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Genetics

वैकल्पिक पूर्व का मात्रात्मक विश्लेषण माउस मस्तिष्क वर्गों में mRNA ब्याह सीटू संकरण परख में आरएनए का उपयोग

Published: August 26, 2018 doi: 10.3791/57889
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 2, 1,3, 1,3,4
1Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, 2Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, 3Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, 4Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

Summary

माउस मस्तिष्क वर्गों में वैकल्पिक पूर्व mRNA ब्याह पैटर्न का पता लगाने के लिए लघु antisense oligonucleotides का उपयोग करता है कि सीटू संकरण (ISH) प्रोटोकॉल में एक वर्णित है ।

Abstract

वैकल्पिक ब्याह (के रूप में) मानव जीन के ९०% से अधिक में होता है । एक वैकल्पिक ब्याह एक्सॉन की अभिव्यक्ति पैटर्न अक्सर एक सेल प्रकार विशेष फैशन में विनियमित है । के रूप में अभिव्यक्ति पैटर्न आमतौर पर आरटी-पीसीआर और आरएनए-seq आरएनए कोशिकाओं की आबादी से अलग नमूनों का उपयोग करके विश्लेषण कर रहे हैं । एक विशेष रूप से जैविक संरचना के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में सीटू की परीक्षा में एक्सॉन-विशिष्ट जांच का उपयोग कर सीटू संकरण (ISH) में आरएनए द्वारा किया जा सकता है । हालांकि, ISH के इस विशेष उपयोग सीमित किया गया है क्योंकि वैकल्पिक exons आम तौर पर भी एक्सॉन विशिष्ट जांच डिजाइन करने के लिए कम कर रहे हैं । इस रिपोर्ट में, BaseScope का उपयोग, एक हाल ही में विकसित तकनीक है कि आरएनए ISH में लघु antisense oligonucleotides रोजगार, माउस मस्तिष्क वर्गों में अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण करने के लिए वर्णन किया गया है । एक्सॉन 23 क of neurofibromatosis type 1 (Nf1) एक उदाहरण के रूप में वर्णन करने के लिए कि लघु एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन जांच में उच्च विशिष्टता के साथ मजबूत संकरण संकेतों को दर्शाने के लिए प्रयोग किया जाता है आरएनए पर माउस मस्तिष्क वर्गों ISH विश्लेषण । इससे भी महत्वपूर्ण बात, संकेतों एक्सॉन शामिल किए जाने के साथ पता लगाया-और लंघन-विशिष्ट जांच मज़बूती से एक माउस मस्तिष्क के विभिंन संरचनात्मक क्षेत्रों में Nf1 एक्सॉन 23 क अभिव्यक्ति के मूल्यों में ब्याह प्रतिशत की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और गणना पद्धति प्रस्तुत कर रहे हैं । परिणाम संकेत मिलता है कि BaseScope एक शक्तिशाली नए उपकरण के रूप में सीटू मेंअभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में मूल्यांकन प्रदान करता है ।

Introduction

वैकल्पिक ब्याह (के रूप में) एक आम प्रक्रिया है कि पूर्व mRNA परिपक्वता के दौरान होता है । इस प्रक्रिया में, एक एक्सॉन अंतर परिपक्व mRNA में शामिल किया जा सकता है । इस प्रकार, के माध्यम से के रूप में, एक जीन कई mRNAs उत्पंन कर सकते है कि विभिंन प्रोटीन उत्पादों के लिए कोड । यह अनुमान है कि 92-मानव जीन के 94% वैकल्पिक ब्याह1,2से गुजरना है । असामान्य वैकल्पिक ब्याह पैटर्न आनुवंशिक उत्परिवर्तनों से परिणामस्वरूप पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, myotonic dystrophy, और3कैंसर,4सहित रोगों की एक बड़ी संख्या से जोड़ा गया है । यह इस प्रकार की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है और बेहतर मानव रोगों के नए उपचार खोजने के प्रयास में वैकल्पिक ब्याह विनियामक तंत्र को समझते हैं ।

के रूप में अक्सर एक सेल प्रकार विशेष फैशन में विनियमित है । यह एक विशिष्ट जीन के रूप में एक दिया जैविक प्रणाली में अभिव्यक्ति पैटर्न का निर्धारण महत्वपूर्ण है । हालांकि, यह जटिल हो जाता है जब एक जटिल अंग है कि कई विभिंन प्रकार की कोशिकाओं में शामिल है, जैसे मस्तिष्क या दिल, अध्ययन किया है । इस मामले में, परख प्रणाली का एक आदर्श विकल्प एक विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में एक साथ कई कोशिका प्रकार में पता लगाया जा सकता है तो ऊतक वर्गों का उपयोग कर सीटू संकरण (ISH) में आरएनए है । दरअसल, एक्सॉन-विशिष्ट जांच एक वैकल्पिक एक्सॉन5,6,7की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए निंनलिखित कारणों के लिए पैटर्न विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है । सबसे पहले, पारंपरिक ISH तरीकों आमतौर पर जांच का उपयोग ३०० बीपी से अधिक है, जबकि हड्डीवाला आंतरिक exons के औसत आकार (नहीं पहले या अंतिम एक्सॉन) १७० न्यूक्लियोटाइड8,9है । दूसरा, जब एक एक्सॉन-विशिष्ट जांच एक आंतरिक वैकल्पिक एक्सॉन के ब्याह पैटर्न की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है, केवल mRNA isoform जांच से पता चला है एक है कि एक्सॉन शामिल है, जबकि mRNA isoform बिना पता नहीं किया जा सकता है । इस प्रकार, वैकल्पिक एक्सॉन के लिए (साई) मूल्य में ब्याह प्रतिशत की गणना जटिल है । इसके अलावा, पारंपरिक फ्लोरोसेंट ish अक्सर immunostaining के साथ ish को जोड़ती है, जो पता लगाने दक्षता और मजबूती कम कर देता है । उदाहरण के लिए, एक अध्ययन है कि तनाव से प्रेरित ब्याह एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ के isoform स्विचन (दर्द) mRNA की जांच में, digoxigenin ISH जांच में शामिल किया गया था और विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया । वैकल्पिक रूप से, बायोटिन-लेबल जांच एक alkaline फॉस्फेट/streptavidin संयुग्मी और क्षारीय फॉस्फेट10के लिए एक सब्सट्रेट द्वारा पता लगाया गया था । न तो विधि का पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए किसी भी प्रवर्धन रणनीति का उपयोग करता है । नतीजतन, यह mRNA टेप है कि निंन स्तर पर व्यक्त कर रहे है का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इस प्रकार, एक सरल और अधिक मजबूत ISH परख प्रणाली को सीटू मेंअभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण की जरूरत है ।

BaseScope हाल ही में RNAscope, एक अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया ISH परख प्रणाली के मंच के आधार पर विकसित किया गया था । दोनों परख प्रणालियों एक लक्ष्य विशेष प्रवर्धन प्रौद्योगिकी है कि पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती रोजगार11,12। क्या दूसरे से अलग एक लक्ष्य अनुक्रम की लंबाई है, जो BaseScope के लिए ५० न्यूक्लियोटाइड के रूप में के रूप में कम है, और 300-RNAscope के लिए 1000 न्यूक्लियोटाइड । इस प्रकार, यह डिजाइन जांच करने के लिए संभव है कि लक्ष्य एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों विशिष्ट वैकल्पिक mRNA isoforms का पता लगाने के लिए । वर्तमान अध्ययन में, एक प्रक्रिया neurofibromatosis प्रकार की अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में जांच करने के लिए स्थापित किया गया था 1 (Nf1) एक्सॉन 23 क, एक वैकल्पिक एक्सॉन बड़े पैमाने पर एक ही प्रयोगशाला में अध्ययन13,14,15 , 16 , 17, माउस मस्तिष्क वर्गों में । परिणाम प्रदर्शित करता है कि BaseScope एक आदर्श प्रणाली को सीटू में Nf1 एक्सॉन 23 क के अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन है । के रूप में इस परख प्रणाली के लिए कई वैकल्पिक exons की अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण अनुकूलित किया जा सकता है, यह के रूप में अध्ययन में एक शक्तिशाली नए उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Protocol

प्रयोगों के सभी यहां वर्णित है कि चूहों को शामिल मामला पश्चिमी रिजर्व विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है । प्रोटोकॉल 2016-0068 (PI: हुआ लो) का शीर्षक है "वैकल्पिक हड्डीवाला विकास में पूर्व mRNA ब्याह की भूमिका" ।

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरण, रिएजेंट और आपूर्ति की सभी सामग्री की तालिकामें शामिल है ।

1. तैयार Formalin फिक्स्ड आयल एंबेडेड (FFPE) वर्गों

  1. Euthanize 1 CD1 माउस और 1 C57BL/6J माउस से सरवाइकल विस्थापन । सावधानी से शल्य कैंची और संदंश के साथ खोपड़ी खुले में कटौती । एक स्कूप के साथ मस्तिष्क निकालें ।
    नोट: 5 महीने पुराने CD1 नर चूहों और 3 महीने की उम्र के C57BL/6J पुरुष चूहों का इस्तेमाल किया गया और इसी तरह के परिणाम दिखाई दिए.
    1. पंजाबियों के साथ ब्रेन वॉश । formalin समाधान के ५० मिलीलीटर में पूरे मस्तिष्क डाल द्वारा 30 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 10% formalin युक्त एक समाधान के साथ पूरे मस्तिष्क को ठीक करें ।
    2. पंजाबियों के लिए फिक्सिंग समाधान बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात पंजाब में मस्तिष्क मशीन । निर्जलीकरण और xylene और तेल के साथ मस्तिष्क एंबेड मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर18।
  2. एक microtome का प्रयोग करें 5 µm वर्गों में एंबेडेड ऊतक में कटौती । पहले एक आरटी जल स्नान में तेल रिबन रखो, और फिर एक ४५ डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान रिबन फैलाने के लिए ।
    1. जब रिबन में झुर्रियों और परतों गायब हो, तुरंत कांच स्लाइड पर वर्गों माउंट । एयर सूखी स्लाइड पर रात भर RT. ६० ° c पर 1 एच के लिए स्लाइड बनाओ उपयोग से पहले ।

2. नमूना उपचार

  1. Deparaffinize ऊतक वर्गों । एक धुएं डाकू में इन कदमों को ले ।
    1. दो वाशिंग व्यंजन भरें (आंकड़ा 1a) २५० मिलीलीटर के साथ ताजा xylene और दो १००% इथेनॉल के २५० मिलीलीटर के साथ । एक कपड़े धोने की रैक में ऊतक स्लाइड डालें (आंकड़ा 1a) और आदेश और गर्मी के समय 1 तालिकामें संकेत दिया निंनलिखित धोने के बर्तन में कपड़े धोने की रैक जगह है ।
    2. प्रत्येक मशीन के दौरान, वाशिंग रैक ऊपर और नीचे धोने के पकवान में अधिक से अधिक 3 बार लिफ्ट । प्रत्येक मशीन के बाद, जल्दी से बाहर सुखाने से ऊतक वर्गों को रोकने के लिए अगले धोने पकवान में धोने रैक चाल ।
    3. इसके बाद, मशीनी स्टेप्स को पूरा करने के बाद वॉशिंग रैक को वाशिंग डिश से स्लाइड के साथ निकाल लें । 5 मिनट के लिए या स्लाइड पूरी तरह से शुष्क है जब तक एक ६० डिग्री सेल्सियस मशीन में रैक प्लेस ।
  2. एक hydrophobic बाधा कलम के साथ ऊतक अनुभाग के आसपास एक ०.७५ ' ' एक्स ०.७५ ' बाधा ड्रा. एयर आरटी में 3 मिनट के लिए बाधा सूखी ।
  3. स्लाइस
    1. एजेंट और उपकरण तैयार करें
      1. संकरण ओवन (आंकड़ा 1b) पर मुड़ें और उपयोग करने से पहले ४० ° c 30 मिनट के लिए तापमान सेट करें ।
      2. humidifying कागज (चित्रा 1E) के साथ आसुत पानी पूरी तरह से गीला है और यह नमी नियंत्रण ट्रे (चित्रा 1 डी, बाएं) में डाल दिया । नमी कंट्रोल ट्रे को संकरण ओवन में रखें ।
      3. ताजा 1x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति रिएजेंट के ७०० मिलीलीटर डीएच2ओ के ६३० मिलीलीटर 10x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति रिएजेंट के ७० मिलीलीटर को जोड़ने के द्वारा तैयार ।
    2. हाइड्रोजन पेरोक्साइड लागू होते हैं ।
      1. विपक्षी स्लाइड्स को बेंच पर रखें । एक अनुभाग में 5-8 हाइड्रोजन पेरोक्साइड की बूंदों को पूरी तरह से ऊतक को कवर जोड़ें । आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
      2. एक समय में हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान, एक स्लाइड को दूर करने के लिए शोषक कागज के एक टुकड़े पर स्लाइड टैप करें । तुरंत एक कपड़े धोने के रैक में स्लाइड डालने और एक धोने डीएच2ओ से भरा पकवान के लिए रैक ले जाएं ।
      3. स्लाइड को ऊपर और नीचे आसुत जल में 3-5 बार के लिए ऊपर ले जाने से धो लें । ताजा आसुत जल से भरे एक कपड़े धोने की थाली धोने के रैक ले जाएं और एक और समय स्लाइड धो लो ।
    3. लक्ष्य पुनर्प्राप्ति निष्पादित करें
      1. एक गरम प्लेट पर एक १,००० मिलीलीटर ग्लास चोंच रखें । चोंच में ताजा 1x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति रिएजेंट के ७०० मिलीलीटर जोड़ें और पंनी के साथ इसे कवर । पन्ना आवरण (figure 1C) के माध्यम से यूरिन में एक थर्मामीटर डालें । गर्म थाली पर बारी और 10 के लिए उच्च पर सेट-15 मिनट ।
      2. ९८ डिग्री सेल्सियस तक पहुँचता है़ के तापमान को कम करने के लिए उच्च से गर्म थाली के तापमान नियंत्रण स्विच करने के लिए एक हल्के फोड़ा बनाए रखने के लिए. 15 मिनट से ज्यादा न उबालें ।
      3. इसी बीच ध्यान से पन्ना खुला और वाशिंग रैक को स्लाइस के अंदर डाल दिया है़ regent. फिर से चोंच कवर और 15 मिनट के लिए मशीन ।
      4. संदंश का प्रयोग करें चोंच से रैक निकालने के लिए डीएच2ओ की २०० मिलीलीटर और कुल्ला 15 एस के लिए एक धोने पकवान से भरा ।
      5. एक धुलाई १००% ताजा इथेनॉल युक्त पकवान के लिए रैक ले जाएं और 3 मिनट के लिए बैठते हैं । स्लाइड निकालें और 10 मिनट के लिए एक ६० डिग्री सेल्सियस मशीन में उंहें सूखी ।
    4. लागू करने का गोरखधंधा III
      1. दाग रैक पर स्लाइड प्लेस (1 डी आंकड़ा, सही) । ऊतक को कवर करने के लिए एक को छेड़ो III के 5 बूंदें जोड़ें । ध्यान से नमी नियंत्रण ट्रे (चित्रा 1 डी, बाएं) में रैक डाल और ४० डिग्री सेल्सियस संकरण ओवन में ट्रे डालें । 30 मिनट के लिए मशीन ।
      2. स्लाइड रैक निकालें और ट्रे ओवन में वापस डाल दिया । अतिरिक्त लिक्विड, एक बार में एक स्लाइड निकालने के लिए स्लाइड्स टैप करें. एक वाशिंग रैक में स्लाइड डालें और डीएच2से भरा एक कपड़े धोने की डिश में रैक जगह हे । 3-5 बार के लिए स्लाइड को धोने के लिए रैक ऊपर और नीचे ले जाएं ।

3. ISH परख

  1. सामग्री तैयार
    1. 20 मिनट के लिए एक ४० डिग्री सेल्सियस मशीन में पूर्व गर्म 50x धो बफर बफ़र डीएच2ओ के २.९४ एल मिश्रण और 50x धोने बफर के ६० मिलीलीटर 1x धो बफर बनाने के लिए ।
    2. ५०% Hematoxylin गिल के Hematoxylin मैं १०० मिलीलीटर के डीएच2ओ के १०० मिलीलीटर जोड़कर समाधान तैयार करें ०.०२% (w/v) अमोनिया पानी 1 N अमोनियम हीड्राकसीड के १.४३ मिलीलीटर को जोड़कर डीएच2ओ की २५० मिलीलीटर को अच्छी तरह मिक्स कर लें ।
    3. उपयोग करने से पहले आर टी 30 मिनट में जांच और AMP 0-6 रिएजेंट रखो । ४० ° c संकरण ओवन में आर्द्रता नियंत्रण ट्रे रखें ।
  2. ISH प्रक्रिया
    नोट: Nf1 ब्याह isoforms की अभिव्यक्ति की जांच करने और एक्सॉन 23 क के लिए (साई) मूल्य में ब्याह प्रतिशत की गणना, तीन अलग ISH जांच लक्ष्य एक्सॉन 23 क-शामिल isoform, एक्सॉन 23 क-निए isoform या दोनों isoforms का उपयोग किया जाता है (चित्रा 2 ). जांच सन्निकट कट ऊतक वर्गों पर इस्तेमाल किया जाता है । गणना की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि तीन ऊतक वर्गों संकरण, प्रवर्धन और संकेत का पता लगाने के चरणों में बिल्कुल एक ही इलाज कर रहे हैं.
    1. जांच संकरण ।
      1. वाशिंग रैक से स्लाइड्स निकालें और स्लाइड्स से अतिरिक्त लिक्विड पर टैप करें । स्लाइड को दाग आलमारी में रखें ।
      2. स्लाइड को जांच नाम से लेबल करने के लिए पेंसिल का उपयोग करें । तीन अलग Nf1 जांच (चित्रा 2) के साथ एक साथ संकर हो तीनों आसंन कट मस्तिष्क ऊतक स्लाइड रखो । स्लाइड्स के उसी क्रम में बाद के चरणों को पूरा करना ।
      3. ऊतक को कवर करने के लिए जांच के 4 बूंदें जोड़ें । अनुभागों को बाहर सूखने से रोकने के लिए एक समय में यह एक स्लाइड करें । नमी नियंत्रण ट्रे में दाग रैक प्लेस और यह 2 एच के लिए ४० डिग्री सेल्सियस ओवन में डालें ।
      4. धोने बफर के साथ दो बार स्लाइड धो लो । प्रत्येक धोने के लिए, 1x धोने बफर के २०० मिलीलीटर के साथ धुंधला पकवान भरें और इसे में एक कपड़े धोने की रैक जगह है । एक बार में एक कागज तौलिया एक स्लाइड पर अतिरिक्त तरल टैप करें और जल्दी से इसे धोने रैक में डालें । स्लाइड रैक ऊपर और नीचे पकवान में 3 के लिए ले जाएं-RT पर 2 मिनट के लिए 5 बार ।
      5. दूसरी वॉश के लिए, ताजा वाश बफ़र का उपयोग करें ।
    2. संकेत प्रवर्धन.
      1. स्लाइड से अतिरिक्त धोने बफर नल और उंहें दाग रैक में जगह है । ऊतक को कवर करने के लिए AMP 0 के 4 बूंदें जोड़ें । नमी नियंत्रण ट्रे में दाग रैक प्लेस और यह ४० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ओवन में डालें ।
      2. ऊपर वर्णित के रूप में दो बार धोने बफर के साथ स्लाइड धो लो ।
      3. 1 AMP के साथ इस कदम को दोहराएँ-आदेश और 2 तालिकाकी स्थिति का पालन 6. प्रत्येक संकरण चरण के बाद स्लाइड्स को दो बार धोएं ।
    3. सिग्नल डिटेक्शन
      1. स्लाइड से अतिरिक्त धोने बफर नल और उंहें दाग रैक में जगह है । एक microcentrifuge ट्यूब में फास्ट रेड ए (1:60 अनुपात) के १२० µ l को फास्ट रेड बी के 2 µ एल जोड़ें । अच्छी तरह से मिश्रण और पूरी तरह से ऊतक अनुभाग को कवर करने के लिए जोड़ें ।
        नोट: लाल A/B मिश्रण की कुल मात्रा ऊतक वर्गों की संख्या और आकार पर आधारित है । एक ०.७५ ' ' x ०.७५ ' ' क्षेत्र के लिए, १२० µ एल एक खंड के लिए पर्याप्त है । 5 मिनट के भीतर मिश्रण का उपयोग करें और सीधे सूरज की रोशनी या यूवी प्रकाश के लिए मिश्रण के जोखिम से बचें ।
      2. ट्रे और आरटी पर 10 मिनट के लिए बंद करो । एक अपशिष्ट कंटेनर के लिए समाधान निकालें और तुरंत एक वाशिंग रैक में स्लाइड डालने और नल के पानी से भरा एक धोने पकवान में रैक जगह है । ताजा नल का पानी के साथ फिर कुल्ला ।
  3. स्लाइडों का Counterstaining
    1. नल के पानी से धोने रैक निकालें, और जल्दी से शोषक कागज पर नल अतिरिक्त पानी निकालने के लिए । एक ५०% hematoxylin धुंधला समाधान में रैक रखो और तुरंत रैक ऊपर और नीचे कई बार ले जाएं । आरटी में 2 मिनट के लिए मशीन ।
    2. स्लाइड रैक वापस नल पानी पकवान में स्थानांतरण । धो 3-5 बार रैक ऊपर और नीचे ले जाकर और ताजा नल का पानी बदलने तक स्लाइड स्पष्ट हो, जबकि मस्तिष्क के ऊतकों बैंगनी रहते हैं ।
    3. एक डिश के लिए रैक ले जाएं ०.०२% अमोनिया पानी युक्त । रैक ऊपर और नीचे ले जाएं 2-3 बार जब तक ऊतकों नीले रंग की बारी है । एक धुंधला पकवान में ताजा नल के पानी के साथ स्लाइड 3-5 बार धो लें ।
  4. नमूनों के बढ़ते
    1. एक ६० डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए धुंधला पकवान से स्लाइड रैक ले जाएं और स्लाइड पूरी तरह से शुष्क कर रहे है जब तक कम से 15 मिनट के लिए गर्मी ।
    2. स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के ४० µ एल प्लेस और ध्यान से ऊतक अनुभाग पर एक 24 मिमी x ५० mm coverslip जगह है । आर टी पर 30 मिनट के लिए एयर ड्राई स्लाइड

4. डेटा संग्रह और विश्लेषण

नोट: 40X आवर्धन पर छवियों को स्कैन करने के लिए किसी स्लाइड स्कैनर का उपयोग करें ।

  1. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण
    1. प्रत्येक प्रयोग के लिए, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 3) शामिल हैं । एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, संकेत 20-40X आवर्धन पर कबरा डॉट्स के रूप में दिखाई जानी चाहिए ।
    2. उपयोग माउस (मिमी)-PPIB-1ZZ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में । यह जांच एक आम गृह व्यवस्था जीन PPIB लक्ष्य । नकारात्मक नियंत्रण के लिए, एक 20X माइक्रोस्कोप क्षेत्र प्रति पृष्ठभूमि धुंधला प्रदर्शित करने के लिए हर 20 कोशिकाओं को डॉट स्वीकार्य है ।
    3. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में DapB-1ZZ जांच का उपयोग करें । यह जांच जीवाणु जीन dapB को टारगेट करता है । इन नियंत्रण जांच कई ISH परख19में इस्तेमाल किया गया है ।
  2. संकेत पता लगाने और Nf1 एक्सॉन 23 क की अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण
    1. के रूप में संकरण संकेत कबरा डॉट्स के रूप में संकेत कर रहे हैं, डॉट्स मैंयुअल रूप से गिनती । डॉट्स की संख्या टेप है कि एक विशिष्ट जांच द्वारा पता चला है के स्तर के साथ संबंधित है । ध्यान दें कि डॉट्स की संख्या भी ImageJ या SpotStudio सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
    2. एक्सॉन 23 क-युक्त, एक्सॉन 23 क-कमी isoforms, या कुल Nf1 टेप (चित्रा 2) को संकरण करने के लिए तीन जांचों का उपयोग करें । तीन जांच एक साथ इस्तेमाल नहीं किया जा सकता के रूप में, प्रत्येक जांच करने के लिए संकरण करने के लिए तीन आसंन मस्तिष्क ऊतक वर्गों का उपयोग करें ।
      1. एक्सॉन 23 क के लिए (साई) में ब्याह प्रतिशत की गणना करने के लिए, कई मस्तिष्क क्षेत्रों में कोशिकाओं और डॉट्स की संख्या गिनती । ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए, संख्या 4में संकेत के रूप में कई उप क्षेत्रों से ४०० से अधिक कोशिकाओं की गिनती ।
      2. तीन जांचों में से प्रत्येक के लिए एक ही उप क्षेत्रों से डेटा इकट्ठा । एक्सॉन 23 क समावेश जांच के साथ प्रति सेल डॉट्स की संख्या के रूप में साई की गणना/(एक्सॉन 23 क समावेशन जांच के साथ प्रति सेल डॉट्स की संख्या + exon23a लंघन जांच के साथ सेल प्रति डॉट की संख्या) x १००% ।

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Representative Results

BaseScope ISH तीन माउस उपभेदों का उपयोग कर बाहर किया गया था: CD1 जंगली प्रकार चूहों, C57BL/6J जंगली प्रकार चूहों, और Nf1 23aIN / 23aIN उत्परिवर्ती चूहों C57BL/6J पृष्ठभूमि में, जिसमें एक्सॉन 23 क इंजीनियर ब्याह साइट का एक परिणाम के रूप में सभी सेल प्रकार में शामिल है 14उत्परिवर्तनों,15।

पहले कदम के रूप में, ISH परख प्रणाली का उपयोग कर कंपनी के एजेंट प्रदान परीक्षण किया गया: स्लाइड है कि 3T3 कोशिकाओं है, और नकारात्मक और सकारात्मक ISH जांच । चित्र 3में दर्शाए अनुसार, ऋणात्मक नियंत्रण जांच का उपयोग करते समय कोई संकेत नहीं पाया गया, जबकि धनात्मक नियंत्रण जांच का उपयोग किए जाने पर कई कबरा डॉट्स पाए गए ।

अगले, ISH माउस मस्तिष्क वर्गों और Nf1-विशिष्ट जांच कि Nf1 टेप है कि एक्सॉन 23 क, छोड़ एक्सॉन 23 क या दोनों isoforms (चित्रा 2) का पता लगाने के लिए डिज़ाइन कर रहे है का उपयोग किया गया । ये जांच विशिष्ट एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों को लक्षित करते हैं । दो मस्तिष्क क्षेत्रों Nf1 एक्सॉन 23 क: प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस CA3 (चित्रा 4) के रूप में अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करने के लिए चुना गया । प्रत्येक क्षेत्र के लिए, तीन उप-क्षेत्रों की गणना करें, जैसा कि आरेख 4में दर्शाया गया है, दोनों कक्ष और डॉट संख्या रिकॉर्डिंग । प्रत्येक क्षेत्र के लिए, कुल में लगभग ४०० कक्षों की गणना की गई और डॉट्स/ Nf1 एक्सॉन 23 क के लिए के रूप में अभिव्यक्ति पैटर्न साई के रूप में गणना की है ।

ISH CD1 चूहों के प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस में तीन Nf1 जांच के साथ प्राप्त संकेतों चित्रा 5-5F और तालिका 3में दिखाए जाते हैं । प्रांतस्था क्षेत्र से C57BL/6J Nf1+/+ और Nf123aIN/23aIN चूहों का भी विश्लेषण किया गया (चित्रा 6).

इन प्रयोगों के परिणामस्वरूप कई निष्कर्ष निकले. सबसे पहले, संकेतों का योग, डॉट्स के रूप में दिखाया गया/सेल, एक्सॉन 23 क शामिल किए जाने से पता लगाया-विशिष्ट और लंघन-विशिष्ट जांच दोनों isoforms (तालिका 3), जो पता चलता है कि तीन जांच के साथ संकर के द्वारा पता चला कि के बराबर है Nf1 समान दक्षता के साथ टेप । दूसरा, प्रांतस्था में एक्सॉन 23 क के साई मूल्य, 10%, पहले की रिपोर्ट आरटी-पीसीआर परिणाम है, जिसमें प्रांतस्था वयस्क C57BL से विच्छेदित किया गया था के साथ संगत/6J माउस मस्तिष्क कुल आरएनए अलगाव और आरटी-पीसीआर विश्लेषण14,15के बाद । यह परिणाम पता चलता है कि BaseScope ISH को मात्रात्मक ऊतक वर्गों में प्रतिलिपि स्तर के अलावा अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है । तीसरा, Nf123aIN/23aIN उत्परिवर्ती मस्तिष्क के ऊतकों, जिसमें Nf1 टेप के सभी एक्सॉन 23 क14,15होते हैं, के साथ प्राप्त परिणामों के संकेतों के समान स्तर दिखाया जब समावेश-विशिष्ट और Nf1 कुल जांच का उपयोग किया गया और कोई संकेत जब लंघन-विशिष्ट जांच का इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 6), यह दर्शाता है कि दो जांच एक्सॉन समावेशन लक्ष्यीकरण या लंघन अत्यधिक विशिष्ट हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: उपकरण ISH में इस्तेमाल किया । (क) वाशिंग डिश और वाशिंग रैक. (ख) संकरण ओवन । (ग) लक्ष्य है़ यूरिन और हॉट प्लेट सेट. (घ) आर्द्रता नियंत्रण ट्रे और दाग रैक. (ङ) Humidifying कागज आर्द्रता नियंत्रण ट्रे के अंदर एक लाल arrowhead द्वारा संकेत दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: जांच अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में Nf1 एक्सॉन 23 क का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । जांच के सभी एक ZZ जोड़ी oligonucleotide होते हैं । शामिल-विशिष्ट जांच (लाल) exons 23 क और 24, लंघन-विशिष्ट जांच (ग्रीन) के जंक्शन लक्ष्य exons 23 और 24 के जंक्शन लक्ष्य है, और Nf1 कुल जांच (नीला) 26 और 27 exons के जंक्शन लक्ष्य है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: 3T3 कक्षों पर ऋणात्मक (A-B) और धनात्मक (C-D) नियंत्रणों का उपयोग करके ISH । 3T3 कक्षों वाली नियंत्रण स्लाइड में प्रोटोकॉल में चरण 2 (नमूना-उपचार) और 3 (ISH कार्यविधि) के माध्यम से संसाधित किया गया था । सकारात्मक संकेतों लाल तीर द्वारा इंगित लाल कबरा डॉट्स के रूप में दिखाए जाते हैं. बी और डी क्रमशः एक और सी की छवियों में ज़ूम कर रहे हैं । स्केल बार = 20 µm (A and C); 5 µm (बी और डी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक माउस मस्तिष्क राज्याभिषेक अनुभाग के चित्र । लाल बक्से प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस CA3 क्षेत्रों में सेल और संकेत संख्या की गिनती के लिए चुने गए क्षेत्रों से संकेत मिलता है । स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: आरएनए ISH संकेतों Nf1-विशिष्ट जांच और माउस मस्तिष्क वर्गों का उपयोग कर पाया । CD1 दिमाग प्रोटोकॉल में कदम 1-4 के माध्यम से संसाधित किया गया । जब तीन Nf1-विशिष्ट जांच ( आरेख 3में दिखाया गया) का उपयोग किया जाता है, तो लाल कबरा डॉट्स धनात्मक संकेतों का संकेत देते हैं । प्रांतस्था (ए-सी) और हिप्पोकैम्पस (डी एफ) दिखाए जाते हैं. Nf1 कुल जांच एक और डी में इस्तेमाल किया गया था, बी और ई में शामिल-विशिष्ट जांच, और सी और एफ पैमाने बार में लंघन-विशिष्ट जांच = ४० µm (A-c); ४०० µm (डी एफ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: आरएनए ISH संकेतों Nf1 में पाया+/+ और Nf123aIN/23aIN मस्तिष्क वर्गों । दोनों माउस उपभेदों C57BL/6J पृष्ठभूमि में हैं । दिमाग प्रोटोकॉल में कदम 1-4 के माध्यम से संसाधित किया गया । एक-सी. Nf1+/+ प्रांतस्था. डी-एफ. Nf123aIN/23aIN प्रांतस्था. Nf1 कुल जांच बी और ई में एक और डी, समावेशन-विशिष्ट जांच में इस्तेमाल किया गया था, और सी और एफ में लंघन-विशिष्ट जांच । स्केल बार = ४० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मशीन के आदेश टीटी डिश में रसायन समय
1 २५० मिलीलीटर की xylene 5 min
2 २५० मिलीलीटर की xylene 5 min
3 १००% इथेनॉल के २५० मिलीलीटर 2 min
4 १००% इथेनॉल के २५० मिलीलीटर 2 min

तालिका 1: 2.1.1 कदम की मशीन प्रक्रिया ।

AMP समाधान मशीन समय गर्मी तापमान
AMP 1 15 मिनट ४० ° c
AMP 2 30 min ४० ° c
AMP 3 30 min ४० ° c
AMP 4 15 मिनट ४० ° c
AMP 5-लाल 30 min कमरे के तापमान
AMP 6-लाल 15 मिनट कमरे के तापमान

तालिका 2: कदम 3.2.2 के संकेत प्रवर्धन प्रक्रिया ।

क्षेत्र लंघन शामिल किए जाने लंघन + शामिल कुल साई
प्रांतस्था 2.9 ± 0.1 0.32 ± 0.03 ३.२१ ३.२२ 10
CA3 5.37 ± 0.2 0.2 ± 0.04 ५.५६ ५.६५ ३.७१

तालिका 3: आरएनए ISH परिणाम चित्रा 5में दिखाया छवि से गणना की । डॉट्स/कक्ष में दिखाए गए संख्याओं, प्रांतस्था और CA3 (आरेख 4) में तीन उप-क्षेत्रों में शामिल ४०० से अधिक कक्षों का उपयोग करके परिकलित किए गए थे । मानक त्रुटियां शामिल हैं ।

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Discussion

इस संचार BaseScope आरएनए ISH के उपयोग के लिए माउस मस्तिष्क वर्गों में अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में जांच रिपोर्ट । यह प्रदर्शित किया जाता है कि विरोधी भावना एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन जांच से कम ५० न्यूक्लियोटाइड एक्सॉन समावेशन लक्ष्य कर सकते है और मजबूती से और विशेष रूप से isoforms लंघन । इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप संकेत एक वैकल्पिक एक्सॉन की साई की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

कुछ रूपों की प्रक्रिया में परीक्षण किया गया । उदाहरण के लिए, जमे हुए ऊतक वर्गों cryostat द्वारा उत्पंन अनुभाग परीक्षण और इस ISH प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए सफल होने के लिए दिखाया गया । इस मामले में, हालांकि, २.१ में deparaffinization कदम 5 मिनट के लिए पंजाबियों के साथ अक्टूबर की धुलाई के लिए बदल गया था । इसके अलावा, हालांकि यह बहुत एसीडी द्वारा प्रदान की संकरण ओवन का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है, ४० ° c पर सेट एक सरल मशीन का उपयोग एक स्लाइड धुंधला immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया ट्रे तुलनीय परिणाम देता है के साथ संयुक्त । महत्वपूर्ण बात यह प्रक्रिया भर में गीला फिल्टर कागज सहित द्वारा बॉक्स में नमी रखने के लिए है ।

इस प्रक्रिया में एक सीमा है । वर्तमान में, यह एक ही ऊतक स्लाइड पर बहु रंग लेबलिंग प्रदर्शन करने के लिए व्यवहार्य नहीं है । इस प्रकार, अलग जांच केवल आसंन कट, विभिंन वर्गों पर इस्तेमाल किया जा सकता है । सही साई मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि जांच संकरण, संकेत प्रवर्धन और पता लगाने की मशीन समय हर ऊतक अनुभाग के लिए एक ही है के लिए महत्वपूर्ण है । भविष्य में, एक ही ऊतक स्लाइड पर बहु रंग जांच के उपयोग को लागू करने, के रूप में RNAscope प्रक्रियाओं में इस्तेमाल किया, अत्यधिक वांछनीय हो जाएगा ।

आरएनए ISH इस रिपोर्ट में वर्णित एक शक्तिशाली नए उपकरण के लिए मात्रात्मक सीटू मेंअभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में विश्लेषण प्रदान करता है । इस तकनीक को कई वैकल्पिक exons के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है । हाल ही की एक रिपोर्ट में, यह सफलतापूर्वक चार ंयूरॉंस में ErbB4 ब्याह isoforms और सेलुलर संकल्प20में oligodendrocytes के अंतर अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । के रूप में इस और कई अंय रिपोर्टों में दिखाया गया है, immunochemistry के साथ BaseScope आरएनए ISH का संयोजन एक शक्तिशाली दृष्टिकोण को स्थानीयकरण और अंतर से व्यक्त ब्याह isoforms6,20के समारोह का अध्ययन होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था [अनुदान-इन-एड 0365274B to H.L.], राष्ट्रीय कैंसर संस्थान [सैनिक बीजाणु P50CA150964 to Z.W.], राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [कार्यालय ऑफ रिसर्च इन्फ्रास्ट्रक्चर साझा इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट S10RR031845 मामला पश्चिमी रिजर्व विश्वविद्यालय में प्रकाश माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा], और चीन छात्रवृत्ति परिषद [X.G. करने के लिए] ।
लेखकों ने स्लाइड स्कैनिंग के साथ अपनी मदद के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी इमेजिंग कोर में रिचर्ड ली का शुक्रिया अदा किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hybridization Oven Advanced Cell Diagnostics 241000ACD
Humidity Control Tray (with lid) Advanced Cell Diagnostics 310012
Stain Rack Advanced Cell Diagnostics 310017
Hot plate Fisher Scientific 1160049SH
Imperial III General Purpose Incubator Lab-Line 302
Slide Scanner Leica SCN400
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Pretreatment kit Advanced Cell Diagnostics 322381
Hydrogen Peroxide Advanced Cell Diagnostics 2000899
Protease III* Advanced Cell Diagnostics 2000901
10x Target Retrieval Advanced Cell Diagnostics 2002555
BaseScope Detection Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 332910
AMP 0 Advanced Cell Diagnostics 2001814
AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 2001815
AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 2001816
AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 2001817
AMP 4 Advanced Cell Diagnostics 16229B
AMP 5-RED Advanced Cell Diagnostics 16229C
AMP 6-RED Advanced Cell Diagnostics 2001820
Fast RED-A Advanced Cell Diagnostics 2001821
Fast RED-B Advanced Cell Diagnostics 16230F
50x Wash Buffer Advanced Cell Diagnostics 310091
Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ Advanced Cell Diagnostics 701021
Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ Advanced Cell Diagnostics 701081
Control slide-mouse 3T3 cell pellet Advanced Cell Diagnostics 310045
Name Company Catalog Number Comments
Other supplies
Humidifying Paper Advanced Cell Diagnostics 310015
Washing Rack American Master Tech Scientific 9837976
Washing Dishes American Master Tech Scientific LWS20WH
Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratory H-4000
Glass Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass, 24 mm x 50 mm Fisher Scientific 12--545-F
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Ammonium hydroxide Fisher Scientific 002689
100% ethanol (EtOH) Decon Labs 2805
formalde solution Fisher Scientific SF94-4
Hematoxylin I American Master Tech Scientific 17012359
Mounting Medium Vector Labs H-5000
Xylene Fisher Scientific 173942

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १३८ सीटू संकरण में neurofibromatosis टाइप 1 एक्सॉन 23 क माउस ब्रेन वैकल्पिक ब्याह
वैकल्पिक पूर्व का मात्रात्मक विश्लेषण माउस मस्तिष्क वर्गों में mRNA ब्याह सीटू संकरण परख <em>में</em> आरएनए का उपयोग
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Guo, X., Zhao, Y., Nguyen, H., Liu,… More

Guo, X., Zhao, Y., Nguyen, H., Liu, T., Wang, Z., Lou, H. Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e57889, doi:10.3791/57889 (2018).

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