale cortex, er der stadig bemærkelsesværdig demyelination, men også nogle remyelinated områder kunne observeres. (J) Dette panel viser kvantificeringen af afmyelineringen (PLP-tab i mm2/halvkugle). 1,5 - 2 μm koronar hjernesektioner blev brugt til PLP-detektion med MS anti-PLP med en fortyndingsfaktor på 1:500. Sektionerne blev modstællet med hematoxylin for cellekerner. Yderligere oplysninger om immunhistokemi findes i Ucal et al. 43. Panel G og J blev ændret fra Ucal et al. 43. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Hjerne atrofi efter anden cytokinindsprøjtning. (A) Dette panel viser en kontrolhjerne (MOG-primet) med en PBS-injektion (dag 15). (B) På dag 15 efter den første cytokininindsprøjtning fører en anden injektion til hjernesvind inden for 15 dage. 1,5 - 2 μm koronar hjernesektioner blev brugt til PLP-detektion med MS anti-PLP med en fortyndingsfaktor på 1:500. Sektionerne blev modstællet med hematoxylin for cellekerner. For detaljerede oplysninger om immunohistochemistry, se Blakemore37. Skalalinjerne = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Modificerede bure for at forhindre, at dyret fjerner kateteret. I standardburene er madholderpladsen på gitteret placeret tættere på burbunden, hvilket skaber et risikabelt smalt rum, der øger kateterets chance for at vikle sig ind i gitteret og derved dets fjernelse. For at undgå dette skal buret ændres. Dette smalle rum blev blokeret med et gennemsigtigt plan, der gjorde det muligt at overholde dyret. Maden skal gives inde i buret i disse modificerede bure. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vores metode bruger DA rotter. Tilpasningen til mus vil sandsynligvis kræve brug af et mindre kateter og skruer. Det skal også tages i betragtning, at sygdomsforløbet, den inflammatoriske reaktion og omfanget af afmyelinering kan afvige fra det, der præsenteres her, hvis der anvendes en anden art / stamme. Sådanne forskelle er blevet observeret med klassiske EAE-modeller ved hjælp af forskellige musstammer. MOG92-106 af rotteoprindelse resulterede f.eks. i primær progressiv eller sekundær progressiv EAE i A.SW-mus, mens det fremkaldte tilbagefalds-remitterende EAE i SJL/J-mus46. Dyr af samme stamme bør derfor anvendes. Der er også rapporteret om kønsforskelle i EAE-manifestationen i forskellige tidligere undersøgelser24. Forekomsten af sådanne kønsvirkninger kan meget vel forventes for den protokol, der er beskrevet her, men mangler at blive valideret i yderligere eksperimenter.
Intraperitoneal (IP) administration af en bedøvelsesblanding bestående af 0,02 mg fentanyl, 0,4 mg/mL midazolam og 0,2 mg/mL med medetomidin anvendes til kirurgisk indgreb. Voksne DA-rotter af hannen, der vejer 270 -300 g, kræver ca. 0,4 - 0,6 mL af denne blanding(dvs.~1,5 mL/kg) for at fremkalde en anæstesi, der varer 60 - 90 min. Efter operationen modarbejdes anæstesi ved en subkutan injektion af en modgift bestående af 0,07 mg/mL flumazenil og 0,42 mg/mL atipamezol i fysiologisk saltvand (0,9% NaCl). En dosis på 1 - 1,5 mL/kg modarbejder anæstesi inden for 5 min. Alternativt kan dyrene få lov til at vågne spontant op ved en fysiologisk vask ud af bedøvelsesmidlerne, men i så fald skal dyrene holdes under observation, indtil de er fuldt bevidste.
Andre anæstesi muligheder, der ofte anvendes til dyreoperationer, såsom en IP-injektion af ketamin og xylazin47 eller natrium pentobarbital48, eller en indånding af flygtige anæstesi som isofluoran49 og halothan50, kan også overvejes for operationen præsenteres her. Det er imidlertid afgørende at vælge et bedøvelsesmiddel, der ikke forstyrrer den eller de påtænkte downstream-interventioner.
Under immunisering og intracerebral cytokin injektion, 5% isoflurane anvendes til anæstesi. Den her beskrevne model blev etableret ved hjælp af rotter, og de anførte eksperimentelle detaljer gælder således specifikt for rotten. Kateteret implantation koordinater blev udvalgt til at muliggøre samtidig analyse af mulige hvide stof ændringer (kateteret spidsen i corpus callosum). Mens kateteret indsættelse site kan varieres med hensyn til anteroposterior og lateral position, udvælgelse af den centrale sulcus kræver undgåelse af skader på den overlegne sagittal sinus.
