Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dissektion af Enhancer funktion ved hjælp af Multiplex CRISPR-baserede forstærker interferens i cellelinjer

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57883
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

Summary

Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at designe og udføre multipleksede målretning af smagsforstærkere med deaktiverende fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, også kendt som forstærker interferens (forstærker-i). Denne protokol giver mulighed for identifikation af smagsforstærkere, der regulerer genekspression og letter dissektion af relationer mellem smagsforstærkere regulerer en fælles mål-genet.

Abstract

Flere smagsforstærkere regulere ofte et bestemt gen, men for de fleste gener, det er uklart, hvilke smagsforstærkere er nødvendige for genekspression, og hvordan disse smagsforstærkere kombineres for at producere en transcriptional svar. Som millioner af smagsforstærkere er blevet identificeret, høj overførselshastighed værktøjer er nødvendige for at bestemme enhancer funktion på en genome-wide skala. Nuværende metoder til at studere enhancer funktion omfatter gøre genetiske sletninger bruger nukleasen-dygtige Cas9, men det er svært at studere kombinatorisk virkningerne af flere smagsforstærkere ved hjælp af denne teknik, da flere successive klonede cellelinjer skal være genereret. Vi præsenterer her, forstærker-i, en CRISPR indblanding-baserede metode, der giver mulighed for funktionel forhør af flere smagsforstærkere samtidig på deres endogene loci. Forstærker-jeg gør brug af to repressive domæner smeltet til nukleasen-mangelfuld Cas9, SID og KRAB, for at opnå enhancer deaktivering via Histon deacetylation på målrettede loci. Denne protokol udnytter forbigående Transfektion af guide RNA'er aktivere forbigående inaktivering af målrettede områder og er særlig effektiv til at blokere inducerbar transcriptional svar på stimuli i vævskultur indstillinger. Forstærker-jeg er meget specifikke, både i sin genomisk målretning og dens virkninger på globale genekspression. Resultaterne fra denne protokol hjælpe til at forstå, om en forstærker bidrager til Gen-ekspression, størrelsen af bidraget, og hvordan bidrag er påvirket af andre nærliggende smagsforstærkere.

Introduction

Storstilet sekventering projekter såsom ENCODE1, køreplanen Epigenomics2og FANTOM3 har identificeret millioner af formodede smagsforstærkere inden for det menneskelige genom på tværs af hundredvis af celletyper. Det anslås at hver promotor associates med et gennemsnit på 4,9 smagsforstærkere og hver forstærker kontakter et gennemsnit på 2,4 gener3, tyder på, at Gen-ekspression er ofte et resultat af integrationen af flere distribuerede regulerende interaktioner. En betydelig resterende udfordring er at definere, ikke kun hvordan de enkelte smagsforstærkere bidrage til genekspression, men hvordan de kombineres for at påvirke udtryk. Genetiske metoder er almindeligt anvendt til at identificere relationer mellem smagsforstærkere i modelorganismer fra Drosophila4 til mus5. Men disse forsøg er tidskrævende og lav-overførselshastighed for studiet af flere smagsforstærkere på flere gener.

En metode til at studere enhancer funktion på en stor skala omfatter massivt parallel reporter assays. Disse assays muliggør samtidige screening af tusindvis af DNA-sekvenser for deres evne til at drive et udtryk for en reporter gen6. Mens disse analyser har vist, at DNA-sekvens alene kan være tilstrækkeligt til at formidle gen forordning information7, kommer de med forbehold af udføres uden for den indfødte kromatin sammenhæng og en heterolog promotor. Endvidere er størrelsen af DNA sekvens bliver analyseret i massivt parallel reporter assays normalt mindre end 200 basepairs, hvilket kan udelukke relevante omkringliggende sekvens. Vigtigere, som reporter assays kun måler aktiviteten af en sekvens på et tidspunkt, tager de ikke hensyn til de komplekse relationer, der kan eksistere mellem smagsforstærkere. Således, mens massivt parallel reporter assays kan være oplysende om den iboende aktivitet af en DNA-sekvens, de ikke nødvendigvis informerer os om funktionen af DNA sekvensen inden for rammerne af genomet.

For nylig smuglet udviklede CRISPR/Cas9 værktøjer8 studiet af genregulering da de tillader sletning af smagsforstærkere i den endogene locus. Dog slette flere smagsforstærkere samtidig kan føre til genomisk ustabilitet, og det er tidskrævende at generere successive enhancer sletninger i en enkelt cellelinje. Derudover nye genomisk sekvens er lavet i stedet for sletning efter reparation, og denne sekvens kan få lovgivningsmæssige funktion. En alternativ version af Cas9 er blevet udviklet specielt til modulerende genekspression, afhængige af fusioner af aktivering9,10 eller undertrykke11,12 domæner til formen nukleasen-mangel af Cas9 (dCas9). Disse fusion proteiner er ideelle til at studere flere loci samtidigt, idet de ikke fysisk ændre DNA-sekvens, og i stedet modulere Epigenetik for at afhøre en regulerende region. Den mest udbredte repressive fusion er KRAB, der rekrutterer KAP1 Co repressor kompleks, fremmer aflejring af undertrykkelse-associerede Histon H3 lysin 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, også kendt som CRISPR indblanding14, har været brugt til target og skærmen individuelle smagsforstærkere for deres bidrag til gen expression15,16; dog er det ikke blevet optimeret for at målrette flere regioner samtidig. En version af multiplex CRISPR indblanding for smagsforstærkere, mosaik-seq17, bruger enkelt celle RNA-seq som en udlæsning, men denne teknologi er dyre og kun velegnede til undersøgelse af stærkt udtrykte gener på grund af den lave følsomhed af enkelt celle RNA-FF.

Vi forsøgte at udvikle en CRISPR indblanding-baseret metode til dissekere kombinatorisk enhancer funktion inden for rammerne af en transcriptional svar til østrogen. Omkring halvdelen af østrogen-responderende gener indeholder 2 eller flere smagsforstærkere bundet af østrogen receptor alpha (ER) i nærheden18, tyder på, at flere smagsforstærkere kan deltage i østrogen reaktion og forståelse af den lovgivningsmæssige logik ville kræve målrette flere smagsforstærkere samtidigt. Som indledende undersøgelser ved hjælp af CRISPR indblanding på initiativtagere foreslog, at ikke alle projektledere er lige så lydhøre over for KRAB-medieret undertrykkelse19, begrundede vi, at tilføjelsen af en særskilt repressive domæne til dCas9 kan lette deaktivering af forskellige smagsforstærkere. Vi valgte Sin3a interagere domæne af Mad1 (SID)20 da det fører til ansættelse af Histon deacetyltransferase21, som fjerner acetylgrupper på histoner, der er forbundet med transcriptional aktivitet. Vigtigere, SID domænet var effektiv til at reducere genekspression når smeltet dCas922 og TALEs23, og Sin3a har vist sig at være en potent repressive co-faktor i en lang række enhancer sekvens sammenhænge24. Vi brugte SID4x-dCas9-KRAB (forstærker-i) for at målrette 10 forskellige smagsforstærkere bundet af Skadestuen, og identificere ER bindingssteder (ERBS), der er nødvendige for østrogen transcriptional svar på 4 gener18. Vi har også målrettet kombinationer af smagsforstærkere til at identificere de websteder, der samarbejder i produktionen af østrogen transcriptional svar. Vi fandt, at op til 50 websteder kan potentielt være målrettet samtidig med påviselig gen expression ændringer. Brug af ChIP-FF. og RNA-FF., viste vi at forstærker-jeg er en meget specifik teknik til at studere flere smagsforstærkere samtidigt.

