Summary
En i situ hybridisering (ISH) protokoll som använder kort antisense oligonukleotider för att upptäcka alternativa pre-mRNA skarvning mönster i mus hjärnan avsnitten beskrivs.
Abstract
Alternativ splitsning (AS) förekommer hos mer än 90% av mänskliga gener. Det uttryck pattern av ett alternativt skarvade exon regleras ofta i en cell typspecifika mode. SOM uttryck mönster analyseras vanligen av RT-PCR och RNA-seq använder RNA prover isolerade från en population av celler. In situ granskning av som uttrycksmönster för en viss biologisk struktur kan utföras av RNA i situ hybridisering (ISH) använder exon-specifika prober. Denna särskilda användning av ISH har dock begränsats eftersom alternativa exoner är i allmänhet alltför kort för att designa exon-specifika prober. I denna rapport beskrivs användningen av BaseScope, en nyligen utvecklad teknik som sysselsätter kort antisense oligonukleotider i RNA ISH, att analysera som uttrycksmönster i mus hjärnan sektioner. Exon 23a Neurofibromatos typ 1 (Nf1) används som ett exempel för att illustrera att kort exon-exon junction sonder uppvisar robust hybridisering signaler med hög specificitet i RNA ISH analys på mus hjärnan sektioner. Viktigare, kan signaler detekteras med exon integration - och hoppa-specifika sonder användas på ett tillförlitligt sätt beräkna de procent som skarvas i värden för Nf1 exon 23a expression i olika anatomiska områden i en mus hjärna. Experimentellt protokoll och beräkningsmetoden för som analys presenteras. Resultaten tyder på att BaseScope ger ett kraftfullt nya verktyg för att bedöma som uttryck mönster i situ.
Introduction
Alternativ splitsning (AS) är en gemensam process som uppstår under pre-mRNA mognad. I denna process kan ett exon differentially inkluderas i mogen mRNA. Således, AS, en gen kan generera många mRNA den kod för olika proteinprodukter. Det uppskattas att 92 – 94% av mänskliga gener genomgår alternativ splitsning1,2. Onormal alternativ splitsning mönster resulterade från genetiska mutationer har kopplats till ett stort antal sjukdomar, däribland amyotrofisk lateralskleros, internationellt dystrofi och cancer3,4. Således är det viktigt att utreda och bättre förstå alternativ splitsning regleringsmekanismer för att försöka hitta nya behandlingar av sjukdomar hos människor.
SOM regleras ofta i en cell typspecifika mode. Det är viktigt att bestämma AS uttrycksmönstret av en specifik gen i ett givet biologiska system. Men blir detta komplicerat när en komplexa organ som innehåller många olika typer av celler, såsom hjärnan eller hjärtat, studeras. I det här fallet är ett idealiskt val av analyssystem RNA i situ hybridisering (ISH) använda vävnad avsnitten så AS uttrycksmönstret av en specifik gen kan upptäckas i många celltyper samtidigt. Exon-specifika prober har faktiskt använts för att bedöma uttrycksnivåerna för en alternativ exon5,6,7. Men är detta synsätt inte väl lämpad för som mönstret analys av följande skäl. Första, konventionella ISH metoder brukar använda sonder längre än 300 bp, medan den genomsnittliga storleken på ryggradsdjur inre exonerna (inte första eller sista exon) är 170 nukleotider8,9. Andra när en exon-specifika sonden används för att granska mönstret för skarvning av en inre alternativa exon, är den enda mRNA isoform upptäcks av sonden en som innehåller exon, medan den mRNA isoformen utan exon inte kan upptäckas. Således är beräkning av procent skarvas i (PSI) värde för de alternativa exon komplicerade. Dessutom kombinerar konventionella fluorescerande ISH ofta ISH med immunfärgning, vilket minskar den upptäckt effektivitet och tålighet. Till exempel i en studie som undersökte den stressinducerade skarvning isoform växling av acetylkolinesteras (AChE) mRNA, digoxigenin införlivades i ISH sonden och detekteras med hjälp av anti-digoxigenin antikroppar. Alternativt, biotin-märkt sonden upptäcktes av en alkalisk fosfatas/streptividin konjugat och substrat för alkaliskt fosfatas10. Varken metod använder någon förstärkning strategi för att öka känsligheten för upptäckt. Som ett resultat, det svårt för att identifiera mRNA avskrifter som uttrycks på låga nivåer. Således behövs ett enklare och mer robust ISH assay system att analysera som uttryck mönster i situ.
BaseScope har nyligen utvecklats baserat på plattformen av RNAscope, en väletablerad och utsträckning ISH analyssystem. Både analys system anställa en mål-specifik amplifiering teknik som ökar känsligheten för upptäckt11,12. Vad skiljer en från den andra är längden på sekvensen mål, som är så korta som 50 nukleotider för BaseScope och 300 – 1 000 nukleotider för RNAscope. Det är således möjligt att design sonder som är inriktade på exon-exon vägkorsningar att upptäcka särskilda alternativ mRNA isoformer. I den aktuella studien inrättades ett förfarande för att undersöka som uttrycksmönster av Neurofibromatos typ 1 (Nf1) exon 23a, en alternativ exon flitigt studerade i samma laboratorium13,14,15 , 16 , 17, i mus hjärnan sektioner. Resultaten visar att BaseScope är ett idealiskt system att studera uttrycksmönster av Nf1 exon 23a i situ. Eftersom detta test system kan anpassas till analysera som uttrycksmönster för många alternativa exoner, utgör det ett kraftfullt nya verktyg i studierna av AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla de experiment som beskrivs här som involverar möss har godkänts av fall Western Reserve University institutionella djur vård och användning kommittén. Titeln av protokollet 2016-0068 (PI: Hua Lou) är ”roll alternativa pre-mRNA splicing i ryggradsdjur utveckling”.
Obs: Information av alla utrustning, reagenser och material som används i detta protokoll ingår i Tabell för material.
1. Förbered Formalin fast Paraffin inbäddat (FFPE) sektioner
-
Avliva 1 CD1 mus och 1 C57BL/6J mus av cervikal dislokation. Skär försiktigt öppna skallen med kirurgisk sax och pincett. Ta bort hjärnan med en skopa.
Obs: 5-månad-gammal CD1 hanmöss och 3-månad-gammal C57BL/6J manliga möss användes och visade liknande resultat.- Tvätta hjärnan med PBS. Fixa hela hjärnan med en lösning innehållande 10% formalin i rumstemperatur (RT) i 30 h genom att sätta hela hjärnan i 50 mL formalin lösningen.
- Ändra den rätta lösningen till PBS och inkubera hjärnan i PBS över natten vid 4 ° C. Torkar och bädda in hjärnan med xylen och paraffin använder standardprocedurerna18.
-
Använd en mikrotom för att skära inbäddade vävnad i 5 µm sektioner. Sätta i paraffin menyfliksområdet i RT vattenbad först och sedan i en 45 ° C vattenbad att sprida i menyfliksområdet.
- När rynkor och veck i menyfliksområdet försvinner, omedelbart montera sektioner på glasskivor. Luften torr diabilder övernattning på RT. baka bilder för 1 h vid 60 ° C före användning.
2. prov förbehandling
-
Deparaffinize vävnadssnitt. Utför stegen i ett dragskåp.
- Fyll två diska (figur 1A) med 250 mL färsk xylen och två med 250 mL 100% etanol. Infoga vävnad bilder i en tvätt rack (figur 1A) och plats tvätten rack i diska efter ordning och inkubation tiden anges i tabell 1.
- Under varje inkubation, lyft tvätt rack upp och ner mer än 3 gånger i tvätt skålen. Efter varje inkubation, flytta snabbt tvätt racket i nästa tvätt skålen att förhindra vävnadssnitt från att torka ut.
- Efter inkubation stegen, ta bort tvätta skålen tvätt racket med rutschkanor. Placera racket i en 60 ° C inkubator för 5 min eller tills bilderna är helt torr.
- Rita ett 0,75 '' x 0,75 '' hinder kring avsnittet vävnad med en hydrofoba barriär penna. Lufttorka barriären för 3 min vid RT.
-
Förbehandla skivor
- Förbereda reagenser och utrustning
- Slå på hybridisering ugnen (figur 1B) och Ställ in temperaturen till 40 ° C 30 min innan användning.
- Blöt befuktning papper (figur 1E) med destillerat vatten helt och lägga den i luftfuktighet kontroll facket (figur 1 d, vänster). Håll luftfuktigheten kontroll facket i hybridisering ugnen.
- Förbereda 700 mL färsk 1 x mål hämtning reagenser genom att lägga till 630 mL dH2O 70 mL 10 x mål hämtning reagenser.
- Tillämpa väteperoxid.
- Sätta deparaffinized bilder på bänken. Tillsätt 5 – 8 droppar väteperoxid till ett avsnitt för att helt täcka vävnaden. Inkubera i 10 min vid RT.
- Tryck på bilderna på ett absorberande papper att ta bort Väteperoxidlösning, en bild i taget. Omedelbart infoga bilden i ett rack som tvätt och flytta racket till en tvätt skål fylld med dH2O.
- Tvätta bilderna genom att flytta racket upp och ner i destillerat vatten för 3 – 5 gånger. Flytta tvätt racket till en tvätt skål fylld med färsk destillerat vatten och tvätta bilder en gång.
- Utföra målet hämtning
- Placera en 1 000 mL-glasbägare på en värmeplatta. Lägg till 700 mL färsk 1 x mål hämtning reagenser till bägaren och täck den med folie. Sätt en termometer i bägaren genom locket folie (figur 1 c). Slå på värmeplattan och Ställ in på hög i 10 – 15 min.
- När temperaturen i hämtning reagenser når 98 ° C, växla temperaturkontroll av värmeplattan från högt till lågt för att upprätthålla en mild koka. Koka inte mer än 15 min.
- Samtidigt försiktigt öppna folien och sätta tvätt racket med skivor inuti hämtning regent. Täck bägaren igen och inkubera i 15 min.
- Använd tången att ta bort racket från bägaren till en tvätt maträtt fylld med 200 mL av dH2O och skölj för 15 s.
- Flytta racket till en tvätt maträtt som innehåller 100% färska etanol och låt sitta för 3 min. ta bort bilder och torka dem i en inkubator på 60 ° C i 10 min.
- Tillämpa proteas III
- Placera glasen på fläcken racket (figur 1 d, höger). Tillsätt 5 droppar proteas III att täcka vävnaden. Försiktigt sätta racket i luftfuktighet kontroll facket (figur 1 d, vänster) och sätt in magasinet i 40 ° C hybridisering ugnen. Inkubera i 30 min.
- Ta bort objektglashållaren och sätta brickan tillbaka in i ugnen. Tryck på bilderna för att ta bort överflödig vätska, en bild i taget. Infoga bilden i en tvätt rack och plats racket i en tvätt skål fylld med dH2O. flytta racket upp och ner för att tvätta bilderna för 3 - 5 gånger.
- Förbereda reagenser och utrustning
3. ISH Assay
-
Förbereda material
- Pre varm 50 x Tvättbuffert i en 40 ° C inkubator för 20 min. blanda 2,94 L dH2O och 60 mL 50 x Tvättbuffert göra 1 x tvättbuffert.
- Förbereda 50% Hematoxylin färglösningen genom att tillsätta 100 mL Gills hematoxylin jag till 100 mL med dH2O. förbereda 0,02% (w/v) ammoniak vatten genom att lägga till 1,43 mL 1 N ammoniumhydroxid till 250 mL dH2O. Mix väl i en behållare.
- Sonder och AMP 0 – 6 reagens vid RT 30 min innan användning. Håll luftfuktigheten kontroll facket i 40 ° C hybridisering ugnen.
-
ISH förfarande
Observera: För att undersöka uttrycket av den Nf1 skarvning isoformer och beräknar den procent som skarvas i (PSI) värde för exon 23a, tre olika ISH sonder som är inriktade på exon 23a-ingår isoform, exon 23a-uteslutna isoform eller båda isoformer är används (figur 2 ). Sonderna används på angränsande skär vävnadssnitt. För att säkerställa noggrannheten i beräkningen, är det viktigt att de tre vävnadssnitt behandlas exakt samma i hybridisering, amplifiering och signal upptäckt steg.- PROBE hybridisering.
- Ta bort bilderna från tvätt rack och knacka av överflödig vätska från glasen. Placera glasen i fläcken rack.
- Använd en penna för att märka bilderna med namnet sonden. Lägg tre angränsande skär hjärnans vävnad bilderna ska vara hybridiseras med tre olika Nf1 sonder (figur 2) tillsammans. Genomföra efterföljande steg i samma ordning på bilderna.
- Tillsätt 4 droppar av sonden att täcka vävnaden. Gör här en bild på en tid för att förhindra avsnitten från att torka ut. Placera den fläck racket i luftfuktighet kontroll facket och sätt in den i ugnen 40 ° C i 2 h.
- Tvätta bilderna två gånger med tvätt buffert. För varje tvätt, Fyll färgning skålen med 200 mL 1 x Tvättbuffert och placera en tvätt rack i den. Tryck på överflödig vätska på en papper handduk en bild i taget och snabbt in den i tvätt racket. Flytta objektglashållaren upp och ner i skålen för 3 – 5 gånger under 2 minuter vid RT.
- För den andra tvätten, Använd färska tvättbuffert.
- Signalerar förstärkning.
- Tryck överflödigt tvättbuffert från glasen och placera dem i fläcken rack. Tillsätt 4 droppar AMP 0 att täcka vävnaden. Placera den fläck racket i luftfuktighet kontroll facket och sätt in den i ugnen i 30 min vid 40 ° C.
- Tvätta bilderna två gånger med tvätt buffert som beskrivs ovan.
- Upprepa detta steg med AMP 1 – 6 efter ordning och skick i tabell 2. Tvätta bilderna två gånger efter varje hybridisering steg.
- Signaldetektion
- Tryck överflödigt tvättbuffert från glasen och placera dem i fläcken rack. Tillsätt 2 µL snabbt Red B i 120 µL av snabbt Red en (1:60 ratio) i en mikrocentrifug rör. Blanda väl och Lägg till för att helt täcka avsnittet vävnad.
Obs: Den totala volymen av röda A / B mix är baserat på antalet och storleken av vävnadssnitt. För en 0,75 '' x 0,75 '' område är 120 µL tillräckligt för ett avsnitt. Använd blandningen inom 5 min och undvika exponering av mixen för direkt solljus eller UV-ljus. - Stäng facket och inkubera i 10 min vid RT. ta bort lösningen till en avfallsbehållare och omedelbart Infoga bilderna i en tvätt rack och placera racket i en tvätt skål fylld med kranvatten. Skölj igen med färskt kranvatten.
- Tryck överflödigt tvättbuffert från glasen och placera dem i fläcken rack. Tillsätt 2 µL snabbt Red B i 120 µL av snabbt Red en (1:60 ratio) i en mikrocentrifug rör. Blanda väl och Lägg till för att helt täcka avsnittet vävnad.
- PROBE hybridisering.
-
Counterstaining bilder
- Ta bort tvätt racket från kranvatten och tryck snabbt på absorberande papper att ta bort extra vatten. Sätta racket i en 50% hematoxylin färgning lösning och omedelbart flytta racket upp och ner flera gånger. Inkubera i 2 min på RT.
- Över objektglashållaren tillbaka i kranvatten skålen. Tvätta 3 – 5 gånger genom att flytta racket upp och ner och ändra färskt kranvatten tills bilderna blir tydliga, medan hjärnans vävnader förbli lila.
- Flytta racket till en maträtt som innehåller 0,02% ammoniak vatten. Flytta racket upp och ner 2 – 3 gånger tills vävnaderna blir blå. Tvätta bilderna 3 – 5 gånger med färskt kranvatten i en färgning maträtt.
-
Montering av proverna
- Flytta objektglashållaren från färgning skålen till en 60 ° C inkubator och inkubera i minst 15 min tills bilderna är helt torr.
- Placera 40 µL av monteringsmedium på bilden och placera försiktigt en 24 x 50 mm täckglas över avsnittet vävnad. Luften torr diabilder i 30 min på RT.
4. datainsamling och analys
Obs: Använd en diascanner för att skanna in bilderna på 40 X förstoring.
-
Positiva och negativa kontroller
- För varje experiment innehålla positiva och negativa kontroller (figur 3). Som bra positiv kontroll, ska signalen synas som punktuell prickar på 20-40 X förstoring.
- Använda musen (Mm) - PPIB - 1ZZ som positiv kontroll. Denna sond riktar en gemensam städning-gen PPIB. För negativ kontroll är en prick för varje 20 celler visar bakgrunden färgning per 20 X mikroskopfält acceptabelt.
- Använda DapB-1ZZ sonden som en negativ kontroll. Denna sond riktar en bakteriell gen dapB. Dessa kontroll sonder har använts i många ISH analyser19.
-
Signaldetektion och analys av som uttrycksmönster av Nf1 exon 23a
- Hybridisering signaler indikeras som punktuell prickar, räkna prickar manuellt. Antalet punkter är korrelerad med den nivå av avskrifter som detekteras av en specifik sond. Observera att antalet punkter kan även analyseras av ImageJ- eller SpotStudio.
- Använd tre sonder för att hybridisera till exon 23a-innehållande exon 23a-saknar isoformer eller totala Nf1 avskrifter (figur 2). Som de tre sonderna inte kan användas samtidigt, använda tre intilliggande hjärnan vävnadssnitt för att hybridisera till varje sond.
- För att beräkna procent skarvas i (PSI) för exon 23a, räkna antalet celler och prickar i flera hjärnregioner. För varje region av intresse, räkna mer än 400 celler från flera sub-regioner som anges i figur 4.
- Samla in data från samma underregionerna för var och en av de tre sonderna. Beräkna PSI som antal punkter per cell med exon 23a inkludering sond / (antalet punkter per cell med exon 23a inkludering sond + antal dot per cell med exon23a hoppa sond) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BaseScope ISH utfördes med tre mus stammar: CD1 vildtyp möss, C57BL/6J vildtyp möss och Nf123aIN/23aIN muterade möss i C57BL/6J bakgrunden, i vilken exon 23a ingår i alla celltyper som ett resultat av konstruerad splice webbplats mutationer14,15.
Som ett första steg, ISH assay systemet testades med företag lämnade reagens: bilder som har 3T3-celler, och negativ och positiv ISH sonder. I figur 3visas upptäcktes ingen signal när sonden negativ kontroll användes, medan många punktuell prickar upptäcktes när sonden positiv kontroll användes.
Nästa, ISH genomfördes med hjälp av musen hjärnan sektioner och Nf1-särskilda sonder som är utformade för att upptäcka Nf1 avskrifter som innehåller exon 23a, hoppa exon 23a eller båda isoformer (figur 2). Dessa sonder rikta specifika exon-exon korsningar. Två regioner i hjärnan valdes för att undersöka AS uttrycksmönstret för Nf1 exon 23a: hjärnbarken och hippocampus CA3 (figur 4). För varje region, räkna tre underregioner, som anges i figur 4, inspelning både cellen och dot nummer. För varje region, var ungefärligt 400 celler räknas totalt och används för att beräkna förhållandet prickar/cell. Det AS uttryck pattern för Nf1 exon 23a beräknas som PSI.
ISH signaler erhålls med de tre Nf1 sonder i hjärnbarken och hippocampus CD1 möss visas i figur 5A-5F och tabell 3. Cortex regionen från C57BL/6J Nf1+/ + och Nf123aIN/23aIN möss var också analyseras (figur 6).
Resultatet av dessa experiment ledde till flera slutsatser. Första, summan av signaler, visas som prickar/cell, upptäcks av exon 23a inkludering-specifika och hoppa-specifika sonder motsvarar som identifieras av sonden korsa till båda isoformer (tabell 3), vilket tyder på att de tre sonderna hybridiseras med Nf1 avskrifter med liknande effektivitet. Andra är PSI värdet av exon 23a i cortex, 10%, konsekvent med den tidigare rapporterade RT-PCR-resultat, där barken var dissekeras från vuxna C57BL/6J mus hjärnan följt av total RNA isolering och RT-PCR analys14,15. Detta resultat tyder på att BaseScope ISH kan användas att kvantitativt analysera som uttrycksmönster förutom avskrift nivåer i vävnadssnitt. För det tredje, de resultat som erhålls med Nf123aIN/23aIN mutant hjärnan vävnaderna, där alla Nf1 avskrifter innehåller exon 23a14,15, visade liknande nivåer av signaler när inkludering-specifika och Nf1 totala sonder användes och ingen signal när hoppa-specifika sonden användes (figur 6), vilket indikerar att de två sonderna inriktning exon integration eller hoppa över är mycket specifika.
Figur 1: utrustning som används i ISH. (A) tvätta skålen och diska rack. (B) hybridisering ugn. (C) rikta hämtning bägare och värmeplatta set. (D) fuktighet styr facket och fläcken rack. (E) befuktning papper indikeras av en röd pilhuvud inuti luftfuktighet kontroll facket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Sonder används för att upptäcka Nf1 exon 23a som uttrycksmönster. Alla sonderna innehåller en ZZ par oligonukleotiden. Inkludering-specifika sonden (röd) riktar sig till korsningen av exonerna 23a och 24, hoppa-specifika sonden (grön) mål korsningen av exonerna 23 och 24, och Nf1 totala sonden (blå) riktar sig till korsningen av exonerna 26 och 27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ISH använder negativa (A-B) och positiva (C-D) kontroller på 3T3-celler. En kontroll bild som innehåller 3T3-celler bearbetas genom steg 2 (prov förbehandling) och 3 (ISH förfarande) i protokollet. Positiva signaler visas som röda punktuell prickar anges med röda pilar. B och D är inzoomade bilder av A och C, respektive. Skalstapeln = 20 µm (A och C); 5 µm (B och D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bild av en mus hjärnan koronalt avsnitt. De röda rutorna ange de områden som valts för inventering av cellen och signal nummer i hjärnbarken och hippocampus CA3 regioner. Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: RNA ISH signaler detekteras med hjälp av Nf1-särskilda sonder och mus hjärnan sektioner. CD1 hjärnor bearbetades igenom steg 1-4 i protokollet. Röd punktuell Prickarna visar positiva signaler när de tre Nf1-särskilda sonder (visas i figur 3) används. Cortex (A-C) och hippocampus (D-F) visas. NF1 totala sonden användes i A och D, inkludering-specifika sond i B och E, och hoppa-specifika sonden i C och F. skala bar = 40 µm (A-C); 400 µm (D-F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: RNA ISH signaler detekteras i Nf1+/ + Nf123aIN/23aIN hjärnan avsnitten och. Båda mus stammar är i C57BL/6J bakgrunden. Hjärnor bearbetades igenom steg 1-4 i protokollet. A-C. Nf1+/ + cortex. D-F. Nf123aIN/23aIN cortex. Nf1 totala sonden användes i A och D, inkludering-specifika sond i B och E, och hoppa-specifika sonden i C och F. skala bar = 40 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Ordning för inkubation | Kemikalier i TT maträtt | Tid |
| 1 | 250 mL xylen | 5 min |
| 2 | 250 mL xylen | 5 min |
| 3 | 250 mL 100% etanol | 2 min |
| 4 | 250 mL 100% etanol | 2 min |
Tabell 1: Inkubation arbetsordning steg 2.1.1.
| AMP lösning | Inkubationstid | Inkubation temperatur |
| AMP 1 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 5-RÖD | 30 min | Rumstemperatur |
| AMP 6-RÖD | 15 min | Rumstemperatur |
Tabell 2: Signalerar förstärkning arbetsordning steg 3.2.2.
| Region | hoppa över | inkludering | hoppar över + integration | Totalt | PSI |
| cortex | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5,56 | 5,65 | 3.71 |
Tabell 3: RNA ISH resultat beräknas från bilden som visas i figur 5. De siffror, som visas i prickar/cell, beräknades med hjälp mer än 400 celler som ingår i de tre underregionerna i cortex och CA3 (figur 4). Standardfel ingår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta meddelande rapporterar användning av BaseScope RNA ISH att undersöka som uttrycksmönster i mus hjärnan sektioner. Det har påvisats att anti känsla exon-exon junction sonder kortare än 50 nukleotider kan rikta exon integration och hopanden isoformer kraftfullt och specifikt. De resulterande signalerna kan dessutom användas för att beräkna PSI av en alternativ exon.
Några varianter testades i förfarandet. Exempelvis fryst vävnadssnitt genereras av kryostaten snittning testades och visat sig vara framgångsrika för användning i ISH protokollet. I detta fall dock har steget avparaffinering i 2.1 ändrats till tvättning av ULT PBS för 5 min. Dessutom, även om det är mycket bekväm att använda hybridisering ugnen som tillhandahålls av ACD, ger användning av en enkel inkubator inställd på 40 ° C i kombination med en bild som färgning bricka används för immunohistokemi jämförbara resultat. Viktigt är att hålla fukten i rutan av inklusive våta filtrerpapper under hela förfarandet.
Det finns en begränsning i detta förfarande. Det är för närvarande inte möjligt att utföra flerfärgade märkning med samma vävnad bild. Olika sonder kan således endast användas på angränsande skär, olika sektioner. För att erhålla korrekt PSI värden, är det viktigt att säkerställa att inkubationstiden för sonden hybridisering, signal amplifiering och upptäckt är samma för varje vävnad avsnitt. I framtiden kommer att genomföra användningen av flerfärgade sonder i samma vävnad bilden som används i de RNAscope förfarandena, vara mycket önskvärt.
De RNA-ISH som beskrivs i denna rapport ger ett kraftfullt nya verktyg att kvantitativt analysera som uttryck mönster i situ. Denna teknik kan användas för att studera många alternativa exoner. I en färsk rapport användes det framgångsrikt att undersöka de differentiella uttrycksmönster av de fyra ErbB4 skarvning isoformer i nervceller och oligodendrocyter cellulära upplösning20. Som visas i denna och flera andra rapporter, kommer att kombinationen av BaseScope RNA ISH med immunkemi vara en kraftfull metod att studera lokalisering och funktion av Differentiellt uttryckta skarvning isoformer6,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av American Heart Association [bidrag 0365274B till H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 till Z.W.], National Institutes of Health [Office av forskning infrastruktur delas Instrumentation Grant S10RR031845 till den ljusmikroskopi Imaging anläggning vid Case Western Reserve University], och Kina stipendium rådet [X.G.].
Författarna tackar Richard Lee i ljus Microscopy Imaging kärnan för hans hjälp med diabilder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
