Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dissektion av Enhancer-funktion som använder Multiplex CRISPR-baserade Enhancer störningar i cellinjer

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57883
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

Summary

Detta protokoll beskriver de steg som behövs för att utforma och utföra multiplexade inriktning av förstärkare med proteinet avaktivera fusion SID4X-dCas9-KRAB, kallas även smakförstärkare störningar (Enhancer-i). Detta protokoll möjliggör identifiering av förstärkare som reglerar genuttryck och underlättar dissektion av relationer mellan smakförstärkare som reglerar en gemensam målgenen.

Abstract

Flera förstärkare reglera ofta en viss gen, men för de flesta gener, det är fortfarande oklart vilka förstärkare är nödvändiga för genuttryck och hur dessa medel kombineras för att producera ett transkriptionell svar. Som miljontals enhancers har identifierats, behövs hög genomströmning verktyg för att bestämma enhancer funktion i genome-wide skala. Nuvarande metoder för att studera enhancer funktion inkluderar att göra genetiska deletioner använder nuclease-kunnig Cas9, men det är svårt att studera kombinatoriska effekter av flera förstärkare använder denna teknik, eftersom flera successiva klonal cellinjer måste vara genereras. Här presenterar vi Enhancer-i, en CRISPR störningar-baserad metod som möjliggör för funktionella förhör av flera smakförstärkare samtidigt på deras endogena loci. Förstärkare-jag gör användningen av två repressiva domäner smält till nuclease-brist Cas9, SID och KRAB, för att uppnå enhancer avaktivering via Histon deacetylering på riktade loci. Detta protokoll använder övergående transfection guide RNAs aktivera övergående inaktivering av riktade regioner och är särskilt effektiva på att blockera inducerbara transkriptionell svar på stimuli i vävnadsodling inställningar. Förstärkare-jag är mycket specifika både i sin genomisk inriktning och dess effekter på globala genuttryck. Resultat från detta protokoll hjälp för att förstå om en förstärkare bidrar till genuttryck, omfattningen av bidrag och hur bidraget påverkas av andra närliggande smakförstärkare.

Introduction

Storskalig sekvensering projekt såsom koda1, färdplan epigenomik2och FANTOM3 har identifierat miljontals förmodad förstärkare inom det mänskliga genomet på hundratals celltyper. Det uppskattas att varje arrangören associates i genomsnitt 4,9 smakförstärkare och varje enhancer kontakter ett genomsnitt på 2,4 gener3, tyder på att genuttrycket är ofta resultatet av integrationen av flera distribuerade reglerande interaktioner. En betydande återstående utmaning är att definiera inte bara hur enskilda enhancers bidra till genuttryck, men hur de kombineras för att påverka uttryck. Genetiska metoder är vanligen används för att identifiera relationer mellan smakförstärkare i modellorganismer från Drosophila4 till möss5. Dessa experiment är dock tidskrävande och låg genomströmning för studier av flera förstärkare på flera gener.

En metod för att studera enhancer funktion i stor skala innebär massivt parallella reporter analyser. Dessa analyser möjliggör samtidiga screening av tusentals DNA-sekvenser för sin förmåga att driva ett uttryck för en reporter gen6. Medan dessa analyser har visat att DNA-sekvensen ensam kan vara tillräckligt för att förmedla gen förordning information7, kommer de med förbehåll av utförs utanför ramen för infödda kromatin och en heterologa promotor. Storleken på DNA-sekvensen som analyseras i massivt parallella reporter analyser är dessutom vanligtvis mindre än 200 basepairs, vilket kan utesluta relevanta omgivande sekvens. Ännu viktigare, som reporter analyser bara mäta aktiviteten av en sekvens i taget, de inte beakta de komplexa relationer som kan finnas mellan förstärkare. Således, medan massivt parallella reporter analyser kan vara informativ om inneboende aktiviteten av en DNA-sekvens, de inte nödvändigtvis informerar oss av att DNA-sekvensen i samband med genomet.

Nyligen har utvecklade CRISPR/Cas9 verktyg8 underlättat att studera genreglering eftersom de tillåter för radering av förstärkare på den endogena locus. Dock ta bort flera smakförstärkare samtidigt kan leda till genomisk instabilitet, och det är tidskrävande att generera successiva enhancer borttagningar i en enda cell linje. Dessutom nya genomiska sekvensen skapas på platsen för borttagning efter reparation, och denna sekvens kan få reglerande funktion. En alternativ version av Cas9 har utvecklats specifikt för modulerande genuttryck, förlitar sig på fusioner av aktivera9,10 eller förtränga11,12 domäner till formuläret nuclease-brist av Cas9 (dCas9). Dessa fusionsproteinerna är idealiska för att studera flera loci samtidigt som de gör inte fysiskt förändra DNA-sekvensen, och istället modulera epigenetik för att förhöra en reglerande region. Den används mest repressiva fusionen är KRAB, som rekryterar KAP1 samtidig repressor anläggningen, att främja avsättning av det förtryck-associerade Histon H3 lysin 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, även kallat CRISPR störningar14, har använts för att mål och skärmen enskilda förstärkare för deras bidrag till gen uttryck15,16; Det har dock inte optimerats för inriktning flera regioner samtidigt. En version av multiplex CRISPR störningar för förstärkare, mosaik-seq17, använder enstaka cell RNA-seq som en avläsning, men denna teknik är dyra och endast lämplig för studier av starkt uttryckt gener på grund av den låga känsligheten i cell RNA-följande punkter

Vi försökte utveckla en CRISPR störningar-baserad metod för att dissekera kombinatoriska enhancer funktion inom ramen för ett transkriptionell svar till östrogen. Ungefär hälften av östrogenkänsliga gener innehåller 2 eller fler förstärkare bunden av östrogen receptor alfa (ER) i närheten18, vilket tyder på att flera förstärkare kan vara deltagande i östrogen svaret, och förstå den reglerande logiken skulle kräva inriktning flera smakförstärkare samtidigt. Som inledande studier med CRISPR störningar vid initiativtagare föreslås att inte alla initiativtagare är lika lyhörd till KRAB-medierad förtryck19, resonerade vi att tillägg av en distinkt repressiva domän till dCas9 kan underlätta avaktivering av mångsidig förstärkare. Vi valde den Sin3a interagerar domän av Mad1 (SID)20 eftersom det leder till rekrytering av Histon deacetylases21, som ta bort acetyl grupper på histoner som är associerade med transkriptionell aktivitet. Ännu viktigare, domänen SID var effektivt minska genuttryck när smält till dCas922 och TALEs23och Sin3a har visat sig vara en potent repressiva Co-faktor i en mängd olika förstärkare sekvens sammanhang24. Vi använde SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) för att rikta 10 olika förstärkare bunden av ER, och identifiera ER bindningsställen (ERBS) som är nödvändiga för östrogen transkriptionell svar 4 gener18. Vi riktade också kombinationer av förstärkare att identifiera webbplatser som samarbetar i produktionen av östrogen transkriptionell svaret. Vi hittade att upp till 50 platser kan potentiellt riktas samtidigt med detekterbara genförändringar uttryck. Med hjälp av ChIP-seq och RNA-seq, visat vi att Enhancer-jag är en mycket specifik teknik för att studera flera smakförstärkare samtidigt.