Et andet træk ved den beskrevne metode er den tilsvarende demyelinering af både ipsi- og kontralaterale halvkugler, eventuelt som følge af transporten af den injicerede cytokinblanding til det subarachnoide rum ved den fysiologiske strøm af interstitiel væske fra kortikale områder51. Injektionstilstanden og ikke kateterets placering forårsager derfor demyelination i hele hjernebarken, og valget af højre eller venstre parietal cortex bør derfor være uden betydning i denne henseende.
Protokollen bruger et 26 G kateter, som er lille nok til at undgå omfattende traumatisk skade og stor nok til at undgå en øget tilstopning af kateterets spids i løbet af eksperimentets lange forløb. Implantationen og tilstedeværelsen af kateteret selv forårsager ganske vist en astrocytisk og mikroglial aktivering, også hos de kontroldyr, der kun modtager kateterimplantationen; Dette er dog mindre sammenlignet med de cytokinin injicerede dyr. 43 For at undgå interferens med efterfølgende analyser brugte vi MR-kompatible katetre lavet af polyether-ether-keton (PEEK).
En lignende opsplitningsdybde skabes faktisk i både ipsi- og kontralaterale regioner med den præsenterede metode. Dette indebærer, at kateterets dybde/længde måske ikke spiller en større rolle i mønstret og omfanget af afmyelination i cortex. Derfor kan en ændring af kateterets længde overvejes for at reducere kateterets inducerede læsionsstørrelse. Ikke desto mindre kan en betydeligt kortere kateterlængde forårsage en lidt mindre udtalt kortikal demyelinering, mens et afgørende svar kun opnås ved forsøg, der specifikt tester for kateterets længde.
En fordel ved modellen er, at det implanterede kateter giver mulighed for testning af potentielle terapier, der administreres til cortex via kateteret for at tillade remyelinering ved eller efter toppen af histologisk påviselig kortikal demyelination (dag 15 eller senere), mens dette i en forbehandlingsindstilling ville være efter immuniseringen, men før cytokininjektionen. Beslutningen om tidsrammen for, hvornår terapeutiske midler skal administreres, vil derfor afhænge af det særlige forskningsspørgsmål og det stof, der er af interesse.
Efter kateterimplantation er det vigtigt at anbringe dyr enkelt i de modificerede (helst høje top) bure for at undgå fjernelse af kateter indtil undersøgelsens afslutning (figur 8). Dyr kan også skrue kateterhætten med indløbet, selvom dette sjældent sker. Dyrene skal observeres dagligt, og fjernede hætter bør udskiftes med friske, for at undgå kateterspidsblokering uden indløb og for at sikre en nøjagtig levering til parenchymaet efter intracerebral injektionen. Dyrene immuniseres tidligst 2 uger efter kateterets implantation for at muliggøre heling og lukning af blod-hjerne-barrieren.
Serum anti-MOG antistoftitler skal måles efter immuniseringen. Et dosisresponsforsøg viste, at 5 μg MOG1-125 (i IFA) gav tilstrækkelig immunisering inden for 4 uger hos voksne DA-rotter hos hanner. En titer på 5.000 μg/mL og derover ville være tilstrækkelig, men vil helt sikkert afhænge af flere faktorer, herunder MOG-præparatet og dyrestammen, og skal derfor bestemmes individuelt. Det er vigtigt at undgå for høje antigendoser, hvilket potentielt resulterer i en klassisk EAE-fænotype med lammede bagben allerede før cytokinindsprøjtningen.
Hvert dyr immuniseres med 5 μg rekombinant myelin oligodendrocyt glycoprotein (rMOG1-125)emulgeret i 200 μL af ufuldstændig Freunds Adjuvans (IFA). Da noget af emulsionen går tabt i sprøjten under forberedelsen, er det tilrådeligt at forberede mere end dette beløb for hvert dyr. Vi brugte rekombinant MOG (1-125 fra N-endestation af rotte MOG), som blev udtrykt i Escherichia coli og blev derefter renset for homogenitet ved chelatkromatografi, opløst i 6 M urea, og dialyzed mod PBS for at opnå et fysiologisk præparat52,53. Kommercielt tilgængelige MOG kan dog også anvendes.
Andre antigenpræparater, såsom MOG1-116, MOG35-55 eller PLP139-151, anvendes i forskellige EAE-modeller, og antigen- og dyrestammeforskelle er kendt for at fremkalde forskellige sygdomsphoenotyper i disse modeller20. Disse antigenpræparater blev ikke testet i DA-rotter, og hvis de anvendes frem for rMOG1-125, kan det fremkalde en sygdomsphoenotype eller histologi, der adskiller sig fra det, der præsenteres her.
En stikkantel af samme længde som kateteret fremstilles inden intracerebral injektionen. Dette kan gøres ved at samle det med et skabelonkateter og skære det i samme størrelse (2 mm i længden) (Figur 4). Det er vigtigt, at stikbeholderen er luftboblefri under cytokinindsprøjtningen - fordi injektionsvolumenet kun er 2 μL, selv en lille luftboble ved kanylespidsen vil reducere væskens volumen betydeligt med succes leveret i hjernen. Dette opnås ved kun at holde pumpen kørende og indsætte kanylen, når der er en voksende dråbe injektionsvæske på spidsen. Efter indføringen af kanylen skrues stikket til kateteret, samtidig med at man undgår overspænding for ikke at beskadige kateterets øverste spids, hvilket vil gøre det vanskeligt at opsummere efter injektionen. Der anvendes en injektionshastighed på 0,2 μL/min for at undgå injektionsinduceret traume. Desuden sikrer en langsom injektion kombineret med en ventetid på 20 minutter efter injektionen udbredelsen af den injicerede væske i interstitiel væske og en effektiv dræning i EFSR'en. Kanylen fjernes derefter langsomt for at undgå en vakuumeffekt.
Den rapporterede metode omfatter kirurgisk indgreb og kræver derfor personale, der er i stand til at udføre stereotaktisk overlevelseskirurgi. Personale i direkte kontakt med dyrene burde have taget de relevante dyreforsøgskurser. Resten af protokollen kan udføres af kompetente laboratoriemedlemmer.
Metoden er beregnet til at producere betændelsesudløset demyelination af hjernebarken og gengiver ikke alle træk ved human MS (f.eks.forekomsten af fokale inflammatoriske hvide stoflæsioner, som er kendetegnende for menneskelig MS).
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke alt personale fra Institute of Biomedical Research ved Medical University Graz for deres hjælp og samarbejde, samt Christopher John Wrighton for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
| Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
| Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
| Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
| Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
| Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
| 10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
| Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
| Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
| Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
| Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
| 70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
| 2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
| carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
| Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
| Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
| Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
| rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
| Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
| Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
| Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
| Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
| Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
| Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
| Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
| Screw driver with 2mm tip-size | |||
| Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
| Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
| Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
| Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
| Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
| Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
| Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
| Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
| Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
| Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
| Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
| Exam gloves | |||
| Surgical gown | |||
| Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
| Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
| Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
| Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
| Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
| 1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
| 26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
| 20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
| Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
| 3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
| Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
| 37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
| Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |
References
- MS Prevalence. National Multiple Sclerosis Society. , Available from: http://www.nationalmssociety.org/About-the-Society/MS-Prevalence (2017).
- Berkovich, R. Treatment of acute relapses in multiple sclerosis. Neurotherapeutics. 10 (1), 97-105 (2013).
- Kalincik, T. Multiple Sclerosis Relapses: Epidemiology, Outcomes and Management. A Systematic Review. Neuroepidemiology. 44 (4), 199-214 (2015).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. The Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus Placebo in Primary Progressive Multiple Sclerosis. The New England Journal of Medicine. 376 (3), 209-220 (2017).
- Dyment, D. A., Ebers, G. C., Sadovnick, A. D. Genetics of multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 3 (2), 104-110 (2004).
- Ascherio, A. Environmental factors in multiple sclerosis. Expert Review of Neurotherapeutics. 13, 12 Suppl 3-9 (2013).
- Allen, I. V., McQuaid, S., Mirakhur, M., Nevin, G. Pathological abnormalities in the normal-appearing white matter in multiple sclerosis. Neurological Sciences. 22 (2), 141-144 (2001).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2705-2712 (2005).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the Neurological Sciences. 233 (1-2), 55-59 (2005).
- Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 50 (3), 389-400 (2001).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical demyelination in multiple sclerosis: a substrate for cognitive deficits. Journal of the Neurological Sciences. 245 (1-2), 123-126 (2006).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. European Journal of Pharmacology. 759, 182-191 (2015).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathology. 27 (2), 123-137 (2017).
- Lebar, R., Lubetzki, C., Vincent, C., Lombrail, P., Boutry, J. M. The M2 autoantigen of central nervous system myelin, a glycoprotein present in oligodendrocyte membrane. Clinical and Experimental Immunology. 66 (2), 423-434 (1986).
- Linington, C., Bradl, M., Lassmann, H., Brunner, C., Vass, K. Augmentation of demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. The American Journal of Pathology. 130 (3), 443-454 (1988).
- Panitch, H., Ciccone, C. Induction of recurrent experimental allergic encephalomyelitis with myelin basic protein. Annals of Neurology. 9 (5), 433-438 (1981).
- Tuohy, V. K., Sobel, R. A., Lees, M. B. Myelin proteolipid protein-induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mice. The Journal of Immunology. 140 (6), 1868-1873 (1988).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25 (7), 1951-1959 (1995).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Bebo, B. F., Vandenbark, A. A., Offner, H. Male SJL mice do not relapse after induction of EAE with PLP 139-151. Journal of Neuroscience Research. 45 (6), 680-689 (1996).
- Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. The Journal of Immunology. 171 (1), 462-468 (2003).
- Scheld, M., et al. Neurodegeneration Triggers Peripheral Immune Cell Recruitment into the Forebrain. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1410-1415 (2016).
- Chanaday, N. L., Roth, G. A. Microglia and astrocyte activation in the frontal cortex of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience. 314, 160-169 (2016).
- Pomeroy, I. M., Matthews, P. M., Frank, J. A., Jordan, E. K., Esiri, M. M. Demyelinated neocortical lesions in marmoset autoimmune encephalomyelitis mimic those in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2713-2721 (2005).
- Merkler, D., et al. Differential macrophage/microglia activation in neocortical EAE lesions in the marmoset monkey. Brain Pathology. 16 (2), 117-123 (2006).
- Storch, M. K., et al. Cortical demyelination can be modeled in specific rat models of autoimmune encephalomyelitis and is major histocompatibility complex (MHC) haplotype-related. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 65 (12), 1137-1142 (2006).
- Ludwin, S. K. Central nervous system demyelination and remyelination in the mouse: an ultrastructural study of cuprizone toxicity. Laboratory Investigation. 39 (6), 597-612 (1978).
- Skripuletz, T., et al. Cortical demyelination is prominent in the murine cuprizone model and is strain-dependent. The American Journal of Pathology. 172 (4), 1053-1061 (2008).
- Norkute, A., et al. Cuprizone treatment induces demyelination and astrocytosis in the mouse hippocampus. Journal of Neuroscience Research. 87 (6), 1343-1355 (2009).
- Acs, P., et al. 17beta-estradiol and progesterone prevent cuprizone provoked demyelination of corpus callosum in male mice. Glia. 57 (8), 807-814 (2009).
- Pott, F., et al. Cuprizone effect on myelination, astrogliosis and microglia attraction in the mouse basal ganglia. Brain Research. 1305, 137-149 (2009).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. Journal of Neurocytology. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Ethidium bromide induced demyelination in the spinal cord of the cat. Neuropathology and Applied Neurobiology. 8 (5), 365-375 (1982).
- Mason, J. L., et al. Oligodendrocytes and progenitors become progressively depleted within chronically demyelinated lesions. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1673-1682 (2004).
- Franco, P. G., Silvestroff, L., Soto, E. F., Pasquini, J. M. Thyroid hormones promote differentiation of oligodendrocyte progenitor cells and improve remyelination after cuprizone-induced demyelination. Experimental Neurology. 212 (2), 458-467 (2008).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Kerschensteiner, M., et al. Targeting experimental autoimmune encephalomyelitis lesions to a predetermined axonal tract system allows for refined behavioral testing in an animal model of multiple sclerosis. The American Journal of Pathology. 164 (4), 1455-1469 (2004).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
- Gardner, C., et al. Cortical grey matter demyelination can be induced by elevated pro-inflammatory cytokines in the subarachnoid space of MOG-immunized rats. Brain. 136, Pt 12 3596-3608 (2013).
- Minagar, A., et al. The thalamus and multiple sclerosis: modern views on pathologic, imaging, and clinical aspects. Neurology. 80 (2), 210-219 (2013).
- Tsunoda, I., Kuang, L. Q., Theil, D. J., Fujinami, R. S. Antibody association with a novel model for primary progressive multiple sclerosis: induction of relapsing-remitting and progressive forms of EAE in H2s mouse strains. Brain Pathology. 10 (3), 402-418 (2000).
- Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behavioural Brain Research. 177 (2), 347-357 (2007).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
- Leonard, J. R., Grady, M. S., Lee, M. E., Paz, J. C., Westrum, L. E. Fluid percussion injury causes disruption of the septohippocampal pathway in the rat. Experimental Neurology. 143 (2), 177-187 (1997).
- Hare, G. M., et al. Severe hemodilutional anemia increases cerebral tissue injury following acute neurotrauma. Journal of Applied Physiology. 103 (3), 1021-1029 (2007).
- Abbott, N. J. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology. Neurochemistry International. 45 (4), 545-552 (2004).
- Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. The Journal of Immunology. 153 (10), 4349-4356 (1994).
- Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Hochmeister, S., Gustafsson, S. A., Jagodic, M. Efficacy of vitamin D in treating multiple sclerosis-like neuroinflammation depends on developmental stage. Experimental Neurology. , 39-48 (2013).