I denne protokol beskriver vi de forskellige trin i udførelsen af forstærker-i, en fleksibel teknik, der giver funktionelle studier af flere smagsforstærkere samtidigt i vævskultur omgivelser. Forstærker-jeg er stærkt korreleret med genetiske sletning men giver forbigående deaktivering, der er afhængige af Histon deacetyltransferase (HDAC'er). Ved at levere guide RNA'er via forbigående Transfektion i modsætning til stabil integration via virale vektorer, undgår denne protokol deposition og potentielle spredning af H3K9me3. Denne protokol detaljer guide RNA design og kloning via Gibson forsamling, Transfektion af guide RNA'er ved hjælp af lipofection, og analysen af resulterende genekspression ændringer af qPCR. Vi også omfatte metoder til at vurdere specificiteten af forstærker-i målretning på niveauet af genom og transkriptom. Mens denne teknik blev udviklet for at studere genregulering is bundet smagsforstærkere i menneskelige cancer cellelinjer, gælder for dissektion af enhver pattedyr enhancer.

Protocol

1. generation af celle linjer stabilt udtrykker SID4X-dCas9-KRAB

Bemærk: Transfektion betingelser og narkotika koncentrationer præsenteres her er blevet optimeret til Ishikawa celler, en endometrie cancer cellelinie, dyrkes i RPMI 1640 media suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin (komplet RPMI). Andre cellelinjer kan kræve forskellige Transfektion betingelser og narkotika koncentrationer. Brugere kan også udføre forbigående Transfektion eksperimenter i wild-type celler, i stedet for at skabe en stabil cellelinie, med en plasmid udtryk for SID4X-dCas9-KRAB sammen med guide RNA udtrykker plasmider; resultater fra forbigående transfections kan dog vanskeligt at reproducere som SID4X-dCas9-KRAB niveauer kan variere efter Transfektion.

  1. Plade Ishikawa celler i mindst 2 brønde i en 6-godt plade på 30-50% confluence (cirka 300.000 Ishikawa celler) i 3 mL af komplet RPMI.
    1. Opsug medier fra cellerne. Vaske cellerne en gang med 1 x PBS (pH 7,4). Opsug PBS og tilføje trypsin (4 mL i en 10 cm parabol eller 5 mL til en T-75 kolbe).
    2. Inkuber celler for ~ 5 minutter ved 37 ° C, kontrol hver 2 min til fritliggende celler og forsigtigt ryste skibet.
    3. Når celler er skilt, pipette trypsinized celler op og ned et par gange, og pipette forsigtigt ned side af skibet til at frigive alle tilknyttede celler.
    4. Overføre cellerne til en 15 mL konisk slange og spin cellerne ned til 5 min. ved 250 x g.
    5. Opsug trypsin og resuspend celler i 5-10 mL af medier. Bruge P1000 pipette til at adskille celle klumper, hvis nødvendigt.
    6. Tælle cellerne og bestemme mængden skulle plade ~ 300.000 celler pr. brønd i en samlet maengde paa 3 mL. Føje celler til 2 separate brønde i en 6-godt plade. Fyld hver godt til 3 mL med komplet RPMI.
    7. Ryst forsigtigt plade hvert 5 min i de første 15 min efter plating at sikre at cellerne fordeles jævnt på pladen. Brug et mikroskop for at sikre, at cellerne har spredt fra midten af brønden.
  2. Inden for 24 timer af plating, udføre følgende transfections ved hjælp af en passende Transfektion reagens for cellelinie af interesse. Ishikawa celler, bruge proceduren som beskrevet nedenfor.
    Bemærk: Denne protokol forudsætter anvendelse af kationiske Liposom-baserede Transfektion reagenser. Elektroporation giver en alternativ metode til celletyper der er meget følsomme over for disse reagenser eller som udviser lav Transfektion effektivitet med lipofection. Transfektion betingelser skal være optimeret til cellelinie af interesse inden du forsøger at forstærker-i eksperimenter.
    1. I en 1,7 mL Eppendorf tube, fortyndes 2,5 μg af SID4X-dCas9-KRAB plasmid og 800 ng af plasmid udtrykker en fluorescerende proteiner i serumfrit medier, således at den endelige mængden i røret er 155 µL og den endelige koncentration af plasmid er 0,020 µg/µL.
    2. I et andet rør, fortyndet 3,3 µg af et plasmid, der ikke indeholder en neomycin modstand kassette, såsom pCMV-normal god landbrugspraksis, i serumfrit media er således at det endelige rumfang i røret er 155 µL og den endelige koncentration af plasmid 0,020 µg/µL.
    3. Vortex hver tube kort og spin-ned ved hjælp af en mikrofuge.
    4. Tilføje 9,9 µL Transfektion reagens (Table of Materials) til hver tube. Mix af vortexing kort på en lav hastighed. Spin rørene ned med en mikrofuge.
    5. Inkuber rør ved stuetemperatur i mindst 5 min., men ikke mere end 20 min.
    6. Tilføj 150 µL af rede DNA: reagens mix dråbevis til en brønd på 6-godt plade i biosikkerhed kabinet. Gentag for de andre tube rede DNA: reagens mix. Bland pladerne af hvirvlende forsigtigt og returnere pladen til rugemaskine.
  3. På dag 2 indlæg Transfektion, ændre medierne og supplere med G418 til en endelig koncentration på 600 ng/μl. Denne koncentration skal være optimeret til celletype.
  4. Ændre komplet RPMI medier og supplere med G418 hver anden dag for 2-4 uger indtil kontrol transfekteret cellerne er døde og brøndene indeholdende SID4X-dCas9-KRAB sammenflydende. Det nøjagtige beløb af tid for cellerne til at inddrive vil afhænge af den fordobling tid af celler.
  5. Når cellerne blive sammenflydende, passage til en T-25 eller T-75 fartøj i komplet RPMI med en lavere dosis af G418 (300 ng/μl til Ishikawa celler). Under denne passage, gøre 2 delprøver af ~ 100.000 celler hver (ca 1/10th af en 6-godt plade) i 2 separate 1,7 mL Eppendorf rør til RNA og DNA isolation, henholdsvis. Spin disse rør ned (5 min, 250 x g), fjerne trypsin af pipettering og fryse rør ved-20 ° C til fremtidig brug.
  6. Isolere genomisk DNA ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits og udføre PCR ved hjælp af "pAC95_PCR" eller "SID4X_PCR" primere (tabel 1) til at kontrollere tilstedeværelsen af fusion protein inden for i cellelinie. Bruge genomisk DNA ekstraheret fra forældrenes linjen som en negativ kontrol, og SID4x-dCas9-KRAB plasmid DNA som positiv kontrol. Bruge et Hi-Fi-polymerase master mix med 50-100 ng af genomisk DNA og følgende cykling betingelser: 98 ° C i 30 s, 25 cykler af (98 ° C i 10 s, 58 ° C i 30 s, 72 ° C i 2 min.), 72 ° C i 5 min , hold ved 4 ° C.
  7. For at kontrollere udtryk for fusion protein på RNA niveau, skal du udføre qPCR med RNA ekstraheret fra linjen celle ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits. Bruge "dCas9_qPCR" primere (tabel 1), og et-trins qPCR protokol leveret i trin 6.3 i denne protokol.
  8. Hvis du vil kontrollere udtrykket protein-niveau af fusionen, udføre en Western skamplet på lysates fra cellelinie. Brug enten anti-FLAG eller anti-HA antistoffer til at opdage fusion protein.