I detta protokoll beskriver vi de olika stegen i utföra Enhancer-i, en flexibel teknik som möjliggör funktionella studier av flera smakförstärkare samtidigt i en vävnadskultur inställning. Förstärkare-jag är starkt korrelerade med genetiska strykningen men ger övergående inaktivering som är beroende av Histon deacetylases (HDAC). Genom att leverera guide RNAs via övergående transfection i stället för stabil integrering via virala vektorer, undviker detta protokoll nedfall och potentiella spridning av H3K9me3. Detta protokoll Detaljer guide RNA design och kloning via Gibson församling, transfection av guide RNAs använder lipofection, och analysen av resulterande genuttryck ändras av qPCR. Vi har även metoder för att utvärdera specificitet Enhancer-i inriktning på nivån av genomet och transkriptom. Medan denna teknik utvecklades för att studera genreglering av ER bundna smakförstärkare i human cancer cellinjer, det gäller för dissektion av alla däggdjur förstärkare.

Protocol

1. generering av Cell linjer stabilt uttrycker SID4X-dCas9-KRAB

Obs: Transfection villkor och läkemedelskoncentrationen som presenteras här har optimerats för Ishikawa celler, en endometriecancer cellinje, odlas i RPMI 1640 media kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin (komplett RPMI). Andra cellinjer kan kräva olika transfection villkor och läkemedelskoncentrationen. Användare kan också utföra övergående transfection experiment vildtyp celler, istället för att generera en stabil cellinje, med en plasmid som uttrycker SID4X-dCas9-KRAB tillsammans med guide RNA uttrycker plasmider; resultat från övergående transfections kan dock svårt att återge som SID4X-dCas9-KRAB nivåer kan variera av transfection.

  1. Tallrik Ishikawa celler i minst 2 brunnar i en 6-väl-plattan på 30-50% confluence (ungefärligt 300.000 Ishikawa celler) 3 ml komplett RPMI.
    1. Aspirera media från cellerna. Tvätta cellerna en gång med 1 x PBS (pH 7,4). Aspirera PBS och lägga till trypsin (4 mL för en 10 cm maträtt eller 5 mL för en T-75 kolv).
    2. Inkubera cellerna för ~ 5 min vid 37 ° C, kontrollera varje 2 min för fristående celler och försiktigt skaka fartyget.
    3. När cellerna har lossnat, pipett trypsinized celler upp och ner några gånger och pipetten försiktigt ner sidan av fartyget att släppa eventuella bifogade celler.
    4. Överföra cellerna till en 15 mL konisk slang och snurra cellerna ner för 5 min på 250 x g.
    5. Uppsugning av trypsin och resuspendera cellerna i 5-10 mL av media. Använda P1000 pipett för att dissociera cell klumpar vid behov.
    6. Räkna cellerna och fastställa den mängd som behövs för att platta ~ 300 000 celler per brunn i en total volym på 3 mL. Lägga till celler till 2 separata brunnar i en 6-bra platta. Fylla varje väl till 3 mL med komplett RPMI.
    7. Skaka försiktigt plattan varje 5 min i de första 15 min efter plätering att se till att cellerna fördelas jämnt på plattan. Använda ett mikroskop för att säkerställa att cellerna har spridda från mitten av brunnen.
  2. Inom 24 h av plätering, utföra de följande transfections med hjälp av ett lämpligt transfection reagens för cell raden av intresse. För Ishikawa celler, använder du proceduren som beskrivs nedan.
    Obs: Detta protokoll förutsätter användningen av katjoniska Liposom-baserade transfection reagenser. Elektroporation erbjuder en alternativ metod för celltyper som är mycket känsliga för dessa reagenser eller som uppvisar låg transfection effektivitet med lipofection. Transfection villkor måste optimeras för cell raden av intresse innan du försöker Enhancer-i experiment.
    1. I en 1,7 mL Eppendorf-rör, späd 2,5 μg av SID4X-dCas9-KRAB plasmid och 800 ng av Plasmiden uttrycker en fluorescerande protein i serumfritt media så att den avslutande volymen i röret är 155 µL och den slutliga koncentrationen av Plasmiden är 0,020 µg/µL.
    2. I en annan tube, späd 3,3 µg av en plasmid som inte innehåller en neomycin motstånd kassett, såsom pCMV-GFP, i serumfritt media så att den avslutande volymen i röret är 155 µL och slutliga koncentrationen av Plasmiden är 0,020 µg/µL.
    3. Vortex varje röret kort och snurra ner med en microfuge.
    4. Lägga till 9,9 µL av transfection reagens (Tabell för material) i varje rör. Blanda genom vortexa kort på en låg hastighet. Snurra rören ner med en microfuge.
    5. Inkubera rören i rumstemperatur i minst 5 min, men inte mer än 20 min.
    6. I biosäkerhet skåp, tillsätt 150 µL av beredda DNA: reagens mixen droppvis till en brunn på 6-väl plattan. Upprepa för andra röret av beredda DNA: reagens mix. Blanda plattorna genom omskakning försiktigt och tillbaka plattan till inkubatorn.
  3. På dag 2 inlägg transfection, ändra media och komplettera med G418 till en slutlig koncentration av 600 ng/μl. Denna koncentration kan behöva optimeras för celltypen.
  4. Ändra komplett RPMI media och komplettera med G418 varannan dag i 2-4 veckor tills kontroll transfekterade celler är döda och brunnarna som innehåller SID4X-dCas9-KRAB blir konfluenta. Den exakta mängden tid som behövs för cellerna att återhämta sig beror på den fördubbling tid av cellerna.
  5. När cellerna blivit konfluenta, passage till ett T-25 eller T-75 fartyg i komplett RPMI med en lägre dos av G418 (300 ng/μl för Ishikawa celler). Under denna passage, göra 2 portioner av ~ 100 000 celler varje (ungefär 1/10th 6-well platta) till 2 separata 1,7 mL Eppendorf-rör för RNA och DNA isolering, respektive. Snurra dessa rör ner (5 min, 250 x g), ta bort trypsin genom pipettering och frysa rören vid-20 ° C för framtida bruk.
  6. Isolera genomiskt DNA med kommersiellt tillgängliga kits och utför PCR med hjälp av ”pAC95_PCR” eller ”SID4X_PCR” primers (tabell 1) för att verifiera förekomsten av proteinet fusion inom i cellinje. Använd genomiskt DNA extraheras från raden föräldraledighet som en negativ kontroll och SID4x-dCas9-KRAB plasmid DNA som positiv kontroll. Använd en HiFi-polymeras master mix med 50-100 ng av genomisk DNA och cykling följande: 98 ° C i 30 s, 25 cykler av (98 ° C för 10 s, 58 ° C i 30 s, 72 ° C under 2 min), 72 ° C under 5 min , håll vid 4 ° C.
  7. Kontrollera uttrycket av proteinet fusion på RNA-nivå, utföra qPCR med RNA som utvinns ur den cellinje som använder kommersiellt tillgängliga kit. Använd ”dCas9_qPCR” primers (tabell 1) och one-step qPCR protokollet anges i steg 6.3 i detta protokoll.
  8. Verifiera proteinnivå uttrycket av fusion, utföra en Western blot på lysates från cellinje. Använd antingen anti-Flag eller anti-HA antikroppar att upptäcka proteinet fusion.

2. guide RNA Design

Obs: Detta protokoll är konstruerad för användning med U6 guide RNA kloning vektor skapad av kyrkan lab och tillgänglig på Addgene (Addgene 41824). För att skapa en version av denna vektor som innehåller puromycin motstånd som tillåts för samma kloning strategi som 41824, flyttade vi flera kloning webbplatsen från denna vektor i den pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin vektorn (Addgene 51133). Antingen Addgene 41824 eller vår version med puromycin (Addgene 106404) är kompatibla med den kloning strategi som beskrivs nedan.

  1. Erhålla 600-900 basepairs av DNA-sekvensen för varje reglerande region av intresse. Använda transkription faktorn bindningsställen och/eller kromatin tillgänglighet för vägledning om var att definiera regionen av intresse (figur 2A).
    Obs: Medan exemplet i figur 2A erbjuder uppströms och nedströms smakförstärkare, det är också möjligt att rikta reglerande element ligger inom introner.
  2. Placera alla sekvenser som erhållits i en enda textfil i FASTA format.
  3. Identifiera minst en negativ kontrollregion som inte förväntas förändras över experimentella villkor, såsom en främjare av en gen som inte uttrycks i cell linje av intresse. Få DNA-sekvensen för denna region och lägga till textfilen i FASTA format.
    Obs: Vi använder guide RNAs inriktning IL1RN promotorn25 som en negativ kontroll för alla regioner vi rikta. Användare kan också välja intergenic sekvens nära regionen av intresse som inte innehåller transkription faktorn bindningsställen som en negativ kontroll. Men om flera loci riktar samtidigt som de är, förenklar en enda negativ kontrollregion experimentell design och tolkning av resultat. Om den rikta förstärkare är intronic, kan det användbart att rikta en intronic region på det samma locus som inte innehåller en förmodad reglerande faktor som en ytterligare negativ kontroll, som dCas9 fusion kan störa transkription.
  4. Identifiera positiva kontrollen regioner, såsom initiativtagare som är de förmodade mål regulatoriska regioner av intresse, eller främjare av gener som transkriberas högt i cell linje av intresse. Få DNA-sekvensen för dessa regioner och lägga till textfilen i FASTA format.
  5. Använda ett program som e-skarp26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) på de DNA-sekvenser som genereras för att hitta guide RNAs med låg off-mål (helst 0-3). Guide RNAs består av 20 nukleotider uppströms av protospacer angränsande motiv (PAM), som tar form ”NGG” för dCas9 från S. pyogenes.
    1. På webbplatsen e-skarp, Välj organismen av intresse med hjälp av den nedrullningsbara menyn. Genomet församlingen visas till höger om Artens namn.
    2. Välj knappen Input är FASTA sekvens . Kopiera den FASTA sekvenser från ovan och klistra in dem i dialogrutan. Se till att en FASTA rubrik ingår för varje sekvens.
      Obs: Upp till 50 sekvenser kan efterfrågas samtidigt.
    3. Välj Medium alternativknappen och enda design i den nedrullningsbara menyn.
    4. Klicka på knappen Starta sgRNA sökning. En ny flik i webbläsaren öppnas, och resultaten kommer att visas. Hämta den kandidat sekvenser genom att klicka på knappen Hämta en rapport i tabellformat Excel formateras för alla fråga sekvenser tillsammans.
    5. Öppna rapporten tabellform Excel eller ett textredigeringsprogram.
  6. Använd UCSC genomet webbläsaren till BLAT kandidat fullängds gärna sekvenser (23 basepairs) till genomet.
    1. I en webbläsare, navigera till webbplatsen UCSC genomet webbläsare (http://genome.ucsc.edu). Under avsnittet våra verktyg, hitta ordet BLAT och klicka på den. Sökverktyget BLAT öppnas.
    2. Använd de nedrullningsbara menyerna ligger under BLAT Sök genomet texten för att välja organism och arvsmassan montering av intresse.
    3. Kopiera guiden RNA sekvenser från tabellform rapport genereras av e-skarp och klistra in dem i dialogrutan. Kontrollera att varje sekvens har en unik FASTA rubrik, klicka på Skicka längst ned i dialogrutan.
      Obs: Upp till 25 sekvenser kan undersökas på en gång. På sidan BLAT sökresultat visas anpassningar av varje guide RNA-sekvens, med varje rad representerar en anpassning. Helst bör det finnas en justering för varje guide RNA, som anger unikitet med denna guide RNA.
    4. Undvik de guider som anpassa till flera platser i genomet om möjligt.
    5. För att undersöka guide RNA lokalisering och distribution inom regionen av intresse, klicka på länken webbläsare under avsnittet åtgärder för en av de efterfrågade guide RNAs. Genomet webbläsaren visas och centreras på den valda guiden RNA. Använd knapparna Zooma ut överst på sidan för att visualisera fördelningen av andra guide RNAs identifieras av e-skarp inom regionen av intresse.
  7. Välj 4 helst icke-överlappande guide RNA-sekvenser som distribueras i hela regionen av intresse (figur 2B). Om regionen av intresse överstiger 600 bp, överväga att lägga till 1-2 ytterligare guider. Undvika guide RNAs med homopolymeric sträckor och extrema GC innehåll, eftersom dessa funktioner kan hindra guide RNA kloning processen och minska guide RNA inriktning effektivitet.
  8. När guider har valts, skapa en fil som innehåller den fullständiga guiden RNA-sekvens (23 nukleotider) för varje önskad guide och ta sedan bort den 5' nukleotid samt den PAM (NGG) från 3' slutet. Detta steg underlättar oligo beställning.
  9. Lägg till följande sekvens i 5' slutet av oligonukleotiden sekvensen: GTGGAAAGGACGAAACACCG.
  10. Lägg till följande sekvens 3' ände oligonukleotiden sekvensen: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
    Obs: Den slutliga sekvensen bör 59 nukleotider långa och titta såhär: GTGGAAAGGACGAAACACCG-målet (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
  11. Kontrollera att varje reglerande element vara riktade med Enhancer-jag har minst 4 unika oligonukleotider utformad för det. Beställ dessa sekvenser tillsammans med ”U6_internal” primers som anges i tabell 1.

3. guide RNA kloning

Obs: Guide RNA kloning via Gibson församlingen har visat sig vara mycket effektiva i våra händer, ger hundratals kolonier per platta, med få om några kolonier i den vektor enda kontrollen. Sådan effektivitet är avgörande för att upprätthålla komplexitet under poolade kloning. En annan fördel med Gibson församlingen kloning är att användare inte behöver bekymra dig om förekomsten av ett restriktionsenzym som skär webbplats i guide RNA de försöker infoga i U6 kloning vektorn. Detta protokoll kan dock anpassas för traditionella restriktionsenzym baserat kloning om så önskas.

  1. Beredes guide RNA oligos med en slutlig koncentration på 100 μM i ultrarent vatten (RNase-fri, DNAS-fri). Det bör finnas minst 4 separata guide RNA oligos för varje region av intresse.
  2. För varje reglerande region av intresse, skapa en pool av alla de oligos motsvarar regionen av intresse. I ett Eppendorf-rör, kombinera 5 μL av varje enskild rekonstituerade guide RNA oligo för varje region. Blanda poolen väl genom vortexa, ta sedan bort 1 μL och späd denna delmängd 1: 200 i ultrarent vatten.
    Obs: Om så önskas, dessa pooler inriktning enskilda regulatoriska regioner kan ytterligare kombineras för att skapa en komplex pool inriktning flera regioner. Upp till 50 regulatoriska regioner kan riktas samtidigt i en enda pool (figur 3 c).
  3. Utföra en kort PCR med U6 primers för att fästa homologi regioner till oligos före Gibson montering. Ca 40 baser kommer att läggas till varje oligo, ger en ~ 100 bp produkt som innehåller tillräcklig homologi till U6 vektorn i båda ändarna.
    1. För varje guide RNA pool, ställa in en 20 μL PCR med en HiFi-polymeras master mix och följande komponenter: 1 μL av utspädda oligo pool från steg 3,2, 1 μL av U6 framåt primer (10 μM), 1 μL av U6 reverse primer (10 μM) , och vatten upp till 20 μL.
    2. Inkubera i en termocykel med följande villkor: 98 ° C i 30 s, 10 cykler av (98 ° C för 10 s, 55 ° C för 30 s, 72 ° C i 2 min), 72 ° C i 5 min, och håll vid 4 ° C.
    3. Kör 5 μL av reaktionen på en 1-2% agarosgel med låg molekylvikt stege. Slutprodukten ska vara ~ 100 basepairs (figur 2 c).
    4. Städa upp förlängning reaktionen med en kolumn-baserad DNA rening kit, och eluera i 20 μL av eluering buffert i kit.
      Obs: Eftersom produkten är kort, undvika att använda pärla-baserade clean-ups, som är utformade för att utesluta små fragment mindre än 100 bp.
    5. Kvantifiera den renade DNA med fluorometer eller spektrofotometer (förväntad avkastning är 10-20 ng/μl). Guide RNA skär kan förvaras vid-20 ° C, eller kan användas direkt i Gibson montering med en linearized U6-vektor.
  4. För att förbereda mottagaren U6 kloning vektor för Gibson montering, ställa in ett restriktionsenzym digest. Om många Gibson församlingen reaktioner skall utföras, Ställ in flera smälter att säkerställa tillräcklig avkastning av skurna vektor.
    1. Använd 20 enheter av AflII enzym och 1 μg av Plasmiden i en 20 μL reaktion med lämpliga restriktionsenzym bufferten. Inkubera vid 37 ° C i 1-2 h.
    2. Städa upp digest med pärlor eller ett kolumnbaserade kit för DNA-rening och eluera i 20 μL av eluering buffert. Kvantifiera den renade DNA med fluorometer eller spektrofotometer. Prover kan frysas vid-20 ° C för senare användning.
  5. Utföra Gibson montering på beredda vektorn och infoga.
    1. Ställa in Gibson församlingen reaktioner på is. Använd 50 ng av vektorn och 7 ng av skäret i en 20 μL reaktion. Späd den skär 1:10 i ultrarent vatten för att underlätta pipettering. Ställa in en vektor bara Gibson församlingen reaktion, med 50 ng av vektorn och ersätter insatsen med vatten.
    2. Inkubera Gibson församlingen reaktionerna för 15 min vid 50 ° C, följt av ett uppehåll vid 4 ° C.
    3. Överföra de sammansatta produkterna till is. Späd de sammansatta produkterna 1:4 i ultrarent vatten på isen. Exempelvis lägga till 5 μL av Gibson församlingen produkt till 15 μL av ultrarent vatten.
  6. Omvandla de utspädda Gibson församling produkterna.
    1. Tina hög effektivitet behöriga celler på isen och göra 25 μl portioner för varje omformning. Om en komplex pool inriktning flera platser önskas, Tina tillräckligt med celler i olika rör att utföra flera oberoende omformningar av samma komplexa gärna pool.
    2. För varje utspädd produkt, tillsätt 1 μL denna utspädning till en 1,7 mL Eppendorf-rör som innehåller 25 μL av behöriga celler. Blanda genom att kort snärta röret. Inkubera rören på is i 30 min.
    3. Värme chock cellerna för 30 s vid 42 ° C, sedan överföra omedelbart för att is i 2 min.
    4. Lägg till 300 μL SOC media (2% trypton, 0,5% jästextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4och 20 mM glukos) och låta cellerna återhämta sig för 1 h vid 37 ° C under skakning (300 rpm). Under denna tid, varma plattorna agar med ampicillin/carbenicillin till 37 ° C i en inkubator. Använd en platta för varje omformning.
    5. Tallrik 50 μL av celler och placera plattorna i en inkubator i 37 ° C under natten. Vid poolerna inriktning på enskilda platser, placera direkt i 3-5 mL LB buljong (Tabell för material) som innehåller ampicillin/carbenicillin (1 mg/mL) och inkubera över natten med skakningar vid 250 rpm vid 37 ° C för minipreps.
  7. Skörda cellerna och isolera DNA.
    1. För stora guide RNA bibliotek inriktning flera webbplatser, använda en plätera skrapan för att samla alla kolonier från varje enskild platta i en maxiprep (150 mL flytande kultur). Detta kan underlättas genom hälla ~ 5 mL LB med anslåantibiotikummen i en 50 mL falconrör och skrapning kolonierna i röret. För biblioteken inriktning på enskilda platser, skrapa plattorna i en miniprep (3-5 mL flytande kultur).
    2. Inkubera dessa kulturer med anslåantibiotikummen för 3-5 h vid 37 ° C med skakningar vid 250 rpm.
    3. Utföra DNA-extraktion med ett kit som resulterar i endotoxinfria preps.
    4. Kvantifiera DNA med fluorometer eller spektrofotometer. Plasmider kan användas omedelbart i transfection eller lagras vid-20 ° C för framtida bruk.
  8. För att bekräfta förekomsten av guide RNA sekvens inom U6 vektorn för små bassänger inriktning enda webbplatser, använda Sanger sekvensering på de förberedda miniprep med ”U6_PCR_R” primern listade i tabell 1. På grund av sammanslagning av guide RNAs, sekvensen 19 basepair gärna mål kommer att ge blandade baser, men de U6 promotorn och guide RNA byggnadsställning kring denna sekvens bör vara intakt.

4. transfection av Enhancer-i

Obs: För framgångsrika blockaden av ett östrogen svar använder Enhancer-i i Ishikawa celler, är det nödvändigt att beröva cellerna av östrogen för 5-7 dagar före transfection genom att upprätthålla dem fenolrött gratis RPMI med 10% träkol-skrapat FBS och 1% penicillin/streptomycin. Cellerna bör vara odlade i detta media under och efter transfection om försöka blockera ett östrogen svar. Vi rekommenderar användning av fenolrött gratis trypsin för passage av celler i komplett fenolrött gratis RPMI.

  1. Dagen innan transfection, tallrik cellerna (vildtyp eller stabilt uttrycker SID4X-dCas9-KRAB) i en 24-well platta på 30-50% konfluens (~ 60 000 celler per brunn för Ishikawa celler). Tallrik tillräckligt med celler så att transfections kan utföras i två exemplar och innehålla brunnar för att vara transfekterade med kontroll guide RNAs.  Säkerställa att cellerna är jämnt fördelad över brunnen genom att försiktigt skaka plattan efter cell plätering som i steg 1.1.7.
    Obs: Detta protokoll förutsätter användningen av katjoniska Liposom-baserade transfection reagenser. Elektroporation erbjuder en alternativ metod för celltyper som är mycket känsliga för dessa reagenser. Transfection villkor måste optimeras för cell raden av intresse innan du försöker Enhancer-i experiment.
  2. Följande dag, förbereda transfections enligt anvisningar av transfection reagens av val. För Ishikawa celler, Använd 550 ng av totala plasmid för varje brunn 24-bra platta. Späd plasmidsna till en slutlig koncentration på 0,020 μg/μL i serumfritt media (1,1 μg DNA i 52 μL av total volym för transfecting 2 brunnar). Använda 3 μL transfection reagens för varje 1 μg DNA, vortex och inkubera som beskrivs i steg 1.2. Tillsätt 25 μl av den slutliga blandningen till varje brunn.
    Till målet kombinationer av platser, Använd samma vikt av Plasmiden för varje enskild plats, och sedan fylla den överblivna vikten med en kontrollplasmid (tom guide RNA kloning vektor- eller guide RNAs inriktning en negativ kontrollregion som den IL1RN Arrangören). För övergående transfections, använda en kvot på 3:2 Cas9 fusion: guide RNA plasmid. Plasmider innehållande fluorescerande reportrar kan läggas för att övervaka transfection effektivitet.
  3. På 36 h post transfection, ändra media använder fenolrött gratis RPMI med 10% träkol-skrapat FBS och 1% penicillin/streptomycin (för Ishikawa celler) och leverera puromycin (slutlig koncentration: 1 μg/mL) och neomycin (slutlig koncentration: 300 ng/mL). Om cellerna är känsliga för transfection reagens, media kan ändras tidigare, men antibiotika bör läggas tidigast 24 h post transfection.
    Obs: Vänta i minst 24 timmar efter att lägga till antibiotika före skörd celler. Uttryck förändringar på grund av Enhancer-jag kan upptäckas så tidigt som 48 h post transfection och upp till 5 dagar efter transfection. Om arbetar med Ishikawa celler som har berövats östrogen, utföra en 8-h 10 nM 17β-Östradiol (E2) induktion dagen efter antibiotikabehandling och sedan skörda celler omedelbart.

5. cell skörd och RNA-extraktion

  1. Förbereda lyseringsbuffert med 1% β-merkaptoetanol (BME). Se till att det finns tillräckligt Lys-BME blandning (300 μL för varje väl skördas).
  2. Aspirera media med hjälp av ett vakuum insugningsventil.
  3. Tvätta cellerna en gång med en lika stor volym av 1 x PBS (500 μL) och aspirera att ta bort så mycket PBS som möjligt.
  4. Tillsätt 300 μL av Lys-BME lösning till varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett. Pipettera lysis lösningen upp och ner 8 - 10 gånger och överföring till en djup, väl tallrik eller 1,7 mL Eppendorf rör på is. RNA kan extraheras omedelbart, eller lysates kan frysas vid-80 ° C för framtida bearbetning.
  5. För att extrahera RNA från lysates, använda ett kommersiellt tillgängliga kit som innehåller en DNAS-behandling. Eluera i den minsta rekommenderade volymen av ultrarent vatten (RNase-fri, DNAS-fri) eller eluering buffert och kvantifiera RNA. För litet antal prover, använda en fluorometer eller spektrofotometer. För stort antal prov, använda en fluorescerande sond som identifierar RNA och åtgärd på en Plattläsare. Prover kan frysas vid-80 ° C före eller efter kvantifiering.

6. kvantifiera gen uttryck ändringar med One-step qPCR och RNA-seq

  1. Erhålla qPCR primers för generna av intresse och minst en städning genen uttrycks nära nivån på riktade gener som inte ändras över försöksbetingelser. Helst dessa primers kommer att spänna över ett exon-exon föreningspunkten för att undvika amplifiering av genomisk DNA.
    1. Testa dessa grundfärger på RNA som erhållits från cellen fodrar av intresse. Användning smälta kurva analys att kontrollera produktionen av en enda produkt. Om en enda produkt inte produceras, testa ytterligare primer par.
  2. För varje Enhancer-i och kontroll guide RNA behandlas prov, identifiera hur många gener måste analyseras i urvalet. Denna uppsättning gener bör omfatta städning gener, till exempel SAP eller GAPDH.
  3. Ställa in qPCR reaktioner.
    1. Späd prover som är alla samma koncentration i vatten, så att 50 ng av total-RNA är enkelt pipetteras, och det finns tillräckligt utspädd RNA för varje reaktion. Till exempel späd RNA till ~16.6 ng/μl och använda 3 μL av RNA i varje reaktion. Hålla RNA på is när du konfigurerar master mixar.
    2. Bered separata master mixar för varje gen skall mätas med hjälp av kommersiellt tillgängliga one-step qPCR Kit. Använda en 20 μl reaktionsvolym med 1 μL av varje grundfärg (10 μM stamlösning). Ställa in dessa reaktioner på is.
    3. I en reaktion-platta som är lämplig för termocykel, lägga till RNA prov följt av master mixar. Försegla med en tallrik sealer och blanda försiktigt genom vortexa eller pipettering. Kort Centrifugera plattan (140 x g för 60 s) att se till att vätska är på botten av brunnarna.
    4. Inkubera plattan i en termocykel som följer (eller som sats instruerar): 48 ° C i 30 min, 95 ° C i 10 min, 40 cykler av (95 ° C under 15 s, 60 ° C i 1 min).
  4. Erhålla Ct-värden för varje gen mätt inom varje prov. Använd metoden jämförande Ct för att identifiera förändringar i genuttryck.
    1. Subtrahera Ct av städning genen från Ct av varje gen av intresse för varje prov att generera normaliserade Ct-värden.
    2. För de behandlade kontrollproverna, ta ett genomsnitt av de normaliserade Ct-värdena för varje gen. Log bas 2-skala fold förtryck kan sedan beräknas genom att subtrahera normaliserade Enhancer-jag behandlas provet Ct för varje gen från samma värde för behandlas kontrollprovet för den motsvarande genen.
  5. För att fastställa globala förändringar i genuttryck efter Enhancer-i behandling, att bereda proverna för RNA-sekvensering använder en kommersiellt tillgänglig kit som är kompatibel med användarens sekvenseringsteknologi. Användning ~ 500 ng av RNA för utgångsmaterial och förbereda bibliotek för minst 2 biologiska replikat.

