Summary
Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.
Abstract
Alternatives Spleißen (AS) tritt in mehr als 90 % der menschlichen Gene. Das Muster des Ausdrucks einer Alternativ gespleißten Exon wird oft in einer Zelle Typ-spezifische Art und Weise geregelt. ALS Ausdruck, die Muster sind in der Regel durch RT-PCR und RNA-Seq analysiert mit RNA-Proben von einer Bevölkerung der Zellen isoliert. In Situ Untersuchung als Expressionsmuster für eine bestimmte biologische Struktur kann durch RNA in Situ Hybridisierung (ISH) mit Exon-spezifischen Sonden durchgeführt werden. Jedoch wurde diese besondere Verwendung des ISH beschränkt, weil alternative Exons in der Regel zu kurz, um Exon-spezifischen Sonden zu entwerfen. In diesem Bericht wird die Verwendung von BaseScope, eine neu entwickelte Technologie, die kurze antisense Oligonukleotide in RNA ISH beschäftigt beschrieben als Expressionsmuster in Maus Gehirn Abschnitten zu analysieren. Exon 23a der Neurofibromatose Typ 1 (Nf1) dient als ein Beispiel zur Veranschaulichung, dass kurze Exon-Exon-Junction-Sonden robuste Hybridisierung Signale mit hoher Spezifität in RNA ISH Analyse auf Maus Gehirn Abschnitte aufweisen. Noch wichtiger ist, können Signale mit Exon Aufnahme und überspringen-spezifische Sonden erkannt verwendet werden, die Werte von Nf1 Exon 23a Ausdruck in verschiedenen anatomischen Bereichen des mausgehirns einer gespleißt Prozent zuverlässig berechnen. Die experimentelle Protokoll und Berechnungsmethode für die Analyse werden vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass BaseScope bietet ein leistungsfähiges neues Tool als Ausdruck Muster in Situbewerten.
Introduction
Alternatives Spleißen (AS) ist ein gemeinsamer Prozess, der auftritt, während der Pre-mRNA-Reifung. In diesem Prozess kann ein Exon differentiell in Reife mRNA aufgenommen werden. So kann durch AS, ein Gen viele mRNAs, dass Code für verschiedene Proteinprodukte generieren. Es wird geschätzt, dass 92 – 94 % der menschlichen Gene alternative Spleißen1,2unterziehen. Abnorme Alternative Spleißen Muster ergab sich aus genetische Mutationen zu einer Vielzahl von Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, myotonische Dystrophie und Krebs3,4in Verbindung gebracht worden. Es ist somit entscheidend zu untersuchen und zu alternative Spleißen regulatorische Mechanismen besser zu verstehen, in einem Versuch, neue Behandlungen von Krankheiten des Menschen zu finden.
WIE oft in einer Zelle Typ-spezifische Art und Weise geregelt ist. Es ist wichtig, das AS Expressionsmuster eines bestimmten Gens in einem bestimmten biologischen System zu bestimmen. Dies wird jedoch kompliziert, wenn ein komplexes Organ, das viele verschiedene Arten von Zellen, wie Gehirn oder Herz, enthält studiert wird. In diesem Fall ist eine ideale Wahl Testsystem RNA in Situ Hybridisierung (ISH) mit Gewebe Abschnitte so AS Ausdrucksmuster eines bestimmten Gens in vielen Zelltypen gleichzeitig erkannt werden. In der Tat wurden Exon-spezifischen Sonden zur Ausdruck Niveaus ein alternative Exon5,6,7festzusetzen. Dieser Ansatz ist jedoch nicht gut geeignet für als Muster Analyse aus den folgenden Gründen. Erste, konventionelle ISH Methoden verwenden in der Regel länger als 300 Sonden bp, während die durchschnittliche Größe der vertebrate internen Exons (nicht vor- oder Nachnamen Exon) 170 Nukleotide8,9. Zweitens Wenn eine Exon-spezifische Sonde verwendet wird, um das Spleißen Muster eine interne alternative Exon untersuchen, ist die einzige mRNA-Isoform erkannt von der Sonde derjenige, der das Exon, während die mRNA-Isoform enthält, ohne das Exon erkannt werden kann. Berechnung der gespleißt (PSI) Wert für das alternative Exon Prozent ist so kompliziert. Darüber hinaus verbindet konventionelle Leuchtstofflampen ISH ISH oft mit Immunostaining, das reduziert die nachweiseffizienz und Robustheit. Zum Beispiel in einer Studie, die untersucht die stressinduzierte Spleißen Isoform Schalten von Acetylcholinesterase (AChE) mRNA, Digoxigenin wurde in die ISH-Sonde aufgenommen und mit Anti-Digoxigenin-Antikörper nachgewiesen. Alternativ wurde Biotin-markierten Sonde durch eine alkalische Phosphatase/Streptavidin-Konjugat und Substrat für alkalische Phosphatase10festgestellt. Weder-Methode verwendet Verstärkung Strategie, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Infolgedessen ist es schwierig um zu mRNA Transkripte zu erkennen, die auf einem niedrigen Niveau zum Ausdruck kommen. Daher ist eine einfachere und robustere ISH-Assay-System erforderlich, um als Ausdruck Muster in Situzu analysieren.
BaseScope wurde vor kurzem entwickelt, basierend auf der Plattform des RNAscope, eine gut etablierte und weit verbreitete ISH Testsystem. Beide Test-Systeme setzen eine gezielt Verstärkungstechnologie, die erhöht die Empfindlichkeit der Erkennung11,12. Was man von den anderen unterscheidet, ist die Länge der Zielsequenz, die so kurz wie 50 Nukleotide für BaseScope und 300 – 1.000 Nukleotide für RNAscope ist. Somit ist es möglich, Design-Sonden, die auf Exon-Exon-Kreuzungen, spezifische alternative mRNA-Isoformen zu erkennen. In der aktuellen Studie wurde ein Verfahren eingesetzt, um zu prüfen wie Expressionsmuster der Neurofibromatose 1 (Nf1) Exon 23a, eine alternative Exon ausgiebig studiert in der gleichen Labor13,14,15 Typ , 16 , 17in Maus Gehirn Abschnitten. Die Ergebnisse zeigen, dass BaseScope ein ideales System, Expressionsmuster von Nf1 Exon 23a in Situzu studieren. Da diesem Testsystem analysieren als Expressionsmuster von vielen Alternativen Exons angepasst werden kann, stellt es ein leistungsfähiges neues Tool in den Studien der AS.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Experimente, bei denen Mäuse wurden von der Case Western Reserve University institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. Der Titel des Protokolls 2016-0068 (PI: Hua Lou) ist "Role of alternative Pre-mRNA Spleißen in vertebrate Entwicklung".
Hinweis: Informationen aller Ausrüstung, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien, die in diesem Protokoll verwendeten sind in Tabelle der Materialienenthalten.
1. bereiten Sie Formalin feste Paraffin eingebettet (FFPE) Abschnitte
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1 CD1-Maus und 1 C57BL/6J Maus durch zervikale Dislokation einschläfern. Schneiden Sie vorsichtig auf, den Schädel mit chirurgische Scheren und Pinzetten. Das Gehirn mit einer Schaufel zu entfernen.
Hinweis: 5-Monate-alten CD1 männliche Mäuse und 3-Monate-alten C57BL/6J männliche Mäuse wurden eingesetzt und zeigten ähnliche Ergebnisse.- Waschen Sie das Gehirn mit PBS. Befestigen Sie das ganze Gehirn mit einer Lösung, die 10 % Formalin bei Raumtemperatur (RT) für 30 h indem man das ganze Gehirn in 50 mL Formalin-Lösung.
- Ändern Sie die festlegunglösung auf PBS und inkubieren das Gehirn mit PBS-Puffer über Nacht bei 4 ° c Entwässern und das Gehirn mit Xylol und Paraffin mit Standardverfahren18einbetten.
-
Verwenden Sie ein Mikrotom, um eingebettete Gewebe 5 µm Ablängen. Setzen Sie das Paraffin-Band in eine RT-Wasserbad, zuerst, und dann im Wasserbad 45 ° C, die Multifunktionsleiste zu verbreiten.
- Wenn die Runzeln und Falten in der Multifunktionsleiste verschwinden, sofort montieren Sie Abschnitte auf Glasobjektträger. Luft trockenere Folien über Nacht bei RT Bake Folien für 1 h bei 60 ° C vor dem Gebrauch.
2. Beispiel-Vorbehandlung
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Deparaffinize Gewebeschnitten. Führen Sie diese Schritte in einer Dampfhaube.
- Füllen Sie zwei abwaschen (Abbildung 1A) mit 250 mL frischem Xylol und zwei mit 250 mL 100 % Ethanol. Einfügen von Gewebe Folien in einer waschen Rack (Abbildung 1A) und das Waschen rack in abwaschen, die nach der Bestellung und Inkubation Zeit in Tabelle 1angegeben.
- Während jeder Inkubation heben Sie waschen Rack rauf und runter mehr als 3 Mal in der Wasch-Schale. Nach jeder Inkubation bewegen sich schnell waschen Rack in die nächsten waschen Schüssel die Gewebeschnitte vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Entfernen Sie nach Abschluss der inkubationsschritte waschen Rack mit Folien aus der Schale waschen. Platzieren Sie die Zahnstange in einem Inkubator von 60 ° C für 5 Minuten oder bis die Folien vollständig trocken sind.
- Zeichnen Sie eine 0,75 '' x 0,75 '' Barriere rund um den Gewebe-Abschnitt mit einem Stift hydrophobe Barriere. Luft trocknen die Barriere für 3 min bei RT
-
Vorbehandeln Scheiben
- Reagenzien und Geräte vorbereiten
- Einschalten der Hybridisierung Ofen (Abbildung 1 b) und Temperatur auf 40 ° C 30 min vor Gebrauch.
- Die befeuchtenden Papier (Abbildung 1E) mit destilliertem Wasser komplett nass und steckte es in Feuchtigkeit Kontrolle Tablett (Abbildung 1, Links). Halten Sie Feuchtigkeit Kontrolle Fach in der Hybridisierung-Ofen.
- Bereiten Sie 700 mL frische 1 X Target Retrieval Reagenzien durch Zugabe von 630 mL dH2O bis 70 mL 10 X Target Retrieval Reagenzien vor.
- Anwendung von Wasserstoffperoxid.
- Setzen Sie die deparaffinized Rutschen auf der Bank. Fügen Sie 5 – 8 Tropfen Wasserstoffperoxid zu einem Abschnitt auf das Gewebe vollständig zu bedecken. 10 min bei RT inkubieren
- Tippen Sie auf die Folien auf einem Stück Küchenpapier, Wasserstoffperoxid-Lösung, eine Folie zu einem Zeitpunkt zu entfernen. Sofort legen Sie die Folie einbauen möchten waschen und nach ein waschen Schale gefüllt mit dH2O. rack
- Waschen Sie die Folien durch Verschieben der Zahnstange rauf und runter in destilliertem Wasser für 3 – 5 Mal. Ein waschen Schale gefüllt mit frischem destilliertem Wasser und waschen Folien noch einmal waschen Rack ans.
- Führen Sie Ziel abrufen
- Legen Sie eine 1.000 mL-Becherglas auf einer heißen Platte. Fügen Sie 700 mL frische 1 X Target Retrieval Reagenzien in das Becherglas und mit Folie abdecken. Legen Sie einen Thermometer in den Becher durch die Folienabdeckung (Abbildung 1). Schalten Sie die Heizplatte und hoch für 10 – 15 Minuten angesetzt.
- Wenn die Temperatur der Abruf Reagenzien 98 ° C erreicht hat, wechseln Sie die Temperaturregelung der Heizplatte von hoch zu niedrig um milde Kochen zu halten. Nicht kochen Sie mehr als 15 min.
- Unterdessen sorgfältig öffnen Sie die Folie und legen Sie das Waschen Rack mit Scheiben im Inneren der Abruf Regent. Das Becherglas wieder abdecken und 15 min inkubieren.
- Verwendung Zange Rack aus den Becher auf einen Teller waschen entfernen gefüllt mit 200 mL dH2O und spülen für 15 s.
- Verschieben der Zahnstange in eine Wasch-Schale mit 100 % frischem Ethanol und für 3 min. Folien entfernen und trocknen Sie sie in einem 60 ° C Inkubator für 10 min. stehen lassen.
- Protease III gelten
- Legen Sie die Folien auf den Fleck Rost (Abbildung 1, rechts). Tropfen Sie 5 Protease III um das Gewebe zu decken. Vorsichtig legen Sie die Zahnstange in die Luftfeuchtigkeit Kontrolle Schublade (Abbildung 1, Links) und setzen Sie die Schale in den Ofen 40 ° C Hybridisierung. 30 min inkubieren.
- Entfernen Sie die Folie Rack und stellte das Tablett wieder in den Ofen. Tippen Sie auf die Folien, um die überschüssige Flüssigkeit, eine Folie zu einem Zeitpunkt zu entfernen. Legen Sie die Folie in einem waschen Rack und Ort das Rack in einem waschen Schale voller dH2O. Move Rack rauf und runter, um die Folien für Waschen 3-5 Mal.
- Reagenzien und Geräte vorbereiten
(3) ISH Assay
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Bereiten Sie Materialien
- Wärmen Sie 50 x Waschpuffer in einem Inkubator 40 ° C für 20 min. Mix 2,94 L dH2O und 60 mL 50 x Waschpuffer, 1 x Waschpuffer zu machen vor.
- Bereiten Sie 50 % Hämatoxylin Färbelösung durch Zugabe von 100 mL Gills Hämatoxylin ich bis 100 mL dH2O. Prepare 0,02 % (w/V) Ammoniak Wasser durch Zugabe von 1,43 mL 1 N Ammonium Hydroxid, 250 mL von dH2O. Mix in einem Behälter gut vor.
- Setzen Sie die Sonden und AMP 0 – 6 Reagenzien bei RT 30 min vor Gebrauch. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit Kontrolle Fach im 40 ° C Hybridisierung Ofen.
-
ISH-Verfahren
Hinweis: Um die Expression von Nf1 Spleißen Isoformen prüfen und berechnen die Prozent (PSI) Wert für Exon 23a, drei verschiedene ISH-Sonden, die auf Exon 23a enthalten Isoform gespleißt sind, Exon 23a ausgeschlossen Isoform oder beide Isoformen verwendet (Abbildung 2 ). Die Sonden werden benachbart geschnittenen Gewebeschnitte verwendet. Um die Genauigkeit der Berechnung zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die drei Gewebeschnitte behandelt werden genauso in der Hybridisierung, Verstärkung und Signal-Erkennung-Schritten.- Sonde Hybridisierung.
- Entfernen Sie die Folien aus dem Waschen Rack und tippen Sie auf die überschüssige Flüssigkeit aus den Folien. Legen Sie die Folien in der Fleck-Rack.
- Benutzen Sie einen Bleistift, um die Folien mit der Sonde Namen zu beschriften. Setzen Sie die drei benachbart geschnittene Gehirn Gewebe Folien zusammen mit drei verschiedenen Nf1 Sonden (Abbildung 2) hybridisiert werden. Führen Sie die nachfolgenden Schritte in der gleichen Reihenfolge von Folien.
- 4 Tropfen der Sonde um das Gewebe zu decken. Tun Sie diese eine Folie zu einem Zeitpunkt zu die Abschnitten Austrocknen verhindert wird. Legen Sie die Fleck-Rack in der Feuchtigkeit Kontrolle Fach und fügen Sie es in den 40 ° C Backofen für 2 h.
- Waschen Sie die Objektträger zweimal mit Waschpuffer. Füllen Sie für jedes waschen die Färbung Schüssel mit 200 mL 1 x Waschpuffer und platzieren Sie Regales waschen drin. Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit auf ein Papier Handtuch eine Folie gleichzeitig und einfügen Sie schnell waschen Rack. Bewegen der Folie Rack rauf und runter in die Schüssel für 3 – 5 Mal für 2 min bei RT
- Verwenden Sie für die zweite Wäsche frisch Waschpuffer.
- Signalverstärkung.
- Tippen Sie auf die überschüssigen Waschpuffer von Folien und legen Sie sie in das Fleck-Rack. Tropfen Sie 4 AMP 0 um das Gewebe zu decken. Legen Sie die Fleck-Rack in der Feuchtigkeit Kontrolle Fach und legen Sie sie in den Ofen für 30 min. bei 40 ° C.
- Waschen Sie die Folien zweimal mit Waschpuffer wie oben beschrieben.
- Wiederholen Sie diesen Schritt mit AMP 1 – 6 Anschluss an die Bestellung und den Zustand der Tabelle 2. Waschen Sie die Folien zweimal nach jedem Schritt Hybridisierung.
- Signalerkennung
- Tippen Sie auf die überschüssigen Waschpuffer von den Folien und legen Sie sie in Fleck Rack. Fast Red 120 µL 2 µL schnell rot B hinzufügen (Verhältnis 1: 60) in einem Microcentrifuge Schlauch. Mischen Sie gut und um Abschnitt Gewebe vollständig zu decken.
Hinweis: Das Gesamtvolumen der roten A / B Mix basiert auf der Anzahl und Größe der Gewebeschnitte. Für einen 0,75 '' x 0,75 '' reicht 120 µL für einen Abschnitt. Verwenden Sie die Mischung innerhalb von 5 min und direktem Sonnenlicht oder UV-Licht meiden Sie der Mischung. - Schließen Sie das Fach und inkubieren Sie für 10 min bei RT. entfernen Sie die Lösung für einen Abfallcontainer und sofort waschen Rack einfügen Sie die Folien und platzieren Sie die Zahnstange in einer Wasch-Schale mit Leitungswasser gefüllt. Wieder mit frischem Leitungswasser abspülen.
- Tippen Sie auf die überschüssigen Waschpuffer von den Folien und legen Sie sie in Fleck Rack. Fast Red 120 µL 2 µL schnell rot B hinzufügen (Verhältnis 1: 60) in einem Microcentrifuge Schlauch. Mischen Sie gut und um Abschnitt Gewebe vollständig zu decken.
- Sonde Hybridisierung.
-
Gegenfärbung der Folien
- Entfernen Sie das Waschen Rack aus Leitungswasser und schnell tippen auf saugfähigem Papier, extra Wasser zu entfernen. Das Rack in einem 50 % Hämatoxylin Färbelösung und sofort bewegen Sie das Gestell nach oben und unten mehrmals. 2 min bei RT inkubieren
- Überweisen Sie Folie-Rack zurück auf das Leitungswasser Gericht. Waschen Sie 3 – 5 Mal durch das Rack rauf und runter bewegen und frisches Leitungswasser zu wechseln, bis die Folien deutlich werden, während das Hirngewebe lila bleiben.
- Bewegen Sie das Rack, eine Schale mit 0,02 % Ammoniakwasser. Das Rack hoch und runter bewegen Sie 2 – 3 Mal bis das Gewebe blau leuchten. Waschen Sie die Objektträger 3 – 5 Mal mit frischem Leitungswasser in einer Färbung Schale.
-
Montage der Proben
- Verschieben der Folie-Rack aus der Färbung Schale in einem 60 ° C Inkubator und mindestens 15 min inkubieren, bis die Folien vollständig trocken sind.
- 40 µL Eindeckmedium auf der Folie und legen Sie ein 24 mm x 50 mm-Deckglas vorsichtig über Abschnitt Gewebe. Luft trocken Folien für 30 min bei RT
4. Datenerhebung und-Analyse
Hinweis: Verwenden Sie einen Diascanner zum Scannen von Bildern bei 40 X Vergrößerung.
-
Positive und negative Kontrollen
- Für jedes Experiment sind positive und negative Kontrollen (Abbildung 3). Als eine gute positive Kontrolle sollte Signal als punktförmige Punkte bei 20-40 X Vergrößerung sichtbar sein.
- Verwendung der Maus (Mm) - PPIB - 1ZZ als Positivkontrolle. Diese Sonde zielt auf einen gemeinsamen Haushalt gen PPIB. Für negative Kontrolle geht einen Punkt für jeden 20 Zellen mit Hintergrund Färbung pro 20 X Mikroskop-Feld angezeigt.
- Verwenden Sie die DapB-1ZZ Sonde als Negativkontrolle. Diese Sonde zielt auf die bakterielle gen DapB. Diese Kontrolle Sonden wurden in vielen ISH Assays19verwendet.
-
Signalerkennung und Analyse von als Expressionsmuster von Nf1 Exon 23a
- Zählen Sie die Hybridisierung Signale als punktförmige Punkte angegeben sind, die Punkte manuell. Die Anzahl der Punkte korreliert mit dem Niveau der Abschriften, die von einer speziellen Sonde erkannt wird. Beachten Sie, dass die Anzahl der Punkte auch mit ImageJ oder SpotStudio Software analysiert werden kann.
- Verwenden Sie drei Sonden um zu hybridisieren Exon 23a-haltigen, Exon 23a fehlt Isoformen oder total Nf1 Transkripte (Abbildung 2). Da die drei Sonden gleichzeitig verwendet werden können, verwenden Sie drei angrenzende Gehirn Gewebeschnitte für jede Sonde hybridisieren.
- Um Prozent gespleißt in (PSI) für Exon 23a zu berechnen, die Anzahl der Zellen und Punkte in verschiedenen Hirnregionen. Zählen Sie für jede Region von Interesse mehr als 400 Zellen aus mehreren Sub-Regionen wie in Abbildung 4dargestellt.
- Sammeln von Daten aus den gleichen Subregionen für jede der drei Sonden. PSI als Anzahl der Punkte pro Zelle zu berechnen, mit der Exon 23a Aufnahme Sonde / (Anzahl der Punkte pro Zelle mit dem Exon 23a Aufnahme Sonde + Anzahl der Punkt pro Zelle mit der exon23a Sonde überspringen) x 100 %.
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Representative Results
BaseScope ISH erfolgte nach drei Mausstämme: CD1 Wildtyp-Mäusen C57BL/6J Wildtyp-Mäusen und Nf123aIN/23aIN mutierte Mäuse im C57BL/6J Hintergrund, in denen Exon 23a in allen Zelltypen infolge eines enthalten ist entwickelt Spleiß-Website Mutationen-14,-15.
Als ersten Schritt, das ISH Assay System wurde getestet mit Unternehmen zur Verfügung gestellt Reagenzien: Folien, die 3 t 3 Zellen und negativen und positiven ISH Sonden. Wie in Abbildung 3gezeigt, war kein Signal erkannt, wenn die negativ-Kontrolle-Sonde verwendet wurde, während viele punktförmige Punkte erkannt wurden, wenn die Positivkontrolle Sonde verwendet wurde.
Als nächstes ISH erfolgte mittels Maus Gehirn Abschnitte und Nf1-spezifische Sonden, die Nf1 Transkripte, die Exon 23a, enthalten geschehener überspringen Exon 23a oder beide Isoformen (Abbildung 2). Diese Sonden gezielt bestimmte Exon-Exon-Kreuzungen. Zwei Gehirnregionen wurden ausgewählt, um die AS Expressionsmuster von Nf1 Exon 23a untersuchen: Kortex und Hippocampus CA3 (Abbildung 4). Zählen Sie für jede Region drei Unterregionen, wie in Abbildung 4, Aufnahme von Zelle und Dot-Nummern angegeben. Für jede Region wurden rund 400 Zellen insgesamt gezählt und verwendet, um die Punkte/Zelle Verhältnis zu berechnen. Das AS-Expressionsmuster für Nf1 Exon 23a errechnet sich PSI.
Die ISH-Signale erhalten mit den drei Sonden Nf1 im Kortex und Hippocampus CD1 Mäuse sind in Abbildung 5Agezeigt-5F und Tabelle 3. Der Kortex Region von C57BL/6J Nf1+ / + und Nf123aIN/23aIN Mäuse war auch analysiert (Abbildung 6).
Das Ergebnis dieser Experimente führten zu mehreren Schlussfolgerungen. Erstens, die Summe der Signale, dargestellt als Punkte/Zelle, erkannt durch Exon 23a Aufnahme-spezifische und überspringen-spezifische Sonden entspricht, die von der Sonde hybridisieren, beide Isoformen (Tabelle 3), was darauf hindeutet, dass die drei Sonden mit der hybridisiert erkannt Nf1 Protokolle mit ähnlichen Effizienz. Zweitens entspricht der PSI-Wert von Exon 23a im Kortex, 10 %, das bereits berichtet RT-PCR-Ergebnis in dem Hirnrinde von Erwachsenen C57BL/6J Mäusegehirn gefolgt von totaler RNA Isolation und RT-PCR Analyse14,15seziert wurde. Dieses Ergebnis legt nahe, dass der BaseScope ISH verwendet werden kann, um quantitativ als Expressionsmuster neben der Abschrift in Gewebeschnitten zu analysieren. Drittens, die erzielten Ergebnisse mit Nf123aIN/23aIN mutierte Hirngewebe, in dem alle die Nf1 -Protokolle 23a Exon14,15 enthalten, zeigte ähnliche Pegel von Signalen als Aufnahme-spezifischen und Nf1 total Sonden wurden verwendet und kein Signal beim überspringen-spezifische Sonde verwendet wurde (Abbildung 6), darauf hinweist, dass die beiden Sonden targeting Exon Aufnahme oder überspringen hochspezifisch sind.
Abbildung 1: Ausrüstung benutzt im ISH. (A) Schale waschen und waschen Rack. (B) Hybridisierung Ofen. (C) Target Retrieval Becher und Kochplatte Satz. (D) Luftfeuchtigkeit kontrollieren Tablett und Flecken Rack. (E) Befeuchtung Papier durch eine rote Pfeilspitze in der Feuchtigkeit Kontrolle Tray angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Sonden verwendet, um Nf1 Exon 23a als Expressionsmuster. Alle Prüfpunkte enthalten ein ZZ paar Oligonukleotid. Die Aufnahme-spezifische Sonde (rot) richtet sich an die Kreuzung der Exons 23a und 24, die überspringen-spezifische Sonde (grün) richtet sich an der Kreuzung der Exons 23 und 24 sowie die Nf1 total Sonde (blau) richtet sich an der Kreuzung der Exons 26 und 27. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: ISH mit negativen (A-B) und (C-D) Positivkontrollen auf 3 t 3 Zellen. Ein Steuerschieber mit 3 t 3 Zellen wurde durch Schritt 2 (Probe Vorbehandlung) und 3 (ISH-Verfahren) im Protokoll verarbeitet. Positive Signale sind als rote punktförmige Punkte gekennzeichnet durch rote Pfeile dargestellt. B und D werden eingezoomt Bilder von A und C, jeweils. Maßstabsleiste = 20 µm (A und C); 5 µm (B und D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Bild von einer Maus Gehirn koronalen Abschnitt. Die roten Kästchen zeigen die Bereiche für die Zählung der Zelle und Signal-Nummern in Kortex und Hippocampus CA3 Regionen ausgewählt. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: RNA-ISH Signale erkannt, mit Nf1-spezifische Sonden und Maus Abschnitte des Gehirns. CD1 Gehirne durch Schritte 1-4 im Protokoll verarbeitet wurden. Rote, punktförmige Punkte zeigen positive signalisiert, wann die drei Nf1-spezifische Sonden (siehe Abbildung 3) dienen. (A-C) Kortex und Hippocampus (D-F) werden angezeigt. NF1 total Sonde diente in A und D, Aufnahme-spezifische Sonde in B und E und überspringen-spezifische Sonde in C und F. Scale Bar = 40 µm (A-C); 400 µm (D-F). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: RNA-ISH Signale erkannt Nf1+ / + und Nf123aIN/23aIN Gehirn Abschnitte. Beide Mausstämme werden im Hintergrund C57BL/6J. Die Gehirn verarbeitet wurden durch die Schritte 1 bis 4 des Protokolls. A-C. Nf1+ / + Kortex. D-F. Nf123aIN/23aIN Cortex. Nf1 total Sonde diente in A und D, Aufnahme-spezifische Sonde in B und E und überspringen-spezifische Sonde in C und F. Scale Bar = 40 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Reihenfolge der Inkubation | Chemikalien in TT Schale | Zeit |
| 1 | 250 mL Xylol | 5 min |
| 2 | 250 mL Xylol | 5 min |
| 3 | 250 mL 100 % ethanol | 2 min |
| 4 | 250 mL 100 % ethanol | 2 min |
Tabelle 1: Inkubation Prozedur Schritt 2.1.1.
| AMP-Lösung | Inkubationszeit | Inkubationstemperatur |
| AMP 1 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 5-ROT | 30 min | Raumtemperatur |
| AMP 6-ROT | 15 min | Raumtemperatur |
Tabelle 2: Signal Verstärkungsprozedur Schritt 3.2.2.
| Region | überspringen | Aufnahme | Hüpfende + Aufnahme | insgesamt | PSI |
| Kortex | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5.56 | 5,65 | 3.71 |
Tabelle 3: RNA ISH Ergebnisse berechnet aus dem Bild in Abbildung 5dargestellten. Die untenstehenden Punkte/Zelle, wurden mit mehr als 400 Zellen, die in drei Unterregionen in Kortex und CA3 enthalten sind berechnet (Abbildung 4). Standardfehler sind im Preis inbegriffen.
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Discussion
Diese Mitteilung berichtet die Verwendung von BaseScope RNA-ISH, als Expressionsmuster Maus Gehirn abschnittsweise zu prüfen. Es wird gezeigt, dass diese Anti-Sense Exon-Exon-Junction-Sonden kürzer als 50 Nukleotide Exon Eingliederung und überspringen Isoformen, robust und speziell ansprechen kannst. Darüber hinaus können die resultierenden Signale zur PSI eine alternative Exon berechnen.
Ein paar Variationen wurden in dem Verfahren getestet. Z. B. wurden gefrorene Gewebeschnitte von Kryostat schneiden erzeugt getestet und für den Einsatz in diesem ISH-Protokoll erfolgreich erwiesen. In diesem Fall jedoch wurde der 4.Wenn Schritt 2.1 geändert für 5 min Okt. mit PBS waschen. Darüber hinaus zwar sehr bequem zu bedienen die Hybridisierung Ofen zur Verfügung gestellt von ACD, bietet Verwendung von einer einfachen Inkubator gesetzt bei 40 ° C in Kombination mit einer Folie Tablett verwendet für immunhistochemische Färbung vergleichbare Ergebnisse. Das wichtigste ist die Feuchtigkeit im Feld zu halten, durch die Einbeziehung von nassen Filterpapiere während des Verfahrens.
Es ist eine Einschränkung in diesem Verfahren. Derzeit ist es nicht möglich, führen Sie mehrfarbige Beschriftung auf der gleichen Gewebe-Folie. So können verschiedene Sonden nur auf benachbart geschnitten, verschiedene Abschnitte verwendet werden. Um genaue PSI-Werte zu erhalten, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Inkubationszeit der Sonde Hybridisierung, Signalverstärkung und Erkennung ist das gleiche für jedes Gewebe-Abschnitt. In Zukunft wird implementieren die Verwendung von Multi-Color-Sonden auf derselben Folie Gewebe, wie in den RNAscope-Verfahren verwendet hoch erwünscht sein.
In diesem Bericht beschriebenen RNA-ISH bietet ein leistungsfähiges neues Tool um quantitativ als Ausdruck Muster in Situzu analysieren. Diese Technik kann angewendet werden, um viele alternative Exons zu studieren. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht diente es erfolgreich die differenzielle Expressionsmuster von vier ErbB4 Spleißen Isoformen in Nervenzellen und Oligodendrozyten im zellulären Auflösung20untersuchen. Wie in diesem und einigen anderen Berichten gezeigt, wird die Kombination von BaseScope RNA ISH mit Immunchemie ein leistungsfähiger Ansatz zur Untersuchung der Lokalisierung und Funktion der differentiell exprimierten Spleißen Isoformen6,20sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von der American Heart Association [Beihilfe 0365274B H.L], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964, Z.W.], National Institutes of Health [Büro der Forschung Infrastruktur gemeinsam Instrumentierung Grant S10RR031845, die Lichtmikroskopie Imaging-Anlage an der Case Western Reserve University], und China Scholarship Council [zu X.G.].
Die Autoren danken Richard Lee in Light Microscopy Imaging Core für seine Hilfe mit Dia scannen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
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