Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Disseksjon Enhancer funksjon med Multiplex CRISPR-baserte Enhancer forstyrrelser i linjer

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57883
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

Summary

Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å utforme og utføre multiplex målretting av enhancers med deaktivering fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, også kjent som forsterker interferens (Enhancer-i). Dette aktiverer identifisering av enhancers som regulerer genuttrykk og forenkler Disseksjon av relasjoner mellom enhancers regulere et felles mål-gen.

Abstract

Flere enhancers regulere ofte et bestemt gen, men for de fleste gener, det er fortsatt uklart hvilken enhancers er nødvendig for genekspresjon, og hvordan disse enhancers kombineres for å produsere transcriptional svar. Som millioner av enhancers identifisert, er høy gjennomstrømming verktøy nødvendig å bestemme enhancer funksjon på en genomet-bred skala. Gjeldende metoder for å studere enhancer funksjonen inkluderer gjør genetisk slettinger bruker nuclease-dyktige Cas9, men det er vanskelig å studere kombinasjon virkningene av flere enhancers bruker denne teknikken, som flere påfølgende klonal cellelinjer må generert. Her presenterer vi Enhancer-i, en CRISPR forstyrrelser-basert metode som tillater funksjonelle avhør av flere enhancers samtidig på deres endogene loci. Enhancer-jeg gjør bruk av to undertrykkende domener del nuclease dårlig Cas9, SID og KRAB, for å oppnå enhancer deaktivering via histone deacetylation på målrettet loci. Denne protokollen utnytter forbigående transfection av guide RNAs aktivere forbigående inaktivering av målrettede regioner og er spesielt effektiv på blokkerer induserbart transcriptional svar på stimuli i vev kultur innstillinger. Enhancer-jeg er svært spesifikke både i genomisk målrettingen og dens virkning på globale genuttrykk. Resultatene fra denne protokollen hjelp til å forstå om en enhancer bidrar til genuttrykk, omfanget av bidrag og hvordan bidraget påvirkes av andre nærliggende enhancers.

Introduction

Store sekvensering prosjekter som kode1, veikart Epigenomics2og FANTOM3 har identifisert millioner av antatte enhancers i det menneskelige genomet på hundrevis av celletyper. Det anslås at hver promoter knytter gjennomsnitt 4,9 enhancers og hver enhancer kontakter gjennomsnittlig 2,4 gener3, antyder at genuttrykk er ofte et resultat av integrasjonen av flere distribuert juridiske interaksjoner. En betydelig gjenværende utfordring er å definere ikke bare hvordan individuelle enhancers bidra til genuttrykk, men hvordan de kombineres for å påvirke uttrykk. Genetiske metoder brukes ofte til å identifisere relasjoner mellom enhancers i modellen organismer fra Drosophila4 mus5. Disse eksperimentene er imidlertid tidkrevende og lav gjennomstrømming for studier av flere enhancers på flere gener.

En tilnærming for å studere enhancer funksjon i stor skala innebærer massivt parallelle reporter analyser. Disse analyser tillate samtidig screening av DNA-sekvenser for sin evne til å kjøre uttrykk for en reporter genet6. Mens disse analyser har vist at DNA sekvensen alene kan være nok til å formidle genet regulering informasjon7, kommer de med begrensningene av utføres enhetskontroll opprinnelige chromatin og en heterologous promoter. I tillegg er størrelsen på DNA sekvensen blir analysert i massivt parallelle reporter analyser vanligvis mindre enn 200 basepairs, som kan utelukke relevante omkringliggende sekvens. Viktigere, som reporter analyser bare måle aktiviteten til en sekvens samtidig, tar de ikke hensyn til komplekse forhold som finnes mellom enhancers. Dermed mens massivt parallelle reporter analyser kan være informativ om iboende aktiviteten til en DNA sekvens, de ikke nødvendigvis informere oss om funksjonen til den DNA sekvensen i sammenheng med genomet.

Nylig lettet utviklede CRISPR/Cas9 tools8 studiet av genet regulering som de tillater for sletting av enhancers på endogene locus. Imidlertid slette flere enhancers samtidig kan føre til genomisk ustabilitet, og det er tidkrevende å generere påfølgende enhancer slettinger i en enkelt celle linje. I tillegg opprettes nye genomisk rekkefølgen på stedet for sletting etter reparasjon, og denne sekvensen kan få regelverket. En alternativ versjon av Cas9 er utviklet spesielt for modulerende genuttrykk, stole på fusjoner aktivere9,10 eller repressing11,12 domener til nuclease dårlig form av Cas9 (dCas9). Disse fusion proteiner er ideelle for å studere flere loci samtidig som de gjør ikke fysisk endre DNA sekvensen, og i stedet modulerer epigenetics for å avhøre en regulerende region. Den mest brukte undertrykkende fusion er KRAB, som rekrutterer KAP1 co repressor komplekset, fremme avsetning av undertrykkelse-assosiert histone H3 lysin 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, også kjent som CRISPR forstyrrelser14, har vært brukt til målet og skjermen personlige enhancers for deres bidrag til gene expression15,16. men har det ikke blitt optimalisert for å målrette flere områder samtidig. En versjon av multiplex CRISPR forstyrrelser for enhancers, mosaikk-seq17, bruker enkeltcelle RNA-seq som en presentasjon, men denne teknologien er dyrt og bare egnet for studiet av svært uttrykt gener på grunn av lav følsomheten av enkelt celle RNA-seq.

Vi søkt å utvikle en CRISPR forstyrrelser-basert metode for dissekere kombinasjon enhancer funksjon innenfor rammen av transcriptional svar til østrogen. Omtrent halvparten av østrogen responsive gener inneholder 2 eller flere enhancers bundet av østrogen reseptor alfa (ER) i nærheten18, antyder at flere enhancers kan delta i estrogen svaret, og forstå regulatoriske logikken ville kreve rettet mot flere enhancers samtidig. Som første studier med CRISPR forstyrrelser på arrangører foreslo at ikke alle arrangører er like lydhør overfor KRAB-mediert undertrykkelse19, tenkte vi at tillegg av en distinkt undertrykkende domenet dCas9 kan lette deaktivering av mangfoldig enhancers. Vi valgte Sin3a samspill domenet av Mad1 (SID)20 som fører til rekruttering av histone deacetylases21, som fjerner acetyl grupper på histones som er forbundet med transcriptional aktivitet. Viktigere, SID domenet var effektivt redusere genuttrykk da smeltet dCas922 og TALEs23, og Sin3a har vist seg å være en potent undertrykkende co-faktor i en rekke enhancer sekvens sammenhenger24. Vi brukte SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) for å målrette 10 forskjellige enhancers bundet av ER, og identifisere ER bindende områder (ERBS) som er nødvendige for østrogen transcriptional svaret 4 gener18. Vi har også målrettet kombinasjoner av enhancers å identifisere nettstedene som samarbeider i produksjon av østrogen transcriptional svaret. Vi fant at opp til 50 steder kan potensielt være målrettet samtidig med synlig gene expression endringer. Bruke ChIP-seq og RNA-seq, vist vi at Enhancer-jeg er en svært spesiell teknikk for å studere flere enhancers samtidig.

I denne protokollen beskriver vi trinnene involvert i å utføre Enhancer-i, en fleksibel teknikk som muliggjør funksjonelle studiet av flere enhancers samtidig i en vev kultur. Enhancer-jeg er sterkt korrelert med genetisk sletting men gir midlertidig deaktivering som er avhengig av histone deacetylases (HDACs). Ved å levere guide RNAs via forbigående transfection i motsetning til stabile integrasjon via viral vektorer, unngår denne protokollen avsettelse og potensielle spredning av H3K9me3. Denne protokollen detaljer guide RNA design og kloning via Gibson montering, hva av guide RNAs med lipofection og analyse av resulterende genuttrykk endringer av qPCR. Vi har også metoder for å vurdere spesifisiteten av Enhancer-i mål for Genova og transcriptome. Mens denne teknikken ble utviklet for å studere genet regulering er bundet enhancers i menneskets kreftcelle linjer, det gjelder Disseksjon av alle pattedyr enhancer.

Protocol

1. generasjon cellen linjer stabilt uttrykke SID4X-dCas9-KRAB

Merk: Hva betingelsene og narkotika konsentrasjoner presenteres her er optimalisert for Ishikawa celler, en livmorkreft cellen linje, vokst i RPMI 1640 medier med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin (fullstendig RPMI). Andre linjer kan kreve forskjellige transfection forhold og narkotika konsentrasjoner. Brukere kan også utføre forbigående transfection eksperimenter i vill-type celler, i stedet for å generere en stabil cellen linje, med en plasmider uttrykke SID4X-dCas9-KRAB sammen med guide RNA uttrykke plasmider; resultater fra forbigående transfections kan imidlertid være vanskelig å gjengi som SID4X-dCas9-KRAB nivåer kan variere etter hva.

  1. Plate Ishikawa celler i minst 2 brønner av en 6-vel plate på 30-50% samløpet (ca 300 000 Ishikawa celler) i 3 mL fullstendig RPMI.
    1. Sug opp media fra cellene. Vask cellene gang med 1 x PBS (pH 7.4). Sug opp PBS og legge trypsin (4 mL for en 10 cm rett eller 5 mL for en T-75 kolbe).
    2. Inkuber celler for ~ 5 min på 37 ° C, sjekker hver 2 min for frittstående celler og forsiktig risting fartøyet.
    3. Når celler har enebolig, Pipetter trypsinized celler opp og ned et par ganger, og Pipetter forsiktig ned på siden av skipet å løslate tilknyttede celler.
    4. Overføre cellene slik 15 mL koniske og Nedspinning cellene i 5 min på 250 x g.
    5. Sug opp trypsin og resuspend cellene i 5-10 mL av media. Bruk en P1000 pipette for å distansere celle klumper om nødvendig.
    6. Telle celler og finne volumet måtte plate ~ 300.000 celler per brønn i et totalt volum på 3 mL. Legge til cellene i 2 separate brønner av en 6-vel plate. Fyll hver godt til 3 mL med komplett RPMI.
    7. Forsiktig risting platen hver 5 min i de første 15 min etter plating slik at cellene er jevnt fordelt på tallerkenen. Bruke et mikroskop for å sikre at cellene har spredt fra midten av brønnen.
  2. Innen 24 timer av plating, kan du utføre følgende transfections ved hjelp av en passende transfection reagens for cellen linje av interesse. Bruk fremgangsmåten for Ishikawa celler, som beskrevet nedenfor.
    Merk: Denne protokollen forutsetter bruk av kationisk liposome-baserte transfection reagenser. Electroporation gir en alternativ metode for celletyper som er svært følsomme for disse reagensene eller som viser lav transfection effektivitet med lipofection. Hva betingelser må være optimalisert for cellen linje rundt før Enhancer-i eksperimenter.
    1. I en 1,7 mL Eppendorf rør, fortynne 2,5 μg av SID4X-dCas9-KRAB plasmider og 800 ng av plasmider uttrykke et fluorescerende protein i serum-free media slik at det siste bindet i røret er 155 µL og endelige konsentrasjonen av plasmider er 0.020 µg/µL.
    2. I en annen tube, fortynne 3.3 µg av en plasmider som ikke inneholder en neomycin motstand kassett, som pCMV-GFP, i serum-free media slik at det siste bindet i røret 155 µL og endelige konsentrasjonen av plasmider er 0.020 µg/µL.
    3. Vortex hver rør kort og spinne ned ved hjelp av en microfuge.
    4. Legg 9.9 µL av transfection reagensen (Table of Materials) til hver rør. Bland ved vortexing kort med lav hastighet. Nedspinning rør med en microfuge.
    5. Inkuber rør ved romtemperatur for minst 5 min, men ikke mer enn 20 min.
    6. I fravær av smittefarlige stoffer skap, legge 150 µL av forberedt DNA: reagens miksen dropwise til en brønn på 6-vel tallerkenen. Gjenta for andre tube forberedt DNA: reagens blanding. Bland platene av virvlende forsiktig og returnere platen til inkubator.
  3. På dag 2 innlegg transfection, endre media og supplere med G418 til en siste konsentrasjon av 600 ng/μL. Denne konsentrasjonen må være optimalisert for den cellen.
  4. Endre komplett RPMI media og supplere med G418 annenhver dag 2-4 uker før kontrollen transfekterte cellene er døde og brønnene som inneholder SID4X-dCas9-KRAB bli confluent. Det eksakte beløpet av tid for cellene å gjenopprette avhenger dobling tid cellene.
  5. Når cellene blir confluent, passasje til et T-25 eller T-75 fartøy i komplett RPMI med en lavere dose G418 (300 ng/μL for Ishikawa celler). Under denne passasjen, gjøre 2 dele ~ 100 000 celler hver (omtrent 1/10th av en 6-vel plate) inn i 2 separate 1,7 mL Eppendorf rør RNA og DNA isolering, henholdsvis. Spin disse rør ned (5 min, 250 x g) fjerne trypsin ved pipettering og fryse rør på 20 ° C for fremtidig bruk.
  6. Isolere genomisk DNA ved å bruke kommersielt tilgjengelige kits og utføre PCR ved hjelp av "pAC95_PCR" eller "SID4X_PCR" primere (tabell 1) for å bekrefte tilstedeværelse av fusion protein i i cellen linje. Bruk genomisk DNA utvunnet fra foreldrenes linjen som en negativ kontroll og SID4x-dCas9-KRAB plasmider DNA som en positiv. Bruke en høy kvalitet utvalg master blanding med 50-100 ng genomisk DNA og sykling følgende: 98 ° C for 30 s, 25 sykluser (98 ° C for 10 s, 58 ° C for 30 s, 72 ° C i 2 min), 72 ° C i 5 min , holde på 4 ° C.
  7. For å kontrollere uttrykket av fusion protein på RNA nivå, kan du utføre qPCR med RNA utdraget fra cellen linje ved hjelp av kommersielt tilgjengelig kits. Bruk "dCas9_qPCR" primerne (tabell 1), og ett-trinns qPCR protokollen i trinn 6.3 i denne protokollen.
  8. For å bekrefte protein nivå uttrykk for fusion, utføre en Western blot på lysates fra cellen linje. Bruke anti-flagg eller anti-HA antistoffer til å oppdage fusion protein.

2. guide RNA Design

Merk: Denne protokollen er utformet for bruk med U6 guide RNA kloning vektor opprettet av kirken lab og på Addgene (Addgene 41824). For å lage en versjon av denne vektoren som inneholder puromycin motstand som tillatt for samme kloning strategi som 41824, flyttet vi flere kloning området fra denne vektoren i pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin vektor (Addgene 51133). Addgene 41824 eller vår versjon med puromycin (Addgene 106404) er kompatible med kloning strategi skissert nedenfor.

  1. Få 600-900 basepairs av DNA sekvensen for regulatoriske områder av interesse. Bruke transkripsjon faktor bindende områder og/eller chromatin tilgjengelighet for veiledning om hvor du skal definere en region av interesse (figur 2A).
    Merk: Mens eksemplet i figur 2A har oppstrøms og nedstrøms enhancers, det er også mulig å målrette regulatoriske elementer innenfor introns.
  2. Plass alle sekvenser som er innhentet i én tekstfil i FASTA format.
  3. Angi minst én negativ kontroll-regionen som ikke forventes å endres eksperimentelle forhold, som en pådriver for et gen som ikke er uttrykt i cellen linje av interesse. Få DNA sekvensen for denne regionen og legge den til tekstfilen i FASTA format.
    Merk: Vi bruker guide RNAs målretting IL1RN promoter25 som en negativ kontroll for alle regioner målet vi. Brukere kan også velge intergenisk rekkefølge i regionen rundt som ikke inneholder transkripsjon faktor bindende områder som en negativ kontroll. Men hvis flere loci blir målrettet samtidig, forenkler en enkelt negativ kontroll region eksperimentell design og tolkning av resultatene. Hvis den målrettede enhancer intronic, kan det være nyttig mot et intronic område på samme locus som ikke inneholder et antatte regulatorisk element som en mer negativ kontroll, som dCas9 fusion kan forstyrre transkripsjon.
  4. Identifisere positive kontroll områder, som arrangører som mulige mål for regulatoriske regionene rundt eller arrangører av gener som er svært transkribert i cellen linje av interesse. Få DNA sekvensen for disse regionene og legge den til tekstfilen i FASTA format.
  5. Bruke et program som e-skarp26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) på DNA-sekvenser generert for å finne guide RNAs med lav av mål (ideelt 0-3). Guide RNAs består av 20 nukleotider oppstrøms av protospacer tilstøtende motivet (PAM), som tar form "NGG" for dCas9 fra S. pyogenes.
    1. På webområdet for e-skarp, Velg organismen rundt ved hjelp av rullegardinmenyen. Samlingen genomet vises til høyre for Artsnavnet.
    2. Velg radioknappen Input er FASTA sekvens . Kopier FASTA sekvensene ovenfor og lim dem inn i dialogboksen. Kontroller at FASTA topptekst er inkludert for hver.
      Merk: Opp til 50 sekvenser kan det spørres samtidig.
    3. Velg Middels alternativknappen og enkelt design i det miste-ned menyen.
    4. Klikk knappen Start sgRNA søk. En ny nettleser fane åpnes, og resultatene vises. Last ned den kandidat sekvenser ved å klikke Last ned en Excel formatert tabellrapport for alle spørringen sekvenser sammen.
    5. Åpne tabellrapport bruke Excel eller et tekstredigeringsprogram.
  6. Bruk UCSC genomet leseren BLAT kandidat full lengde gRNA sekvenser (23 basepairs) til genomet.
    1. I en leser, kan du gå til UCSC genomet nettleser nettsiden (http://genome.ucsc.edu). Under delen våre verktøy, finne ordet BLAT og klikk på den. Søkeverktøyet BLAT åpnes.
    2. Bruk rullegardinmenyene ligger under BLAT søk genomet teksten for å velge samlingen organismen og genom av interesse.
    3. Kopier GUIDen RNA sekvenser fra tabellrapport generert av e-skarp og lime dem inn i dialogboksen. Kontroller at hver har en unik FASTA topptekst, klikke på Send nederst i dialogboksen.
      Merk: Opp til 25 sekvenser kan undersøkes samtidig. På siden BLAT søkeresultater vises justeringer av hver guide RNA sekvensen med hver linje representerer en justering. Ideelt sett bør det være en justering for hver guide RNA, indikerer unikt som guide RNA.
    4. Unngå hjelpemidler som justerer til flere steder i genomet hvis mulig.
    5. For å undersøke guide RNA lokalisering og distribusjon i regionen rundt, klikker du på koblingen leseren under ACTIONS -inndelingen for en av de forespurte guiden RNAs. Genomet leseren vises og midtstilles på den merkede hjelpelinjen RNA. Bruk knappene zoome ut på toppen av siden visualisere fordelingen av andre guide RNAs identifisert av e-skarp i området rundt.
  7. Velg 4 helst ikke-overlappende guide RNA sekvenser som er distribuert i hele regionen rundt (figur 2B). Hvis regionen rundt overskrider 600 bp, vurdere å legge ytterligere 1-2-guider. Unngå guide RNAs med homopolymeric strekninger og ekstreme GC innhold, disse funksjonene kan hindre guide RNA Klon forarbeide og redusere guide RNA målretting effektivitet.
  8. Når førerne er valgt, opprette en fil som inneholder hele guiden RNA sekvens (23 nukleotider) for hver ønsket guide og deretter fjerne 5' nukleotid samt PAM (NGG) fra 3 slutten. Dette trinnet forenkler oligo bestilling.
  9. Legg til følgende sekvens på 5' slutten av oligonucleotide sekvensen: GTGGAAAGGACGAAACACCG.
  10. Legg til følgende sekvens på 3 slutten av oligonucleotide sekvensen: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
    Merk: Den siste sekvensen skal 59 nukleotider lenge og se som dette: GTGGAAAGGACGAAACACCG-mål (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
  11. Sikre at alle regulerende elementer bli målrettet med Enhancer-jeg har minst 4 unike oligonucleotides designet for den. Bestille disse sekvensene med "U6_internal" primerne oppført i tabell 1.

3. guide RNA kloning

Merk: Guide RNA kloning via Gibson samlingen har vist seg for å være svært effektiv i våre hender, gir hundrevis av koloniene per plate, med få, om noen kolonier i kontrollen vektor bare. Slike effektivitet er avgjørende for å opprettholde kompleksiteten i grupperte kloning. En annen fordel med Gibson montering kloning er at brukere ikke har å bekymre seg om tilstedeværelsen av en begrensning enzym kuttet nettstedet i guiden RNA de prøver å sette inn U6 kloning vektoren. Likevel, denne protokollen kan tilpasses for tradisjonelle begrensning enzym basert kloning hvis ønskelig.

  1. Rekonstituer guide RNA oligos i en endelig konsentrasjon av 100 μM i ultrapure vann (RNase-fri, DNase-fri). Det bør være minst 4 separate veiledningen RNA-oligos for områder av interesse.
  2. For regulatoriske områder av interesse, kan du opprette et utvalg av alle oligos tilsvarer regionen rundt. I en Eppendorf rør, kombinere 5 μL av hver individuelle rekonstituert guide RNA oligo for hver region. Bland bassenget godt vortexing, og fjerne 1 μL og fortynne denne aliquot 1:200 i ultrapure vann.
    Merk: Hvis ønskelig, disse bassengene målretting personlige regulatoriske ytterligere kombineres for å generere en kompleks pool målretting flere områder. Opptil 50 regulatoriske regioner kan være målrettet samtidig i en enkelt pool (Figur 3 c).
  3. Utføre en kort PCR med U6 primerne å knytte homologi regioner til oligos før Gibson montering. 40 baser legges til hver oligo, gir et ~ 100 bp produkt som inneholder tilstrekkelig homologi til U6 vektor i begge ender.
    1. Hver guide RNA basseng, satt opp en 20 μL PCR med en høy kvalitet utvalg master mix og følgende komponenter: 1 μL utvannet oligo bassenget fra trinn 3.2, 1 μL U6 frem primer (10 μM), 1 μL U6 reversere primer (10 μM) , og vann opp til 20 μL.
    2. Inkuber i en termisk cycler med følgende vilkår: 98 ° C for 30 s, 10 sykluser (98 ° C for 10 s, 55 ° C for 30 s, 72 ° C i 2 min), 72 ° C i 5 minutter, og hold på 4 ° C.
    3. Kjør 5 μL reaksjonen på en 1-2% agarose gel med en lav molekylvekt stige. Det endelige produktet skal ~ 100 basepairs (figur 2C).
    4. Rydde opp utvidelsen reaksjon med en kolonne-baserte DNA rensing kit, og elute i 20 μL elueringsbufferen i settet.
      Merk: Produktet er kort, unngå å bruke perle-baserte oppryddinger, som er utformet for å utelate små fragmenter mindre enn 100 bp.
    5. Kvantifisere renset DNA ved hjelp av en fluorometer eller spektrofotometeret (forventet avkastning er 10-20 ng/μL). Guide RNA setter inn kan lagres på 20 ° C, eller kan brukes umiddelbart i Gibson montering med en linearisert U6 vektor.
  4. For å forberede mottakeren U6 kloning vektor for Gibson samling, opprette en begrensning enzym digest. Hvis mange Gibson montering reaksjoner er utført, definere flere fordøyer å sikre tilstrekkelig avkastning på kutt vektor.
    1. Bruk 20 enheter av AflII enzym og 1 μg av plasmider i en 20 μL reaksjon med passende begrensning enzym bufferen. Inkuber ved 37 ° C i 1-2 h.
    2. Rydde opp sammendraget med perler eller et kolonne-baserte kit for DNA rensing og elute i 20 μL elueringsbufferen. Kvantifisere renset DNA ved hjelp av en fluorometer eller spektrofotometeret. Eksempler kan være frosset om 20 ° C for senere bruk.
  5. Utføre Gibson montering på forberedt vektoren og sett.
    1. Definere Gibson montering reaksjoner på is. Bruk 50 ng av vektoren og 7 ng av sette i en 20 μL reaksjon. Fortynne setter inn 1:10 i ultrapure vann å lette pipettering. Definere en vektor bare Gibson montering reaksjon, bruker 50 ng vektoren og erstatte innsatsen med vann.
    2. Inkuber Gibson montering reaksjonene i 15 min ved 50 ° C, etterfulgt av tak på 4 ° C.
    3. Overføre montert produktene til is. Fortynne de sammensatte produktene 1:4 i ultrapure vann på is. For eksempel legge til 5 μL Gibson montering produkt 15 μL ultrapure vann.
  6. Transformere utvannet Gibson montering produktene.
    1. Tine høy effektivitet kompetent celler på is og gjøre 25 μL dele for hver transformasjon. Hvis en kompleks pool målretting flere områder, tine nok celler i forskjellige rør utføre flere uavhengige transformasjoner av samme kompleks gRNA.
    2. For hvert utvannet produkt, tilsett 1 μL av dette fortynning en 1,7 mL Eppendorf rør som inneholder 25 μL kompetent celler. Bland ved å sveipe kort røret. Inkuber rørene på is 30 min.
    3. Varme sjokk celler for 30 s på 42 ° C, deretter overføre umiddelbart for i 2 minutter.
    4. Legg 300 μL SOC media (2% tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4og 20 mM glukose) og la cellene gjenopprette 1t på 37 ° C med skjelvende (300 rpm). Samtidig varme agar platene med ampicillin/carbenicillin 37 ° c i en inkubator. Bruke en plate for hver transformasjon.
    5. Plate 50 μL av celler og plasser platene i en inkubator 37 ° C over natten. For bassengene målrette individuelle nettsteder, plasserer direkte i 3-5 mL av LB kjøttkraft (Tabell for materiale) som inneholder ampicillin/carbenicillin (1 mg/mL) og ruge over natten med skjelvende på 250 rpm ved 37 ° C i minipreps.
  7. Høste celler og isolere DNA.
    1. For stor guide RNA biblioteker målretting flere områder, kan du bruke plate skraper for å samle alle koloniene fra hver enkelt plate i en maxiprep (150 mL væske kultur). Dette kan bli lettere pouring ~ 5 mL av LB med det passende antibiotikumet i en 50 mL falcon tube og skraping koloniene inn i røret. For biblioteker målrette individuelle nettsteder, skrape plater til en miniprep (3-5 mL væske kultur).
    2. Inkuber disse kulturene med det passende antibiotikumet for 3-5 h på 37 ° C med skjelvende på 250 rpm.
    3. Utføre DNA utvinning bruker et kit som resulterer i endotoxin-fri forutbetalt.
    4. Kvantifisere DNA ved å bruke en fluorometer eller spektrofotometeret. Plasmider kan brukes umiddelbart i transfection eller lagret på 20 ° C for fremtidig bruk.
  8. For å bekrefte tilstedeværelse av guide RNA rekkefølge i U6 vektoren for små bassenger målretting enkelt nettsteder, bruke Sanger sekvensering på forberedt miniprep med "U6_PCR_R" primer oppført i tabell 1. På grunn av pooling av guide RNAs, 19 basepair gRNA målet sekvensen vil gi blandet baser, men U6 selskapet samt guide RNA stillaset rundt denne sekvensen bør være intakt.

4. hva av Enhancer

Merk: For vellykket blokade av et østrogen svar bruke Enhancer-jeg i Ishikawa celler, er det nødvendig å frata cellene av estrogen for 5-7 dager før transfection ved å opprettholde dem fenol red gratis RPMI med 10% kull-strippet FBS og 1% penicillin/streptomycin. Cellene skal kultivert i dette mediet under og etter hva hvis prøver å blokkere et østrogen svar. Vi anbefaler bruk av fenol red gratis trypsin for passering av celler i fullstendig fenol rødt gratis RPMI.

  1. Dagen før transfection, plate cellene (vill-type eller stabilt uttrykke SID4X-dCas9-KRAB) i en 24-vel plate på 30-50% confluency (~ 60 000 celler per brønn for Ishikawa celler). Plate nok celler slik at transfections kan utføres i duplikat, og inkluderer brønner for å være transfekterte med kontroll guide RNAs.  Kontroller at cellene er jevnt fordelt over brønnen ved forsiktig risting platen etter celle plating som i trinn 1.1.7.
    Merk: Denne protokollen forutsetter bruk av kationisk liposome-baserte transfection reagenser. Electroporation gir en alternativ metode for celletyper som er svært følsomme for disse reagensene. Hva betingelser må være optimalisert for cellen linje rundt før Enhancer-i eksperimenter.
  2. Dagen forberede transfections henhold til instruksjonene av transfection reagensen valgfrihet. For Ishikawa celler, bruk 550 ng av totale plasmider for hver brønn av en 24-vel plate. Fortynne plasmider til en siste konsentrasjon av 0.020 μg/μL i serum-free media (1.1 μg DNA i 52 μL totale volumet transfecting 2 brønner). Bruke 3 μL transfection reagens til hver 1 μg av DNA, vortex og Inkuber som beskrevet i trinn 1.2. Legg til 25 μL endelige blandingen i hver brønn.
    Note å mål kombinasjoner av områder, bruk plasmider samme vekt for hvert enkelt område, og deretter fylle leftover vekten med en kontroll plasmider (tom guide RNA kloning vektor eller guide RNAs målretting en negativ kontroll regionen som IL1RN arrangøren). Midlertidig transfections, bruke forholdet 3:2 Cas9 fusion: guide RNA plasmider. Plasmider med fluorescerende journalister kan legges til å overvåke hva effektivitet.
  3. 36 h innlegget transfection, endre media med fenol red gratis RPMI med 10% kull-strippet FBS og 1% penicillin/streptomycin (for Ishikawa celler) og leverer puromycin (siste konsentrasjon: 1 μg/mL) og neomycin (siste konsentrasjon: 300 ng/mL). Hvis celler er følsomme for transfection reagens, media kan endres tidligere, men antibiotika bør legges ikke tidligere enn 24 h innlegget transfection.
    Merk: Vent minst 24 timer etter antibiotika før høste celler. Uttrykket endringer på grunn av Enhancer-jeg kan oppdages som tidlig som 48t legge transfection og opp til 5 dager legge transfection. Hvis arbeider med Ishikawa celler som har blitt fratatt østrogen, Utfør en 8-h 10 nM 17β-østradiol (E2) induksjon dagen etter antibiotikabehandling, og deretter høste celler umiddelbart.

5. celle Harvest og RNA utvinning

  1. Forberede lyseringsbuffer med 1% β-mercaptoethanol (BME). Kontroller at det er nok lyse-BME blanding (300 μL for hver også blir høstet).
  2. Sug opp media bruker et vakuum aspirator.
  3. Vask cellene gang med en lik mengde 1 x PBS (500 μL) og leveringstanken fjerne PBS så mye som mulig.
  4. Legge til 300 μL lysis-BME løsning i hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipette. Pipetter lysis løsningen opp og ned 8 - 10 ganger, og overføre til en dyptgående brønn tallerken eller 1,7 mL Eppendorf rør på is. RNA kan trekkes umiddelbart, eller lysates kan være frosset om-80 ° C for fremtidige behandling.
  5. Til ekstrakt RNA fra lysates, kan du bruke en kommersielt tilgjengelig kit som inneholder en DNase behandling. Elute i det minste anbefalte volumet ultrapure vann (RNase-fri, DNase-gratis) eller elueringsrør buffer og kvantifisere RNA. For lite antall prøver, kan du bruke en fluorometer eller spektrofotometeret. For store mengder av prøver, bruke en fluorescerende sonde som oppdager RNA og mål på en plate-leser. Eksempler kan være frosset om-80 ° C før eller etter kvantifisering.

6. kvantifisering Gene Expression endringer ettrinns qPCR og RNA-seq

  1. Få qPCR primere for genene rundt og minst én housekeeping genet som uttrykkes i nærheten av nivået av målrettet gener og endrer ikke over eksperimentelle forhold. Ideelt sett vil disse veiledningene spenner et ekson-ekson kryss for å unngå forsterkning av genomisk DNA.
    1. Teste disse veiledningene på RNA fra cellen linjen av interesse. Bruk smelte curve analyse å kontrollere produksjonen av ett enkelt produkt. Hvis ett enkelt produkt ikke er produsert, teste flere primer par.
  2. For hver Enhancer-jeg og kontroll guide RNA behandlet prøve, identifisere hvor mange gener må være assayed i dette eksemplet. Dette settet av gener bør inkludere housekeeping gener, for eksempel CTCF eller GAPDH.
  3. Definere qPCR reaksjoner.
    1. Fortynne alle prøver til samme konsentrasjonen i vann, slik at 50 ng av totalt er lett pipetted, og det er nok utvannet RNA for hver reaksjon. For eksempel fortynne RNA til ~16.6 ng/μL og bruke 3 μL av hver reaksjon. Holde RNA på is stund innfatning opp master mikser.
    2. Forbered separat master mikser for hver genet skal måles ved hjelp av kommersielt tilgjengelig ettrinns qPCR kits. Bruk et 20 μL reaksjon volum med 1 μL av hver primer (10 μM lager løsning). Definere disse reaksjonene på is.
    3. I en reaksjon plate som passer for den termiske cycler, legge RNA etterfulgt prøver av master mikser. Forsegle med en plate sealer og bland forsiktig ved vortexing eller pipettering. Kort sentrifuge platen (140 x g for 60 s) å sikre at væsken er på bunnen av brønnene.
    4. Inkuber platen i en termisk cycler som følger (eller som kit instruerer): 48 ° C i 30 min, 95 ° C i 10 min, 40 sykluser (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min).
  4. Få Ct verdier for hver genet målt innenfor hvert utvalg. Bruk metoden for sammenlignende Ct for å identifisere endringer i genuttrykk.
    1. Trekk Ct av housekeeping genet fra Ct av hver genet av interesse for hver prøve å generere normaliserte Ct verdier.
    2. Behandlet prøver, ta en gjennomsnittlig normalisert Ct verdiene for hver genet for kontrollen. Logg base 2 skala kaste undertrykkelse kan deretter beregnes ved å trekke normalisert Enhancer-jeg behandlet prøven Ct for hver genet fra samme verdi for kontroll behandlet prøven for det tilsvarende genet.
  5. For å finne globale endringer i genuttrykk etter Enhancer-i behandling, forberede prøvene RNA sekvenser ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit kompatibel med brukerens sekvensering teknologi. Bruk ~ 500 ng av for å starte materiale og forberede biblioteker minst 2 biologiske gjentak.

7. verifisering av bestemte genomisk målretting av SID4X-dCas9-KRAB bruker ChIP-seq

Merk: SID4X-dCas9-KRAB fusion protein inneholder både flagg epitope koder og en HA epitope kode, men best resultat for ChIP-seq ble oppnådd med anti-flagg antistoffer. Eventuelt kan brukeren utføre flere eksperimenter som ChIP-seq transkripsjonsfaktorer potensielt berørte av Enhancer-i eller H3K27ac, et tegn på enhancer aktivitet som minskes med Enhancer-i. Men krever hvert ChIP-seq eksperiment 10 x 106 celler, så planen tilsvarende.

  1. Transfect celler med Enhancer-i bassenger.
    1. Plate 10 x 106 celler i 15 cm vev kultur parabol. Hver rett representerer 1 ChIP-seq eksperiment for 1 faktor av interesse.
    2. Dagen transfect cellene med 20 μg totale DNA per fat. For transfections i cellelinjer stabilt uttrykke SID4X-dCas9-KRAB, bør DNA være et plasmider basseng av guide RNAs rettet mot alle steder av interesse, og eventuelt en plasmider uttrykke fluorescerende protein. Midlertidig transfections, bruke forholdet 3:2 dCas9 fusion protein: guide RNA bassenget. ChIP-seq andre TFs eller histone modifikasjoner, utføre minst én ekstra kontroll guide RNA transfection på en annen tallerken.
    3. Behandle retter med puromycin (1 μg/mL) og neomycin (300 ng/mL) på 24-48 h innlegget transfection. Vent minst 24 timer før høsting chromatin.
  2. Harvest chromatin fra retter.
    Merk: Å studere virkningene av Enhancer-jeg ER genomisk bindingen i Ishikawa celler, utfører en 1t 10 nM E2 behandling retter transfekterte med kontroll guide RNAs og Enhancer-i tidligere å høste. Å studere virkningene av Enhancer-jeg på H3K27ac, utfører en 8 h 10 nM E2 induksjon retter transfekterte med kontroll guide RNAs og Enhancer-i tidligere å høste.
    1. Bruke 500 μL 37% formaldehyd hver rett (siste konsentrasjon på 1%). Swirl platene kort. La platene sitte ved romtemperatur i 10 min.
    2. Legg 1 mL 2,5 M glysin (siste konsentrasjon av 125 mM). Swirl platene kort.
    3. Hell av media med formaldehyd og glycine. Legge til en lik volum (~ 20 mL) på kalde 1 x PBS.
    4. Helle på PBS. Sug opp med et vakuum aspirator fjerne så mye PBS som mulig. Plass rettene på isen.
    5. Legge til 3-5 mL kaldt 1 x PBS eller Farnham lyseringsbuffer (5mM rør pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) med 1 x protease hemmer (lagt like før bruk) til hver plate. Skrape fatet med en plate skraper og overføre løsningen slik 15 mL konisk på is.
    6. Pellets chromatin av snurrende ned rør i en centrifuge for 5 min på 4 ° C på 1000 x g. Forkast nedbryting lagre pellets ved-80 ° C for fremtidig bruk, og fortsette med ChIP-seq protokollen valg med et anti-flagg antistoff eller antistoffer målretting andre transkripsjonsfaktorer eller histone modifikasjoner av interesse (H3K27ac, H3K9me3).

Representative Results

Figur 1 viser en skjematisk av arbeidsflyten beskrevet i protokollen. For å finne ut bidrag av ER bundet enhancers nær østrogen regulert genet MMP17, som har 3 bindende områder i nærheten som definert av ChIP-seq (figur 2A), guide RNAs ble laget for hver region. Design guide RNAs, et 600-900 bp vindu av rundt hvert ER ble binding området rundt valgt og satt i et guide RNA utformingsprogram. Resulterer guide sekvenser RNA med 0-2 spådd av målet områder ble justert til det menneskelige genomet bruker BLAT. Fire ikke-overlappende guide RNAs som spredte regionen definert av ChIP-seq og DNaseI overfølsomhet ble valgt for målretting (figur 2B). Ekstra sekvens (tabell 1) ble lagt til hver ende å lette nedstrøms kloning og den resulterende 59 nukleotid fragmenter ble bestilt. Ved ankomst, ble guide RNAs ble utvannet og samlet av området, og en kort PCR utført for å legge til homologi regioner før Gibson montering. Figur 2C viser forventet guide RNA produktet etter en kort PCR bruker "U6_internal" primerne (tabell 1), som vil legge til 20 basepairs av sekvens i hver ende av den 59 basepair guide RNA fragment, resulterer i en ~ 100 basepair. Etter Gibson montering, disse guide RNA bassengene ble forvandlet til bakterier og plasmider minipreps var forberedt dagen. Figur 2D viser resultater fra et enhancer disseksjon eksperiment, der flere enhancers i nærheten MMP17 målrettes alene og i kombinasjon med Enhancer-i. Nettstedene målrettet av Enhancer-i angis med en svart sekskant. Guide RNA plasmider målretting de angitte områdene ble transfekterte i en estrogen-belastede Ishikawa cellen linje stabilt uttrykke SID4X-dCas9-KRAB. To dager senere, media ble endret og puromycin ble lagt til berike for transfekterte celler. Dagen ble cellene høstet etter en 8 h 10 nM østradiol behandling. RNA ble isolert, og en ett-trinns qPCR ble utført. I dette eksemplet er 1 og 2 nødvendig for en komplett estrogenic respons av MMP17, mens nettstedet 3 ikke bidrar under disse forholdene (figur 2D, baner ii-iv). Når bare nettsteder 2 eller 3 er aktive (vi og vii), østrogen svaret er lik når ingen områder er aktiv (viii), tyder på at disse områdene ikke kan bidra uavhengig. Området 1 kan bidra noen uttrykk av seg selv (v), men den største aktiviteten er sett når 1 og 2 er aktive (iv).

For å manipulere 10 enhancers nær 4 ulike gener samtidig (figur 3A), komplekse bassenger av guide RNAs ble generert som inneholder 42 enhancer guider og 16 promoter guider. Guide RNA oligos var samlet før første guiden RNA forlengelsen PCR (trinn 3.3), og resulterende PCR produktene ble renset og kombinert med Tom puromycin U6 kloning vektoren bruker Gibson samling. Etter samlingen Gibson var flere uavhengige transformasjoner utføres og belagt. Platene var skrapt i LB og lov til å vokse ut for 2-4 h før maxiprep. Figur 3B viser representant reduksjoner i genuttrykk ved qPCR når disse guide RNA bassengene transfekterte i en estrogen-belastede Ishikawa cellen linje stabilt uttrykke SID4X-dCas9-KRAB og behandlet som beskrevet ovenfor (figur 2D). Reduksjoner fra Enhancer-jeg er lik de man får av målretting arrangøren av antatte målet genet. Figur 3 c viser effekten av fortynning av guide RNAs reduksjon av estrogen svaret bruker Enhancer-i. En 1:50 fortynning av en guide RNA målretting enhancer nær G0S2 fortsatt gir betydelig reduksjon i genuttrykk, antyder at Enhancer-jeg kan brukes til å målrette opptil 50 steder samtidig. Men kan frata bli utvannet, indikerer at hundrevis av nettsteder ikke kan målrettes samtidig med mindre sensitive gjenkjenningsmetoder er ansatt.

Figure 1
Figur 1. Protokollen skjematisk for multiplex enhancer disseksjon bruker Enhancer-i. Guide RNAs (rød og blå) er utformet med e-skarp og valgte UCSC genomet webleser. Fire guide RNAs er valgt som dekker områdene rundt (transkripsjon faktor bindende områder som definert av ChIP-seq). Guide RNA oligonucleotides som har blitt samlet av regionen rundt (rød og blå) gjennomgår en PCR å legge homologi regioner (oransje) før Gibson montering og transformasjon. Resulterende plasmider bassenger er transfekterte via lipofection til cellelinjer stabilt uttrykke SID4X-dCas9-KRAB eller vill-type celler i forbindelse med SID4X-dCas9-KRAB plasmider. Guide RNA plasmider bassenger kan være transfected individuelt målrettingsland ett område om gangen, eller i kombinasjon å målrette flere områder samtidig. Transfekterte cellene behandles med antibiotika for å berike for celler med guide RNAs. På ~ 72 h innlegget transfection høstes cellene. Nukleinsyrer kan trekkes ut for qPCR, RNA-seq eller ChIP-seq. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Guide RNA design og enhancer disseksjon for MMP17. (A) genomet kikker skjermene av ER alpha-bundet enhancers (grå) bli målrettet nær MMP17. Dette tallet har blitt endret fra Carleton, et al. 18. (B) Guide RNA design for 3 bindende områder18. Binding området for ER som definert av ChIP-seq er målet, og 4 guide RNAs flis over denne regionen. DNaseI følsomhet signalet, som webområdet bindende, kan også brukes til å definere målet sekvens for guide RNA design. Både ChIP-seq og DNaseI HS ble innhentet fra Ishikawa cellene behandlet med 10 nM østradiol for 1 h. (C) representant guide RNA sekvenser som er klare for Gibson montering, har gjennomgått en kort PCR å legge homologi regioner. (D) Relative uttrykk for MMP17 målt via qPCR etter målretting av bestemte regioner med Enhancer-jeg og en 8-h10 nM østradiol behandling. Uttrykket er i forhold til CTCF og uttrykk nivå av MMP17 i cellene ikke behandles med østradiol. Kontroll guide RNAs målet bak IL1RN. Alle feilfelt representerer SEM, dobbel stjernene indikerer p < 0,01 og enkelt stjernene indikerer p < 0,05 i en parvis t-test. Dette tallet har blitt endret fra Carleton, et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Målretting flere enhancers nær ulike gener samtidig med samlet Enhancer-i. (A) skjematisk av bindende og arrangører bli målrettet i grupperte Enhancer-i. (B) effekter på uttrykk målt ved qPCR etter E2 behandling på Ishikawa celler transfekterte med Enhancer-i plasmider bassenget (grønn), selskapet-i plasmider bassenget (blå) eller kontroll gRNAs (hvit)18. En betydelig reduksjon på alle gener er observert med Enhancer-i. Dette tallet ble endret fra Carleton, et al. 18. (C) effekter på G0S2 uttrykk nivåer etter E2 behandling på Ishikawa celler transfekterte med ulike mengder guide RNAs rettet mot G0S2. En betydelig reduksjon kan sees selv med små mengder guide RNA (1:50 fortynning), tyder på at opptil 50 steder kan mål samtidig. Alle feilfelt representerer SEM, dobbel stjernene indikerer p < 0,01 og enkelt stjernene indikerer p < 0,05 i en parvis t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

navn Sekvens
U6_internal_F TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_R GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_F CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_R AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_F GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_R AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_F GTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_R AGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_F AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_R CGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_F CAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_R TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

Tabell 1. Primere brukt for guide RNA utvidelse og sekvensering, qPCR og oppdagelsen av fusion protein.

Discussion

Denne protokollen beskriver en enkel og fleksibel metode for dissekere enhancer funksjonen på endogene genomisk locus uten fysisk endre DNA sekvensen. Mens lignende i konsept til tidligere publiserte CRISPR forstyrrelser protokollene ved hjelp dCas9-KRAB27, Enhancer-jeg er forskjellig fra disse protokollene i 3 måter. Først bruker Enhancer-jeg SIN3A samspill domenet MAD120 å oppnå enhancer deaktivering. Enhancer deaktivering kan reddes ved hjelp HDAC hemmere, antyder at den primære mekanismen for deaktivering er HDAC avhengige. I motsetning til CRISPR innblanding dCas9-KRAB føre Enhancer-jeg ikke til avleiring av H3K9me3. Dette er sannsynlig skyldes at Enhancer-jeg er avhengig av forbigående innføring av guide RNAs, med celler blir høstet etter 3 dager legge transfection. CRISPR forstyrrelse, er det observert en økning i H3K9me3 på 7 dager innlegget signaltransduksjon12. Til slutt gir Enhancer-i protokollen en strategi for å målrette flere nettsteder samtidig og overvåke effektiviteten av målretting. I mosaikk-seq17, dCas9-KRAB brukes til å målrette flere enhancers samtidig, men denne teknikken er avhengig av én celle RNA sekvensering å identifisere uttrykk endringer, og mange gener (for eksempel østrogen-responsive gener) gå usett på grunn av lav Følsomheten av encellede RNA-seq. Enhancer-jeg gir en pålitelig metode for å studere enhancers individuelt og i kombinasjon for enhver genet.

Det viktigste trinnet i Enhancer-jeg er hva, som skal være optimalisert for den cellen interesse. Denne protokollen er avhengig av puromycin behandling å berike for transfekterte celler, men det er mulig at co transfecting guide RNAs med et fluorescerende protein og sortering for fluorescerende celler ved hjelp av flowcytometri kan vise seg for å være en bedre berikelse for noen celle typer. Vi anbefaler overvåking uttrykk nivå av guide RNAs og SID4x-dCas9-KRAB av qPCR til å feilsøke og bekrefte hva. Hvis guide RNA nivåer er lav (syklus terskelen > 30), brukere kan også vurdere alternative guide RNA produksjon strategier som i vitro transkripsjon28. Det er også mulig at til tross for høy gRNA nivåer, guide RNA målretting av SID4x-dCas9-KRAB protein er ineffektivt, da velge forskjellige guide RNA sekvenser kan være nødvendig. Ved å utføre ChIP-seq på fusion protein med chromatin fra Enhancer-jeg behandlet celler, kan effektiviteten av målretting overvåkes. Hvis høy signal av SID4x-dCas9-KRAB på området av interesse, og uttrykket endringer i sin antatte målet genet oppdages, deretter bidrar regionen trolig ikke til uttrykk for det genet under forhold studert.

En potensiell begrensning av Enhancer-jeg er at off-målet effekter kan samle Hvis for mange nettsteder er målrettet samtidig. Likevel har CRISPR forstyrrelser strategier for knockdown færre av målet effekter enn RNAi29, spesielt når en polyklonale celle linje uttrykke dCas9-KRAB brukes. Mens vi har sett av mål genomisk binding av SID4X-dCas9-KRAB når målretting 10 nettsteder samtidig, har vi ikke funnet gene expression endringer de bindende hendelsene. Noen enhancers kan kontakte flere arrangører og/eller andre enhancers, er det mulig at mange gener kan endre uttrykket på målretting av en enkelt enhancer, men det er uklart om denne typen genreguleringen er vanlig. For å bekrefte at endres uttrykket observert skyldes rettet mot en bestemt enhancer, og ikke av mål effekter, kan brukere utføre Enhancer-i to forskjellige sett med ikke-overlappende guide RNAs rettet mot samme område. I tillegg kan genetisk sletting for ved hjelp nuclease-kompetent Cas9 videre bekrefte dens virkning på genuttrykk.

Som Enhancer-i funksjoner gjennom histone deacetylation, er det mulig at dens deaktivering evner er begrenset til enhancers som har nevneverdig nivåer av histone acetylation. Det finnes en rekke alternative undertrykkende fusjoner som kan være mer effektiv på målretting bestemte enhancers. DNA methyltransferase fusjoner til dCas9 kan brukes til å redusere genuttrykk når rettet mot distale enhancers30, men denne undertrykkelse er ofte ikke forbigående. En annen undertrykkende fusion bruker domenet venn av GATA1 (FOG1), som fører til histone H3 lysin 27 trimethylation og represses genuttrykk på nivåer ligner dCas9-KRAB over en rekke cellen linjer og arrangører31. Interessant, redusert å legge til flere kopier av FOG1 dCas9 undertrykkende potensial på arrangører, antyder at en enkelt kopi av SID domenet kan gi mer enhancer deaktivering enn 4 kopiene som brukes i Enhancer-i. Det er mulig at noen loci kan ha nytte av dobbelt målretting av forskjellige kombinasjoner av de ovennevnte dCas9 fusjoner. For eksempel kan stabil langsiktig undertrykkelse oppnås ved samtidige signaltransduksjon dCas9-DNMT3a og dCas9-KRAB32. De fleste av disse undertrykkende fusjoner har bare vært rettet mot en enkelt locus samtidig, og det er fortsatt uklart som er mest effektiv til å manipulere flere enhancers samtidig.

Enhancer-i, mens en egnet metode for å studere kombinasjoner av enhancers for en håndfull av gener er fortsatt noe begrenset i gjennomstrømming hvis brukeren ønsker å studere mulige enhancers for hundrevis av gener. Fremtidige anvendelser av denne teknikken vil innlemme imaging-baserte teknologier å kvantifisere flere gener i flere prøver samtidig. Viktigere, er disse teknologiene kompatible med direkte deteksjon av RNA molekyler fra lysate, eliminerer behovet for tidkrevende RNA isolasjon. Disse tilpasninger vil lette avhør av større sett av enhancers.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH/NHGRI R00 HG006922 og NIH/NHGRI R01 HG008974 til JG Huntsman Cancer Institute. J.B.C. ble støttet av NIH treningsprogrammet i genetikk T32GM007464.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZR 96-well Quick-RNA Kit Zymo Research R1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Applied Biosystems 4389986
AflII restriction enzyme NEB R0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer NEB M0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L
FuGENE HD Promega E2312
DNA Clean & Concentrator Kit Zymo Research D4013
Buffer RLT Plus Qiagen 1053393
b-estradiol Sigma-Aldrich E2758
Human: Ishikawa cells ECACC 99040201
H3K27ac rabbit polyclonal Active Motif  39133
H3K9me3 rabbit polyclonal Abcam  ab8898
FLAG mouse monoclonal Sigma-Aldrich  F1804
ER alpha rabbit polyclonal Santa Cruz sc-544
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid Addgene  51133 Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector plasmid Addgene  41824 Mali et al., 2013
AflII U6 puromycin plasmid Addgene  106404 Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB plasmid Addgene  106399 Carleton et al., 2017
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads Kapa Biosytems KK8420
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets ThermoFisher Scientific A32959
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich 252549-25ML
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131035
LB Broth ThermoFisher Scientific 10855001
Quick-DNA Miniprep Kit Zymo Research D3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder NEB N0050S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  3. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  4. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).
  5. Lam, D. D., et al. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935 (2015).
  6. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  7. Savic, D., et al. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  10. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).
  11. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  12. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  13. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869 (2010).
  14. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  15. Fulco, C. P., et al. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).
  16. Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  17. Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).
  18. Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).
  19. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  20. Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).
  21. Alland, L., et al. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).
  22. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  23. Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).
  24. Stampfel, G., et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).
  25. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  26. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  27. Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).
  28. Romanienko, P. J., et al. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362 (2016).
  29. Smith, I., et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213 (2017).
  30. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  31. O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  32. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).

Tags

Genetikk problemet 136 Gene regulering CRISPR/Cas9 enhancer epigenetics funksjonell genomforskning transkripsjonsfaktorer
Disseksjon Enhancer funksjon med Multiplex CRISPR-baserte Enhancer forstyrrelser i linjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carleton, J. B., Berrett, K. C.,… More

Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines. J. Vis. Exp. (136), e57883, doi:10.3791/57883 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter