Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

बढ़ाने का विच्छेदन कार्य मल्टीप्लेक्स CRISPR-आधारित बढ़ाने का प्रयोग सेल लाइंस में व्यवधान

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57883
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

Summary

यह प्रोटोकॉल डिजाइन करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करता है और निष्क्रिय फ्यूजन प्रोटीन SID4X-dCas9-KRAB के साथ बढ़ाने के मल्टीप्लेक्स लक्ष्यीकरण प्रदर्शन, यह भी बढ़ाने हस्तक्षेप (बढ़ाने-मैं) के रूप में जाना जाता है । इस प्रोटोकॉल को बढ़ाने की पहचान है कि जीन अभिव्यक्ति को विनियमित और बढ़ाने के बीच संबंधों के विच्छेदन की सुविधा के लिए सक्षम बनाता है एक आम लक्ष्य जीन विनियमन ।

Abstract

कई बढ़ाने अक्सर एक दिया जीन को विनियमित, अभी तक सबसे जीन के लिए, यह स्पष्ट नहीं रहता है जो बढ़ाने के जीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक हैं, और कैसे इन बढ़ाने के लिए एक transcriptional प्रतिक्रिया का उत्पादन गठबंधन । बढ़ाने के लाखों लोगों की पहचान की गई है के रूप में, उच्च प्रवाह उपकरण एक जीनोम चौड़ा पैमाने पर बढ़ाने समारोह निर्धारित करने की जरूरत है । बढ़ाने के अध्ययन के लिए वर्तमान तरीकों समारोह आनुवंशिक विलोपन nuclease-कुशल Cas9 का उपयोग कर शामिल है, लेकिन यह कई लगातार क्लोनिंग सेल लाइनों के रूप में होना चाहिए इस तकनीक का उपयोग कर, एकाधिक बढ़ाने के मिश्रित प्रभाव का अध्ययन करने के लिए मुश्किल है उत्पन्न. यहाँ, हम बढ़ाने वर्तमान, एक CRISPR हस्तक्षेप आधारित विधि है कि कई बढ़ाने के कार्यात्मक पूछताछ के लिए एक साथ अपने अंतर्जात loci पर अनुमति देता है । बढ़ाने-मैं दो दमनात्मक डोमेन का उपयोग करता है nuclease की कमी Cas9, सिड और KRAB से जुड़े, लक्षित deacetylation पर हिस्टोन loci के माध्यम से बढ़ाने को प्राप्त करने के लिए सक्रियण । इस प्रोटोकॉल लक्षित क्षेत्रों की क्षणिक निष्क्रियता सक्षम करने के लिए गाइड RNAs के क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग करता है और ऊतक संस्कृति सेटिंग्स में उत्तेजनाओं के लिए inducible transcriptional प्रतिक्रियाओं को अवरुद्ध करने में विशेष रूप से प्रभावी है. बढ़ाने-मैं अपने जीनोमिक लक्ष्यीकरण और वैश्विक जीन अभिव्यक्ति पर अपने प्रभाव में अत्यधिक विशिष्ट है । इस प्रोटोकॉल से प्राप्त परिणामों को समझने में मदद कि क्या एक बढ़ाने जीन अभिव्यक्ति में योगदान दे रहा है, योगदान की भयावहता, और कैसे योगदान के अंय आसपास बढ़ाने से प्रभावित है ।

Introduction

ऐसे सांकेतिक शब्दों में बदलना1, रोडमैप Epigenomics2, और FANTOM3 के रूप में बड़े पैमाने पर अनुक्रमण परियोजनाओं सेल प्रकार के सैकड़ों भर में मानव जीनोम के भीतर ख्यात बढ़ाने के लाखों लोगों की पहचान की है । यह अनुमान है कि ४.९ बढ़ाने और प्रत्येक बढ़ाने के एक औसत के साथ प्रत्येक प्रवर्तक सहयोगियों २.४ जीन की एक औसत3, सुझाव है कि जीन अभिव्यक्ति अक्सर कई वितरित विनियामक बातचीत के एकीकरण का परिणाम है । एक महत्वपूर्ण शेष चुनौती को परिभाषित करने के लिए न केवल कैसे व्यक्तिगत बढ़ाने जीन अभिव्यक्ति में योगदान है, लेकिन कैसे वे अभिव्यक्ति को प्रभावित गठबंधन । आनुवंशिक दृष्टिकोण आमतौर पर Drosophila4 से चूहों5के लिए मॉडल जीवों में बढ़ाने के बीच संबंधों को पहचानने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, इन प्रयोगों के कई जीन पर कई बढ़ाने के अध्ययन के लिए समय लेने वाली और कम प्रवाह कर रहे हैं ।

एक बड़े पैमाने पर बढ़ाने समारोह का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर परख शामिल है । इन परख उनकी क्षमता एक रिपोर्टर जीन6की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए डीएनए दृश्यों के हजारों की एक साथ स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देते हैं । जबकि इन परख पता चला है कि डीएनए अनुक्रम अकेले जीन विनियमन जानकारी7व्यक्त करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, वे देशी क्रोमेटिन संदर्भ के बाहर प्रदर्शन किया जा रहा है और एक heterologous प्रमोटर के साथ के निरंतर के साथ आते हैं । इसके अलावा, डीएनए अनुक्रम का आकार व्यापक रूप से समानांतर रिपोर्टर परख में विश्लेषण किया जा रहा है आमतौर पर कम से २०० basepairs है, जो प्रासंगिक आसपास के अनुक्रम को बाहर कर सकते हैं । महत्वपूर्ण बात, के रूप में रिपोर्टर परख केवल एक समय में एक अनुक्रम की गतिविधि को मापने, वे खाते में जटिल रिश्तों कि बढ़ाने के बीच मौजूद कर सकते है नहीं ले । इस प्रकार, जबकि बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर परख एक डीएनए अनुक्रम के आंतरिक गतिविधि के बारे में जानकारीपूर्ण जा सकता है, वे जरूरी नहीं कि हम जीनोम के संदर्भ में है कि डीएनए अनुक्रम के समारोह की सूचना ।

हाल ही में विकसित CRISPR/Cas9 उपकरण8 जीन विनियमन के अध्ययन की सुविधा के रूप में वे अंतर्जात लोकस में बढ़ाने के विलोपन के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, कई बढ़ाने को एक साथ हटाने से जीनोमिक अस्थिरता पैदा हो सकती है, और यह एक एकल कोशिका लाइन में क्रमिक बढ़ाने वाले विलोपन को उत्पन्न करने के लिए समय लेने वाली है । इसके अलावा, नया जीनोमिक अनुक्रम हटाने के बाद सुधार की साइट पर बनाया जाता है, और यह अनुक्रम विनियामक फ़ंक्शन प्राप्त कर सकते हैं । Cas9 का एक वैकल्पिक संस्करण विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति संग्राहक के लिए विकसित किया गया है,9,10 या दमन11,12 डोमेन Cas9 के nuclease कमी के रूप में सक्रिय करने के संलयन पर निर्भर (dCas9) । ये फ्यूजन प्रोटीन एक साथ कई loci का अध्ययन करने के लिए आदर्श होते हैं क्योंकि वे शारीरिक रूप से डीएनए अनुक्रम में परिवर्तन नहीं करते हैं, और इसके बजाय एक विनियामक क्षेत्र से पूछताछ करने के लिए epigenetics का नियमन करते हैं । सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दमन संलयन KRAB है, जो KAP1 सह दमन परिसर में भर्ती है, दमन के जमाव को बढ़ावा देने के-एसोसिएटेड हिस्टोन H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3)13। dCas9-KRAB, भी CRISPR हस्तक्षेप14के रूप में जाना जाता है, को लक्ष्य और स्क्रीन जीन अभिव्यक्ति के लिए उनके योगदान के लिए व्यक्तिगत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है15,16; हालांकि, यह एक साथ एकाधिक क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए ऑप्टिमाइज़ नहीं किया गया है । बढ़ाने के लिए मल्टीप्लेक्स CRISPR हस्तक्षेप का एक संस्करण, मोज़ेक-seq17, एक readout के रूप में एकल सेल आरएनए-seq का उपयोग करता है, लेकिन इस प्रौद्योगिकी महंगा है और केवल अत्यधिक व्यक्त जीन के अध्ययन के लिए उपयुक्त एक सेल की कम संवेदनशीलता के कारण आरएनए-seq.

हम एस्ट्रोजन के लिए एक transcriptional प्रतिक्रिया के संदर्भ में मिश्रित बढ़ाने समारोह विदारक के लिए एक CRISPR हस्तक्षेप आधारित विधि विकसित करने की मांग की । के बारे में एस्ट्रोजन का आधा-उत्तरदायी जीन 2 या अधिक एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (एर) पास के18से बंधे बढ़ाने, सुझाव है कि कई बढ़ाने एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया में भाग लेने जा सकता है, और नियामक तर्क को समझने की आवश्यकता होगी एक साथ कई बढ़ाने लक्ष्यीकरण । के रूप में प्रारंभिक प्रमोटरों पर CRISPR हस्तक्षेप का उपयोग अध्ययन का सुझाव दिया है कि नहीं सभी प्रवर्तक समान रूप से KRAB के लिए उत्तरदाई है-मध्यस्थता दमन19, हम कारण है कि एक अलग दमन डोमेन के अलावा dCas9 को निष्क्रियता की सुविधा हो सकती है विविध बढ़ाने । हमने Mad1 (SID)20 के Sin3a इंटरैक्टिंग डोमेन को चुना है, क्योंकि यह हिस्टोन deacetylases21की भर्ती की ओर जाता है, जो एसिटाइल समूहों histones गतिविधि के साथ संबद्ध है जो transcriptional पर निकालते हैं । महत्वपूर्ण बात, सिड डोमेन जीन अभिव्यक्ति को कम करने में प्रभावी था जब dCas922 और दास्तां23से जुड़े, और Sin3a को बढ़ाने के अनुक्रम की एक किस्म में एक शक्तिशाली दमन सह कारक हो दिखाया गया है24। हम SID4x-dCas9-KRAB (बढ़ाने-i) का इस्तेमाल किया 10 अलग एर द्वारा बंधे बढ़ाने के लक्ष्य, और एर बाध्यकारी साइटों (ERBS) की पहचान है कि 4 जीन18में एस्ट्रोजन transcriptional प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं । हम भी बढ़ाने के संयोजन के लक्षित साइटों है कि एस्ट्रोजन transcriptional प्रतिक्रिया के उत्पादन में सहयोग की पहचान करने के लिए । हमने पाया है कि अप करने के लिए ५० साइटों संभवतः एक साथ जासूसी जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के साथ लक्षित किया जा सकता है । चिप seq और आरएनए-seq का उपयोग कर, हम है कि बढ़ाने का प्रदर्शन किया-मैं एक साथ कई बढ़ाने का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक विशिष्ट तकनीक है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम बढ़ाने-i, एक लचीला तकनीक है कि एक ऊतक संस्कृति की स्थापना में एक साथ कई बढ़ाने के कार्यात्मक अध्ययन में सक्षम बनाता है प्रदर्शन में शामिल कदम का वर्णन । बढ़ाने-मैं अत्यधिक आनुवंशिक विलोपन के साथ संबंधित है, लेकिन क्षणिक निष्क्रियता प्रदान करता है कि हिस्टोन deacetylases (HDACs) पर निर्भर है । वायरल वैक्टर के माध्यम से स्थिर एकीकरण का विरोध के रूप में क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से गाइड RNAs देने के द्वारा, इस प्रोटोकॉल जमाव और H3K9me3 के संभावित प्रसार से बचा जाता है । इस प्रोटोकॉल विवरण गाइड आरएनए डिजाइन और गिब्सन विधानसभा के माध्यम क्लोनिंग, गाइड RNAs lipofection का उपयोग कर के अभिकर्मक, और qPCR द्वारा जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के परिणामस्वरूप के विश्लेषण । हम भी बढ़ाने की विशिष्टता के मूल्यांकन के लिए तरीकों में शामिल है-मैं जीनोम और transcriptome के स्तर पर लक्ष्यीकरण । इस तकनीक को मानव कैंसर कोशिका लाइनों में ईआर बाध्य बढ़ाने के द्वारा जीन विनियमन अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, यह किसी भी स्तनधारी बढ़ाने के विच्छेदन के लिए लागू है.

Protocol

1. सेल लाइनों छुरा SID4X-dCas9-KRAB व्यक्त की पीढ़ी

नोट: अभिकर्मक शर्तों और दवा यहां प्रस्तुत सांद्रता Ishikawa कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, एक एंडोमेट्रियल कैंसर सेल लाइन, RPMI १६४० में उगाया मीडिया 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin (पूरा RPMI) के साथ पूरक । अंय सेल लाइनों विभिंन अभिकर्मक स्थितियों और दवा सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है । उपयोगकर्ताओं को भी एक स्थिर सेल लाइन पैदा करने के बजाय, जंगली प्रकार की कोशिकाओं में क्षणिक अभिकर्मक प्रयोगों प्रदर्शन कर सकते हैं, गाइड आरएनए व्यक्त KRAB के साथ साथ एक प्लाज्मिड व्यक्त SID4X-dCas9-plasmids के साथ; हालांकि, क्षणिक transfections से परिणाम SID4X-dCas9-KRAB स्तर अभिकर्मक द्वारा भिन्न हो सकते हैं के रूप में पुन: उत्पन्न करने के लिए कठिन हो सकता है ।

  1. प्लेट Ishikawa कोशिकाओं में एक 6-well थाली के कम से कम 2 कुओं में 30-50% संगम (लगभग ३००,००० Ishikawa कोशिकाओं) में पूर्ण RPMI के 3 मिलीलीटर ।
    1. कोशिकाओं से मीडिया को महाप्राण । 1x पंजाबियों (पीएच ७.४) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । पंजाबियों को महाप्राण और trypsin (4 एमएल के लिए 10 सेमी डिश या एक टी-७५ कुप्पी के लिए 5 मिलीलीटर) जोड़ें ।
    2. ३७ ° c पर ~ 5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन, अलग कोशिकाओं के लिए हर 2 मिनट की जांच और धीरे पोत मिलाते हुए ।
    3. एक बार कोशिकाओं अलग है, पिपेट trypsinized कोशिकाओं को ऊपर और नीचे कुछ समय, और पिपेट धीरे पोत के पक्ष नीचे किसी भी संलग्न कोशिकाओं को जारी करने के लिए ।
    4. कोशिकाओं को एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब पर स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को नीचे स्पिन २५० x g पर ।
    5. महाप्राण trypsin और मीडिया के 5-10 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड । यदि आवश्यक हो तो अलग कर देना कक्ष के झुरमुट को एक P1000 पिपेट का प्रयोग करें ।
    6. कोशिकाओं की गणना और थाली के लिए आवश्यक मात्रा का निर्धारण ~ ३००,००० कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से 3 मिलीलीटर की कुल मात्रा में । एक 6-खैर प्लेट के 2 अलग कुओं के लिए कोशिकाओं को जोड़ें । पूरी RPMI के साथ एक अच्छी तरह से 3 मिलीलीटर भरें ।
    7. धीरे प्लेट हर 5 मिनट पहले 15 मिनट में चढ़ाना के बाद यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को समान रूप से प्लेट पर वितरित कर रहे हैं । एक खुर्दबीन का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं के बीच से अच्छी तरह से फैलाया है ।
  2. चढ़ाना के 24 घंटे के भीतर, ब्याज की सेल लाइन के लिए एक उपयुक्त अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर निंनलिखित transfections प्रदर्शन । Ishikawa कक्षों के लिए, नीचे बताई गई कार्यविधि का उपयोग करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल cationic liposome-आधारित अभिकर्मक एजेंट का उपयोग मानता है । Electroporation इन रिएजेंट के लिए बहुत संवेदनशील हैं जो कक्ष प्रकारों के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है या जो lipofection के साथ कम अभिकर्मक दक्षता प्रदर्शित करें । अभिकर्मक शर्तों को बढ़ाने के प्रयास से पहले ब्याज की सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए-मैं प्रयोगों ।
    1. एक १.७ मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में, पतला २.५ μg के SID4X-dCas9-KRAB प्लाज्मिड और ८०० प्लाज्मिड के एनजी सीरम मुक्त मीडिया में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस ऐसी है कि ट्यूब में अंतिम मात्रा १५५ µ एल और प्लाज्मिड के अंतिम एकाग्रता है ०.०२० µ g/µ l
    2. एक और ट्यूब में, पतला ३.३ µ जी एक प्लाज्मिड है कि एक निओमायसिन प्रतिरोध कैसेट, जैसे pCMV-GFP, सीरम मुक्त मीडिया में शामिल नहीं है कि ट्यूब में अंतिम मात्रा १५५ µ एल और प्लाज्मिड की अंतिम एकाग्रता है ०.०२० µ जी/µ एल है ।
    3. भंवर प्रत्येक ट्यूब संक्षेप में और एक microfuge का उपयोग कर नीचे स्पिन ।
    4. प्रत्येक ट्यूब के लिए अभिकर्मक रिएजेंट (सामग्री की तालिका) के ९.९ µ एल जोड़ें । संक्षेप में एक कम गति से भंवर से मिश्रण । एक microfuge के साथ ट्यूबों नीचे स्पिन ।
    5. गर्मी के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों के ंयूनतम 5 मिनट के लिए, लेकिन अधिक से अधिक 20 मिनट ।
    6. सुरक्षा कैबिनेट में, तैयार डीएनए के १५० µ एल जोड़ें: रिएजेंट 6-अच्छी तरह से थाली पर एक अच्छी तरह से dropwise मिश्रण । तैयार डीएनए की अन्य ट्यूब के लिए दोहराएँ: रिएजेंट मिक्स. धीरे से घूमता है और मशीन के लिए थाली वापस द्वारा प्लेटें मिश्रण ।
  3. दिन में 2 पोस्ट अभिकर्मक, बदलने के मीडिया और G418 के साथ पूरक ६०० एनजी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए/μL । इस एकाग्रता को कक्ष प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  4. बदलें पूरा RPMI मीडिया और G418 के साथ पूरक 2-4 सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन जब तक नियंत्रण transfected कोशिकाओं और मर SID4X युक्त कुओं-dCas9-KRAB धाराप्रवाह हो रहे हैं । कोशिकाओं को ठीक करने के लिए समय की जरूरत की सटीक राशि कोशिकाओं के दोहरीकरण समय पर निर्भर करेगा ।
  5. जब कोशिकाओं को धाराप्रवाह हो, G418 की एक कम खुराक के साथ पूरा RPMI में एक टी-25 या टी-७५ पोत के लिए मार्ग (Ishikawa कोशिकाओं के लिए ३०० एनजी/μL) । इस मार्ग के दौरान, ~ १००,००० कोशिकाओं प्रत्येक (मोटे तौर पर एक 6-अच्छी प्लेट के लगभग 1/10गु ) आरएनए और डीएनए अलगाव, क्रमशः के लिए 2 अलग १.७ मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में 2 aliquots बनाओ । इन ट्यूबों नीचे स्पिन (5 मिनट, २५० एक्स जी), pipetting द्वारा trypsin हटाने, और ट्यूब पर रोक-20 ° c भविष्य के उपयोग के लिए ।
  6. अलग जीनोमिक डीएनए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर और पीसीआर प्रदर्शन "pAC95_PCR" या "SID4X_PCR" प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग करने के लिए सेल लाइन में फ्यूजन प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में माता पिता की रेखा से निकाले जीनोमिक डीएनए का प्रयोग करें, और SID4x-dCas9-KRAB प्लाज्मिड डीएनए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में । ५०-१०० जीनोमिक डीएनए के एनजी के साथ एक उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण का प्रयोग करें और निम्नलिखित साइकिलिंग की स्थिति: ९८ ° c 30 एस के लिए, (९८ ° c के लिए 10 एस, ५८ ° c 30 s के लिए, ७२ ° c 2 मिनट के लिए), ७२ ° c 5 मिनट के लिए , 4 ° c पर रखें ।
  7. आरएनए स्तर पर फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति सत्यापित करने के लिए, आरएनए के साथ सेल लाइन से निकाली गई qPCR प्रदर्शन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर. "dCas9_qPCR" प्राइमर्स (तालिका 1) का उपयोग करें, और इस प्रोटोकॉल के चरण ६.३ में प्रदान किए गए एक-चरण qPCR प्रोटोकॉल ।
  8. फ्यूजन के प्रोटीन स्तर की अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए, सेल लाइन से lysates पर एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन करते हैं । फ्यूजन प्रोटीन का पता लगाने के लिए या तो विरोधी ध्वज या विरोधी हा एंटीबॉडी का प्रयोग करें ।

2. गाइड आरएनए डिजाइन

नोट: इस प्रोटोकॉल U6 गाइड शाही सेना क्लोनिंग वेक्टर चर्च लैब द्वारा बनाई गई और Addgene पर उपलब्ध के साथ प्रयोग के लिए बनाया गया है (Addgene ४१८२४) । puromycin प्रतिरोध है कि ४१८२४ के रूप में एक ही क्लोनिंग रणनीति के लिए अनुमति दी है कि इस वेक्टर के एक संस्करण बनाने के लिए, हम इस सदिश से कई क्लोनिंग साइट pGL3 में चले गए-U6-sgRNA-PGK-puromycin वेक्टर (Addgene ५११३३) । या तो Addgene ४१८२४ या puromycin (Addgene १०६४०४) के साथ हमारे संस्करण नीचे उल्लिखित क्लोनिंग रणनीति के साथ संगत कर रहे हैं ।

  1. ब्याज की प्रत्येक विनियामक क्षेत्र के लिए डीएनए अनुक्रम के ६००-९०० basepairs प्राप्त करें । (चित्र 2a) ब्याज के क्षेत्र को कहां परिभाषित करने के लिए मार्गदर्शन के लिए प्रतिलिपि फ़ैक्टर बाइंडिंग साइट्स और/या क्रोमेटिन पहुंच का उपयोग करें ।
    नोट: जबकि चित्रा 2a में उदाहरण के ऊपर और बहाव बढ़ाने सुविधाओं, यह भी introns के भीतर स्थित नियामक तत्वों को लक्षित करने के लिए संभव है.
  2. फसता स्वरूप का उपयोग कर किसी एकल पाठ फ़ाइल में प्राप्त सभी अनुक्रम रखें ।
  3. की पहचान करें कि एक जीन है कि ब्याज की सेल लाइन में व्यक्त नहीं किया है की एक प्रमोटर के रूप में प्रयोगात्मक शर्तों, पर बदलने की उंमीद नहीं है कम से एक नकारात्मक नियंत्रण क्षेत्र । इस क्षेत्र के लिए डीएनए अनुक्रम प्राप्त करें और इसे फसता प्रारूप में पाठ फ़ाइल में जोड़ें ।
    नोट: हम गाइड RNAs का उपयोग IL1RN प्रमोटर25 लक्ष्यीकरण सभी क्षेत्रों हम लक्ष्य के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में । उपयोगकर्ताओं को भी ब्याज के क्षेत्र के पास intergenic अनुक्रम का चयन कर सकते है कि एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों को शामिल नहीं है । हालांकि, यदि एकाधिक loci एक साथ लक्षित किया जा रहा है, एक नकारात्मक नियंत्रण क्षेत्र प्रयोगात्मक डिजाइन और परिणामों की व्याख्या को सरल करता है । लक्षित बढ़ाने intronic है, तो यह एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ख्यात विनियामक तत्व शामिल नहीं करता है एक ही लोकस पर एक intronic क्षेत्र को लक्षित करने के लिए उपयोगी हो सकता है, dCas9 संलयन प्रतिलेखन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
  4. ऐसे प्रवर्तकों के रूप में सकारात्मक नियंत्रण क्षेत्रों की पहचान करें, जो ब्याज के विनियामक क्षेत्रों के ख्यात लक्ष्य हैं, या जीन के प्रवर्तक जो अत्यधिक ब्याज की सेल लाइन में प्रतिलिखित हैं । इन क्षेत्रों के लिए डीएनए अनुक्रम प्राप्त करें और इसे फसता प्रारूप में पाठ फ़ाइल में जोड़ें ।
  5. ऐसे ई के रूप में एक कार्यक्रम का प्रयोग करें, डीएनए (आदर्श 0-3) के साथ कम से गाइड RNAs मिल उत्पंन अनुक्रम पर26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) कुरकुरा । गाइड RNAs एक protospacer आसंन आकृति (पाम) के 20 न्यूक्लियोटाइड ऊपर से मिलकर बनता है, जो फार्म लेता है "NGG" से dCas9 के लिए एस. pyogenes।
    1. ई-नपा वेबसाइट पर ड्रॉप-डाउन मेन्यू का इस्तेमाल करते हुए प् याज के जीव का चयन करें । जीनोम असेंबली प्रजातियों के नाम के अधिकार के लिए प्रकट होता है ।
    2. का चयन करें इनपुट फसता अनुक्रम रेडियो बटन है । ऊपर से फसता अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाएँ और उन्हें संवाद बॉक्स में चिपकाएँ । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अनुक्रम के लिए कोई फसता शीर्ष लेख शामिल है ।
      नोट: अप करने के लिए ५० अनुक्रम एक साथ क्वेरी किया जा सकता है ।
    3. ड्रॉप-डाउन मेनू में मध्यम रेडियो बटन और एकल डिज़ाइन का चयन करें ।
    4. बटन प्रारंभ sgRNA खोजक्लिक करें । एक नया ब्राउज़र टैब खुलेगा, और परिणाम प्रदर्शित होंगे । बटन पर क्लिक करके उम्मीदवार अनुक्रम डाउनलोड करें एक साथ सभी क्वेरी अनुक्रम के लिए Excel स्वरूपित तालिका रिपोर्ट डाउनलोड करें।
    5. Excel या किसी पाठ संपादन प्रोग्राम का उपयोग करके तालिका रिपोर्ट खोलें ।
  6. जीनोम के लिए BLAT उंमीदवार पूर्ण लंबाई gRNA दृश्यों (23 basepairs) के लिए UCSC जीनोम ब्राउज़र का प्रयोग करें ।
    1. एक ब्राउज़र में, UCSC जीनोम ब्राउज़र वेबसाइट (http://genome.ucsc.edu) के लिए नेविगेट । हमारे उपकरणअनुभाग के तहत, शब्द BLAT की स्थिति जानें और उस पर क्लिक करें । BLAT खोज उपकरण खुल जाएगा ।
    2. ब्याज की जीव और जीनोम विधानसभा का चयन करने के लिए BLAT खोज जीनोम पाठ के तहत स्थित ड्रॉप डाउन मेनू का प्रयोग करें ।
    3. ई-कुरकुरा द्वारा उत्पन्न तालिका रिपोर्ट से गाइड आरएनए अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाएँ और उन्हें संवाद बॉक्स में चिपकाएँ । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अनुक्रम में अनंय फसता शीर्षलेख है, फिर संवाद बॉक्स के नीचे सबमिट करें
      नोट: एक बार में 25 जुगाड़ की जांच की जा सकती है । BLAT खोज परिणाम पृष्ठ पर, प्रत्येक गाइड आरएनए अनुक्रम के संरेखण, एक संरेखण का प्रतिनिधित्व करने वाली प्रत्येक पंक्ति के साथ दिखाई देगा । आदर्श रूप में, वहां एक गाइड आरएनए के लिए एक संरेखण होना चाहिए, कि गाइड आरएनए की विशिष्टता का संकेत है ।
    4. गाइड है कि यदि संभव हो तो जीनोम में कई स्थानों के लिए संरेखित से बचें ।
    5. रुचि के क्षेत्र के भीतर गाइड आरएनए स्थानीयकरण और वितरण की जांच करने के लिए, क्वेरी गाइड RNAs में से एक के लिए क्रिया एं अनुभाग के अंतर्गत ब्राउज़र लिंक पर क्लिक करें । जीनोम ब्राउज़र दिखाई देगा और चयनित गाइड आरएनए पर केंद्रित किया जाएगा. ब्याज के क्षेत्र के भीतर ई-नपा द्वारा पहचाने गए अन्य गाइड RNAs के वितरण की कल्पना करने के लिए पृष्ठ के शीर्ष पर ज़ूम आउट करें बटंस का उपयोग करना ।
  7. चुनें 4 अधिमानतः गैर अतिव्यापी गाइड आरएनए अनुक्रम है कि ब्याज के क्षेत्र में वितरित कर रहे है (आंकड़ा 2 बी) । यदि ब्याज का क्षेत्र ६०० bp से अधिक है, तो 1-2 अतिरिक्त मार्गदर्शिकाएं जोड़ने पर विचार करें । homopolymeric हिस्सों और अति GC सामग्री के साथ गाइड RNAs से बचें, क्योंकि इन सुविधाओं गाइड आरएनए क्लोनिंग प्रक्रिया में बाधा और गाइड आरएनए लक्ष्यीकरण दक्षता को कम कर सकते हैं.
  8. एक बार गाइड का चयन किया गया है, एक पूर्ण गाइड आरएनए अनुक्रम (23 न्यूक्लियोटाइड) युक्त एक फ़ाइल प्रत्येक वांछित गाइड के लिए बनाने के लिए, और फिर 5 ' न्यूक्लियोटाइड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पाम (NGG) 3 ' अंत से हटा दें । इस चरण में oligo आदेश की सुविधा है ।
  9. oligonucleotide अनुक्रम के 5 ' अंत करने के लिए निम्न अनुक्रम जोड़ें: GTGGAAAGGACGAAACACCG ।
  10. oligonucleotide अनुक्रम के 3 ' अंत करने के लिए निम्न अनुक्रम जोड़ें: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC ।
    नोट: अंतिम अनुक्रम ५९ न्यूक्लियोटाइड लंबा होना चाहिए और इस तरह दिखते हैं: GTGGAAAGGACGAAACACCG-लक्ष्य (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC ।
  11. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक विनियामक तत्व बढ़ाने के साथ लक्षित किया जा करने के लिए-मैं इसके लिए डिज़ाइन किया गया कम से 4 अद्वितीय oligonucleotides है । आदेश "U6_internal" प्राइमरों तालिका 1में सूचीबद्ध के साथ साथ इन दृश्यों.