7. kontroll av specifika genomisk inriktning av SID4X-dCas9-KRAB använder ChIP-seq

Obs: SID4X-dCas9-KRAB fusion proteinet innehåller både en flagga epitop tagg och ett HA epitop tagg, men bästa resultat för ChIP-seq erhölls med anti-Flag antikroppar. Om så önskas, kan användaren utföra ytterligare ChIP-seq experiment för transkriptionsfaktorer som potentiellt berörs av Enhancer-i, eller för H3K27ac, ett märke av enhancer aktivitet som är minskade Enhancer-i. Varje ChIP-seq experiment kräver dock 10 x 106 celler, så planera med detta.

  1. Transfect celler med Enhancer-i pool.
    1. Platta 10 x 106 celler i en 15 cm vävnadsodling maträtt. Varje maträtt representerar 1 ChIP-seq experiment för 1 faktor av intresse.
    2. Följande dag, transfect cellerna med 20 μg totala DNA per maträtt. För transfections i cellinjer som stabilt uttrycker SID4X-dCas9-KRAB, bör DNA vara en plasmid pool av guide RNAs inriktning alla platser av intresse, och eventuellt en plasmid uttrycker fluorescerande protein. För övergående transfections, använda en kvot på 3:2 dCas9 fusion protein: guide RNA pool. För ChIP-seq andra TFs eller Histon ändringar, utför minst en ytterligare kontroll guide RNA transfection på en annan maträtt.
    3. Behandla rätter med puromycin (1 μg/mL) och neomycin (300 ng/mL) på 24-48 h post transfection. Vänta minst 24 h innan skörd kromatin.
  2. Skörda kromatin från rätter.
    Obs: Att studera effekterna av Enhancer-jag på ER genomisk bindande i Ishikawa celler, utföra en 1 h 10 nM E2 behandling på rätter transfekterade med kontroll guide RNAs och Enhancer-i före skörden. Att studera effekterna av Enhancer-i på H3K27ac, utföra en 8 h 10 nM E2 induktion på rätter transfekterade med kontroll guide RNAs och Enhancer-i före skörden.
    1. 500 μL av 37% formaldehyd gälla varje maträtt (slutliga koncentration av 1%). Snurra runt plattorna kort. Låt plattorna stå i rumstemperatur i 10 min.
    2. Tillsätt 1 mL 2,5 M glycin (slutlig koncentration på 125 mM). Snurra runt plattorna kort.
    3. Häll av media med formaldehyd och glycin. Tillsätt en motsvarande volym (~ 20 mL) kallt 1 x PBS.
    4. Häll av PBS. Aspirera med en vakuum hygienfilter ta bort så mycket PBS som möjligt. Placera rätterna på is.
    5. Tillsätt 3-5 mL kallt 1 x PBS eller Farnham lyseringsbuffert (5mM rör pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) med 1 x proteashämmare (läggs strax innan användning) till varje tallrik. Skrapa skålen med en tallrik skrapa och överför lösningen till en 15 mL koniska rör på is.
    6. Pellet kromatin av spinning ner rören i en Centrifugera under 5 minuter vid 4 ° C vid 1000 x g. Kassera supernatanten och lagra pellets vid-80 ° C för framtida bruk, eller fortsätta med ChIP-seq protokollet av val med en anti-Flag antikropp eller antikroppar riktade andra transkriptionsfaktorer eller Histon modifieringar av intresse (H3K27ac, H3K9me3).

Representative Results

Figur 1 visar en schematisk av arbetsflödet beskrivs i protokollet. För att fastställa bidragen från ER-bundna enhancers nära östrogen-reglerade genen MMP17, som har 3 bindningsställen i närheten definieras av ChIP-seq (figur 2A), vägleda RNAs utformades för varje region. För att designa guide RNAs, en 600-900 bp fönster av sekvens som omger varje ER bindande platsen av intresse valdes och sätta i en guide RNA designprogram. Resulterar guide sekvenser RNA med 0-2 förutspådde avviker från målet platser anpassades till det mänskliga genomet som använder BLAT. Fyra icke-överlappande guide RNAs som sträckte sig över regionen definieras av ChIP-seq och DNaseI överkänslighet valdes för inriktning (figur 2B). Ytterligare sekvens (tabell 1) lades till varje ände att underlätta nedströms kloning och den resulterande 59 nukleotid fragment beställdes. Vid ankomsten utfördes guide RNAs var utspädd och poolade genom webbplatsen, och en kort PCR för att lägga till homologi regioner före Gibson montering. Figur 2 c visar produktens förväntade guide RNA efter en kort PCR använder ”U6_internal” primers (tabell 1), som kommer att lägga 20 basepairs i sekvens till varje ände av den 59 basepair guide RNA fragment, vilket resulterar i en ~ 100 basepair sekvens. Efter Gibson församling, poolerna guide RNA förvandlades till bakterier och plasmiden minipreps utarbetades följande dag. Figur 2D visar resultat från ett enhancer dissektion experiment, där flera förstärkare i närheten MMP17 riktar sig ensam och i kombination med Enhancer-i. Platser riktade av Enhancer-i indikeras med en svart hexagon. Guide RNA plasmider inriktning de angivna platserna var transfekterade in en östrogen-berövade Ishikawa cellinje stabilt uttrycker SID4X-dCas9-KRAB. Två dagar senare, media har ändrats och puromycin lades till berika för transfekterade celler. Följande dag, skördades cellerna efter en 8 h 10 nM estradiol behandling. RNA isolerades och en one-step qPCR utfördes. I det här exemplet är platser 1 och 2 nödvändiga för en fullständig östrogena respons av MMP17, medan webbplatsen 3 inte bidrar under dessa förhållanden (figur 2D, körfält ii-iv). När endast platser 2 eller 3 är aktiva (vi och vii), östrogen svar är liknande när inga platser är aktiv (viii), vilket tyder på att dessa platser inte kan bidra självständigt. Plats 1 kan bidra något uttryck av sig själv (v), men den största aktiviteten ses när platser 1 och 2 är aktiva (iv).

För att manipulera 10 förstärkare nära 4 olika gener samtidigt (figur 3A), komplexa pooler av guide RNAs genererades innehållande 42 enhancer stödlinjer och 16 arrangören guider. Guide RNA oligos var poolade innan guiden inledande RNA filändelsen PCR (steg 3,3), och resulterande PCR-produkter var renat och kombinerat med de tomma puromycin U6 kloning vector med Gibson församling. Efter den Gibson församlingen, var flera oberoende omformningar utförs och förkromad. Plattorna var skrapade i LB och tillåts växa ut för 2-4 h före maxiprep. Figur 3B visar representativa minskningar i genuttryck av qPCR när dessa guide RNA pooler var transfekterade in en östrogen-berövade Ishikawa cellinje stabilt uttrycker SID4X-dCas9-KRAB och behandlas enligt ovan (figur 2D). Minskningen från Enhancer-jag är liknande dem som erhållits genom att rikta främjare av förmodad målgenen. Figur 3 c visar effekterna av utspädning av guide RNAs på minskning av östrogen svar använder Enhancer-i. 1:50 utspädning av en guide RNA pool inriktning förstärkare nära G0S2 fortfarande ger betydande minskning av genuttryck, tyder på att Enhancer-i kan användas för att rikta upp till 50 platser på en gång. Avaktiveringen kan dock spädas ut, vilket indikerar att hundratals webbplatser inte kan riktas samtidigt såvida inte känsligare identifieringsmetoder är anställda.

Figure 1
Figur 1. Protokoll Schematisk för multiplex enhancer dissektion med Enhancer-i. Guide RNAs (röd och blå) är utformade med hjälp av e-skarp och valda i webbläsaren UCSC genomet. Fyra guide RNAs väljs som spänner över regionerna av intresse (transkription faktorn bindningsställen som definieras av ChIP-seq). Guide RNA oligonukleotider som slagits samman regionen av intresse (röd och blå) genomgå en PCR för att lägga till homologi regioner (orange) före Gibson församling och transformation. Resulterande plasmid pooler är transfekterade via lipofection till cellinjer stabilt uttrycker SID4X-dCas9-KRAB eller till vildtyp celler i samband med SID4X-dCas9-KRAB plasmid. Guide RNA plasmid pooler kan vara transfekterade individuellt för att rikta en plats i taget, eller i kombination att rikta flera platser samtidigt. Transfekterade celler behandlas med antibiotika för att berika för celler som innehåller guide RNAs. På ~ 72 h post transfection skördas cellerna. Nukleinsyror kan extraheras för qPCR, RNA-seq eller ChIP-följande punkter vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Vägleda RNA design och enhancer dissektion för MMP17. (A) genomet webbläsare skärmdump av de ER alpha-bundna Smakförstärkare (grå) riktas nära MMP17. Denna siffra har ändrats från Carleton, o.a. 18. (B) Guide RNA designar för 3 bindande platser18. Bindningsstället för ER som definieras av ChIP-seq är målet, och 4 guide RNAs kakel över denna region. Signalen DNaseI känslighet, som sträcker sig bindningsstället, kan också användas för att definiera målet sekvens för guide RNA design. Både ChIP-seq och DNaseI HS data erhölls från Ishikawa celler behandlas med 10 nM estradiol för 1 h. (C) representativa guide RNA sekvenser som är klara för Gibson montering, som genomgått en kort PCR för att lägga till homologi regioner. (D) relativ uttryck av MMP17 mäts via qPCR efter inriktning för specifika regioner med Enhancer-i och en 8-h10 nM estradiol behandling. Uttrycket är i förhållande till SAP och uttryck nivå av MMP17 i celler som inte behandlas med estradiol. Kontroll guide RNAs rikta främjare av IL1RN. Alla felstaplar representera SEM, dubbla asterisker visar p < 0,01 och enda asterisker visar p < 0,05 i ett parat t-test. Denna siffra har ändrats från Carleton, et al. 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Inriktning flera förstärkare nära olika gener samtidigt med poolade Enhancer-i. (A) Schematisk av bindningsställen och initiativtagare att riktas på poolade Enhancer-i. (B) effekter på uttrycket mätt med qPCR efter E2 behandling på Ishikawa celler transfekterade med Enhancer-i plasmiden pool (grön), arrangören-i plasmiden poolen (blå) eller kontroll gRNAs (vit)18. En betydande minskning på alla gener observeras Enhancer-i. Denna siffra ändrades från Carleton, et al. 18. (C) effekterna på G0S2 uttryck nivåer efter E2 behandling på Ishikawa celler transfekterade med olika mängder av guide RNAs inriktning G0S2. En betydande minskning kan ses även med små mängder guide RNA (1:50 utspädning), tyder på att upp till 50 platser kan riktad samtidigt. Alla felstaplar representera SEM, dubbla asterisker visar p < 0,01 och enda asterisker visar p < 0,05 i ett parat t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Namn Sekvens
U6_internal_F TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_R GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_F CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_R AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_F GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_R AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_F GTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_R AGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_F AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_R CGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_F CAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_R TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

Tabell 1. Primers används för guide RNA förlängning och sekvensering, qPCR och detektion av proteinet fusion.

Discussion

Det här protokollet beskriver en enkel och flexibel metod för dissekera enhancer funktion på den endogena genomisk locus utan att fysiskt förändra DNA-sekvensen. Medan liknande koncept till tidigare publicerade CRISPR störningar protokoll använder dCas9-KRAB27, Enhancer-jag skiljer sig från dessa protokoll på 3 olika sätt. Först, Enhancer-jag använder tredjeparts SIN3A samverkande domänen MAD120 att uppnå enhancer avaktivering. Enhancer avaktivering kan räddas med hjälp av HDAC-hämmare, tyder på att den primära mekanismen av inaktivering är HDAC beroende. Till skillnad från CRISPR störningar med dCas9-KRAB leder Enhancer-jag inte till avsättning av H3K9me3. Detta är sannolikt på grund av att Enhancer-jag är beroende av övergående införandet av guide RNAs, med celler skördas på 3 dagar post transfection. I CRISPR störningar observeras en ökning H3K9me3 7 dagar post transduktion12. Förstärkare-i protokollet föreskrivs slutligen en strategi för att rikta flera platser samtidigt och övervaka effektiviteten av inriktning. I mosaik-seq17, dCas9-KRAB används för att rikta flera smakförstärkare samtidigt, men denna teknik bygger på encelliga RNA-sekvensering att identifiera uttryck förändringar, och många gener (såsom östrogenkänsliga gener) förbli oupptäckta på grund av låga känslighet av encelliga RNA-följande punkter Enhancer-i ger en pålitlig metod för att studera enhancers individuellt och i kombination för någon gen.

Det mest kritiska steget av Enhancer-i är transfection, som bör optimeras för den cellen fodrar av intresse. Protokollet bygger på puromycin behandling för att berika för transfekterade celler, men det är möjligt att co transfecting guide RNAs med ett fluorescerande protein och sortering för fluorescerande celler med hjälp av flödescytometri kan visa sig vara en bättre anrikning metod för vissa cell typer. Vi rekommenderar att övervaka uttryck nivå av guide RNAs och SID4x-dCas9-KRAB av qPCR att felsöka och bekräfta transfection. Om guide RNA nivåerna är låga (cykel tröskel > 30), användare kan också överväga alternativa guide RNA produktionsstrategier som in vitro- transkription28. Det är också möjligt att trots hög gärna nivåer, guide RNA inriktning av proteinet SID4x-dCas9-KRAB är ineffektiv, då välja olika guide RNA sekvenser kan behövas. Genom att utföra ChIP-seq på proteinet fusion med kromatin från Enhancer-jag behandlade celler, kan effektiviteten i inriktning övervakas. Om det finns hög signal av SID4x-dCas9-KRAB på regionen av intresse, och inga uttryck förändringar i dess förmodade målgenen upptäcks, då bidrar regionen sannolikt inte till uttrycket av den genen på villkor som studerade.

En potentiell begränsning av Enhancer-i är att off-target effekter kan ackumuleras om alltför många webbplatser riktar samtidigt. CRISPR störningar strategier för knockdown har dock färre off effekter än RNAi29, särskilt när en polyklonala cellinje som uttrycker dCas9-KRAB används. Samtidigt som vi har sett off-target genomisk bindningen av SID4X-dCas9-KRAB när inriktning 10 platser samtidigt, har vi inte identifierat gen uttryck förändringar till följd av dessa bindande händelser. Som vissa förstärkare kan kontakta flera initiativtagare eller andra medel, är det möjligt att många gener kan ändra uttryck vid inriktning av en enda förstärkare, men det är oklart om denna form av genreglering är vanligt. För att bekräfta att de uttryck förändringarna observerats beror på rikta en specifik förstärkare, och inte off-target effekter, kan användare utföra Enhancer-jag med två olika uppsättningar av icke-överlappande guide RNAs inriktning samma region. Genetiska strykningen av regionen använder nuclease-behöriga Cas9 kan dessutom ytterligare bekräfta dess effekter på genuttryck.

Som förstärkare-i-funktioner genom Histon deacetylering, det är möjligt att dess avaktivering förmågor är begränsade till förstärkare som har märkbara nivåer av Histon acetylering. Det finns en mängd alternativa repressiva fusioner som kan vara mer effektiva på att rikta specifika smakförstärkare. DNA methyltransferase fusioner till dCas9 kan användas för att minska genuttryck när riktade till distala enhancers30, men detta förtryck är ofta inte övergående. En annan repressiva fusion använder domänen vän av GATA1 (FOG1), som leder till Histon H3 lysin 27 trimethylation och förtrycker genuttryck på nivåer som är liknande till dCas9-KRAB över en mängd olika cell linjer och initiativtagare31. Intressant, minskas att lägga till fler kopior av FOG1 till dCas9 repressiva potentialen vid initiativtagare, vilket tyder på att en enda kopia av domänen SID kan tillhandahålla mer enhancer avaktivering än de 4 kopior som för närvarande används i Enhancer-i. Det är möjligt att vissa loci får nytta av dubbla inriktning genom olika kombinationer av de ovanstående dCas9 fusioner. Stabila långsiktiga förtryck kan exempelvis uppnås genom samtidig transduktion i dCas9-DNMT3a och dCas9-KRAB32. De flesta av dessa repressiva fusioner har endast varit riktad till en enda locus i taget, och det är fortfarande oklart vilket är mest effektiva på att manipulera flera smakförstärkare samtidigt.

Förstärkare-i, samtidigt som en lämplig metod för att studera kombinationer av förstärkare för en handfull gener, är fortfarande något begränsad i genomströmning om användaren önskar att studera förmodad förstärkare för hundratals gener. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer att införliva imaging-baserad teknik för att kvantifiera flera gener i flera prover samtidigt. Ännu viktigare, är dessa tekniker kompatibla med direkt påvisande av RNA-molekyler från lysate, vilket eliminerar behovet av tidskrävande RNA isolering. Dessa anpassningar kommer att underlätta förhör av större uppsättningar av förstärkare.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH/NHGRI R00 HG006922 och NIH/NHGRI R01 HG008974 till J.G. och Huntsman Cancer Institute. J.B.C. stöddes av NIH träningsprogram i genetik T32GM007464.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZR 96-well Quick-RNA Kit Zymo Research R1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Applied Biosystems 4389986
AflII restriction enzyme NEB R0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L
FuGENE HD Promega E2312
DNA Clean & Concentrator Kit Zymo Research D4013
Buffer RLT Plus Qiagen 1053393
b-estradiol Sigma-Aldrich E2758
Human: Ishikawa cells ECACC 99040201
H3K27ac rabbit polyclonal Active Motif  39133
H3K9me3 rabbit polyclonal Abcam  ab8898
FLAG mouse monoclonal Sigma-Aldrich  F1804
ER alpha rabbit polyclonal Santa Cruz sc-544
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid Addgene  51133 Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector plasmid Addgene  41824 Mali et al., 2013
AflII U6 puromycin plasmid Addgene  106404 Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB plasmid Addgene  106399 Carleton et al., 2017
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads Kapa Biosytems KK8420
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets ThermoFisher Scientific A32959
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich 252549-25ML
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131035
LB Broth ThermoFisher Scientific 10855001
Quick-DNA Miniprep Kit Zymo Research D3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder NEB N0050S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  3. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  4. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).
  5. Lam, D. D., et al. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935 (2015).
  6. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  7. Savic, D., et al. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  10. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).
  11. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  12. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  13. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869 (2010).
  14. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  15. Fulco, C. P., et al. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).
  16. Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  17. Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).
  18. Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).
  19. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  20. Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).
  21. Alland, L., et al. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).
  22. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  23. Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).
  24. Stampfel, G., et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).
  25. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  26. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  27. Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).
  28. Romanienko, P. J., et al. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362 (2016).
  29. Smith, I., et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213 (2017).
  30. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  31. O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  32. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).

Tags

Genetik fråga 136 genreglering enhancer funktionsgenomik epigenetik CRISPR/Cas9 transkriptionsfaktorer
Dissektion av Enhancer-funktion som använder Multiplex CRISPR-baserade Enhancer störningar i cellinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carleton, J. B., Berrett, K. C.,… More

Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines. J. Vis. Exp. (136), e57883, doi:10.3791/57883 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter