Summary
È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.
Abstract
Splicing alternativo (AS) si verifica in oltre il 90% dei geni umani. Il pattern di espressione di un esone alternativamente impiombato spesso è regolato in modo specifico del tipo di cella. COME espressione di modelli in genere vengono analizzati mediante RT-PCR e RNA-seq utilizzando campioni di RNA isolato da una popolazione di cellule. In situ esame di come modelli di espressione per una particolare struttura biologica può essere effettuato da RNA in situ di ibridazione (ISH) usando le sonde essone-specific. Tuttavia, questo uso particolare di ISH è stato limitato poiché esoni alternativi sono generalmente troppo brevi per la progettazione di sonde essone-specific. In questo rapporto, l'uso di BaseScope, una tecnologia sviluppata di recente che si avvale di corti oligonucleotidi antisenso in RNA ISH, è descritto per analizzare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. Esone 23a di neurofibromatosi di tipo 1 (Nf1) viene utilizzato come esempio per illustrare che sonde di giunzione esone-esone breve mostrano segnali di ibridazione robusto con elevata specificità nell'analisi di RNA ISH su sezioni di cervello di topo. Ancora più importante, i segnali rilevati con sonde specifiche inclusione e saltando essone utilizzabile per calcolare in modo affidabile la percentuale impiombata in valori di Nf1 esone 23a espressione in diverse aree anatomiche di un cervello di topo. Il protocollo sperimentale e metodo di calcolo per analisi sono presentati. I risultati indicano che BaseScope fornisce un nuovo e potente strumento per valutare come espressione modelli in situ.
Introduction
Splicing alternativo (AS) è un processo comune che si verifica durante la maturazione del pre-mRNA. In questo processo, un esone possa essere incluse differenzialmente nel mRNA maturo. Così, attraverso AS, un gene può generare molti mRNA che codificano per prodotti proteici differenti. Si stima che 92 – 94% dei geni umani sottoposti a1,d'impionbatura alternativa2. Modelli di splicing alternativo che anormale è derivato da mutazioni genetiche sono state collegate a un gran numero di malattie, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, la distrofia miotonica e cancro3,4. È dunque fondamentale per studiare e comprendere meglio i meccanismi regolatori d'impionbatura alternative nel tentativo di trovare nuovi trattamenti delle malattie umane.
COME spesso è regolata in modo specifico del tipo di cella. È importante determinare il pattern di espressione AS di un gene specifico in un determinato sistema biologico. Tuttavia, questo diventa complicato quando un organo complesso che contiene molti tipi diversi di cellule, come il cervello o del cuore, è studiato. In questo caso, la scelta ideale del sistema di dosaggio è RNA in situ ibridazione (ISH usando il tessuto) sezioni così il modello di espressione AS di un gene specifico può essere rilevato in molti tipi cellulari contemporaneamente. Infatti, sonde essone-specific sono stati utilizzati per valutare i livelli di espressione di un'alternativa dell'essone5,6,7. Tuttavia, questo approccio non è adatto come analisi di modelli per i seguenti motivi. Primi, ISH i metodi convenzionali di solito uso sonde più di 300 bp, mentre la dimensione media degli esoni interni dei vertebrati (non primo o l'ultimo esone) è di 170 nucleotidi8,9. In secondo luogo, quando una sonda essone-specific è utilizzata per esaminare il pattern d'impionbatura di un esone alternativo interno, la sola isoforma di mRNA rilevata dalla sonda è quello che contiene l'esone, mentre l'isoforma di mRNA senza l'esone non può essere rilevato. Così, il calcolo della percentuale impiombata nel rapporto (PSI) dell'esone alternativo è complicato. Inoltre, ISH fluorescenti convenzionali spesso combina ISH con immunostaining, che riduce l'efficienza di rivelazione e la robustezza. Ad esempio, in uno studio che ha analizzato l'indotta da stress splicing isoforma di commutazione dell'acetilcolinesterasi (AChE) mRNA, digossigenina fu incorporata la sonda ISH e rilevato usando l'anticorpo anti-digossigenina. In alternativa, la sonda marcata con biotina è stato rilevato da un coniugato di fosfatasi alcalina/streptavidina e un substrato per la fosfatasi alcalina10. Nessun metodo utilizza qualsiasi strategia di amplificazione per aumentare la sensibilità di rilevazione. Di conseguenza, è difficile da rilevare trascritti di mRNA che sono espressi a livelli bassi. Così, un sistema di dosaggio più semplice e più affidabile di ISH è necessario analizzare come espressione modelli in situ.
BaseScope recentemente è stato sviluppato sulla base della piattaforma di RNAscope, una consolidata e ampiamente usato sistema di dosaggio ISH. Entrambi i sistemi di analisi utilizzano una tecnologia di amplificazione specifica della destinazione che aumenta la sensibilità di rilevazione11,12. Ciò che distingue uno da altro è la lunghezza della sequenza di destinazione, che è più breve 50 nucleotidi per BaseScope e 300 – 1.000 nucleotidi per RNAscope. Così, è possibile per le sonde di progettazione destinati a giunzioni esone-esone per rilevare specifiche isoforme di mRNA alternativi. Nello studio corrente, è stata predisposta una procedura per esaminare come modelli di espressione di neurofibromatosi tipo 1 (Nf1) esone 23a, un esone alternativo ampiamente studiato nel laboratorio stesso13,14,15 , 16 , 17, nelle sezioni del cervello del mouse. I risultati dimostrano che BaseScope è un sistema ideale per studiare i modelli di espressione di Nf1 esone 23a in situ. Come questo sistema di dosaggio può essere adattato per analizzare come i modelli di espressione degli esoni alternativi molti, rappresenta un nuovo e potente strumento negli studi di As.
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Protocol
Tutti gli esperimenti descritti qui che coinvolgono i topi sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali con istituzionale Case Western Reserve University. Il titolo del protocollo 2016-0068 (PI: Hua Lou) è il "Ruolo di impionbatura alternativo pre-mRNA in vertebrate development".
Nota: Le informazioni di tutte le attrezzature, reagenti e materiali di consumo utilizzati nel presente protocollo sono incluso nella Tabella materiali.
1. preparare la formalina fisso paraffina (FFPE) sezioni incorporate
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Eutanasia 1 CD1 ed 1 mouse C57BL/6J di dislocazione cervicale. Accuratamente tagliato aperto il cranio con forbici e pinze. Rimuovere il cervello con una paletta.
Nota: topo maschio di 5 mesi CD1 e topi maschii di C57BL/6J 3 mesi sono stati utilizzati e ha mostrati risultati simili.- Lavare il cervello con PBS. Riparare il cervello con una soluzione contenente formalina al 10% a temperatura ambiente (TA) per 30 h mettendo l'intero cervello in 50 mL di soluzione di formalina.
- Modificare la soluzione di fissaggio in PBS e incubare il cervello in PBS durante la notte a 4 ° C. Disidratare e incorporare il cervello con xilene e paraffina utilizzando le procedure standard18.
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Utilizzare un microtomo per tagliare il tessuto incorporato in 5 sezioni di µm. Mettere il nastro di paraffina a bagnomaria RT prima e poi in un bagno di acqua 45 ° C per diffondere la barra multifunzione.
- Quando scompaiono le rughe e le pieghe sulla barra multifunzione, montare immediatamente sezioni sulle lastre di vetro. Aria secche diapositive durante la notte alle diapositive RT. cuocere per 1 h a 60 ° C prima dell'uso.
2. pretrattamento del campione
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Deparaffinizzare sezioni di tessuto. Eseguire questi passaggi in una cappa aspirante.
- Riempire due piatti di lavaggio (Figura 1A) con 250 mL di xilene fresco e due con 250 mL di etanolo al 100%. Inserire le diapositive del tessuto in un lavaggio rack (Figura 1A) e posto il lavaggio cremagliera a lavare i piatti dopo la data di ordine e incubazione indicata nella tabella 1.
- Durante ciascuna incubazione, sollevate il vassoio di lavaggio su e giù più di 3 volte nel piatto lavaggio. Dopo ciascuna incubazione, spostare rapidamente il rack di lavaggio nel piatto successivo lavaggio per evitare che le sezioni di tessuto dall'asciugarsi.
- Dopo aver completato le fasi di incubazione, togliere la rastrelliera di lavaggio con scivoli dal piatto di lavaggio. Mettere la griglia in un incubatore a 60 ° C per 5 minuti o fino a quando le diapositive siano completamente asciutte.
- Disegnare una 0,75 '' x 0.75 ' barriera che circonda la sezione di tessuto con una penna di barriera idrofoba. Aria secca la barriera per 3 minuti a TA.
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Pretrattare fette
- Preparare i reagenti e le attrezzature
- Accendere il forno di ibridazione (Figura 1B) e impostare la temperatura a 40 ° C 30 min prima dell'uso.
- Bagnare completamente la carta umidificazione (Figura 1E) con acqua distillata e metterlo nel vassoio di controllo umidità (Figura 1, sinistra). Tenere il vassoio di controllo di umidità nel forno ibridazione.
- Preparare 700 mL di 1x fresca destinazione recupero reagenti aggiungendo 630 mL di dH2O a 70 mL di 10 x destinazione recupero dei reagenti.
- Applicare il perossido di idrogeno.
- Mettere le diapositive Sparaffinatura in panchina. Aggiungere 5-8 gocce di perossido di idrogeno a una sezione da ricoprire completamente il tessuto. Incubare per 10 min a RT.
- Toccare le diapositive su un pezzo di carta assorbente per rimuovere la soluzione di perossido di idrogeno, una diapositiva alla volta. Immediatamente inserire la diapositiva in un rack di lavaggio e spostare il rack in un piatto di lavaggio riempito di dH2O.
- Lavare i vetrini spostando il rack su e giù in acqua distillata per 3 – 5 volte. Spostare il rack di lavaggio in un piatto di lavaggio riempito con acqua distillata e lavare una volta di più.
- Eseguire il recupero di destinazione
- Posizionare un bicchiere di vetro di 1.000 mL su un piatto caldo. Aggiungere 700 mL di 1x fresca destinazione recupero reagenti nel becher e coprirlo con un foglio. Inserire un termometro nel becher attraverso la pellicola di copertura (Figura 1). Accendere la piastra e impostato su high per 10 – 15 min.
- Quando la temperatura dei reagenti di recupero raggiunge 98 ° C, è possibile passare il controllo della temperatura della piastra riscaldante da alta a bassa per mantenere un lieve bollore. Non bollire più di 15 min.
- Nel frattempo, attenzione aprire la pellicola e mettere la griglia di lavaggio con fette dentro il reggente di recupero. Coprire il becher nuovamente e incubare per 15 min.
- Uso forcipe per togliere la rastrelliera dal Becher per un piatto di lavaggio riempita con 200 mL di dH2O e risciacquare per 15 s.
- Spostare il rack in un piatto di lavaggio contenente etanolo al 100% e lasciate riposare per 3 minuti togliere i vetrini e farli asciugare in un incubatore a 60 ° C per 10 min.
- Applicare proteasi III
- Porre i vetrini sul rack macchia (Figura 1, destra). Aggiungere 5 gocce di proteasi III per coprire il tessuto. Accuratamente messo il rack nella barra di controllo umidità (Figura 1, sinistra) e inserire il vassoio del forno di ibridazione di 40 ° C. Incubare per 30 min.
- Rimuovere il portavetrini e rimettere il vassoio nel forno. Toccare le diapositive per rimuovere il liquido in eccesso, una diapositiva alla volta. Inserire la diapositiva in un rack di lavaggio e posizionare la cremagliera in un piatto di lavaggio riempita di dH2O. spostare il rack su e giù per lavare i vetrini per 3 - 5 volte.
- Preparare i reagenti e le attrezzature
3. ISH Assay
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Preparare i materiali
- Pre-riscaldare 50 x tampone di lavaggio in un incubatore a 40 ° C per 20 min. Mix 2,94 L di dH2O e 60 mL di 50 x tampone di lavaggio per fare il tampone di lavaggio 1X.
- Preparare soluzione colorazione ematossilina al 50% con l'aggiunta di 100 mL di ematossilina di Gill I per 100 mL di dH2O. Prepare 0,02% (p/v) ammoniaca acqua aggiungendo 1,43 mL di idrossido di ammonio N 1 a 250 mL di dH2O. Mix bene in un contenitore.
- Mettere le sonde e AMP 0 – 6 reagenti a RT 30 min prima dell'uso. Tenere il vassoio di controllo di umidità nel forno di ibridazione di 40 ° C.
-
Procedura di ISH
Nota: Per esaminare l'espressione di Nf1 isoforme di splicing e calcolare la percentuale impiombata in valore (PSI) per esone 23a, tre diverse sonde ISH destinati a esone 23a-incluso isoforma, esone 23a-escluso isoforma o entrambe le isoforme sono usati (Figura 2 ). Le sonde sono usate su sezioni di tessuto adiacenti taglio. Per garantire la precisione del calcolo, è fondamentale che le sezioni di tre tessuto sono trattate esattamente lo stesso nei passaggi di rilevamento segnale, amplificazione e ibridazione.- Sonda di ibridazione.
- Rimuovere le diapositive dal rack lavaggio e toccare il liquido in eccesso dalle diapositive. Porre i vetrini in rack macchia.
- Utilizzare una matita per marcare i vetrini con il nome di sonda. Mettere le diapositive di tessuto di cervello adiacenti taglio tre per essere ibridate insieme con tre diverse sonde di Nf1 (Figura 2). Eseguire i passaggi successivi nello stesso ordine delle diapositive.
- Aggiungere 4 gocce di sonda per coprire il tessuto. Fare questa una diapositiva alla volta per evitare che le sezioni dall'asciugarsi. Mettere la griglia di macchia nella barra di controllo di umidità e inserirla nel forno a 40 ° C per 2 h.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio. Per ogni lavaggio, riempire il piatto di colorazione con 200 mL di tampone di lavaggio 1X e un rack di lavaggio in esso. Toccare il liquido in eccesso in una diapositiva di un tovagliolo di carta alla volta e inserire rapidamente nel rack lavaggio. Muoversi su e giù il portavetrini nel piatto per 3 – 5 volte per 2 minuti a TA.
- Per il secondo lavaggio, utilizzare il tampone di lavaggio fresco.
- Amplificazione del segnale.
- Toccare il tampone di lavaggio in eccesso dalle diapositive e metterli nel rack macchia. Aggiungere 4 gocce di AMP 0 per coprire il tessuto. Mettere la griglia di macchia nella barra di controllo di umidità e inserirlo nel forno per 30 min a 40 ° C.
- Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio, come descritto in precedenza.
- Ripetere questo passaggio con AMP 1 – 6 seguendo l'ordine e la condizione della tabella 2. Lavare i vetrini due volte dopo ogni passaggio di ibridazione.
- Rilevamento del segnale
- Toccare il tampone di lavaggio in eccesso dalle diapositive e metterli nel rack di macchia. Aggiungere 2 µ l di Fast Red B a 120 µ l di Fast Red (diluizione 1: 60) in un tubo del microcentrifuge. Mescolare bene e aggiungere per coprire completamente la sezione del tessuto.
Nota: Il volume totale del rosso A / B mix si basa sul numero e le dimensioni delle sezioni del tessuto. Per una 0,75 '' x 0.75 ' zona, 120 µ l è sufficiente per una sezione. Utilizzare l'impasto entro 5 min ed evitare l'esposizione del mix alla luce diretta del sole o alla luce UV. - Chiudere il vassoio e incubare per 10 min a RT. Remove la soluzione a un contenitore per rifiuti e immediatamente inserire le diapositive in un rack di lavaggio e mettere la griglia in un piatto di lavaggio riempito con acqua di rubinetto. Risciacquare con acqua fresca di rubinetto.
- Toccare il tampone di lavaggio in eccesso dalle diapositive e metterli nel rack di macchia. Aggiungere 2 µ l di Fast Red B a 120 µ l di Fast Red (diluizione 1: 60) in un tubo del microcentrifuge. Mescolare bene e aggiungere per coprire completamente la sezione del tessuto.
- Sonda di ibridazione.
-
Colorazione di contrasto delle diapositive
- Estrarre il cestello di lavaggio da acqua di rubinetto e toccare rapidamente su carta assorbente per togliere l'acqua in eccesso. Inserite la griglia in un 50% ematossilina soluzione di colorazione e immediatamente spostare il rack su e giù più volte. Incubare per 2 minuti a TA.
- Trasferire il portavetrini nuovamente dentro il piatto di acqua del rubinetto. Lavare 3 – 5 volte spostando su e giù il rack e cambiando l'acqua fresca del rubinetto fino a quando le diapositive diventano chiare, mentre i tessuti di cervello rimangono viola.
- Spostare il rack in un recipiente contenente acqua ammoniaca 0,02%. Spostare il rack su e giù 2 – 3 volte fino a quando i tessuti diventano blu. Lavare i vetrini 3 – 5 volte con acqua fresca di rubinetto in un piatto di colorazione.
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Montaggio dei campioni
- Spostare il portavetrini dal piatto di colorazione in un incubatore a 60 ° C ed incubare per almeno 15 min fino a quando le diapositive sono completamente asciutte.
- Posto 40 µ l di soluzione di montaggio sulla diapositiva e attentamente porre un coprivetrino 24 x 50 mm sopra la sezione del tessuto. Aria secche diapositive per 30 minuti a TA.
4. analisi e raccolta dati
Nota: Utilizzare un scanner per diapositive per la scansione delle immagini a 40 ingrandimenti.
-
Controlli positivi e negativi
- Per ogni esperimento, includono controlli positivi e negativi (Figura 3). Come un buon controllo positivo, il segnale dovrebbe essere visibile come punctate punti 20-40 ingrandimenti.
- Uso del Mouse (Mm) 1ZZ - PPIB - come controllo positivo. Questa sonda è destinato un comune gene housekeeping PPIB. Per il controllo negativo, un punto per ogni 20 celle visualizzazione sfondo colorazione al campo di 20 X microscopio è accettabile.
- Utilizzare la sonda DapB-1ZZ come controllo negativo. Questa sonda è destinato il gene batterico dapB. Queste sonde di controllo sono state utilizzate in molti ISH saggi19.
-
Rilevamento del segnale e l'analisi di come i modelli di espressione di Nf1 esone 23a
- Come i segnali di ibridazione sono indicati come puntini punctate, contare i puntini manualmente. Il numero di punti è correlato con il livello delle trascrizioni che viene rilevato da una sonda specifica. Si noti che il numero di punti possa anche essere analizzato dal software di ImageJ o SpotStudio.
- Utilizzare tre sonde per ibridare ad esone 23a-contenenti, esone 23a-carente isoforme o trascrizioni di Nf1 totale (Figura 2). Le tre sonde non possono essere utilizzati contemporaneamente, è possibile utilizzare tre sezioni di tessuto cerebrale adiacente per ibridare ad ogni sonda.
- Per calcolare la percentuale impiombato in (PSI) per esone 23a, contare il numero di cellule e puntini in parecchie regioni del cervello. Per ogni area di interesse, contano più di 400 celle da diverse sub-regioni come indicato nella Figura 4.
- Raccogliere dati dalla stesse sub-regioni per ognuna delle tre sonde. Calcolare PSI come numero di punti per cella con la sonda di inclusione dell'esone 23a / (numero di punti per cella con la sonda l'inclusione dell'esone 23a + numero del puntino per cella con la exon23a saltando sonda) x 100%.
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Representative Results
BaseScope ISH è stata effettuata utilizzando tre diversi ceppi di topi: topi wild type CD1, topi wild type C57BL/6J e Nf123aIN/23aIN topi mutanti in background C57BL/6J, nel quale esone 23a è incluso in tutti i tipi di cellule come conseguenza di engineered della giuntura le mutazioni14,15.
Come primo passo, il sistema di analisi ISH è stato testato utilizzando reagenti società ha fornito: sonde ISH di diapositive che hanno cellule 3T3 e negativo e positivo. Come mostrato nella Figura 3, è stato rilevato alcun segnale quando la sonda di controllo negativo è stata utilizzata, mentre molti puntini punctate sono stati rilevati quando la sonda di controllo positivo è stata utilizzata.
Successivamente, ISH è stata effettuata utilizzando sezioni di cervello di topo e Nf1-sonde specifiche che sono progettate per rilevare le trascrizioni di Nf1 che contengono esone 23a, saltare esone 23a o entrambe le isoforme (Figura 2). Queste sonde di destinazione giunzioni esone-esone specifico. Due regioni del cervello sono state selezionate per esaminare il pattern di espressione AS di Nf1 esone 23a: corteccia e nell'ippocampo CA3 (Figura 4). Per ogni regione, conta tre sub-regioni, come indicato nella Figura 4, registrazione di numeri di cellulare e di dot. Per ogni regione, circa 400 celle sono stati contati in totale e utilizzate per calcolare la percentuale di punti/cella. Il modello di espressione AS per Nf1 esone 23a è calcolato come PSI.
ISH segnali ottenuti con le tre sonde di Nf1 in corteccia ed ippocampo dei topi CD1 sono mostrati in Figura 5A-5F e tabella 3. La regione di corteccia da C57BL/6J Nf1+ + e topi Nf123aIN/23aIN è stato anche analizzato (Figura 6).
Il risultato di questi esperimenti ha portato a conclusioni diverse. Prima di tutto, la somma dei segnali, mostrato come puntini/cella, rilevato da esone 23a sonde specifiche saltando e inclusione uguale a quella rilevata dalla sonda di ibridazione per entrambe le isoforme (tabella 3), che suggerisce che le tre sonde ibridate con la NF1 trascrizioni con efficienza simile. In secondo luogo, il valore PSI dell'esone 23a nella corteccia, 10%, è coerente con il risultato di RT-PCR precedentemente segnalato, in cui la corteccia è stata sezionata dal cervello di topo adulto C57BL/6J seguito da isolamento di RNA totale e RT-PCR analisi14,15. Questo risultato suggerisce che l'ISH BaseScope può essere utilizzato per analizzare quantitativamente come modelli di espressione oltre ai livelli di trascrizione in sezioni di tessuto. In terzo luogo, i risultati ottenuti con i tessuti di cervello mutante di Nf123aIN/23aIN , in cui tutte le trascrizioni di Nf1 contengono esone 23a14,15, hanno mostrato i livelli simili di segnali quando l'inclusione specifici e Nf1 totale sonde sono state usate e nessun segnale quando sonda saltando-specific è stato utilizzato (Figura 6), che indica che le due sonde targeting l'inclusione dell'esone o saltando sono altamente specifiche.
Figura 1: apparecchiatura usata in ISH. (A) piatto di lavaggio e di lavaggio rack. (B) forno di ibridazione. (C) set di Becher e piastra calda di recupero di destinazione. (D) umidità di controllo vassoio e macchia rack. (E) carta di umidificazione indicato da una freccia rossa all'interno del vassoio di controllo di umidità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sonde utilizzate per rilevare Nf1 esone 23a come modelli di espressione. Tutte le sonde contengono un oligonucleotide di coppia ZZ. La sonda di inclusione specifici (rosso) si rivolge all'incrocio degli esoni 23a e 24, la sonda di saltare-specific (verde) è destinato all'incrocio degli esoni 23 e 24, e la sonda totale di Nf1 (blu) destinato all'incrocio degli esoni 26 e 27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: ISH utilizzando (A-B) negativa e positiva (C-D) controlli sulle cellule 3T3. Un vetrino di controllo contenente cellule 3T3 è stato elaborato attraverso passaggi 2 (pretrattamento del campione) e 3 (procedura di ISH) nel protocollo. Segnali positivi vengono visualizzati come punti punctati rossi indicati dalle frecce rosse. B e D sono ingrandito immagini di A e C, rispettivamente. Barra della scala = 20 µm (A e C); 5 µm (B e D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: foto di una sezione coronale del cervello di topo. Le caselle rosse indicano le aree selezionate per il conteggio dei numeri di cellulare e segnale nella corteccia e nell'ippocampo regioni CA3. Barra della scala = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Segnali di RNA ISH rilevati utilizzando Nf1-mouse e sonde specifiche sezioni del cervello. CD1 cervelli sono stati elaborati attraverso passaggi 1-4 nel protocollo. Puntini rossi punctate indicano positivo segnala quando i tre Nf1-vengono utilizzate sonde specifiche (illustrate nella Figura 3). Corteccia (A-C) e l'ippocampo (D-F) vengono visualizzati. NF1 sonda totale è stata usata nella A e D, sonda di inclusione-specific in B ed E e sonda di saltare-specific in C e F. scala bar = 40 µm (A-C); 400 µm (D-F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: RNA ISH segnali rilevati Nf1+ + e sezioni del cervello di Nf123aIN/23aIN . Entrambi i ceppi del mouse sono in background C57BL/6J. I cervelli sono stati elaborati attraverso passaggi 1-4 nel protocollo. A-C. Nf1+ + corteccia. D-F. Corteccia di NF123aIN/23aIN . Totale sonda NF1 è stata usata nella A e D, sonda di inclusione-specific in B ed E e sonda di saltare-specific in C e F. scala bar = 40 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ordine di incubazione | Prodotti chimici in TT piatto | Tempo |
| 1 | 250 mL di xilene | 5 min |
| 2 | 250 mL di xilene | 5 min |
| 3 | 250 mL di etanolo al 100% | 2 min |
| 4 | 250 mL di etanolo al 100% | 2 min |
Tabella 1: Procedura di incubazione del passaggio 2.1.1.
| Soluzione di AMP | Tempo di incubazione | Temperatura di incubazione |
| AMP 1 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 5-ROSSO | 30 min | Temperatura ambiente |
| AMP 6-ROSSO | 15 min | Temperatura ambiente |
Tabella 2: Segnale procedura di amplificazione del punto 3.2.2.
| Regione | saltare | inclusione | salto + inclusione | totale | PSI |
| corteccia | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5,56 | 5,65 | 3,71 |
Tabella 3: RNA ISH risultati calcolati dall'immagine mostrata nella Figura 5. I numeri, indicati in puntini/cella, sono stati calcolati usando più di 400 celle incluse in tre sottoregioni nella corteccia e CA3 (Figura 4). Gli errori standard sono inclusi.
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Discussion
La presente comunicazione illustra l'uso di BaseScope RNA ISH per esaminare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. È dimostrato che giunzione esone-esone anti-senso sonde inferiore 50 nucleotidi possono indirizzare l'inclusione dell'esone e saltando le isoforme robustamente e specificamente. Inoltre, i segnali risultanti possono essere utilizzati per calcolare PSI di un esone alternativo.
Alcune variazioni sono state testate nella procedura. Ad esempio, sezioni di tessuto congelato generate dalla divisione di criostato sono state testate e dimostrate di avere successo per l'uso in questo protocollo ISH. In questo caso, tuttavia, il passo di sparaffinatura in 2.1 è stato cambiato al lavaggio di ottobre con PBS per 5 min. Inoltre, anche se è molto conveniente usare il forno di ibridazione fornito da ACD, utilizzo di un semplice incubatore impostata a 40 ° C, combinato con una diapositiva macchiatura vassoio utilizzato per immunoistochimica dà risultati comparabili. La cosa importante è quello di mantenere l'umidità nella finestra includendo carte da filtro bagnate durante tutta la procedura.
C'è una limitazione in questa procedura. Attualmente, non è possibile eseguire multi-colore di etichettatura nella stessa diapositiva del tessuto. Così, diverse sonde possono essere utilizzati solo sulle sezioni adiacenti tagliare, diverse. Per ottenere valori accurati di PSI, è fondamentale per garantire che il tempo di incubazione di ibridazione della sonda, rilevamento e amplificazione del segnale è lo stesso per ogni sezione del tessuto. In futuro, l'impiego di sonde multi-colore di esecuzione nella stessa diapositiva del tessuto, come utilizzati nelle procedure RNAscope, sarà altamente desiderabile.
L'ISH di RNA descritto in questo rapporto fornisce un nuovo e potente strumento per analizzare quantitativamente come espressione modelli in situ. Questa tecnologia può essere applicata per studiare molti esoni alternativi. In un recente rapporto, esso è stato usato con successo per esaminare i modelli di espressione differenziale del ErbB4 quattro isoforme nei neuroni e oligodendrociti cellulari risoluzione20di splicing. Come mostrato in questo e in molti altri rapporti, combinazione di BaseScope RNA ISH con immunochimica sarà un approccio potente per studiare la localizzazione e la funzione del differenzialmente espressi d'impionbatura isoforme6,20.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'associazione americana del cuore [sovvenzione dai 0365274B a H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 a Z.W.], National Institutes of Health [Ufficio di ricerca infrastrutture condivise strumentazione Grant S10RR031845 a la microscopia chiara Imaging Facility presso Case Western Reserve University] e del Consiglio di borsa di studio di Cina [a X.G.].
Gli autori ringraziano Richard Lee nel nucleo Imaging microscopia luce per il suo aiuto con scivolo di scansione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
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