3. गाइड आरएनए क्लोनिंग

नोट: गाइड आरएनए गिब्सन विधानसभा के माध्यम से क्लोनिंग हमारे हाथ में अत्यधिक कुशल साबित हो गया है, थाली प्रति कालोनियों के सैकड़ों उपज, कुछ के साथ अगर वेक्टर केवल नियंत्रण में मौजूद किसी भी कालोनियों । ऐसी दक्षता परित क्लोनिंग के दौरान जटिलता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । गिब्सन विधानसभा क्लोनिंग का एक और लाभ यह है कि प्रयोक्ताओं के लिए गाइड आरएनए में एक प्रतिबंध एंजाइम कटौती साइट की उपस्थिति के बारे में चिंता वे U6 क्लोनिंग वेक्टर में डालने की कोशिश कर रहे है नहीं है । बहरहाल, इस प्रोटोकॉल पारंपरिक प्रतिबंध आधारित क्लोनिंग अगर वांछित एंजाइम के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

  1. ultrapure जल (RNase-मुक्त, DNase-मुक्त) में १०० माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता पर गाइड आरएनए ओलिगोस्पर्मिया का पुनर्गठन । ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए कम से कम 4 अलग गाइड आरएनए ओलिगोस्पर्मिया होना चाहिए ।
  2. ब्याज की प्रत्येक विनियामक क्षेत्र के लिए, सभी ओलिगोस्पर्मिया का एक पूल बनाने के हित के क्षेत्र के लिए इसी । एक Eppendorf ट्यूब में, प्रत्येक व्यक्ति के 5 μL गठबंधन प्रत्येक क्षेत्र के लिए गाइड आरएनए oligo का गठन । पूल को अच्छी तरह से भंवर करके मिक्स करें, फिर 1 μL निकालें और इस aliquot 1:200 को ultrapure पानी में पतला कर दें ।
    नोट: यदि चाहें, तो व्यक्तिगत विनियामक क्षेत्रों को टार्गेट करने वाले इन पूल्स को एकाधिक क्षेत्रों को लक्षित करने वाला जटिल पूल बनाने के लिए संयुक्त किया जा सकता है । अप करने के लिए ५० विनियामक क्षेत्रों एक साथ एक पूल (चित्रा 3सी) में लक्षित किया जा सकता है ।
  3. U6 प्राइमरों के साथ एक छोटी पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए गिब्सन विधानसभा से पहले ओलिगोस्पर्मिया को समरूपता क्षेत्रों देते हैं । के बारे में ४० कुर्सियां प्रत्येक oligo में जोड़ा जाएगा, एक ~ १०० बीपी उत्पाद है कि U6 वेक्टर दोनों सिरों पर पर्याप्त समरूपता शामिल उपज ।
    1. प्रत्येक गाइड आरएनए पूल के लिए, एक उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स और निम्नलिखित घटकों के साथ एक 20 μL पीसीआर की स्थापना: ३.२ कदम से पतला oligo पूल के 1 μL, μL आगे प्राइमर के 1 U6 (10 माइक्रोन), μL रिवर्स प्राइमर के 1 U6 (10 माइक्रोन) , और 20 μL तक पानी ।
    2. निम्नलिखित स्थितियों के साथ एक थर्मल साइकिल चालक में मशीन: ९८ ° c 30 s के लिए, 10 एस के लिए (९८ ° c, के लिए 11 डिग्री सेल्सियस, ५५ ° c के लिए 30 s, ७२ ° c 2 मिनट के लिए), ७२ ° c 5 मिनट के लिए, और 4 ° c पर पकड़ ।
    3. भागो 5 एक कम आणविक वजन सीढ़ी के साथ एक 1-2% agarose जेल पर प्रतिक्रिया के μL । अंतिम उत्पाद ~ १०० basepairs (चित्र 2c) होना चाहिए ।
    4. एक कॉलम आधारित डीएनए शुद्धिकरण किट के साथ एक्सटेंशन रिएक्शन को साफ करें, और किट में दिए गए रेफरेंस बफर के 20 μL में elute ।
      नोट: के रूप में उत्पाद कम है, मनका-आधारित साफ अप, जो छोटे टुकड़े से कम १०० बीपी को बाहर करने के लिए डिज़ाइन कर रहे है का उपयोग कर से बचें ।
    5. एक fluorometer या spectrophotometer का उपयोग कर शुद्ध डीएनए यों तो (अपेक्षित उपज है 10-20 एनजी/μL) । गाइड आरएनए आवेषण-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, या एक रैखिक U6 वेक्टर के साथ गिब्सन विधानसभा में तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. को तैयार करने के लिए प्राप्तकर्ता U6 क्लोनिंग गिब्सन विधानसभा के लिए वेक्टर, एक प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट की स्थापना की । कई गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जा करने के लिए कर रहे हैं, तो कटौती वेक्टर के पर्याप्त उपज सुनिश्चित करने के लिए कई पचा सेट.
    1. उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम बफर के साथ एक 20 μL प्रतिक्रिया में AflII एंजाइम और प्लाज्मिड के 1 μg की 20 इकाइयों का प्रयोग करें । 1-2 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    2. साफ करने के लिए मोतियों के साथ डाइजेस्ट या डीएनए शुद्धि और elute के लिए एक कॉलम आधारित किट रेफरेंस बफर के 20 μL में । एक fluorometer या spectrophotometer का उपयोग कर शुद्ध डीएनए यों तो । नमूनों में बाद में उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जम सकता है ।
  5. तैयार वेक्टर और डालने पर गिब्सन विधानसभा प्रदर्शन ।
    1. बर्फ पर गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रियाओं की स्थापना की । का प्रयोग करें ५० सदिश के एनजी और 7 एक 20 μL प्रतिक्रिया में डालने के एनजी । पतला आवेषण 1:10 ultrapure पानी में pipetting की सुविधा के लिए । सेट अप एक वेक्टर केवल गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रिया, ५० का उपयोग कर वेक्टर के एनजी और पानी के साथ डालने की जगह ।
    2. ५० डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रियाओं गर्मी, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पकड़ के बाद ।
    3. बर्फ के लिए इकट्ठे उत्पादों हस्तांतरण । बर्फ पर ultrapure पानी में इकट्ठे उत्पादों 1:4 पतला । उदाहरण के लिए, गिब्सन विधानसभा उत्पाद के 5 μL जोड़ने के लिए 15 ultrapure पानी की μL ।
  6. पतला गिब्सन विधानसभा उत्पादों को बदलने ।
    1. बर्फ पर गल उच्च दक्षता सक्षम कोशिकाओं और प्रत्येक परिवर्तन के लिए 25 μL aliquots बनाते हैं । यदि एक जटिल कई साइटों को लक्षित पूल वांछित है, अलग ट्यूबों में गल पर्याप्त कोशिकाओं को एक ही जटिल gRNA पूल के कई स्वतंत्र रूपांतरण प्रदर्शन करते हैं ।
    2. प्रत्येक पतला उत्पाद के लिए, सक्षम कोशिकाओं के 25 μL युक्त एक १.७ मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब के लिए इस कमजोर पड़ने के 1 μL जोड़ें । संक्षेप में ट्यूब फ़्लिक करके मिक्स । 30 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब मशीन ।
    3. गर्मी सदमे में ४२ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए कोशिकाओं, तो बर्फ को तुरंत हस्तांतरण के लिए 2 मिनट ।
    4. जोड़ें ३०० μL समाज मीडिया (2% tryptone, ०.५% खमीर निकालने, 10 मिमी NaCl, २.५ मिमी KCl, 10 मिमी MgCl2, 10 मिमी MgSO4, और 20 मिमी ग्लूकोज) और कोशिकाओं 1 के लिए ठीक हो रही के साथ ३७ ° c में मिलाते (३०० rpm) । इस समय के दौरान, एम्पीसिलीन/carbenicillin के साथ आगार प्लेटें एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म । प्रत्येक परिवर्तन के लिए एक थाली का उपयोग करें ।
    5. प्लेट ५० कोशिकाओं की μL और रात भर एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में प्लेटों जगह है । व्यक्तिगत साइटों को लक्षित पूल के लिए, पौंड शोरबा (सामग्री की मेज) एम्पीसिलीन/carbenicillin (1 मिलीग्राम/एमएल) और minipreps के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर २५० rpm पर मिलाते के साथ रात भर की मशीन के 3-5 मिलीलीटर में सीधे जगह ।
  7. कोशिकाओं फसल और डीएनए को अलग ।
    1. बड़ी गाइड आरएनए पुस्तकालयों के लिए कई साइटों को लक्षित, एक प्लेट खुरचनी का उपयोग करने के लिए एक maxiprep (१५० मिलीलीटर तरल संस्कृति) में प्रत्येक व्यक्ति की थाली से सभी कालोनियों को इकट्ठा । यह एक ५० मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ पौंड की ~ 5 मिलीलीटर डालने और ट्यूब में कालोनियों परिमार्जन द्वारा सुविधा दी जा सकती है । व्यक्तिगत साइटों को लक्षित पुस्तकालयों के लिए, एक miniprep (3-5 मिलीलीटर तरल संस्कृति) में प्लेटों परिमार्जन ।
    2. २५० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3-5 ज के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ इन संस्कृतियों की मशीन ।
    3. endotoxin-मुक्त प्रस्तुतीकरण में परिणाम है कि एक किट का उपयोग डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन ।
    4. एक fluorometer या spectrophotometer का उपयोग कर डीएनए यों तो । Plasmids अभिकर्मक में तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या भविष्य में उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
  8. एकल साइटों को लक्षित छोटे पूल के लिए U6 वेक्टर के भीतर गाइड आरएनए अनुक्रम की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, तालिका 1में सूचीबद्ध "U6_PCR_R" प्राइमर के साथ तैयार miniprep पर सैंज अनुक्रमण का उपयोग करें । गाइड RNAs के पूलिंग के कारण, 19 basepair gRNA लक्ष्य अनुक्रम मिश्रित कुर्सियां निकलेगा, लेकिन U6 प्रमोटर और गाइड आरएनए पाड़ आसपास इस अनुक्रम बरकरार रहना चाहिए.

4. बढ़ाने की अभिकर्मक-i

नोट: एक एस्ट्रोजन बढ़ाने का उपयोग कर प्रतिक्रिया के सफल नाकाबंदी के लिए-मैं Ishikawa कोशिकाओं में, यह 5-7 दिन के लिए एस्ट्रोजन की कोशिकाओं को वंचित करने के लिए अभिकर्मक से पहले उंहें phenol लाल मुक्त RPMI में बनाए रखने के द्वारा 10% चारकोल-छीन लिया FBS और 1% के साथ आवश्यक है पेनिसिलिन/streptomycin. कोशिकाओं के दौरान और अभिकर्मक के बाद इस मीडिया में कल्चरित किया जाना चाहिए यदि एक एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया ब्लॉक करने की कोशिश कर रहा. हम पूरी phenol लाल मुक्त RPMI में कोशिकाओं के पारित होने के लिए phenol लाल मुक्त trypsin के उपयोग की सलाह देते हैं ।

  1. अभिकर्मक से पहले दिन, प्लेट कोशिकाओं (या तो जंगली प्रकार या छुरा SID4X-dCas9-KRAB व्यक्त) में एक 24 अच्छी तरह से थाली में 30-50% पर प्रवाह (~ ६०,००० प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं Ishikawa कोशिकाओं के लिए) । प्लेट पर्याप्त कोशिकाओं ऐसी है कि transfections डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया जा सकता है, और कुओं को शामिल नियंत्रण गाइड RNAs के साथ transfected हो ।  कोशिकाओं को समान रूप से धीरे से चरण 1.1.7 में के रूप में सेल चढ़ाना के बाद थाली मिलाकर अच्छी तरह से भर में वितरित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
    नोट: इस प्रोटोकॉल cationic liposome-आधारित अभिकर्मक एजेंट का उपयोग मानता है । Electroporation इन रिएजेंट के लिए बहुत संवेदनशील हैं जो कक्ष प्रकारों के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है । अभिकर्मक शर्तों को बढ़ाने के प्रयास से पहले ब्याज की सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए-मैं प्रयोगों ।
  2. अगले दिन, पसंद के अभिकर्मक रिएजेंट के निर्देशों के अनुसार transfections तैयार करें । Ishikawa कोशिकाओं के लिए, एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए कुल प्लाज्मिड के ५५० एनजी का उपयोग करें । सीरम-मुक्त मीडिया में ०.०२० μg/μL के एक अंतिम एकाग्रता के लिए plasmids को पतला (डीएनए की १.१ μg में μL 2 कुओं के लिए कुल मात्रा का ५२ transfecting) । १.२ कदम में वर्णित के रूप में डीएनए, भंवर और मशीन के हर 1 μg के लिए अभिकर्मक रिएजेंट के 3 μL का प्रयोग करें । अंतिम मिश्रण के 25 μL को एक अच्छी तरह से जोड़ें ।
    नोट: साइटों के संयोजन को लक्षित करने के लिए, प्रत्येक व्यक्तिगत साइट के लिए प्लाज्मिड के समान वजन का उपयोग करें, और फिर एक नियंत्रण प्लाज्मिड (खाली गाइड आरएनए क्लोनिंग वेक्टर या गाइड RNAs जैसे एक नकारात्मक नियंत्रण क्षेत्र को लक्षित करने के साथ बचे हुए वजन भरें IL1RN प्रमोटर) । क्षणिक transfections के लिए, 3:2 Cas9 फ्यूजन के अनुपात का उपयोग करें: गाइड आरएनए प्लाज्मिड. Plasmids युक्त फ्लोरोसेंट पत्रकारों अभिकर्मक क्षमता पर नजर रखने के लिए जोड़ा जा सकता है ।
  3. ३६ ज पोस्ट अभिकर्मक में, 10% चारकोल के साथ phenol रेड फ्री RPMI का उपयोग कर मीडिया बदल-छीन FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin (Ishikawa कोशिकाओं के लिए) और आपूर्ति puromycin (अंतिम एकाग्रता: 1 μg/एमएल) और निओमायसिन (अंतिम एकाग्रता: ३०० एनजी/ कोशिकाओं अभिकर्मक एजेंट के लिए संवेदनशील हैं, तो मीडिया पहले बदला जा सकता है, लेकिन एंटीबायोटिक्स 24 ज पोस्ट अभिकर्मक से कोई पहले जोड़ा जाना चाहिए ।
    ध्यान दें: कोशिकाओं को कटाई से पहले एंटीबायोटिक को जोड़ने के बाद कम से 24 ज रुको । अभिव्यक्ति बढ़ाने के कारण परिवर्तन-मैं ४८ एच पोस्ट अभिकर्मक के रूप में जल्दी के रूप में पता लगाया जा सकता है और 5 दिनों के बाद अभिकर्मक । यदि एस्ट्रोजन से वंचित किया गया है कि Ishikawa कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, एंटीबायोटिक उपचार के बाद दिन में एक 8-एच 10 एनएम 17β-एस्ट्राडियोल (E2) प्रेरण प्रदर्शन और फिर कोशिकाओं को तुरंत फसल ।

5. सेल हार्वेस्ट और आरएनए निष्कर्षण

  1. 1% β-mercaptoethanol (BME) के साथ lysis बफर तैयार करें । सुनिश्चित करें कि पर्याप्त lysis-BME मिश्रण (३०० μL के लिए एक अच्छी तरह से काटा जा रहा है) ।
  2. एक वैक्यूम aspirator का उपयोग कर मीडिया महाप्राण ।
  3. 1x पंजाबियों (५०० μL) की बराबर मात्रा के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और जितना संभव हो उतना पंजाबियों को निकालने के लिए महाप्राण ।
  4. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक अच्छी तरह से lysis-BME समाधान के ३०० μL जोड़ें । पिपेट lysis समाधान ऊपर और नीचे 8-10 बार, और एक गहरी अच्छी तरह से प्लेट या बर्फ पर १.७ मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों के लिए स्थानांतरण । आरएनए तुरंत निकाला जा सकता है, या lysates भविष्य प्रसंस्करण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है ।
  5. lysates से आरएनए निकालने के लिए, एक DNase उपचार शामिल है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करें । ultrapure पानी (RNase-मुक्त, DNase-मुक्त) या रेफरेंस बफर और Elute आरएनए की सबसे छोटी सिफारिश की मात्रा में । नमूनों की छोटी संख्या के लिए, एक fluorometer या spectrophotometer का उपयोग करें । नमूनों की बड़ी संख्या के लिए, एक फ्लोरोसेंट जांच है कि आरएनए का पता लगाता है और एक प्लेट रीडर पर उपाय का उपयोग करें । नमूने ठहराव से पहले या बाद में-८० ° c पर जमे हुए किया जा सकता है ।

6. एक कदम qPCR और आरएनए-seq का उपयोग जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन को बढ़ाता है

  1. ब्याज के जीन के लिए qPCR प्राइमरों प्राप्त करने के लिए और कम से एक गृह व्यवस्था जीन है कि लक्षित जीन के स्तर के पास व्यक्त की है और प्रयोगात्मक परिस्थितियों में परिवर्तन नहीं के लिए । आदर्श रूप में, इन प्राइमरों एक एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन अवधि के लिए जीनोमिक डीएनए के प्रवर्धन से बचने होगा ।
    1. आरएनए पर इन प्राइमरों का परीक्षण ब्याज की सेल लाइन से प्राप्त की । एक ही उत्पाद के उत्पादन को सत्यापित करने के लिए वक्र विश्लेषण पिघल का उपयोग करें । यदि एक भी उत्पाद का उत्पादन नहीं होता है, तो अतिरिक्त प्राइमरी जोड़ियों का परीक्षण करें ।
  2. प्रत्येक बढ़ाने के लिए-मैं और नियंत्रण गाइड आरएनए का इलाज नमूना, कि कितने जीन कि नमूने में परख की जानी चाहिए की पहचान । जीन के इस सेट में ऐसी CTCF या GAPDHके रूप में गृह व्यवस्था जीन, शामिल होना चाहिए ।
  3. qPCR प्रतिक्रियाओं को सेट करें ।
    1. पानी में एक ही एकाग्रता के लिए सभी नमूनों को पतला, इस तरह कि कुल आरएनए के ५० एनजी आसानी से pipetted है, और प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त पतला आरएनए है । उदाहरण के लिए, पतला आरएनए के लिए ~ १६.६ एनजी/μL और प्रत्येक प्रतिक्रिया में आरएनए के 3 μL का उपयोग करें । मास्टर घोला जा सकता है की स्थापना करते हुए बर्फ पर आरएनए रखो.
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक कदम qPCR किट का उपयोग कर मापा जा करने के लिए प्रत्येक जीन के लिए अलग मास्टर घोला जा सकता है तैयार. प्रत्येक प्राइमर (10 माइक्रोन स्टॉक समाधान) के 1 μL के साथ एक 20 μL प्रतिक्रिया मात्रा का प्रयोग करें । इन प्रतिक्रियाओं को बर्फ पर सेट करें ।
    3. थर्मल साइकिल चालक के लिए उपयुक्त है कि एक प्रतिक्रिया प्लेट में, गुरु घोला जा सकता है के बाद आरएनए नमूने जोड़ें । एक प्लेट मुहर के साथ सील और भंवर या pipetting द्वारा धीरे मिश्रण । संक्षेप में प्लेट (६० एस के लिए १४० x जी) के लिए सुनिश्चित करें कि तरल कुओं के नीचे है ।
    4. इस प्रकार के रूप में एक थर्मल साइकिल चालक में थाली मशीन (या किट निर्देश के रूप में): ४८ ° c के लिए 30 मिनट, ९५ ° c के लिए 10 मिनट, ४० चक्र के लिए (९५ ° c के लिए 15 s, ६० ° c 1 मिनट के लिए).
  4. प्रत्येक नमूने के भीतर मापा प्रत्येक जीन के लिए सीटी मूल्यों प्राप्त करें । जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान के लिए तुलनात्मक सीटी विधि का प्रयोग करें ।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए ब्याज की प्रत्येक जीन की सीटी से गृह व्यवस्था जीन की सीटी घटाना सामान्यीकृत सीटी मूल्यों उत्पंन करने के लिए ।
    2. नियंत्रण के लिए नमूनों का इलाज, प्रत्येक जीन के लिए सामान्यीकृत सीटी मूल्यों का एक औसत ले । लॉग आधार 2-स्केल गुना दमन तो सामान्यीकृत बढ़ाने से गणना की जा सकती है-मैं नियंत्रण के लिए एक ही मूल्य से प्रत्येक जीन के लिए नमूना सीटी इलाज इसी जीन के लिए नमूना इलाज किया ।
  5. बढ़ाने के बाद जीन अभिव्यक्ति में वैश्विक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए-मैं उपचार, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट उपयोगकर्ता के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के साथ संगत का उपयोग कर आरएनए अनुक्रमण के लिए नमूने तैयार करते हैं । का प्रयोग करें ~ ५०० आरएनए के एनजी सामग्री शुरू करने के लिए और तैयार पुस्तकालयों के लिए कम से 2 जैविक प्रतिकृति ।

7. SID4X द्वारा विशिष्ट जीनोमिक लक्ष्यीकरण का सत्यापन-dCas9-KRAB चिप-seq का उपयोग

नोट: SID4X-dCas9-KRAB फ्यूजन प्रोटीन दोनों एक झंडा epitope टैग और एक हा epitope टैग होता है, लेकिन चिप seq के लिए सबसे अच्छा परिणाम विरोधी ध्वज एंटीबॉडी के साथ प्राप्त किया गया । यदि वांछित, उपयोगकर्ता प्रतिलेखन के लिए अतिरिक्त चिप-seq प्रयोगों संभावित बढ़ाने से प्रभावित कारकों-i, या H3K27ac, बढ़ाने गतिविधि है कि बढ़ाने की कमी आई है की एक छाप के लिए प्रदर्शन कर सकते है-i । हालांकि, प्रत्येक चिप-seq प्रयोग 10 x 106 कक्षों की आवश्यकता होती है, इसलिए तदनुसार योजना बनाएं ।

  1. बढ़ाने के साथ Transfect कोशिकाओं-मैं पूल ।
    1. एक 15 सेमी ऊतक संस्कृति डिश में प्लेट 10 एक्स 106 कोशिकाओं । प्रत्येक डिश 1 ब्याज की एक कारक के लिए चिप-seq प्रयोग का प्रतिनिधित्व करता है ।
    2. अगले दिन, transfect डिश प्रति कुल डीएनए के 20 μg का उपयोग कर कोशिकाओं । सेल लाइनों में transfections के लिए छुरा SID4X-dCas9-KRAB व्यक्त, डीएनए गाइड के एक प्लाज्मिड पूल ब्याज की सभी साइटों को लक्षित किया जाना चाहिए, और वैकल्पिक रूप से एक RNAs फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त । क्षणिक transfections के लिए, 3:2 dCas9 फ्यूजन प्रोटीन के अनुपात का उपयोग करें: गाइड आरएनए पूल । अंय TFs या हिस्टोन संशोधनों के चिप-seq के लिए, कम से एक अतिरिक्त नियंत्रण गाइड आरएनए अभिकर्मक एक और डिश पर करते हैं ।
    3. puromycin (1 μg/एमएल) और 24-48 एच पोस्ट अभिकर्मक में निओमायसिन (३०० एनजी/एमएल) के साथ बर्तन की दावत । फसल कटाई से पहले कम से क्रोमेटिन 24 ज रुको ।
  2. व्यंजन से फसल क्रोमेटिन ।
    नोट: बढ़ाने के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए-मैं एर जीनोमिक पर Ishikawa कोशिकाओं में बाध्यकारी, नियंत्रण गाइड RNAs और बढ़ाने के साथ transfected व्यंजन पर एक 1 एच 10 एनएम E2 उपचार प्रदर्शन-मैं फसल से पहले । H3K27ac पर बढ़ाने के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, नियंत्रण गाइड RNAs और बढ़ाने के साथ transfected व्यंजन पर एक 8 एच 10 एनएम E2 प्रेरण प्रदर्शन-मैं फसल से पहले ।
    1. प्रत्येक डिश के लिए ३७% formaldehyde के ५०० μL लागू करें (1% की अंतिम एकाग्रता) । प्लेटें संक्षेप में घूमता है । प्लेटें 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं ।
    2. २.५ मीटर glycine (१२५ मिमी की अंतिम एकाग्रता) की 1 मिलीलीटर जोड़ें । प्लेटें संक्षेप में घूमता है ।
    3. formaldehyde और glycine के साथ मीडिया बंद डालो । एक समान मात्रा (~ 20 एमएल) कोल्ड 1x पंजाबियों के जोड़ें ।
    4. बंद करो पंजाबियों डालो । एक वैक्यूम aspirator के साथ महाप्राण जितना संभव हो उतना पंजाबियों को हटा दें । व्यंजन को बर्फ पर लगाएं ।
    5. Farnham lysis बफर (5 मिमी पाइप पीएच ८.०, ८५ मिमी KCl, ०.५% NP-४०) 1x के साथ एक थाली के लिए (बस का उपयोग करने से पहले जोड़ा)-3-5 मिलीलीटर ठंड 1x एक प्लेट खुरचनी के साथ पकवान परिमार्जन और बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण ।
    6. गोली क्रोमेटिन 5 मिनट के लिए एक केंद्रापसारक में ट्यूब नीचे कताई द्वारा १००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर supernatant त्यागें और छर्रों की दुकान पर-८० ° c भविष्य के उपयोग के लिए, या विकल्प के चिप seq प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी या एंटीबॉडी अंय लक्ष्यीकरण का उपयोग प्रतिलेखन कारकों या ब्याज की हिस्टोन संशोधनों (H3K27ac, H3K9me3) ।

Representative Results

चित्र 1 प्रोटोकॉल में वर्णित कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध रूप से पता चलता है । एस्ट्रोजन-विनियमित जीन MMP17के पास एर-बाउंड बढ़ाने के योगदान का निर्धारण करने के लिए, जिसमें चिप-seq (चित्र 2a) द्वारा परिभाषित 3 बाइंडिंग साइटें हैं, प्रत्येक क्षेत्र के लिए गाइड RNAs डिजाइन किए गए थे । गाइड RNAs डिजाइन करने के लिए, एक ६००-९०० के अनुक्रम के बीपी खिड़की ब्याज की प्रत्येक एर बाइंडिंग साइट आसपास का चयन किया गया था और एक गाइड आरएनए डिजाइन कार्यक्रम में डाल दिया । 0-2 के साथ जिसके परिणामस्वरूप गाइड आरएनए अनुक्रम बंद लक्ष्य साइटों की भविष्यवाणी की BLAT का उपयोग कर मानव जीनोम के लिए गठबंधन किया गया । चिप-seq और DNaseI अतिसंवेदनशीलता द्वारा निर्धारित क्षेत्र में फैले चार गैर-अतिव्यापी मार्गदर्शिका RNAs को टार्गेटिंग (चित्र b) के लिए चुना गया था । अतिरिक्त अनुक्रम (तालिका 1) के बहाव क्लोनिंग की सुविधा के लिए प्रत्येक के अंत में जोड़ा गया था और जिसके परिणामस्वरूप ५९ न्यूक्लियोटाइड टुकड़े का आदेश दिया गया था । आगमन पर, गाइड RNAs पतला और साइट द्वारा परित थे, और एक छोटी पीसीआर को समरूपता क्षेत्र जोड़ने के लिए गिब्सन विधानसभा से पहले किया गया था । चित्रा 2c "U6_internal" प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग कर एक छोटी पीसीआर के बाद उम्मीद गाइड आरएनए उत्पाद से पता चलता है, जो ५९ basepair गाइड आरएनए टुकड़ा के प्रत्येक अंत करने के लिए अनुक्रम के 20 basepairs जोड़ देगा, एक ~ १०० basepair अनुक्रम में जिसके परिणामस्वरूप. गिब्सन विधानसभा के बाद, इन गाइड आरएनए पूल बैक्टीरिया में तब्दील हो गए थे और प्लाज्मिड minipreps अगले दिन तैयार थे । चित्रा 2d एक बढ़ाने विच्छेदन प्रयोग, जहां एकाधिक बढ़ाने पास MMP17 पास अकेले और संयोजन में बढ़ाने का उपयोग कर रहे है से परिणाम से पता चलता है । बढ़ाने के द्वारा लक्षित साइटें-मैं एक काले षट्कोण के साथ संकेत दिया जाता है । गाइड आरएनए plasmids लक्ष्यीकरण संकेत साइटों एक एस्ट्रोजन-वंचित Ishikawa सेल लाइन में transfected थे छुरा SID4X-dCas9-KRAB व्यक्त । दो दिन बाद, मीडिया बदल गया था और puromycin transfected कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए जोड़ा गया था । अगले दिन, कोशिकाओं को एक 8 एच 10 एनएम एस्ट्राडियोल उपचार के बाद काटा गया । आरएनए अलग था, और एक कदम qPCR प्रदर्शन किया गया था । इस उदाहरण में, साइटें 1 और 2 MMP17की एक पूर्ण एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं, जबकि साइट 3 इन शर्तों (चित्र 2d, गलियाँ ii-iv) के अंतर्गत योगदान नहीं करती है । जब केवल साइटों 2 या 3 (vi और सातवीं) सक्रिय हैं, एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया जब कोई साइट (viii) सक्रिय हैं, सुझाव है कि इन साइटों को स्वतंत्र रूप से योगदान नहीं कर सकते है के समान है । 1 साइट खुद (v) द्वारा कुछ अभिव्यक्ति योगदान कर सकते हैं, लेकिन सबसे बड़ी गतिविधि देखा जाता है जब 1 साइटों और 2 सक्रिय है (iv) ।

एक साथ 4 अलग जीन के पास 10 बढ़ाने में हेरफेर करने के लिए (चित्र 3ए), गाइड RNAs के जटिल पूल ४२ बढ़ाने गाइड और 16 प्रमोटर गाइड युक्त उत्पन्न किया गया. गाइड आरएनए ओलिगोस्पर्मिया प्रारंभिक गाइड आरएनए एक्सटेंशन पीसीआर (चरण ३.३) से पहले परित थे, और जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों को शुद्ध और खाली puromycin U6 क्लोनिंग गिब्सन विधानसभा का उपयोग कर वेक्टर के साथ संयुक्त थे । गिब्सन विधानसभा के बाद, कई स्वतंत्र परिवर्तनों प्रदर्शन किया और चढ़ाया गया । प्लेटों को पौंड में स्क्रैप किया गया और maxiprep से पहले 2-4 एच के लिए बाहर बढ़ने की अनुमति दी गई । चित्र बी qPCR द्वारा जीन अभिव्यक्ति में प्रतिनिधि कटौती से पता चलता है जब इन गाइड आरएनए पूल एक एस्ट्रोजन-वंचित Ishikawa सेल लाइन में छुरा transfected व्यक्त SID4X-dCas9-KRAB और ऊपर वर्णित के रूप में इलाज किया गया (चित्रा 2d) । बढ़ाने से कटौती-मैं ख्यात लक्ष्य जीन के प्रवर्तक को लक्षित करने से प्राप्त उन लोगों के समान हैं । चित्रा 3 सी को बढ़ाने का उपयोग एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया की कमी पर गाइड RNAs के कमजोर पड़ने के प्रभाव से पता चलता है-i. एक गाइड आरएनए पूल के 1:50 कमजोर पड़ने के पास बढ़ाने के लिए लक्ष्यीकरण G0S2 अभी भी जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी पैदावार, सुझाव है कि बढ़ाने-मैं एक बार में ५० साइटों के लिए लक्ष्य किया जा सकता है । हालांकि, निष्क्रियता को पतला किया जा सकता है, यह दर्शाता है कि सैकड़ों साइटों को एक साथ तब तक लक्षित नहीं किया जा सकता जब तक कि अधिक संवेदनशील खोज पद्धतियां नियोजित न हों ।

Figure 1
चित्र 1. मल्टीप्लेक्स बढ़ाने के लिए प्रोटोकॉल योजनाबद्ध लकीर बढ़ाने का उपयोग कर-i. गाइड RNAs (लाल और नीले) ई का उपयोग कर तैयार कर रहे है कुरकुरा और UCSC जीनोम ब्राउज़र का उपयोग कर चुना । चार गाइड RNAs कि अवधि के हित के क्षेत्रों (प्रतिलेखन कारक चिप-seq द्वारा परिभाषित के रूप में बंधन साइटों) चुना जाता है । गाइड आरएनए oligonucleotides कि ब्याज के क्षेत्र (लाल और नीला) द्वारा परित किया गया है एक पीसीआर से गुजरना समरूपता क्षेत्रों (नारंगी) गिब्सन विधानसभा और परिवर्तन करने से पहले जोड़ने के लिए । जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड पूल lipofection के माध्यम से transfected-dCas9-KRAB SID4X के साथ संयोजन के रूप में जंगली प्रकार के कोशिकाओं में SID4X-dCas9-KRAB या व्यक्त कर रहे है सेल लाइनों में । गाइड आरएनए प्लाज्मिड पूल एक समय में एक साइट को लक्षित करने के लिए व्यक्तिगत रूप से transfected जा सकता है, या संयोजन में एक साथ कई साइटों को लक्षित करने के लिए । Transfected कोशिकाओं को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज कर रहे है गाइड RNAs युक्त कोशिकाओं के लिए समृद्ध । पर ~ ७२ ज पद अभिकर्मक, कोशिकाओं को काटा जाता है । न्यूक्लिक एसिड qPCR, आरएनए-seq, या चिप seq के लिए निकाला जा सकता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. गाइड आरएनए डिजाइन और बढ़ाने के लिए विच्छेदन MMP17। (क) MMP17 के पास लक्षित किया जा करने के लिए एर अल्फा बाध्य बढ़ाने (ग्रे) के जीनोम ब्राउज़र स्क्रीनशॉट । यह आंकड़ा Carleton, एट अल से संशोधित किया गया है । 18. (ख) 3 बाध्यकारी साइटों के लिए गाइड आरएनए डिजाइन18। चिप द्वारा परिभाषित के रूप में ईआर के लिए बाध्यकारी साइट-seq लक्ष्य है, और इस क्षेत्र में 4 गाइड RNAs टाइल । DNaseI संवेदनशीलता संकेत है, जो बाइंडिंग साइट तक फैला है, भी गाइड आरएनए डिजाइन के लिए लक्ष्य अनुक्रम को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । दोनों चिप seq और DNaseI एच एस डेटा 1 एच के लिए 10 एनएम एस्ट्राडियोल के साथ इलाज Ishikawa कोशिकाओं से प्राप्त किया गया था. (ग) प्रतिनिधि गाइड आरएनए अनुक्रम कि गिब्सन विधानसभा के लिए तैयार कर रहे हैं, समरूपता क्षेत्रों को जोड़ने के लिए एक छोटी पीसीआर आया । (घ) MMP17 के सापेक्ष अभिव्यक्ति बढ़ाने के साथ विशिष्ट क्षेत्रों के लक्ष्यीकरण के बाद qPCR के माध्यम से मापा-मैं और एक 8-h10 एनएम एस्ट्राडियोल उपचार । अभिव्यक्ति एस्ट्राडियोल के साथ व्यवहार नहीं कक्षों में CTCF और व्यंजक स्तर MMP17 के सापेक्ष है । नियंत्रण मार्गदर्शिका RNAs IL1RN के प्रवर्तक को लक्षित करते हैं । सभी त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं, दोहरे तारांकन चिह्न इंगित करता है p < 0.01 और एकल तारांकन चिह्न किसी युग्मित t-परीक्षण में p < 0.05 इंगित करते हैं । इस आंकड़े को Carleton, एट alसे संशोधित किया गया है । 18. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3. विभिन्न जीन के पास कई बढ़ाने को लक्षित करने के साथ-साथ परित बढ़ाने-i. (क) बाध्यकारी साइटों और प्रमोटरों की योजनाबद्ध को परित बढ़ाने में लक्षित है-i. (ख) अभिव्यक्ति पर प्रभाव के रूप में qPCR द्वारा मापा Ishikawa कोशिकाओं पर E2 उपचार के बाद transfected बढ़ाने के साथ-मैं प्लाज्मिड पूल (हरा), प्रमोटर-i प्लाज्मिड पूल (नीला) या नियंत्रण gRNAs (सफेद)18। सभी जीनों में एक महत्वपूर्ण कमी को बढ़ाने के साथ मनाया जाता है-i. यह आंकड़ा Carleton, एट अलसे संशोधित किया गया था । 18. (ग) Ishikawa कोशिकाओं पर E2 उपचार के बाद G0S2 अभिव्यक्ति स्तरों पर प्रभाव गाइड RNAs लक्ष्यीकरण G0S2की विभिन्न मात्राओं के साथ transfected. एक महत्वपूर्ण कमी भी गाइड आरएनए की छोटी मात्रा (1:50 कमजोर पड़ने) के साथ देखा जा सकता है, सुझाव है कि अप करने के लिए ५० साइटों को एक साथ लक्षित कर सकते हैं । सभी त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं, दोहरे तारांकन चिह्न इंगित करता है p < 0.01 और एकल तारांकन चिह्न किसी युग्मित t-परीक्षण में p < 0.05 इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नाम अनुक्रम
U6_internal_F TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_R GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_F CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_R AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_F GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_R AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_F GTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_R AGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_F AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_R CGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_F CAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_R TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

तालिका 1. प्राइमर गाइड आरएनए विस्तार और अनुक्रमण, qPCR, और फ्यूजन प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से डीएनए अनुक्रम बदलने के बिना अंतर्जात जीनोमिक लोकस में विदारक बढ़ाने समारोह के लिए एक सरल और लचीली विधि का वर्णन करता है । जबकि अवधारणा में इसी तरह से पहले प्रकाशित CRISPR हस्तक्षेप dCas9 का उपयोग कर प्रोटोकॉल-KRAB27, बढ़ाने-मैं 3 मुख्य तरीके में इन प्रोटोकॉल से अलग है । सबसे पहले, बढ़ाने-मैं MAD120 के SIN3A बातचीत डोमेन का उपयोग करने बढ़ाने के लिए निष्क्रियता को प्राप्त करने. बढ़ाने निष्क्रियण HDAC अवरोधकों का उपयोग कर बचाया जा सकता है, सुझाव है कि निष्क्रियता के प्राथमिक तंत्र निर्भर HDAC है । dCas9 के साथ CRISPR हस्तक्षेप के विपरीत-KRAB, बढ़ाने-मैं H3K9me3 के जमाव के लिए नेतृत्व नहीं करता है । इस तथ्य यह है कि बढ़ाने के कारण की संभावना है-मैं गाइड RNAs के क्षणिक परिचय पर निर्भर करता है, कोशिकाओं के साथ 3 दिनों के बाद अभिकर्मक में काटा जा रहा है । CRISPR व्यवधान में, H3K9me3 में वृद्धि 7 दिनों के बाद transduction12में मनाया जाता है । अंत में, बढ़ाने-मैं प्रोटोकॉल एक साथ कई साइटों को लक्षित और लक्ष्यीकरण की दक्षता की निगरानी करने के लिए एक रणनीति प्रदान करता है । मोज़ेक में-seq17, dCas9-KRAB एक साथ कई बढ़ाने को लक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन इस तकनीक अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान करने के लिए एकल सेल आरएनए अनुक्रमण पर निर्भर करता है, और कई जीन (जैसे एस्ट्रोजन प्रतिक्रियाशील जीन के रूप में) जाने के कारण पता चला कम एकल-सेल आरएनए-seq. बढ़ाने की संवेदनशीलता-मैं व्यक्तिगत रूप से और किसी भी जीन के लिए संयोजन में बढ़ाने का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है ।

बढ़ाने का सबसे महत्वपूर्ण कदम-मैं अभिकर्मक है, जो ब्याज की सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल puromycin उपचार पर निर्भर करता है transfected कोशिकाओं के लिए समृद्ध है, लेकिन यह संभव है कि सह transfecting गाइड एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ RNAs और फ्लोरोसेंट प्रवाह cytometry का उपयोग कर कोशिकाओं के लिए छंटाई के लिए एक बेहतर संवर्धन विधि साबित हो सकता है कुछ सेल के लिए प्रकार. हम qPCR के निवारण और पुष्टि करने के लिए अभिकर्मक द्वारा मार्गदर्शिका RNAs और SID4x-dCas9-KRAB के व्यंजक स्तर की निगरानी करने का सुझाव देते हैं । अगर गाइड आरएनए स्तर कम कर रहे हैं (चक्र दहलीज > 30), उपयोगकर्ताओं को भी वैकल्पिक गाइड आरएनए उत्पादन रणनीतियों पर विचार कर सकते हैं जैसे इन विट्रो प्रतिलेखन28. यह भी संभव है कि उच्च gRNA स्तर के बावजूद, गाइड आरएनए लक्ष्यीकरण SID4x-dCas9-KRAB प्रोटीन अक्षम है, जो मामले में अलग गाइड आरएनए अनुक्रम का चयन आवश्यक हो सकता है. चिप-seq बढ़ाने से क्रोमेटिन के साथ फ्यूजन प्रोटीन पर प्रदर्शन करके-मैं कोशिकाओं का इलाज, लक्ष्यीकरण की क्षमता पर नजर रखी जा सकता है. यदि ब्याज के क्षेत्र में SID4x-dCas9-KRAB का उच्च संकेत है, और इसके ख्यात लक्ष्य जीन में कोई अभिव्यक्ति परिवर्तन का पता चला रहे हैं, तो इस क्षेत्र की संभावना का अध्ययन शर्तों के तहत है कि जीन की अभिव्यक्ति के लिए योगदान नहीं है ।

बढ़ाने की एक संभावित सीमा-मैं है कि बंद लक्ष्य प्रभाव भी कई साइटों को एक साथ लक्षित कर रहे है जमा कर सकते हैं । बहरहाल, पछाड़ना के लिए CRISPR हस्तक्षेप रणनीतियों से कम है RNAi29से लक्ष्य प्रभाव, विशेष रूप से जब एक polyclonal सेल लाइन व्यक्त dCas9-KRAB का प्रयोग किया जाता है । जब तक हम SID4X-dCas9-KRAB के लक्ष्य जीनोमिक बाध्यकारी देखा है जब एक साथ 10 साइटों को लक्षित, हम उन बाध्यकारी घटनाओं का एक परिणाम के रूप में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान नहीं है । के रूप में कुछ बढ़ाने कई प्रमोटरों और/या अंय बढ़ाने से संपर्क कर सकते हैं, यह संभव है कि कई जीन एक बढ़ाने के लक्ष्यीकरण पर अभिव्यक्ति बदल सकते हैं, हालांकि यह स्पष्ट नहीं है अगर जीन विनियमन के इस फार्म का आम है । यह पुष्टि करने के लिए कि अभिव्यक्ति परिवर्तन स्वीकार्य एक विशिष्ट बढ़ाने को लक्षित करने के कारण हैं, और नहीं बंद-लक्ष्य प्रभाव, उपयोगकर्ताओं को बढ़ाने कर सकते है-मैं एक ही क्षेत्र को लक्षित RNAs गैर अतिव्यापी गाइड के दो विशिष्ट सेट के साथ । इसके अलावा, nuclease का उपयोग कर क्षेत्र के आनुवंशिक विलोपन-सक्षम Cas9 आगे जीन अभिव्यक्ति पर इसके प्रभाव की पुष्टि कर सकते हैं ।

बढ़ाने के रूप में-मैं हिस्टोन deacetylation के माध्यम से कार्य करता है, यह संभव है कि अपनी निष्क्रियता क्षमता बढ़ाने के लिए सीमित कर रहे है कि हिस्टोन acetylation के प्रशंसनीय स्तर है । वहां वैकल्पिक दमन संलयन है कि विशिष्ट बढ़ाने को लक्षित करने में अधिक प्रभावी हो सकता है की एक किस्म है । डीएनए methyltransferase फ्यूजन dCas9 करने के लिए जीन अभिव्यक्ति को कम जब बाहर बढ़ाने के लिए लक्षित30इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस दमन अक्सर क्षणिक नहीं है । एक अंय दमनकारी संलयन GATA1 (FOG1) डोमेन है, जो हिस्टोन H3 lysine 27 trimethylation और dCas9 के समान स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है के दोस्त का उपयोग करता है सेल लाइनों और प्रमोटरों की एक किस्म में31। दिलचस्प है, FOG1 की अधिक प्रतियां जोड़ने के लिए dCas9 प्रवर्तकों में दमित क्षमता कम, सुझाव है कि सिड डोमेन की एक प्रतिलिपि वर्तमान में बढ़ाने में इस्तेमाल 4 प्रतियां से अधिक बढ़ाने निष्क्रियता प्रदान कर सकता है-i । यह संभव है कि कुछ loci ऊपर dCas9 संलयन के विभिंन संयोजनों द्वारा दोहरी लक्ष्यीकरण से लाभ हो सकता है । उदाहरण के लिए, स्थिर दीर्घकालिक दमन dCas9-DNMT3a और dCas9-KRAB३२के एक साथ transduction द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । इन दमनात्मक संलयन के अधिकांश केवल एक समय में एक एकल लोकस करने के लिए लक्षित किया गया है, और यह एक साथ कई बढ़ाने से जोड़ तोड़ में सबसे प्रभावी है जो स्पष्ट नहीं रहता है.

बढ़ाने-मैं, जबकि जीन की एक मुट्ठी भर के लिए बढ़ाने के संयोजन के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त तरीका है, अभी भी कुछ हद तक प्रवाह में सीमित अगर उपयोगकर्ता के लिए जीन के सैकड़ों के लिए ख्यात बढ़ाने का अध्ययन करना चाहता है । इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों के एक साथ कई नमूनों में एकाधिक जीन यों तो इमेजिंग आधारित प्रौद्योगिकियों को शामिल करेंगे । महत्वपूर्ण बात, इन प्रौद्योगिकियों lysate से आरएनए अणुओं का प्रत्यक्ष पता लगाने के साथ संगत कर रहे हैं, समय लेने वाली आरएनए अलगाव की जरूरत को दूर करने. इन रूपांतरों को बढ़ाने के बड़े सेट के पूछताछ की सुविधा होगी ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIH/NHGRI R00 HG006922 और NIH/NHGRI R01 HG008974 को J.G., और व्याध कैंसर इंस्टिट्यूट द्वारा समर्थित किया गया । J.B.C. जेनेटिक्स T32GM007464 में NIH प्रशिक्षण कार्यक्रम का समर्थन किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZR 96-well Quick-RNA Kit Zymo Research R1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Applied Biosystems 4389986
AflII restriction enzyme NEB R0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L
FuGENE HD Promega E2312
DNA Clean & Concentrator Kit Zymo Research D4013
Buffer RLT Plus Qiagen 1053393
b-estradiol Sigma-Aldrich E2758
Human: Ishikawa cells ECACC 99040201
H3K27ac rabbit polyclonal Active Motif  39133
H3K9me3 rabbit polyclonal Abcam  ab8898
FLAG mouse monoclonal Sigma-Aldrich  F1804
ER alpha rabbit polyclonal Santa Cruz sc-544
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid Addgene  51133 Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector plasmid Addgene  41824 Mali et al., 2013
AflII U6 puromycin plasmid Addgene  106404 Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB plasmid Addgene  106399 Carleton et al., 2017
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads Kapa Biosytems KK8420
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets ThermoFisher Scientific A32959
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich 252549-25ML
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131035
LB Broth ThermoFisher Scientific 10855001
Quick-DNA Miniprep Kit Zymo Research D3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder NEB N0050S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  3. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  4. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).
  5. Lam, D. D., et al. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935 (2015).
  6. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  7. Savic, D., et al. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  10. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).
  11. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  12. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  13. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869 (2010).
  14. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  15. Fulco, C. P., et al. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).
  16. Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  17. Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).
  18. Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).
  19. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  20. Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).
  21. Alland, L., et al. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).
  22. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  23. Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).
  24. Stampfel, G., et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).
  25. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  26. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  27. Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).
  28. Romanienko, P. J., et al. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362 (2016).
  29. Smith, I., et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213 (2017).
  30. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  31. O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  32. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).

Tags

आनुवंशिकी अंक १३६ जीन विनियमन CRISPR/Cas9 बढ़ाने epigenetics कार्यात्मक जीनोमिक्स प्रतिलेखन कारकों
बढ़ाने का विच्छेदन कार्य मल्टीप्लेक्स CRISPR-आधारित बढ़ाने का प्रयोग सेल लाइंस में व्यवधान
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carleton, J. B., Berrett, K. C.,… More

Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines. J. Vis. Exp. (136), e57883, doi:10.3791/57883 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter