Summary
ويرد وصف بروتوكولا تهجين (ايش) في الموقع الذي يستخدمه النوكليوتيد العقاقير قصيرة للكشف عن أنماط الربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس.
Abstract
يحدث الربط بديلة (AS) في أكثر من 90% جينات البشرية. نمط التعبير إكسون المقسمة بدلاً من ذلك غالباً ما تنظم بطريقة خاصة بنوع خلية. كالتعبير عادة يتم تحليل أنماط RT-PCR وتسلسل الحمض النووي الريبي باستخدام عينات الحمض النووي الريبي معزولة عن أن خلايا. يمكن الاضطلاع في الموقع دراسة أنماط التعبير عن بنية بيولوجية خاصة بالجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين (العش) استخدام المسابير إكسون-محددة. بيد هذا الاستخدام بالتحديد من العش كان محدودا نظراً لأن exons بديلة تكون عادة قصيرة جداً لتصميم إكسون-خاصة بالمجسات. في هذا التقرير، يرد استخدام باسيسكوبي، تكنولوجيا المتقدمة مؤخرا التي توظف النوكليوتيد العقاقير قصيرة في الجيش الملكي النيبالي العش، لتحليل أنماط التعبير في أقسام الدماغ الماوس. إكسون 23 ألف من الورم العصبي الليفي النمط 1 (Nf1) كمثال لتوضيح أن المسابير مفرق القصير إكسون-إكسون يحمل إشارات قوية التهجين مع خصوصية عالية في تحليل الحمض النووي الريبي العش في أقسام الدماغ الماوس. الأهم من ذلك، يمكن استخدام إشارات الكشف مع إكسون إدراج تخطي محددة وتحقيقات لحساب موثوق % تقسم في قيم Nf1 إكسون 23a التعبير في مختلف المجالات التشريحية للدماغ الماوس. ويعرض البروتوكول التجريبي وطريقة الحساب كالتحليل. وتبين النتائج أن باسيسكوبي يوفر أداة قوية جديدة لتقييم كتعبير الأنماط في الموقع.
Introduction
الربط بديلة (AS) هو عملية شائعة التي تحدث أثناء النضج قبل مرناً. في هذه العملية، يمكن تضمين إكسون متفاوتاً في مرناً ناضجة. وهكذا، من خلال، أحد الجينات يمكن توليد مرناس العديد من التعليمات البرمجية لمنتجات مختلفة من البروتين. ومن المقدر أن 92 – 94% جينات البشرية الخضوع للربط البديل1،2. نتجت عن بديل طبيعي الربط أنماط الطفرات الوراثية قد ربطت بعدد كبير من الأمراض، بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي وضمور ميوتونيك والسرطان3،4. وبالتالي من الأهمية بمكان التحقيق، وفهم أفضل لآليات تنظيمية الربط بديلة في محاولة لإيجاد علاجات جديدة للأمراض التي تصيب الإنسان.
كما غالباً ما تنظم بطريقة خاصة بنوع خلية. من المهم تحديد نمط التعبير كجين معين في نظام بيولوجي معين. ومع ذلك، هذا يصبح معقداً عند جهاز معقد يحتوي على العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مثل الدماغ أو القلب، وهو درس. وفي هذه الحالة، هو خياراً مثاليا لنظام تحليل الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين (العش) استخدام أنسجة الفروع حيث يمكن اكتشاف نمط التعبير كجين معين في العديد من أنواع الخلايا في وقت واحد. وفي الواقع، استخدمت تحقيقات خاصة إكسون لتقييم مستويات التعبير إكسون البديلة5،،من67. غير أن هذا النهج ليس مناسبة لتحليل نمط للأسباب التالية. أولاً، التقليدية وأساليب العش عادة استخدام المسابير أطول من 300 شركة بريتيش بتروليوم، بينما متوسط حجم exons الداخلية الفقاريات (إكسون ليس الأول أو الأخير) هو 170 النيوكليوتيدات8،9. ثانيا، عندما يتم استخدام مجس إكسون على حدة دراسة نمط إكسون بديلة داخلية الربط، isoform مرناً فقط الكشف عنها بواسطة المسبار هو واحد يحتوي على إكسون، بينما isoform مرناً دون إكسون لا يمكن الكشف عنها. وهكذا، معقد لحساب نسبة تقسم في قيمة إكسون البديلة (PSI). وعلاوة على ذلك، يجمع العش الفلورسنت التقليدية غالباً ما العش مع إيمونوستينينج، مما يقلل من كفاءة الكشف ومتانة. على سبيل المثال، في دراسة أن التحقيق الإجهاد الناجم عن الربط isoform التبديل من أستيلكولينستراز (وجع) مرناً، أدمجت في التحقيق العش ديجوكسيجينين والكشف عن استخدام الأجسام المضادة ديجوكسيجينين. وبدلاً من ذلك، تم الكشف عن مسبار المسمى البيوتين المتقارن الفوسفاتيز قلوية/ستريبتافيدين وركيزة الفوسفاتيز القلوية10. يستخدم الأسلوب لا أي استراتيجية التضخيم لزيادة حساسية الكشف. نتيجة لذلك فإنه يمثل تحديا للكشف عن النصوص مرناً التي يتم التعبير عنها في مستويات منخفضة. وهكذا، يلزم وجود نظام مقايسة ايش أبسط وأكثر قوة لتحليل كتعبير الأنماط في الموقع.
باسيسكوبي مؤخرا قد وضعت استناداً إلى منصة رناسكوبي، راسخة، وتستخدم على نطاق واسع نظام مقايسة العش. كلا النظامين المقايسة تستخدم تقنية تضخيم محددة الهدف الذي يزيد من حساسية الكشف عن11،12. وما يميز أحدهما من الآخر هو طول التسلسل المستهدفة، وقصيرة بقدر النيوكليوتيدات 50 باسيسكوبي، والنيوكليوتيدات 300 – 1,000 رناسكوبي. وهكذا، من الممكن تصميم المجسات التي تستهدف تقاطعات إكسون-إكسون للكشف عن isoforms مرناً بديلة محددة. في الدراسة الحالية، وتم وضع إجراء لدراسة أنماط التعبير [نيوروفيبرومتوسس] الكتابة 1 (Nf1) إكسون 23 ألف، إكسون بديلة درس على نطاق واسع في نفس المختبر13،،من1415 , 16 , 17، في أقسام الدماغ الماوس. النتائج تثبت أن باسيسكوبي نظام مثالي لدراسة أنماط التعبير من Nf1 إكسون 23 ألف في الموقع. كما يمكن أن يكون هذا النظام مقايسة تكييفها لتحليل أنماط التعبير من exons بديلة كثيرة، أنه يمثل أداة جديدة قوية في دراسات as.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب الموضحة هنا التي تنطوي على الفئران عليها "لجنة الاستخدام" و "رعاية الحيوان حالة Western Reserve جامعة المؤسسية". عنوان البروتوكول بحلول عام 2016-0068 (PI: لو هوا) هو "دور الربط مرناً قبل بديلة في التنمية فقاريات".
ملاحظة: يتم تضمين معلومات جميع المعدات والمواد الكاشفة واللوازم المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول للمواد.
1. إعداد الفورمالين البارافين ثابت مضمن المقاطع (FFPE)
-
Euthanize 1 CD1 الماوس والماوس C57BL/6J 1 بخلع عنق الرحم. عناية قص فتح الجمجمة بالمقص الجراحي والملقط. إزالة الدماغ مع حلج القطن.
ملاحظة: عمرها 5 أشهر CD1 ذكور الفئران والفئران الذكور C57BL/6J عمره 3 أشهر كانت تستخدم وأن أظهرت نتائج مماثلة.- غسل الدماغ مع برنامج تلفزيوني. إصلاح الدماغ كله مع محلول يحتوي على الفورمالين 10% في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 30 عن طريق وضع الدماغ كله في 50 مل الحل الفورمالين.
- تغيير تحديد الحل لبرنامج تلفزيوني واحتضان الدماغ في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يذوي وتضمين الدماغ مع زيلين نفط والكيروسين باستخدام إجراءات معيارية18.
-
استخدم مبضع يقتطع جزءا لا يتجزأ من النسيج 5 ميكرومتر المقاطع. وضع الشريط البارافين في حمام مائي RT أولاً، ثم في حمام مائي 45 درجة مئوية لنشر الشريط.
- عندما تختفي التجاعيد والطيات في الشريط، فورا تحميل المقاطع على الشرائح الزجاجية. الجوية الجافة الشرائح بين عشية وضحاها في شرائح خبز الرايت ح 1 عند 60 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2-نموذج المعالجة المسبقة
-
ديبارافينيزي أقسام الأنسجة. القيام بهذه الخطوات في غطاء دخان.
- ملء اثنين غسالة الأطباق (الشكل 1A) مع 250 مل من زيلين نفط جديدة، واثنان مع 250 مل إيثانول 100%. إدراج شرائح الأنسجة في رف الغسيل (الشكل 1A) ومكان رف الغسيل في غسالة الأطباق بعد وقت النظام والحضانة هو مبين في الجدول 1.
- أثناء كل حضانة، رفع رف الغسيل صعودا وهبوطاً أكثر من 3 مرات في طبق الغسيل. بعد كل حضانة، التحرك بسرعة على الرف الغسيل في طبق الغسيل التالية لمنع المقاطع الأنسجة من جفاف.
- بعد إكمال الخطوات الحضانة، إزالة رف الغسيل مع الشرائح من طبق الغسيل. وضع على الرف في حاضنة 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى الشرائح جافة تماما.
- رسم حاجزاً 0.75 '' 0.75 '' المحيطة بقسم الأنسجة بقلم حاجز مسعور. الهواء الجاف الحاجز لمدة 3 دقائق في الرايت
-
بريتريت شرائح
- إعداد الكواشف والمعدات
- قم بتشغيل الفرن التهجين (الشكل 1B) وضبط درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية و 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- الرطب ورقة هوميديفيينج (الشكل 1E) مع الماء المقطر تماما ووضعها في علبة التحكم الرطوبة (الشكل 1، يسار). اترك الدرج مراقبة الرطوبة في الفرن التهجين.
- تعد 700 مل س 1 جديدة مستهدفة استرجاع المواد الكاشفة عن طريق إضافة مل 630 درهم2س إلى 70 مل الهدف x 10 استرجاع المواد الكاشفة.
- تطبيق بيروكسيد الهيدروجين.
- وضع الشرائح ديبارافينيزيد على مقاعد البدلاء. إضافة 5 – 8 قطرات بيروكسيد الهيدروجين إلى مقطع تغطي كامل الأنسجة. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
- انقر فوق الشرائح على قطعة من الورق ماصة لإزالة الحل فوق أكسيد الهيدروجين، شريحة واحدة في وقت واحد. إدراج الشريحة في رف غسيل فورا ونقل الحامل إلى طبق غسيل مليئة dH2o.
- يغسل الشرائح عن طريق تحريك الرف صعودا وهبوطاً في الماء المقطر ل 3 – 5 مرات. نقل رف الغسيل إلى طبق غسيل مليئة بالماء المقطر الطازج ويغسل الشرائح مرة أخرى.
- إجراء استرداد الهدف
- ضع كوب زجاج مل 1,000 على لوحة الساخن. إضافة 700 مل س 1 جديدة مستهدفة استرجاع المواد الكاشفة في الكأس وتغطية ذلك بإحباط. إدراج مقياس حرارة في الكأس من خلال تغطية إحباط (الشكل 1). بدوره على صفيحة وتعيين على ارتفاع لمدة 10 – 15 دقيقة.
- عندما تصل درجة الحرارة لاسترجاع المواد الكاشفة إلى 98 درجة مئوية، التبديل التحكم في درجة الحرارة من صفيحة من عالية إلى منخفضة للحفاظ على يغلي معتدل. لا تغلي أكثر من 15 دقيقة.
- وفي الوقت نفسه، بعناية فتح إحباط ووضع رف الغسيل مع شرائح داخل ريجنت استرجاعها. تغطي الكأس مرة أخرى واحتضان لمدة 15 دقيقة.
- استخدام الملقط لإزالة الرف من الكأس على طبق غسيل مليئة 200 مل dH2س وشطف لمدة 15 ثانية.
- نقل الحامل إلى طبق غسيل التي تحتوي على 100% إيثانول الطازجة، والسماح للجلوس للحد الأدنى 3 إزالة الشرائح وتجفيفها في حاضنة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تطبيق حوزتي الثالث
- ضع الشرائح على الرف وصمة عار (الشكل 1، حق). قم بإضافة 5 قطرات من "الثالث مبطلات" لتغطية الأنسجة. بعناية وضع على الرف في علبة التحكم الرطوبة (الشكل 1، يسار) وإدراج صينية في الفرن التهجين 40 درجة مئوية. احتضان لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة حامل الشرائح ووضع العلبة مرة أخرى في الفرن. انقر فوق الشرائح لإزالة السائل الزائد، شريحة واحدة في وقت واحد. إدراج الشريحة على حامل غسيل ووضع على الرف في طبق غسيل مليئة dH2نقل سين الرف صعودا وهبوطاً ليغسل الشرائح ل 3-5 مرات.
- إعداد الكواشف والمعدات
3-ايش الإنزيم
-
إعداد المواد
- قبل الحارة 50 × أغسل المخزن المؤقت في حاضنة 40 درجة مئوية ل 20 دقيقة ميكس 2.94 لتر من dH2س و 60 مل من 50 × أغسل المخزن المؤقت لجعل 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- تحضير محلول 50% الهيماتوكسيلين المصبوغة بإضافة 100 مل توضع لجيل الأول إلى 100 مل لتحضير O. 0.02% (w/v) الأمونيا المياه عن طريق إضافة 1.43 مل هيدروكسيد الأمونيوم N 1 إلى 250 مل من مزيج O. dH2dH2جيدا في حاوية.
- وضع المسابر وامبير 0 – 6 الكواشف في الرايت 30 دقيقة قبل الاستخدام. اترك الدرج مراقبة الرطوبة في الفرن التهجين 40 درجة مئوية.
-
ايش الإجراء
ملاحظة: للنظر في التعبير عن Nf1 الربط إيسوفورمس وحساب المائة تقسم في القيمة (PSI) إكسون 23 ألف، ثلاثة تحقيقات العش المختلفة التي تستهدف إكسون شملت 23 ألف isoform، إكسون تستثني 23 ألف إيسوفورم أو إيسوفورمس على حد سواء هي المستخدمة (رقم 2 ). وتستخدم التحقيقات في الأقسام يوجد قطع الأنسجة. لضمان دقة الحساب، من الأهمية بمكان أن يتم التعامل مع الفروع الثلاثة الأنسجة بالضبط نفس في خطوات الكشف عن التهجين وتضخيم الإشارات.- التحقيق التهجين.
- إزالة الشرائح من رف الغسيل والاستفادة من السائل الزائد من الشرائح. وضع الشرائح في الرف وصمة عار.
- استخدام قلم رصاص لتسمية الشرائح مع اسم المسبار. وضع ثلاث شرائح أنسجة الدماغ يوجد قطع يكون تهجين مع ثلاثة تحقيقات Nf1 مختلفة (الشكل 2) معا. القيام بالخطوات اللاحقة في نفس ترتيب الشرائح.
- إضافة 4 قطرات مسبار لتغطية الأنسجة. هذا شريحة واحدة في كل مرة لمنع المقاطع من الجفاف. وضع على الرف وصمة عار في علبة التحكم الرطوبة وأدخله في الفرن 40 درجة مئوية ح 2.
- يغسل الشرائح مرتين مع الغسيل المخزن المؤقت. لكل غسل، ملء الطبق المصبوغة مع 200 مل 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ووضع رف غسيل فيه. اضغط السائل الزائد على شريحة واحدة منشفة ورقة في وقت واحد وأدخله بسرعة في رف الغسيل. نقل رف شريحة صعودا وهبوطاً في الطبق ل 3 – 5 مرات لمدة 2 دقيقة في الرايت
- ليغسل الثانية، استخدام المخزن المؤقت للمياه العذبة والصرف الصحي.
- تضخيم الإشارات.
- انقر فوق المخزن المؤقت الغسيل الزائد من الشرائح ووضعها في الرف وصمة عار. إضافة 4 قطرات أمبير 0 لتغطية الأنسجة. وضع على الرف وصمة عار في علبة التحكم الرطوبة وأدخله في الفرن لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
- يغسل الشرائح مرتين مع الغسيل المخزن المؤقت كما هو موضح أعلاه.
- كرر هذه الخطوة مع أمبير 1-6 بعد الترتيب وحالة من الجدول 2. أغسل الشرائح مرتين بعد كل خطوة من خطوات التهجين.
- كشف الإشارات
- انقر فوق المخزن المؤقت الغسيل الزائد من الشرائح ووضعها في الرف وصمة عار. إضافة 2 ميليلتر "حمل الأحمر ب" 120 ميليلتر من "الأحمر السريع" (نسبة 1:60) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. يخلط جيدا وإضافة إلى تغطية كامل المقطع الأنسجة.
ملاحظة: الحجم الإجمالي للاحمر A/ميكس ب استناداً إلى عدد وحجم مقاطع الأنسجة. لمنطقة '' 0.75 x 0.75 ''، ميليلتر 120 ما يكفي لقسم واحد. استخدام هذا المزيج داخل 5 دقيقة وتجنب التعرض لهذا المزيج لأشعة الشمس المباشرة أو الأشعة فوق البنفسجية. - إغلاق علبة الورق واحتضان لمدة 10 دقائق في إزالة الرايت الحل لحاوية نفايات وفورا إدراج الشرائح في رف غسيل ووضع على الرف في طبق غسيل مليئة بماء الصنبور. الشطف بماء الصنبور جديدة مرة أخرى.
- انقر فوق المخزن المؤقت الغسيل الزائد من الشرائح ووضعها في الرف وصمة عار. إضافة 2 ميليلتر "حمل الأحمر ب" 120 ميليلتر من "الأحمر السريع" (نسبة 1:60) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. يخلط جيدا وإضافة إلى تغطية كامل المقطع الأنسجة.
- التحقيق التهجين.
-
كونتيرستاينينج الشرائح
- إزالة رف الغسيل من ماء الصنبور، والصنبور بسرعة على ورقة ماصة لإزالة المياه الزائدة. وضعت على الرف توضع 50% تلطيخ الحل وتتحرك فورا على الرف صعودا وهبوطاً عدة مرات. احتضان لمدة 2 دقيقة في الرايت
- نقل رف الشريحة مرة أخرى إلى صحن ماء الصنبور. أغسل 3 – 5 مرات عن طريق تحريك الرف صعودا وهبوطاً وتغيير ماء الصنبور جديدة حتى تصبح الشرائح واضحة، في حين تظل أنسجة الدماغ الأرجواني.
- نقل الحامل إلى طبق الذي يحتوي على مياه الأمونيا 0.02 في المائة. نقل الرف صعودا وهبوطاً 2 – 3 مرات حتى تتحول الأنسجة الزرقاء. تغسل شرائح 3 – 5 مرات مع الاستفادة من المياه العذبة في صحن المصبوغة.
-
متصاعدة العينات
- نقل رف شريحة من الطبق المصبوغة لحاضنة 60 درجة مئوية واحتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى الشرائح جافة تماما.
- 40 مكان ميليلتر من تصاعد المتوسطة على الشريحة وعناية ضع ساترة 24 مم × 50 مم على قسم الأنسجة. الشرائح الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة في الرايت
4-جمع البيانات وتحليلها
ملاحظة: استخدام ماسح ضوئي شريحة لمسح الصور في 40 X التكبير.
-
عناصر إيجابية وسلبية
- لكل تجربة، وتتضمن عناصر إيجابية وسلبية (الشكل 3). كعنصر تحكم إيجابية جيدة، يجب أن تكون إشارة مرئية كنقط الشروريه في 20-40 X التكبير.
- استخدام الماوس (مم) 1ZZ-بيب-كعنصر إيجابي. ويستهدف هذا التحقيق جين التدبير المنزلي مشتركة بب. لمراقبة سلبية، نقطة واحدة لكل الخلايا 20 عرض خلفية تلطيخ كل X 20 مجهر الحقل مقبولة.
- استخدام مسبار 1ZZ دابب كعنصر سلبي. ويستهدف هذا التحقيق دابب الجينات البكتيرية. استخدمت هذه المسابر التحكم في العديد من فحوصات ايش19.
-
كشف الإشارات وتحليل أنماط التعبير من إكسون Nf1 23a
- كما ترد إشارات التهجين كنقط الشروريه، عد النقاط يدوياً. ويرتبط بعدد النقاط مع مستوى النصوص يتم الكشف عنها بواسطة إجراء تحقيق معين. لاحظ أنه يمكن أيضا أن تحلل بعدد النقاط ببرنامج إيماجيج أو سبوتستوديو.
- استخدم ثلاثة تحقيقات هجن إكسون 23a المحتوية على أو إكسون isoforms تفتقر إلى 23 ألف، أو مجموع النصوص Nf1 (الشكل 2). المسابر الثلاثة لا يمكن أن تستخدم في وقت واحد، استخدم ثلاثة أقسام أنسجة الدماغ المجاورة هجن لكل التحقيقات.
- لحساب تقسم في (PSI) إكسون 23 ألف في المائة، حساب عدد الخلايا والنقاط في العديد من مناطق الدماغ. لكل منطقة من مناطق الاهتمام، عد الخلايا أكثر من 400 من العديد من المناطق الفرعية كما هو مبين في الشكل 4.
- جمع البيانات من نفس المناطق الفرعية لكل من الثلاثة تحقيقات. حساب هذه المبادرة كعدد النقاط لكل خلية في بحث إدراج إكسون 23 ألف/(عدد النقاط لكل خلية مع المسبار إدراج إكسون 23 ألف + عدد دوت كل خلية مع exon23a تخطي مسبار) × 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ايش باسيسكوبي أجريت باستخدام ثلاث سلالات من الماوس: CD1 نوع البرية الفئران والفئران البرية نوع C57BL/6J Nf123aIN/23aIN الفئران المسخ في الخلفية C57BL/6J، إكسون التي أدرجت 23 ألف في جميع أنواع الخلايا نتيجة لتصميم موقع الوصلة 14،الطفرات15.
كخطوة أولى، تم اختبار نظام مقايسة ايش استخدام الكواشف الشركة المقدمة: يسبر ايش الشرائح التي تحتوي الخلايا 3T3، والسلبية والإيجابية. كما هو موضح في الشكل 3، تم الكشف عن أي إشارة عندما استخدمت مسبار المراقبة السلبية، في حين تم الكشف عن العديد من النقاط الشروريه عندما تم استخدام مسبار المراقبة الإيجابية.
وبعد ذلك، أجريت العش باستخدام الماوس أقسام الدماغ و Nf1-تحقيقات محددة مصممة للكشف عن النصوص Nf1 التي تحتوي على إكسون 23 ألف، تخطي إكسون 23 ألف أو كلا إيسوفورمس (الشكل 2). وتستهدف هذه المسابر تقاطعات محددة إكسون-إكسون. اختير المنطقتين الدماغ لدراسة نمط التعبير AS Nf1 إكسون 23 ألف: اللحاء، وقرن آمون CA3 (الشكل 4). لكل المنطقة، وعدد المناطق الفرعية الثلاث، كما هو مبين في الشكل 4، تسجيل أرقام الخلية ودوت. لكل منطقة، تحسب في مجموع الخلايا حوالي 400 والمستخدمة لحساب نسبة النقاط/خلية. يتم حساب نمط التعبير AS Nf1 إكسون 23 ألف كهذه المبادرة.
إشارات العش الحصين فئران CD1 يرد في الشكل 5Aوالحصول عليها مع ثلاثة تحقيقات Nf1 في القشرة-5F و الجدول 3. منطقة اللحاء من C57BL/6J Nf1+ + والفئران Nf123aIN/23aIN وكان أيضا تحليل (الشكل 6).
نتيجة لهذه التجارب أدت إلى استنتاجات عدة. أولاً، مجموع الإشارات، أظهرت النقاط/الخلية والكشف عنها بواسطة إكسون 23 ألف المسابير إدراج وتخطي محددة يساوي للكشف عنها بواسطة المسبار التهجين لكلا إيسوفورمس (الجدول 3)، مما يوحي بأن تحقيقات ثلاثة المهجنة مع Nf1 المحاضر بكفاءة مماثلة. ثانيا، وقيمة هذه المبادرة إكسون 23 ألف في القشرة، 10%، يتسق مع النتيجة RT-PCR المبلغ عنها سابقا، الذي كان تشريح قشرة من المخ الماوس C57BL/6J الكبار متبوعاً بعزل الحمض النووي الريبي و RT-PCR تحليل14،15. هذه النتيجة تشير إلى أن العش باسيسكوبي يمكن استخدامها لتحليل كمي كأنماط التعبير بالإضافة إلى مستويات محاضر في أقسام الأنسجة. ثالثا، أظهرت النتائج المتحصل عليها مع أنسجة الدماغ متحولة Nf123aIN/23aIN ، التي تحتوي كافة النصوص Nf1 على إكسون 23 ألف14،15، مستويات مماثلة من إشارات عند إدراج محددة و Nf1 المسابير مجموع استخدمت ولا توجد إشارة عندما استخدمت التحقيق الخاصة بتخطي (الشكل 6)، مشيراً إلى أن تحقيقات اثنين تستهدف إدراج إكسون أو تخطي محددة للغاية.
رقم 1: المعدات المستخدمة في العش. (أ) غسل الأطباق وغسل الرف. (ب) فرن التهجين. (ج) استهداف مجموعة استرجاع الكأس وصفيحة. (د) الرطوبة التحكم في علبة ووصمة عار الرف. (ﻫ) التبول السيارات ورقة المؤشرة على رأس سهم أحمر داخل علبة التحكم الرطوبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: المجسات المستخدمة للكشف عن Nf1 إكسون 23 ألف كأنماط التعبير. تحتوي كافة التحقيقات على اليغنوكليوتيد زوج ZZ واحد. التحقيق الخاصة بإدراج (أحمر) يستهدف ملتقى exons 23 ألف و 24، التحقيق الخاصة بتخطي (الأخضر) ويستهدف ملتقى exons 23 و 24، ويستهدف التحقيق مجموع Nf1 (أزرق) تقاطع exons 26 و 27. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ايش استخدام الضوابط (ج-د) إيجابية في الخلايا 3T3 وسلبية (أ-ب). شريحة تحكم التي تحتوي على خلايا 3T3 تمت معالجتها من خلال الخطوات 2 (نموذج المعالجة) و 3 (العش الداخلي) في البروتوكول. وترد إشارات إيجابية كنقاط حمراء الشروريه المبين بالأسهم الحمراء. B و D هي أسرع في الصور من ألف وجيم، على التوالي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (ألف وجيم)؛ 5 ميكرومتر (ب ود). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 4: صورة لمقطع الاكليلية الدماغ الماوس. مربعات حمراء تشير إلى المجالات المختارة لعد أرقام الخلية والإشارات في منطقتي CA3 القشرة والحصين. مقياس بار = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: رنا ايش إشارات الكشف عن استخدام Nf1-تحقيقات محددة والماوس أقسام الدماغ. العقول CD1 تم تجهيزها من خلال الخطوات من 1-4 في البروتوكول. نقاط الشروريه حمراء تشير إلى إيجابية إشارات عند ثلاثة Nf1-تستخدم تحقيقات محددة (كما هو موضح في الشكل 3). تظهر قشرة (أ-ج) والحصين (د-و). Nfمسبار 1 المجموع استخدمت في أ ود والتحقيق الخاصة بإدراجها في ه وب والتحقيق الخاصة بتخطي في شريط جيم وواو مقياس = 40 ميكرومتر (أ-ج)؛ 400 ميكرون (د-و). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: الكشف عن الإشارات ايش الجيش الملكي النيبالي في Nf1+ + وأقسام الدماغ Nf123aIN/23aIN - كلا سلالات الماوس يتم في الخلفية C57BL/6J. تم تجهيز العقول من خلال الخطوات من 1-4 في البروتوكول. ألف-جيم Nf1+ + اللحاء. د-F. قشرة Nf123aIN/23aIN . تم استخدام مجس مجموع Nf1 في ألف د والتحقيق الخاصة بإدراجها في ه وب والتحقيق الخاصة بتخطي في شريط جيم وواو مقياس = 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| ترتيب الحضانة | المواد الكيميائية في صحن من دولارات ترينيداد وتوباغو | الوقت |
| 1 | 250 مل من زيلين نفط | 5 دقيقة |
| 2 | 250 مل من زيلين نفط | 5 دقيقة |
| 3 | 250 مل إيثانول 100% | 2 دقيقة |
| 4 | 250 مل إيثانول 100% | 2 دقيقة |
الجدول 1: الاحتضان الداخلي للخطوة 2.1.1.
| الحل أمبير | وقت الحضانة | درجة حرارة الحضانة |
| أمبير 1 | مدة 15 دقيقة | 40 درجة مئوية |
| أمبير 2 | 30 دقيقة | 40 درجة مئوية |
| أمبير 3 | 30 دقيقة | 40 درجة مئوية |
| أمبير 4 | مدة 15 دقيقة | 40 درجة مئوية |
| 5-الأحمر أمبير | 30 دقيقة | درجة حرارة الغرفة |
| 6-الأحمر أمبير | مدة 15 دقيقة | درجة حرارة الغرفة |
الجدول 2: إشارة الداخلي التضخيم للخطوة 3.2.2.
| المنطقة | تخطي | إدراج | تخطي + إدراج | المجموع | هذه المبادرة |
| قشرة | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5.56 | 5.65 | 3.71 |
الجدول 3: نتائج ايش الجيش النيبالي الملكي حساب من الصورة التي تظهر في الشكل 5- الأرقام، وهو مبين في النقاط/الخلية، حسبت باستخدام أكثر من 400 من الخلايا التي تم تضمينها في المناطق الفرعية الثلاث في القشرة و CA3 (الشكل 4). وأدرجت الأخطاء المعيارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الاتصال تقارير استخدام "العش باسيسكوبي الجيش الملكي النيبالي" القيام بدراسة أنماط التعبير في أقسام الدماغ الماوس. ثبت تقاطع الشعور المضادة إكسون-إكسون أن يسبر أقصر مما يمكن استهداف النيوكليوتيدات 50 إدراج إكسون وتخطي isoforms قويا، وعلى وجه التحديد. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الإشارات الناتجة لحساب هذه المبادرة من إكسون البديلة.
تم اختبار عدد قليل من الاختلافات في الإجراء. على سبيل المثال، اختبار أقسام الأنسجة المجمدة التي تم إنشاؤها بواسطة كريوستات تمزيقها وتبين أنها ناجحة للاستخدام في هذا البروتوكول العش. في هذه الحالة، ومع ذلك، تم تغيير الخطوة ديبارافينيزيشن في 2.1 للغسيل من أكتوبر مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أنها مريحة جداً لاستخدام الفرن التهجين المقدمة من حوار التعاون الآسيوي، استخدام حاضنة بسيطة تعيين عند 40 درجة مئوية، جنبا إلى جنب مع شريحة تلطيخ صينية تستخدم immunohistochemistry يعطي نتائج مماثلة. والشيء المهم هو الاحتفاظ الرطوبة في المربع بها بما في ذلك ورقات تصفية الرطب طوال فترة الإجراءات.
هناك قيد في هذا الإجراء. في الوقت الراهن، ليس مجديا لأداء متعدد الألوان العلامات في نفس الشريحة الأنسجة. وهكذا، يمكن فقط استخدام تحقيقات مختلفة في أقسام مختلفة، ويوجد قطع. للحصول على قيم دقيقة في هذه المبادرة، أنها حاسمة لضمان أن وقت الحضانة مسبار التهجين، تضخيم الإشارات والكشف هو نفسه بالنسبة لكل قسم الأنسجة. في المستقبل، استخدام المسابير متعدد الألوان في نفس الشريحة الأنسجة، كما تستخدم في إجراءات رناسكوبي، سيكون تنفيذ مرغوب فيه للغاية.
ايش الجيش الملكي النيبالي الموصوفة في هذا التقرير يوفر أداة قوية جديدة لتحليل كمي كتعبير الأنماط في الموقع. يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا لدراسة العديد من exons البديلة. في تقرير صدر مؤخرا، استخدمت بنجاح لدراسة أنماط التعبير التفاضلية من ErbB4 أربعة الربط إيسوفورمس في الخلايا العصبية و oligodendrocytes في القرار الخلوية20. كما هو موضح في هذا المجال والعديد من التقارير الأخرى، سيكون مزيج من "باسيسكوبي الجيش الملكي النيبالي العش" مع immunochemistry نهج قوية لدراسة الترجمة والدالة isoforms الربط خلطات المعلنة6،20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "جمعية القلب الأمريكية" [معونات 0365274B إلى H.L.]، المعهد الوطني للسرطان [بوغ غي P50CA150964 إلى Z.W.]، "المعاهد الوطنية للصحة" [مكتب للبحوث البنية التحتية المشتركة الأجهزة منحة S10RR031845 إلى مجهرية الخفيفة التصوير مرفق في جامعة الاحتياطي الغربية حالة]، ومجلس المنح الدراسية الصيني [على X.G.].
يشكر المؤلفون ريتشارد لي في "صميم التصوير الضوء الفحص المجهري" لمساعدته مع الشريحة المسح الضوئي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