2. guide RNA Design

Bemærk: Denne protokol er udviklet til brug med U6 guide RNA kloning vektor oprettet af kirken lab og tilgængelig på Addgene (Addgene 41824). For at oprette en version af denne vektor indeholdende puromycin modstand, der er tilladt for den samme kloning strategi som 41824, flyttede vi på flere kloning websted fra denne vektor i pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin vektor (Addgene 51133). Enten Addgene 41824 eller vores version med puromycin (Addgene 106404) er kompatibel med kloning strategien skitseret nedenfor.

  1. Få 600-900 basepairs af DNA-sekvens for hvert lovgivningsmæssige område af interesse. Bruge transskription faktor bindingssteder og/eller kromatin tilgængelighed for vejledning om, hvor at definere region af interesse (figur 2A).
    Bemærk: Mens eksemplet i figur 2A funktioner opstrøms og nedstrøms smagsforstærkere, det er også muligt at målrette regulerende elementer ligger i introns.
  2. Placere alle sekvenser er fremstillet i en enkelt tekstfil benytter formatet FASTA.
  3. Identificere mindst én negativ kontrol-regionen, der ikke forventes at ændre over eksperimentelle betingelser, såsom en promotor af et gen, der ikke er udtrykt i cellelinie af interesse. Få DNA-sekvens for denne region og føje den til tekstfil i FASTA format.
    Bemærk: Vi bruger guide RNA'er målretning IL1RN promotor25 som en negativ kontrol for alle regioner vi målrette. Brugerne kan også vælge intergenic sekvens i nærheden af det pågældende område, der ikke indeholder transskription faktor bindingssteder som en negativ kontrol. Men hvis flere loci målrettes samtidigt, en enkelt negativ kontrol region forenkler eksperimentelle design og fortolkning af resultater. Hvis den målrettede enhancer er intronic, kan det være nyttigt at indskyde en intronic region i den samme locus, som ikke indeholder en formodede regulerende element som en yderligere negativ kontrol, som dCas9 fusion kan interferere med transskription.
  4. Identificere positiv kontrol regioner, som projektledere, der er de formodede mål på de reguleringsmæssige regioner af interesse, eller initiativtagerne af gener, der er stærkt transskriberet i cellelinie af interesse. Få DNA-sekvens for disse regioner og føje den til tekstfil i FASTA format.
  5. Bruge et program som e-sprød26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) på de DNA-sekvenser, der er genereret for at finde guide RNA'er med lav off-mål (ideelt 0-3). Guide RNA'er består af 20 nukleotider opstrøms af protospacer tilstødende motiv (PAM), som tager form "NGG" for dCas9 fra S. pyogenes.
    1. E-sprød hjemmeside, Vælg organisme af interesse ved hjælp af drop-down menuen. Genom-assembly vises til højre for navnet arter.
    2. Vælg alternativknappen Input er FASTA sekvens . Kopiere FASTA sekvenser fra oven og indsætte dem i dialogboksen. Sikre, at en FASTA header er inkluderet for hver sekvens.
      Bemærk: Op til 50 sekvenser kan forespørges samtidigt.
    3. Vælg den Medium radio knap og enkelt design i drop-down menuen.
    4. Klik på knappen Start sgRNA søgning. En ny browserfane vil åbne, og resultaterne vil blive vist. Download kandidat sekvenser ved at klikke på knappen Hent en Excel formateret rapport i tabelformat for alle forespørgslen sekvenser sammen.
    5. Åbn en rapport i tabelformat ved hjælp af Excel eller en tekst redigering program.
  6. Bruge UCSC genom browser til BLAT kandidat fuld længde gRNA sekvenser (23 basepairs) til genomet.
    1. I en browser, gå til UCSC genom-browser hjemmeside (http://genome.ucsc.edu). Under afsnittet vores værktøjer, Find ordet BLAT og klikke på den. Søgeværktøj BLAT åbnes.
    2. Brug drop-down menuer placeret under BLAT Søg genom tekst til at vælge den organisme og genom forsamling af interesse.
    3. Kopiere guide RNA sekvenser fra tabelrapport genereret af e-sprød og indsætte dem i dialogboksen. Sikre, at hver sekvens har en unik FASTA header, klik derefter på Send nederst i dialogboksen.
      Bemærk: Op til 25 sekvenser kan undersøges på én gang. På siden BLAT søgeresultater vises alignments af hver guide RNA sekvens med hver linje, der repræsenterer en justering. Ideelt set bør der være en justering for hver guide RNA, der angiver unikke i at guide RNA.
    4. Undgå de guider, der tilretter til flere steder i genomet, hvis muligt.
    5. For at undersøge guide RNA lokalisering og distribution inden for området af interesse, skal du klikke på linket Browser under afsnittet handlinger for et af de forespurgte guide RNA'er. Genom-Browser vil blive vist og vil være centreret om den valgte guide RNA. Bruge knapperne Zoom øverst på siden til at visualisere fordelingen af andre guide RNA'er identificeret af e-sprød inden for det pågældende område.
  7. Vælg 4 helst ikke-overlappende guide RNA sekvenser, der er fordelt i hele region af interesse (figur 2B). Hvis det pågældende område, overstiger 600 bp, overveje at tilføje 1-2 ekstra guider. Undgå guide RNA'er med homopolymeric strækninger og ekstreme GC indhold, da disse funktioner kan hæmme guide RNA kloning processen og reducere guide RNA målretning effektivitet.
  8. Når hjælpelinjerne er blevet udvalgt, oprette en fil, der indeholder den fulde vejledning RNA sekvens (23 nukleotider) for hver ønskede guide, og fjern derefter 5' nukleotid samt PAM (NGG) fra 3'-enden. Dette trin letter oligo bestilling.
  9. Tilføj følgende sekvens 5' enden af oligonukleotid sekvensen: GTGGAAAGGACGAAACACCG.
  10. Tilføj følgende sekvens til 3'-enden af oligonukleotid sekvensen: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
    Bemærk: Den sidste sekvens skal 59 nukleotider lange og ser gerne dette: GTGGAAAGGACGAAACACCG-mål (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
  11. Sikre, at hvert enkelt regulerende element skal målrettes med forstærker-i mindst 4 unikke oligonukleotider designet til den. Bestil disse sekvenser sammen med de "U6_internal" primere, der er anført i tabel 1.

3. guide RNA kloning

Bemærk: Guide RNA kloning via Gibson forsamling har vist sig for at være yderst effektive i vores hænder, giver hundredvis af kolonier pr. plade, med ingen eller få kolonier i vektor eneste kontrol. Sådan effektivitet er afgørende for at opretholde kompleksitet under poolede kloning. En anden fordel ved Gibson forsamling kloning er, at brugerne ikke behøver at bekymre sig om tilstedeværelsen af en restriktion enzym skære site i guide RNA de forsøger at indsætte i U6 kloning vektor. Ikke desto mindre, denne protokol kan være tilpasset til traditionelle begrænsning enzym baseret kloning hvis det ønskes.

  1. Rekonstruere guide RNA oligos i en endelig koncentration på 100 μM i ultrarent vand (fri for RNase, DNase-fri). Der bør være mindst 4 separate guide RNA oligos for hvert område af interesse.
  2. For hver lovgivningsmæssige område af interesse, Opret en pulje af alle oligos svarende til det pågældende område. I en Eppendorf tube, kombinere 5 μl af hver individuel rekonstitueret guide RNA oligo for hver region. Bland poolen godt af vortexing, derefter fjerne 1 μL og fortynde denne alikvot 1:200 i ultrarent vand.
    Bemærk: Hvis det ønskes, disse puljer rettet mod enkelte administrative regioner kan yderligere kombineres for at generere en kompleks pool målretning flere regioner. Op til 50 lovgivningsmæssige områder kan være målrettet samtidigt i en enkelt pulje (figur 3 c).
  3. Udføre en kort PCR med U6 primere for at vedhæfte homologi regioner til oligos før Gibson samling. Omkring 40 baser tilføjes hver oligo, giver en ~ 100 bp produkt, der indeholder tilstrækkelige homologi U6 vektor i begge ender.
    1. For hver guide RNA pool, oprettet 20 μl PCR med en high-fidelity polymerase master mix og følgende komponenter: 1 μL fortyndet oligo pool fra trin 3.2, 1 μL U6 fremad primer (10 μM), 1 μL U6 reverse primer (10 μM) , og vand op til 20 μL.
    2. Inkuber i et termisk cycler med følgende betingelser: 98 ° C i 30 s, 10 cyklusser af (98 ° C i 10 s, 55 ° C til 30 s, 72 ° C i 2 min.), 72 ° C i 5 min, og hold på 4 ° C.
    3. Køre 5 μl af reaktionen på en 1-2%-agarosegel med en lav molekylevægt stige. Slutproduktet skal vaere ~ 100 basepairs (figur 2 c).
    4. Rydde op i forlængelse reaktion med en kolonne-baseret DNA rensning kit, og elueres i 20 μL eluering buffer findes i kit.
      Bemærk: Produktet er korte, undgå at bruge perle-baseret ren-ups, som er designet til at udelukke små fragmenter er mindre end 100 bp.
    5. Kvantificere oprenset DNA ved hjælp af en fluorometer eller spektrofotometeret (forventet udbytte er 10-20 ng/μl). Guide RNA skær kan opbevares ved-20 ° C, eller kan anvendes umiddelbart i Gibson forsamling med et lineært U6 vektor.
  4. For at forberede modtageren U6 kloning vektor for Gibson forsamling, oprette en restriktion enzym digest. Hvis mange Gibson forsamling reaktioner der skal udføres, oprette flere fordøjer at sikre tilstrækkelige udbytte af cut vektor.
    1. Bruge 20 enheder af AflII enzym og 1 μg af plasmid i en 20 μL reaktion med passende begrænsning enzym buffer. Der inkuberes ved 37 ° C i 1-2 h.
    2. Rydde op i digest med perler eller en kolonne-baserede kit til DNA oprensning og elueres i 20 μL eluering buffer. Kvantificere oprenset DNA ved hjælp af en fluorometer eller spektrofotometeret. Prøver kan fryses ved-20 ° C til senere brug.
  5. Udføre Gibson forsamling på den forberedte vektor og Indsæt.
    1. Oprette Gibson forsamling reaktioner på is. Brug 50 ng af vektor og 7 ng af insertet i en 20 μL reaktion. Fortynd skær 1:10 i ultrarent vand at lette pipettering. Oprette en vektor eneste Gibson forsamling reaktion, ved hjælp af 50 ng af vektor og erstatte indsatsen med vand.
    2. Inkuber Gibson forsamling reaktioner i 15 min. ved 50 ° C, efterfulgt af et hold på 4 ° C.
    3. Overføre de sammensatte produkter til is. Fortynd de forsamlede produkter 1:4 i ultrarent vand på is. For eksempel, tilsættes 5 μl af Gibson forsamling produkt 15 μl ultrarent vand.
  6. Omdanne de fortyndede Gibson forsamling produkter.
    1. Tø højeffektiv kompetente celler på is og gøre 25 μL delprøver for hver transformation. Eventuelt komplekse swimmingpool målretning flere steder tø nok celler i forskellige rør til at udføre flere uafhængige omdannelser af samme kompleks gRNA pool.
    2. For hver fortyndede produkt, tilsættes 1 μL af denne fortynding en 1,7 mL Eppendorf rør indeholdende 25 μL af kompetente celler. Mix af kortvarigt svippede røret. Inkuber rør på is i 30 min.
    3. Heat shock celler til 30 s på 42 ° C, derefter overføre straks til is i 2 min.
    4. Tilsæt 300 μl SOC medier (2% trypton, 0,5% gærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4og 20 mM glukose) og lad cellerne inddrive i 1 timer ved 37 ° C under omrystning (300 rpm). I løbet af denne tid, varm agar plader med ampicillin/carbenicillin til 37 ° C i en inkubator. Bruge en trykplade for hver transformation.
    5. Plade 50 μL af celler og læg pladerne i et 37 ° C inkubator natten over. Til pools rettet mod individuelle websteder, placere direkte i 3-5 mL af LB bouillon (Table of Materials) indeholdende ampicillin/carbenicillin (1 mg/mL) og der inkuberes natten over med rysten på 250 rpm ved 37 ° C i minipreps.
  7. Høste cellerne og isolere DNA.
    1. For store guide RNA biblioteker målretning flere websteder, skal du bruge en plade skraber til at indsamle alle kolonier fra hver enkelt plade til én maxiprep (150 mL flydende kultur). Dette kan lettes ved at hælde ~ 5 mL af LB med passende antibiotika i en 50 mL falcon tube og skrabe kolonierne ind i røret. For biblioteker rettet mod individuelle websteder, skal du skrabe pladerne i et miniprep (3-5 mL flydende kultur).
    2. Ruger disse kulturer med passende antibiotika i 3-5 timer ved 37 ° C under omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
    3. Udføre DNA-ekstraktion ved hjælp af et kit, der resulterer i endotoxin-fri preps.
    4. Kvantificere DNA ved hjælp af en fluorometer eller spektrofotometeret. Plasmider kan anvendes umiddelbart i Transfektion eller opbevares ved-20 ° C til fremtidig brug.
  8. For at bekræfte tilstedeværelsen af guide RNA sekvens i U6 vektor for små puljer målretning indre steder, bruge Sanger sekventering på den forberedte miniprep med "U6_PCR_R" primer angivet i tabel 1. Sammenlægning af guide RNA'er, 19 basepair gRNA target sekvens vil give blandet baser, men U6 promotor og guide RNA stillads omkring denne rækkefølge bør være intakt.

4. Transfektion af forstærker-i

Bemærk: For den vellykkede blokade af en østrogen svar ved hjælp af forstærker-i i Ishikawa celler, er det nødvendigt at fratage cellerne af østrogen for 5-7 dage før Transfektion ved at fastholde dem i phenol rød gratis RPMI med 10% trækul-strippet FBS og 1% penicillin/streptomycin. Celler skal være kulturperler i dette medie, under og efter Transfektion hvis forsøger at blokere en østrogen svar. Vi anbefaler brug af fenol rød gratis trypsin for passage af celler i komplet phenol rød gratis RPMI.

  1. Dagen før Transfektion, plade celler (enten wild-type eller stabilt udtrykker SID4X-dCas9-KRAB) i en 24-godt plade på 30-50% confluency (~ 60.000 celler pr. brønd for Ishikawa celler). Plade nok celler, således at transfections kan udføres i to eksemplarer, og omfatter wells for at være transfekteret med kontrol guide RNA'er.  Sikre, at cellerne er jævnt fordelt over brønden ved forsigtigt ryste pladen efter celle plating som i trin 1.1.7.
    Bemærk: Denne protokol forudsætter anvendelse af kationiske Liposom-baserede Transfektion reagenser. Elektroporation giver en alternativ metode til celletyper, der er meget følsomme over for disse reagenser. Transfektion betingelser skal være optimeret til cellelinie af interesse inden du forsøger at forstærker-i eksperimenter.
  2. Den følgende dag, forberede transfections som pr instruktioner Transfektion reagens valg. For Ishikawa celler, brug 550 ng af samlede plasmid til hver brønd med en 24-godt plade. Fortynd plasmider til en endelig koncentration på 0,020 μg/μL serum-gratis medier (1,1 μg af DNA i 52 μL af samlede volumen for transfecting 2 brønde). Bruge 3 μL Transfektion reagens til hver 1 μg DNA, vortexes og inkuberes som beskrevet i trin 1.2. Tilsæt 25 μl af den endelige blanding til hver brønd.
    Bemærk: At målet kombinationer af websteder, bruge den samme vægt af plasmid for hvert enkelt websted, og derefter udfylde sidesten vægten med en kontrol plasmid (Tom guide RNA kloning vektor eller guide RNA'er rettet mod en negativ kontrol region som IL1RN promotor). Forbigående transfections, bruge et forhold på 3:2 Cas9 fusion: guide RNA plasmid. Plasmider, der indeholder fluorescerende journalister kan tilføjes for at overvåge Transfektion effektivitet.
  3. På 36 h post Transfektion, ændre medierne ved hjælp af phenol rød gratis RPMI med 10% trækul-strippet FBS og 1% penicillin/streptomycin (for Ishikawa celler) og levere puromycin (endelig koncentration: 1 μg/mL) og neomycin (endelig koncentration: 300 ng/mL). Hvis celler er følsomme over for Transfektion reagens, medierne kan ændres tidligere, men bør tilsættes antibiotika tidligst 24 timer post Transfektion.
    Bemærk: Vent mindst 24 timer efter tilsætning af antibiotika før høsten celler. Udtrykket ændringer som følge af forstærker-i kan opdages så tidligt som 48 h post Transfektion og op til 5 dage efter Transfektion. Hvis arbejder med Ishikawa celler, der er blevet berøvet af østrogen, udføre en 8-h 10 nM 17β-estradiol (E2) induktion dagen efter behandling med antibiotika og derefter høste celler straks.

5. celle høst og RNA udvinding

  1. Forberede lysisbuffer med 1% β-mercaptoethanol (BME). Sikre, at du nok lysis-BME blanding (300 μL for hver godt at blive høstet).
  2. Opsug medierne ved hjælp af et vakuum indsugningsventil.
  3. Cellerne vaskes en gang med et lige saa stort volumen af 1 x PBS (500 μl) og aspirat at fjerne så meget PBS som muligt.
  4. Tilsæt 300 μl af lysis-BME løsning til hver brønd ved hjælp af en multikanalpipette. Afpipetteres lysis løsning op og ned 8 - 10 gange, og overførsel til en dyb-godt plade eller 1,7 mL Eppendorf-rør på is. RNA kan udtrækkes umiddelbart, eller lysates kan fryses ved-80 ° C for fremtidig behandling.
  5. For at udtrække RNA fra lysates, bruge en kommercielt tilgængeligt kit, der indeholder en DNase behandling. Elueres i den mindste anbefalede mængde ultrarent vand (fri for RNase, DNase-fri) eller eluering buffer og kvantificere RNA. For et lille antal prøver, bruge en fluorometer eller spektrofotometeret. For et stort antal prøver, bruge en fluorescerende sonde, der registrerer RNA og måle på en pladelæseren. Prøver kan frosne ved-80 ° C, før eller efter kvantificering.

6. kvantificering gen Expression ændringer ved hjælp af et-trins qPCR og RNA-seq

  1. Få qPCR primere for gener af interesse og for mindst ét husholdning gen, der er udtrykt i nærheden af niveauet af målrettede gener og ændrer ikke på tværs af eksperimentelle betingelser. Ideelt set vil disse primere span en exon-exon krydset for at undgå forstærkning af genomisk DNA.
    1. Teste disse primere på RNA fra cellelinie af interesse. Brug smelte kurve analyse at kontrollere produktionen af et enkelt produkt. Hvis et produkt ikke fremlægges, teste yderligere primer par.
  2. Hver forstærker-i og kontrol guide RNA behandlet prøve, identificere hvor mange gener skal analyseres i at prøve. Dette sæt af gener bør omfatte husholdning gener, som CTCF eller GAPDH.
  3. Opsætning af qPCR reaktioner.
    1. Fortynd alle prøver den samme fusion i vand, således at 50 ng af total RNA er let pipetted, og der er nok fortyndes RNA for hver reaktion. For eksempel, fortyndes RNA til ~16.6 ng/μl og bruge 3 μL af RNA i hver reaktion. Holde RNA på isen under opsætningen af master mix.
    2. Forbered særskilt master mix for hvert gen skal måles ved hjælp af kommercielt tilgængelige one-step qPCR kits. Bruge en 20 μL reaktion volumen med 1 μL af hver primer (10 μM stamopløsning). Konfigurere disse reaktioner på is.
    3. I en reaktion plade, der er relevante for den termiske cycler, tilføje RNA efterfulgt prøver af master mix. Forsegle med en plade sealer og blandes forsigtigt ved vortexing eller pipettering. Kort centrifugeres pladen (140 x g i 60 s) til at sikre, at væsken er i bunden af brøndene.
    4. Inkuber plade i en termisk cycler som følger (eller som kit instruerer): 48 ° C i 30 min, 95 ° C i 10 min, 40 cyklusser af (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min).
  4. Få Ct værdier for hvert gen målt i hver prøve. Brug metoden sammenlignende Ct til at identificere ændringer i genekspression.
    1. Subtrahere Ct af husholdning genet fra Ct af hvert gen af interesse for hver prøve at generere normaliseret Ct værdier.
    2. Behandlet kontrolprøver, tage et gennemsnit af de normaliserede Ct-værdier for hvert Gen. Log base 2-skala fold undertrykkelse kan derefter beregnes ved at fratrække den normaliserede Enhancer-jeg behandlet prøve Ct for hvert gen fra den samme værdi for kontrolprøve behandlet for det tilsvarende gen.
  5. For at bestemme globale ændringer i genekspression efter Enhancer-i behandling, forberede prøverne RNA sekventering ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit kompatibel med brugerens sekventering teknologi. Brug ~ 500 ng af RNA for at starte materiale og forberede mindst 2 biologiske replikater biblioteker.

7. verifikation af specifikke genomisk målretning af SID4X-dCas9-KRAB bruger ChIP-seq

Bemærk: SID4X-dCas9-KRAB fusion protein indeholder både et FLAG epitop tag og en HA epitop tag, men bedste resultater for ChIP-seq blev opnået med anti-FLAG antistoffer. Hvis det ønskes, kan brugeren udføre yderligere ChIP-seq eksperimenter for transskriptionsfaktorer potentielt påvirket af forstærker-i, eller til H3K27ac, et mærke af enhancer aktivitet, der er faldet med forstærker-i. Hver ChIP-seq eksperiment kræver dog 10 x 106 celler, så planen i overensstemmelse hermed.

  1. Transfect celler med forstærker-i pools.
    1. Plade 10 x 106 celler i en 15 cm vævskultur parabol. Hver tallerken repræsenterer 1 ChIP-seq eksperiment for 1 faktor af interesse.
    2. Den følgende dag, transfect celler ved hjælp af 20 μg samlede DNA pr parabol. For transfections i cellelinjer stabilt udtrykker SID4X-dCas9-KRAB, bør DNA være en plasmid pulje af guide RNA'er målretning alle steder af interesse, og eventuelt en plasmid udtrykker fluorescerende proteiner. Forbigående transfections, bruge en forholdet 3:2 dCas9 fusion protein: guide RNA pool. Foretage mindst én yderligere kontrol guide RNA Transfektion af ChIP-FF. i andre TFs eller Histon ændringer, på en anden tallerken.
    3. Behandle retter med puromycin (1 μg/mL) og neomycin (300 ng/mL) på 24-48 h post Transfektion. Vent mindst 24 timer før høsten kromatin.
  2. Høst kromatin fra retter.
    Bemærk: At studere virkningerne af forstærker-jeg ER genomisk bindingen i Ishikawa celler, udføre en 1 h 10 nM E2 behandling på retter transfekteret med kontrol guide RNA'er og forstærker-i forudgående til høst. At studere virkningerne af forstærker-i på H3K27ac, udføre en 8 h 10 nM E2 induktion på retter transfekteret med kontrol guide RNA'er og forstærker-i forudgående til høst.
    1. Anvende 500 μL af 37% formaldehyd til hvert fad (endelig koncentration på 1%). Swirl pladerne kort. Lad pladerne sidde ved stuetemperatur i 10 min.
    2. Der tilsættes 1 mL 2,5 M Glycin (endelig koncentration af 125 mM). Swirl pladerne kort.
    3. Hæld medier med formaldehyd og glycin. Tilføje en tilsvarende mængde (~ 20 mL) koldt 1 x PBS.
    4. Hæld PBS. Opsug med en vakuum betjent sug til at fjerne så meget PBS som muligt. Placer retterne på is.
    5. Føje 3-5 mL koldt 1 x PBS eller Farnham lysisbuffer (5mM rør pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) med 1 x protease inhibitor (tilføjet lige før brug) til hver plade. Skrab skålen med en plade skraber og opløsningen overføres til en 15 mL konisk slange på is.
    6. Pellet kromatin af spinning ned rør i en centrifugeres i 5 min. ved 4 ° C på 1000 x g. udsmid supernatanten og gemme piller ved-80 ° C til fremtidig brug eller fortsætte med ChIP-seq-protokollen af valg ved hjælp af et anti-FLAG antistof eller antistoffer rettet mod andre transkriptionsfaktorer eller Histon ændringer af interesse (H3K27ac, H3K9me3).

Representative Results

Figur 1 viser et skematisk af arbejdsprocessen beskrevet i protokollen. Bestem bidrag af ER-bundet smagsforstærkere nær østrogen-regulerede genet MMP17, som har 3 bindingssteder i nærheden som defineret af ChIP-seq (figur 2A), guide RNA'er blev beregnet for hver region. For at designe guide RNA'er, en 600-900 bp vindue af sekvens omkring hver ER blev bindingssted af interesse valgt og sætte i en guide RNA designprogram. Der følger vejledning sekvenser RNA med 0-2 forudsagt væk fra målet websteder blev justeret til det menneskelige genom ved hjælp af BLAT. Fire ikke-overlappende guide RNA'er, som strakte sig over regionen defineret af ChIP-FF. og DNaseI overfølsomhed blev valgt til målretning (figur 2B). Yderligere sekvens (tabel 1) blev føjet til hver ende til at lette downstream kloning og den deraf følgende 59 nukleotid fragmenter blev bestilt. Ved ankomsten, blev guide RNA'er blev fortyndet og samles af site, og en kort PCR udført for at tilføje homologi regioner før Gibson samling. Figur 2 c viser den forventede guide RNA vare efter en kort PCR ved hjælp af "U6_internal"-primere (tabel 1), som vil tilføje 20 basepairs af sekvens til hver ende af de 59 basepair guide RNA fragment, hvilket resulterer i en ~ 100 basepair sekvens. Efter Gibson forsamling, disse guide RNA puljer blev omdannet til bakterier og plasmidet minipreps blev udarbejdet den følgende dag. Figur 2D viser resultater fra en forstærker dissektion eksperiment, hvor flere smagsforstærkere i nærheden MMP17 er målrettet alene og i kombination med forstærker-i. Websteder målrettet af forstærker-jeg er angivet med en sort sekskant. Guide RNA plasmider rettet mod de angivne steder var transfekteret i en østrogen-berøvet Ishikawa cellelinie, stabilt udtrykker SID4X-dCas9-KRAB. To dage senere, medierne blev ændret og puromycin blev tilføjet til at berige for transfekteret celler. Den følgende dag, er cellerne høstet efter en 8 h 10 nM estradiol behandling. RNA er isoleret, og en et-trins qPCR blev udført. I dette eksempel er sider 1 og 2 nødvendige for en fuldstændig østrogene svar af MMP17, mens site 3 ikke bidrager disse betingelser (figur 2D, baner ii-iv). Når kun websteder 2 eller 3 er aktive (vi og vii), østrogen svar er lig når ingen websteder er aktive (viii), hvilket tyder på, at disse websteder ikke kan bidrage uafhængigt. Webstedet 1 kan bidrage nogle udtryk af sig selv (v), men den største aktivitet ses når sider 1 og 2 er aktive (iv).

For at manipulere 10 smagsforstærkere nær 4 forskellige gener samtidig (figur 3A), komplekse puljer af guide RNA'er blev genereret indeholdende 42 enhancer guider og 16 promotor guider. Guide RNA oligos blev samlet før den første guide RNA udvidelse PCR (trin 3.3), og deraf følgende PCR produkter blev renset og kombineret med tomme puromycin U6 kloning vektor med Gibson assemblyen. Efter samlingen Gibson var flere uafhængige transformeringer udføres og forgyldt. Pladerne var skrabet i LB og lov til at vokse ud for 2-4 h før maxiprep. Figur 3B viser repræsentative reduktioner i genekspression af qPCR, når disse guide RNA pools var transfekteret i en østrogen-berøvet Ishikawa cellelinie, stabilt udtrykker SID4X-dCas9-KRAB og behandles som beskrevet ovenfor (figur 2D). Reduktioner fra Enhancer-jeg er magen til dem, der opnås ved at målrette promotor af formodede target-genet. Figur 3 c viser virkningerne af fortynding af guide RNA'er på reduktion af østrogen svar ved hjælp af forstærker-i. En 1:50 fortynding af en guide RNA pool målretning forstærker i nærheden af G0S2 stadig giver betydelig reduktion i genekspression, tyder på, at forstærker-i kan bruges til at målrette op til 50 steder på en gang. Inaktivering kan dog fortyndes ud, der angiver, at hundredvis af websteder ikke kan være målrettet samtidig, medmindre mere følsomme detektionsmetoder er ansat.

Figure 1
Figur 1. Protokollen skematisk for multiplex enhancer dissektion ved hjælp af forstærker-i. Guide RNA'er (rød og blå) er designet ved hjælp af e-sprød og valgte bruger UCSC genom-browser. Fire guide RNA'er er valgt, der spænder over regionerne af interesse (transskription faktor bindingssteder som defineret af ChIP-seq). Guide RNA-oligonukleotider, der har været samlet af region af interesse (rød og blå) underkastes en PCR for at tilføje homologi regioner (orange) før Gibson forsamling og transformation. Resulterende plasmid pools er transfekteret via lipofection i cellelinjer stabilt udtrykker SID4X-dCas9-KRAB eller i wild-type celler sammen med SID4X-dCas9-KRAB plasmid. Guide RNA plasmid puljer kan transfekteret individuelt for at målrette en hjemmeside på et tidspunkt, eller i kombination til at målrette flere steder samtidig. Transfekteret celler behandles med antibiotika for at berige for celler, der indeholder guide RNA'er. På ~ 72 h post Transfektion, er cellerne høstet. Nukleinsyrer kan udvindes for qPCR, RNA-seq eller ChIP-FF. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Guide RNA design og forstærker dissektion for MMP17. (A) genom browser screenshot af ER alfa-bundet smagsforstærkere (grå) skal målrettes nær MMP17. Dette tal er blevet ændret fra Carleton, et al. 18. (B) Guide RNA designs til 3 bindende websteder18. Bindingssted for ER defineret af ChIP-seq er målet, og 4 guide RNA'er flise i hele denne region. DNaseI følsomhed signal, som spænder over bindingssted, kan også bruges til at definere mål sekvens for guide RNA design. Både ChIP-FF. og DNaseI HS data blev indhentet fra Ishikawa celler behandles med 10 nM estradiol for 1 h. (C) repræsentative guide RNA sekvenser, der er klar til Gibson forsamling, har undergået en kort PCR for at tilføje homologi regioner. (D) Relative udtryk af MMP17 målt via qPCR efter målretning af bestemte regioner med forstærker-i og en 8-h10 nM estradiol behandling. Udtrykket er i forhold til CTCF og udtryk niveau af MMP17 i cellerne ikke behandlet med østradiol. Kontrol guide RNA'er målrette promotor af IL1RN. Alle fejllinjer repræsenterer SEM, dobbelt stjerner angiver p < 0,01 og enkelt stjerner angiver p < 0,05 i en parvis t-test. Dette tal er blevet ændret fra Carleton, mfl. 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Målrette flere smagsforstærkere i nærheden af forskellige gener samtidig med samlet Enhancer-i. (A) skematisk af bindingssteder og projektlederne skal målrettes i poolede Enhancer-i. (B) virkningerne på udtryk som målt ved qPCR efter E2 behandling på Ishikawa celler transfekteret med forstærker-i plasmid pool (grøn), Promoter-i plasmid pool (blå) eller kontrol gRNAs (hvid)18. En betydelig reduktion på alle gener er observeret med forstærker-i. Dette tal blev ændret fra Carleton, mfl. 18. (C) indvirkning på G0S2 udtryk niveauer efter E2 behandling om Ishikawa celler transfekteret med forskellige mængder af guide RNA'er rettet mod G0S2. En betydelig reduktion kan ses selv med små mængder af guide RNA (1:50 fortynding), tyder på, at op til 50 websteder kan målrettet samtidigt. Alle fejllinjer repræsenterer SEM, dobbelt stjerner angiver p < 0,01 og enkelt stjerner angiver p < 0,05 i en parvis t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Navn Sekvens
U6_internal_F TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_R GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_F CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_R AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_F GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_R AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_F GTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_R AGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_F AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_R CGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_F CAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_R TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

Tabel 1. Primere anvendes til guide RNA udvidelse og sekventering, qPCR og påvisning af fusion protein.

Discussion

Denne protokol beskriver en enkel og fleksibel metode til dissekere enhancer funktion i den endogene genomisk locus uden fysisk at ændre DNA-sekvens. Mens samme koncept som tidligere udgivne CRISPR indblanding protokoller ved hjælp af dCas9-KRAB27, forstærker-i adskiller sig fra disse protokoller i 3 vigtigste måder. Først, forstærker-jeg udnytter SIN3A interagerende domæne MAD120 at opnå enhancer deaktivering. Forstærker inaktivering kan reddes ved hjælp af HDAC-hæmmere, tyder på, at den primære mekanisme af deaktivering er HDAC afhængige. I modsætning til CRISPR interferens med dCas9-KRAB fører forstærker-jeg ikke til aflejring af H3K9me3. Det er sandsynligt, at forstærker-jeg er afhængig af forbigående indførelsen af guide RNA'er, med celler høstet på 3 dage post Transfektion. I CRISPR indblanding, er en forøgelse af H3K9me3 observeret på 7 dage post transduktion12. Endelig, forstærker-i-protokollen giver en strategi for at målrette flere steder samtidigt og overvåge effektiviteten af målretning. I mosaik-seq17, dCas9-KRAB bruges til at målrette flere smagsforstærkere samtidigt, men denne teknik er baseret på én celle RNA sekvensering til at identificere udtryk ændringer, og mange gener (såsom østrogen-responderende gener) gå upåagtet hen på grund af lave følsomhed af encellede RNA-FF. Enhancer-jeg giver en pålidelig metode til at studere smagsforstærkere, individuelt og i kombination for enhver gene.

Det mest kritiske trin i Enhancer-jeg er Transfektion, som skulle være optimeret til cellelinie af interesse. Denne protokol er afhængig af puromycin behandling til at berige for transfekteret celler, men det er muligt at co transfecting guide RNA'er med en fluorescerende proteiner og sortering for fluorescerende celler ved hjælp af flowcytometri kan vise sig for at være en bedre berigelse metode for nogle celle typer. Vi anbefaler overvågning udtryk niveau af guide RNA'er og SID4x-dCas9-KRAB af qPCR til fejlfinding og bekræfte Transfektion. Hvis guide RNA er lavt (cyklus tærskel > 30), brugere kan også overveje alternative guide RNA produktion strategier såsom in vitro- transskription28. Det er også muligt, at trods høj gRNA niveauer, guide RNA målretning af SID4x-dCas9-KRAB protein er ineffektive, i hvilket tilfælde vælge forskellige guide RNA sekvenser kan være nødvendigt. Ved at udføre ChIP-seq på fusion protein med kromatin fra Enhancer-jeg behandlede celler, kan effektiviteten af målretning overvåges. Hvis der er højt signal af SID4x-dCas9-KRAB på det pågældende område, og ingen udtryk ændringer i dens formodede target genet er fundet, derefter bidrager regionen sandsynligvis ikke til udtryk af at gen betingelser studerede.

En potentielle begrænsning af forstærker-i er at off-target effekter kan akkumulere hvis for mange websteder er målrettet samtidigt. Alligevel har CRISPR indblanding strategier for knockdown færre off target effekter end RNAi29, især når en polyklonale cellelinje at udtrykke dCas9-KRAB bruges. Mens vi har set ud for målgruppen genomisk bindingen af SID4X-dCas9-KRAB, når målretning 10 lokaliteter samtidigt, har vi ikke identificeret genet udtryk ændringer som følge af disse bindende begivenheder. Som nogle smagsforstærkere kan kontakte flere initiativtagere og/eller andre smagsforstærkere, er det muligt, at mange gener kan ændre udtryk ved målretning af en enkelt enhancer, selvom det er uklart, om denne form for genregulering er fælles. For at bekræfte, at udtrykket ændringer observeret er rettet mod en specifik forstærker, og ikke ud-target effekter, kan brugerne foretage Enhancer-jeg med to forskellige sæt af ikke-overlappende guide RNA'er målretning samme region. Derudover kan den genetiske sletning af regionen ved hjælp af nukleasen-kompetente Cas9 yderligere bekræfte dens virkninger på genekspression.

Som forstærker-i funktioner gennem Histon deacetylation, det er muligt, at dens deaktivering evner er begrænset til smagsforstærkere, der har betydelige niveauer af Histon acetylation. Der er en bred vifte af alternative repressive fusioner, der kan være mere effektive til at målrette specifikke smagsforstærkere. DNA methyltransferase alternativ til dCas9 kan bruges til at reducere genekspression når målrettet til distale smagsforstærkere30, men denne undertrykkelse er ofte ikke forbigående. En anden repressive fusion bruger domænet ven af GATA1 (FOG1), hvilket fører til Histon H3 lysin 27 trimethylation og undertrykker genekspression på et niveau svarende til dCas9-KRAB på tværs af en bred vifte af celle linjer og initiativtagere31. Interessant, reduceret tilføjer flere kopier af FOG1 til dCas9 de repressive potentiale på initiativtagere, tyder på, at en enkelt kopi af domænet SID kan give mere enhancer deaktivering end de 4 eksemplarer i øjeblikket anvendes i forstærker-i. Det er muligt, at nogle loci kan drage fordel af dobbelt målretning af forskellige kombinationer af de ovennævnte dCas9 fusioner. For eksempel, kan stabil lang sigt undertrykkelse opnås ved samtidige transduktion af dCas9-DNMT3a og dCas9-KRAB32. De fleste af disse repressive fusioner har kun været målrettet mod et enkelt locus ad gangen, og det er fortsat uklart, der er mest effektiv til at manipulere med flere smagsforstærkere samtidigt.

Forstærker-i, mens en passende metode til at studere kombinationer af smagsforstærkere til en håndfuld af gener, er stadig noget begrænset i overførselshastighed, hvis brugeren ønsker at studere formodede smagsforstærkere til hundredvis af gener. Fremtidige ansøgninger af denne teknik vil indarbejde imaging-baserede teknologier for at kvantificere flere gener i flere prøver samtidigt. Vigtigere, er disse teknologier kompatibel med direkte påvisning af RNA molekyler fra lysate, eliminerer behovet for tidskrævende RNA isolering. Disse tilpasninger vil lette afhøring af større sæt af smagsforstærkere.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH/NHGRI R00 HG006922 og NIH/NHGRI R01 HG008974 til J.G. og jægeren Cancer Institute. JBC blev støttet af NIH træningsprogram i genetik T32GM007464.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZR 96-well Quick-RNA Kit Zymo Research R1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Applied Biosystems 4389986
AflII restriction enzyme NEB R0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L
FuGENE HD Promega E2312
DNA Clean & Concentrator Kit Zymo Research D4013
Buffer RLT Plus Qiagen 1053393
b-estradiol Sigma-Aldrich E2758
Human: Ishikawa cells ECACC 99040201
H3K27ac rabbit polyclonal Active Motif  39133
H3K9me3 rabbit polyclonal Abcam  ab8898
FLAG mouse monoclonal Sigma-Aldrich  F1804
ER alpha rabbit polyclonal Santa Cruz sc-544
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid Addgene  51133 Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector plasmid Addgene  41824 Mali et al., 2013
AflII U6 puromycin plasmid Addgene  106404 Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB plasmid Addgene  106399 Carleton et al., 2017
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads Kapa Biosytems KK8420
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets ThermoFisher Scientific A32959
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich 252549-25ML
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131035
LB Broth ThermoFisher Scientific 10855001
Quick-DNA Miniprep Kit Zymo Research D3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder NEB N0050S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  3. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  4. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).
  5. Lam, D. D., et al. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935 (2015).
  6. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  7. Savic, D., et al. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  10. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).
  11. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  12. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  13. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869 (2010).
  14. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  15. Fulco, C. P., et al. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).
  16. Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  17. Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).
  18. Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).
  19. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  20. Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).
  21. Alland, L., et al. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).
  22. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  23. Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).
  24. Stampfel, G., et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).
  25. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  26. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  27. Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).
  28. Romanienko, P. J., et al. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362 (2016).
  29. Smith, I., et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213 (2017).
  30. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  31. O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  32. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).

Tags

Genetik sag 136 RIBOREGULATION CRISPR/Cas9 enhancer Epigenetik funktionel genomforskning transkriptionsfaktorer
Dissektion af Enhancer funktion ved hjælp af Multiplex CRISPR-baserede forstærker interferens i cellelinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carleton, J. B., Berrett, K. C.,… More

Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines. J. Vis. Exp. (136), e57883, doi:10.3791/57883 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter