Summary
현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.
Abstract
대안 접합 (AS)는 인간 유전자의 90% 이상에서 발생합니다. 양자 택일로 접합된 한 exon의 표현 패턴 셀 형식 관련 패션에서 자주 통제 된다. 패턴은 일반적으로 RT-PCR 및 RNA-seq 분석 식으로 RNA 샘플을 사용 하 여 셀의 인구에서 고립. 현장에서 시험의 특정 생물 학적 구조에 대 한 식 패턴으로는 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) exon 전용 프로브를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 양자 택일 exons는 일반적으로 너무 exon 전용 프로브 디자인 때문에,의 사용이 제한 되었습니다. 이 보고서에서 BaseScope, 짧은 센스 oligonucleotides RNA 분에를 사용 하 여 최근에 개발 된 기술을 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 분석 설명 되어 있습니다. Exon 23a neurofibromatosis 유형 1 (Nf1)의 짧은 엑손-엑손 접합 프로브 마우스 뇌 섹션에 RNA 분 분석에 높은 특이성을 가진 강력한 교 잡 신호를 전시 설명 하기 위해 예제로 사용 됩니다. 더 중요 한 것은, exon 포함 및 건너뛰는 특정 프로브와 감지 신호 안정적으로 마우스 뇌의 다른 해 부 영역에 Nf1 exon 23a 식의 값에 접합 하는 퍼센트 계산을 사용할 수 있습니다. 실험 프로토콜 및 분석에 대 한 계산 방법 선물 된다. 결과 BaseScope 식 패턴에서 제자리에로 평가 하는 강력한 새로운 도구를 제공 합니다 나타냅니다.
Introduction
대안 접합 (AS)는 사전 mRNA 성숙 하는 동안 발생 하는 일반적인 과정입니다. 이 과정에서는 exon 차동 성숙한 mRNA에 포함 될 수 있습니다. 따라서, AS, 통해 한 유전자 생성할 수 있습니다 많은 mRNAs 다른 단백질 제품에 대 한 코드. 그것은 추정 인간 유전자의 92-94% 대체 접합1,2를 받 다. 비정상적인 대안 접합 패턴에서 결과 유전자 변이 루 경화 증, 암3,4, myotonic 영양 장애 등 질병의 많은 수에 연결 되었습니다. 따라서 조사 하 고 인간의 질병의 새로운 치료법을 찾을 하려고 대체 접합 규제 메커니즘 이해 결정적 이다.
마찬가지로 종종 셀 형식 관련 패션에서 통제 된다. 그것은 생물 학적 시스템에서 특정 유전자의 AS 식 패턴을 결정 하는 것이 중요입니다. 그러나,이 세포, 심장, 뇌 등의 다양 한 종류를 포함 하는 복잡 한 기관 공부 때 복잡 한 됩니다. 이 경우에, 분석 결과 시스템의 이상적인 선택 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) 티슈를 사용 하 여 특정 유전자의 AS 식 패턴 동시에 많은 세포 유형에서 검출 될 수 있다 그래서 섹션입니다. 실제로, exon 전용 프로브 대체 exon5,,67의 식 수준을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나,이 방법은 아니다 적합 패턴 분석으로 다음과 같은 이유로. 첫째, 기존의 틱 방법 일반적으로 사용 하는 프로브 300 이상 혈압, 척추 내부 exons (하지 첫 번째 또는 마지막 exon)의 평균 크기는 170 뉴클레오티드8,9. 둘째, 내부 양자 택일 exon의 접합 패턴을 검사 하는 exon 전용 프로브를 사용 하는 경우 조사에 의해 감지만 mRNA isoform는 exon를 감지할 수 없습니다 없이 mRNA isoform 동안 exon를 포함 하 이다. 따라서, 양자 택일 exon (PSI) 값에 접합 %의 계산 복잡 하다. 또한, 기존의 형광 틱 종종 결합 분 immunostaining, 검출 효율 및 견고성을 감소 시키는. 예를 들어 스트레스 유발 조사 연구에서 isoform acetylcholinesterase (통증)의 스위칭 접합 mRNA, digoxigenin 분 탐침에 통합 했다 및 안티-digoxigenin 항 체를 사용 하 여 감지. 또는, biotin 표시 된 프로브는 알칼리 성 인산 가수분해 효소/streptavidin 공액 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소10기판에 의해 검색 되었습니다. 어느 방법 탐지의 감도 증가 어떤 확대 전략을 사용 합니다. 결과적으로, 그것은 낮은 수준에서 표현 되는 mRNA 사본 검색 도전 이다. 따라서, 간단 하 고 더 강력한 분 분석 결과 시스템은 식 패턴에서 제자리에분석 필요 합니다.
BaseScope는 RNAscope, 잘 설립의 플랫폼에 따라 최근 개발 하 고 널리 이용 되는 분 분석 결과 시스템. 두 분석 결과 시스템 탐지11,12의 감도 증가 하는 특정 대상 증폭 기술을 사용 합니다. 어떻게 구별 하나에서 다른 짧은 BaseScope에 대 한 50 뉴클레오티드 및 RNAscope에 대 한 300-1000 뉴클레오티드는 대상 시퀀스의 길이입니다. 따라서, 디자인 조사 대상 엑손-엑손 접합 특정 대체 mRNA isoforms를 감지 하는 것이 가능 하다. 현재 연구에서 프로시저 neurofibromatosis 식 패턴 입력 1 (Nf1) exon 23a, 같은 실험실13,,1415 에 광범위 하 게 공부 하는 대안 exon 검사 설립 , 16 , 17, 마우스 뇌 섹션에서. 결과 BaseScope는 Nf1 exon 23a 제자리의 식 패턴을 공부 하는 이상적인 시스템을 보여 줍니다. 이 분석 결과 시스템 많은 양자 택일 exons의 표현 패턴 분석에 적응 될 수 있는, 그것은 다른 이름으로의 연구에 강력한 새로운 도구 대표
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Protocol
여기에 설명 된 쥐를 포함 하는 실험의 모든 케이스 서쪽 예비 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다. 2016-0068 프로토콜의 제목 (PI: 화 루)은 "척추 개발에 대체 이전 mRNA 접합의 역할".
참고: 모든 장비, 시 약 및 공급이이 프로토콜에 사용 되는 정보 자료의 테이블에에서 포함 됩니다.
1. 준비 포 르 말린 고정된 파라핀 포함 (FFPE) 섹션
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자 궁 경부 전위에 의해 1 CD1 마우스와 1 C57BL/6J 마우스를 안락사. 조심 스럽게 잘라 오픈 수술가 위, 집게와 두개골. 특 종으로 두뇌를 제거 합니다.
참고: 5 개월 CD1 남성 생쥐와 3 개월 된 C57BL/6J 남성 마우스 사용 되었고 비슷한 결과 보였다.- PBS와 뇌를 씻어. 전체 뇌 말린 솔루션 50 mL에 넣어 실 온 (RT)에서 10% 포 르 말린을 포함 하는 솔루션으로 30 h 전체 뇌를 해결.
- PBS를 고정 솔루션을 변경 하 고 하룻밤 4 ° c.에 PBS에 뇌를 품 어 탈수 하 고 크 실 렌 그리고 파라핀 표준 절차18를 사용 하 여 두뇌를 포함.
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톰을 사용 하 여 포함 된 조직 5 µ m 섹션으로 잘라. 첫 번째, 그리고 리본으로 45 ° C 물 욕조에 파라핀 리본 RT 물 욕조에 넣어.
- 주름과 주름 리본에서 사라질 때 즉시 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 사용 하기 전에 60 ° C에서 1 시간에 대 한 실시간 빵 슬라이드에서 하룻밤 건조 슬라이드에 어.
2. 샘플 전처리
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조직 단면도 deparaffinize 증기 두건에서 이러한 단계를 실시 합니다.
- 신선한 크 실 렌과 2 100% 에탄올의 250 mL의 250 mL로 두 세척 접시 (그림 1A)를 채우십시오. 다음 표 1에 표시 된 순서 및 보육 시간 세척 요리에서 랙 세척 세척 랙 (그림 1A) 장소에 조직 슬라이드를 삽입 합니다.
- 각 인큐베이션 기간 동안 리프트 세척 랙 아래로 3 회 이상 세척 접시에. 각 부 화 후 신속 하 게 밖으로 건조에서 조직 단면도 방지 하기 위해 다음 세척 접시에 세척 랙을 이동 합니다.
- 부 화 단계를 완료 한 후 세척 접시에서 슬라이드와 세척 선반을 제거 합니다. 랙 슬라이드는 완전히 건조 될 때까지 또는 5 분 동안 60 ° C 인큐베이터에 놓습니다.
- 소수 성 장벽 펜 조직 단면도 둘러싼 0.75 "x 0.75" 배리어를 그립니다. 공기 건조 3 분 실시간에 대 한 장벽
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분할 영역을 pretreat
- 시 약 및 장비 준비
- 교 잡 오븐 (그림 1B)를 켜고 온도를 40 ° C 사용 하기 전에 30 분 설정.
- 증류수와 humidifying 종이 (그림 1E)를 완전히 습식 및 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣어. 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.
- 10 x 대상 검색 시 약 70 mL를 dH2O의 630 mL을 추가 하 여 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 700 mL를 준비 합니다.
- 과산화 수소를 적용 합니다.
- 벤치에 deparaffinized 슬라이드를 넣어. 완전히 커버 조직 섹션에 과산화 수소의 5-8 방울을 추가 합니다. 실시간에서 10 분 동안 품 어
- 과산화 수소 솔루션을 한 번에 한 슬라이드를 제거 하는 흡수 성 종이의 조각에 슬라이드를 누릅니다. 즉시 세척 랙에 슬라이드를 삽입 하 고 세척 접시 가득 dH2오 랙 이동
- 대 한 증류수에 랙을 아래로 이동 하 여 슬라이드를 씻어 3-5 시간. 세척 접시 가득 신선한 증류수 세척 슬라이드 한 번 더 세척 랙을 이동 합니다.
- 대상 검색 수행
- 뜨거운 접시에 1000 mL 유리 비 커를 놓습니다. 비 커에 700 mL 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 추가 호 일로 다룹니다. 포 일 덮개 (그림 1C)을 통해 비 커에 온도계를 넣습니다. 핫 플레이트를 켜고 높이 10-15 분에 대 한 설정.
- 검색 시 약의 온도 98 ° C에 도달 하면, 가벼운 종 기를 유지 하기 위해 낮은 높이에서 핫 플레이트의 온도 제어를 전환 합니다. 15 분 이상 끓여 야 하지 않습니다.
- 한편, 신중 하 게 포 일을 열고 검색 젠 내부 조각와 세척 선반을 넣어. 다시 비 커를 커버 하 고 15 분 동안 품 어.
- 세척 접시를 비 커에서 선반을 제거 하려면 사용 하 여 집게 dH2O와 15 린스 200ml 가득한 s.
- 포함 하는 100% 신선한 에탄올 세척 접시 랙 이동 그리고 앉아 3 분 슬라이드를 제거 하 고 10 분 동안 60 ° C 배양 기에서 그들을 건조.
- 프로 테아 제 III를 적용
- 얼룩 랙 (그림 1D, 오른쪽)에 슬라이드를 놓습니다. 조직 커버 프로 테아 제 3의 5 방울을 추가 합니다. 조심 스럽게 랙 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣고 40 ° C 교 잡 오븐으로 트레이 삽입. 30 분 동안 품 어.
- 슬라이드 랙 제거 하 고 다시 오븐에 트레이 넣어. 제거 초과 액체, 한 번에 한 슬라이드에 슬라이드를 누릅니다. 세척 랙에서 슬라이드를 삽입 하 고 장소 세척 접시에서 랙 가득 dH2오 이동에 대 한 슬라이드를 아래로 랙 3-5 시간.
- 시 약 및 장비 준비
3. 분 분석 결과
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재료 준비
- 미리 따뜻한 워시 버퍼 워시 버퍼 x 1을 x dH2O 및 50의 60 mL 20 분 혼합 2.94 L에 40 ° C 인큐베이터에 워시 버퍼 x 50.
- DH2dH2오 믹스의 250 mL에 1 N 수산화 암모늄의 1.43 mL을 추가 하 여 수술 준비 0.02% (w/v) 암모니아 물 100 mL를 컨테이너에 잘 하는 길의 되며 100 mL를 추가 하 여 50% 되며 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
- 프로브와 앰프 0-6 사용 하기 전에 RT 30 분 시 약. 40 ° C 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.
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틱 절차
참고: isoforms를 접합 하는 n f 1 의 식 검사 하 고 exon 23a, 3 다른 분 프로브 exon 23a 포함 isoform, 대상에 대 한 값 (PSI)에 접합 하는 백분율을 계산 하려면 exon 23a 제외 isoform 또는 두 isoforms는 사용된 (그림 2 ). 프로브 adjacently 컷된 직물 단면도에 사용 됩니다. 계산의 정확도 보장 하기 위해, 그것은 3 개의 직물 단면도 처리 됩니다 중요 한 교 잡, 증폭 및 신호 감지 단계에서 정확 하 게 동일.- 교 잡 조사.
- 세척 선반에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드에서 과잉 액체를 누릅니다. 얼룩 랙에서 슬라이드를 놓습니다.
- 연필을 사용 하 여 프로브 이름으로 슬라이드를. 3 다른 Nf1 프로브 (그림 2)와 함께 때 교배 수 세 adjacently 컷된 뇌 조직 슬라이드를 넣어. 슬라이드의 순서에서 다음 단계를 실시 합니다.
- 프로브는 조직 커버를 4 방울을 추가 합니다. 섹션 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 한 번에 한 슬라이드를 할. 습도 제어 트레이에 얼룩 선반을 놓고 2 시간 동안 40 ° C 오븐에 삽입 합니다.
- 씻어 슬라이드 두 번 버퍼를 세척. 각 세척에 대 한 얼룩 요리 워시 버퍼 x 1의 200 mL와 함께 그것에 세척 선반을 배치. 한 번에 종이 타월 한 슬라이드에서 과잉 액체를 누르고 신속 하 게 세척 랙에 삽입 합니다. 대 한 접시에 아래로 슬라이드 랙 이동 실시간 2 분에 대 한 3-5 시간
- 두 번째 세척에 대 한 신선한 워시 버퍼를 사용 합니다.
- 신호의 증폭
- 슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 앰프는 조직 커버를 0 4 방울을 추가 합니다. 습도 제어 트레이에 얼룩 랙 하 고 40 ° c.에 30 분 동안 오븐에 넣고
- 씻어 슬라이드 두 번 설명한 것 처럼 버퍼를 세척.
- 1-6 다음 순서 및 조건 표 2의 앰프와 함께이 단계를 반복 합니다. 두 번 각 교 잡 단계 후 슬라이드를 씻어.
- 신호 검출
- 슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 빨리 레드의 120 µ L에 빨리 레드 B의 2 µ L를 추가 microcentrifuge 튜브에서 (1:60 비율). 잘 혼합 하 고 완벽 하 게 커버 조직 섹션에 추가.
참고: 빨간색의 총 볼륨 수와 조직 섹션의 크기를 기반으로 하는 B 믹스 /. 0.75 "x 0.75" 지역, 120 µ L 충분 한 부분입니다. 5 분 이내 믹스를 사용 하 고 직접적인 햇빛 또는 자외선 믹스의 노출을 피하십시오. - 트레이 닫습니다 및 폐기물 컨테이너 솔루션 실시간 제거에서 10 분 동안 품 어 및 즉시 세척 랙 슬라이드 삽입 선반을 두십시오는 수돗물 가득 세척 접시에. 다시 물으로 씻어 신선한 수돗물.
- 슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 빨리 레드의 120 µ L에 빨리 레드 B의 2 µ L를 추가 microcentrifuge 튜브에서 (1:60 비율). 잘 혼합 하 고 완벽 하 게 커버 조직 섹션에 추가.
- 교 잡 조사.
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슬라이드 counterstaining
- 수도 물에서 세척 랙 제거 하 고 신속 하 게 여분의 물을 제거 하는 흡수 성 종이에 누릅니다. 50% 되며 솔루션 얼룩으로 선반을 넣고 즉시 여러 번 위아래로 랙 이동. 실시간에서 2 분 동안 품 어
- 슬라이드 랙 수돗물 접시에 다시 전송 합니다. 선반을 위와 아래로 이동 하 고 슬라이드 뇌 조직 유지 보라색 명확 하 게 될 때까지 신선한 수돗물을 변경 하 여 3-5 회 세척.
- 랙 0.02% 암모니아 물을 포함 하는 접시에 이동. 랙 아래로 2-3 회 때까지 이동 조직 푸른색. 슬라이드 3-5 번 얼룩 요리에 신선한 수돗물으로 씻는 다.
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샘플의 설치
- 60 ° C 인큐베이터에 얼룩 요리에서 슬라이드 랙 이동 하 고 슬라이드 완전히 건조 될 때까지 적어도 15 분 동안 품 어.
- 슬라이드에 장착 매체의 40 µ L을 놓고 신중 하 게 조직 섹션 24 m m x 50 m m coverslip를 배치 합니다. 실시간에서 30 분 동안 공기 건조 슬라이드
4. 데이터 수집 및 분석
참고: 40 X 배율에서 이미지를 스캔 하는 슬라이드 스캐너를 사용 합니다.
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긍정적이 고 부정적인 컨트롤
- 각 실험에 대 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 (그림 3)을 포함 합니다. 좋은 긍정적인 제어 신호는 20-40 X 확대 punctate 점으로 표시 되어야 합니다.
- 사용 마우스-PPIB-1ZZ 긍정적인 제어로 (Mm). 이 프로브는 일반적인 내부 관리 유전자 PPIB 대상. 부정적인 통제에 대 한 모든 20 셀 배경 20 X 현미경 필드 얼룩을 표시 한 점을 허용 됩니다.
- DapB 1ZZ 프로브를 사용 하 여 부정적인 컨트롤. 이 조사 대상 세균 유전자 dapB. 이러한 제어 프로브 많은 분 분석 실험19에서 사용 되었습니다.
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신호 검출 및 Nf1 exon 23a의 식 패턴으로의 분석
- 교 잡 신호는 punctate 점으로 표시는, 수동으로 점 들을 계산 합니다. 도트 수 특정 조사에 의해 감지 되는 성적 증명서의 수준으로 상관 된다. 참고 도트 수 또한 ImageJ 또는 SpotStudio 소프트웨어에 의해 분석 될 수 있다.
- 3 개의 프로브를 사용 하 여 교배 exon 23a 포함, 엑손 23a 부족 isoforms, 또는 총 Nf1 성적표 (그림 2). 3 개의 프로브를 동시에 사용할 수 없습니다, 3 개의 인접 한 뇌 조직 섹션 사용 하 여 각 프로브에 교배를.
- Exon 23a에 대 한 (PSI)에 접합 하는 %를 계산 하려면 셀과 몇몇 두뇌 지구에서 점 들의 수를 계산 합니다. 관심의 각 지역에 대해 그림 4에 표시 된 대로 여러 하위 영역에서 400 개 이상의 셀을 계산.
- 각 3 개의 프로브에 대 한 동일한 하위 영역에서 데이터를 수집 합니다. 셀 당 도트 수로 계산 하는 exon 23a 포함 프로브 PSI / (exon 23a 포함 프로브 + 프로브를 건너뛰는 exon23a 셀 당 도트 수로 셀 당 점의 수) x 100%.
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Representative Results
BaseScope 분 3 마우스 종자를 사용 하 여 실시 되었다: CD1 야생 타입 마우스, C57BL/6J 야생 타입 마우스 및 C57BL/6J 배경, 어떤 exon에 23a의 결과로 모든 셀 형식에 포함 되어 있는 n f 123aIN/23aIN 돌연변이 쥐 스플라이스 사이트 설계 변이14,15.
첫 번째 단계로 분 분석 결과 시스템 제공 하는 회사 시 약을 사용 하 여 테스트 되었습니다: 슬라이드 3T3 세포, 그리고 부정과 긍정을 흉내만 프로브. 그림 3에서 보듯이, 부정적인 컨트롤 프로브, 많은 punctate 점 긍정적인 제어 프로브를 사용 하는 경우 검색 하는 동안 사용 된 때 신호 감지 되었습니다.
다음, 분 실시 되었다 마우스 뇌 섹션 및 n f 1를 사용 하 여-엑손 23a를 포함 하는 n f 1 성적을 감지 하도록 설계 된 특정 프로브 건너 exon 23a 또는 두 isoforms (그림 2). 이 프로브는 특정 엑손-엑손 접합 대상. 두 개의 두뇌 영역 Nf1 exon 23a의 AS 식 패턴 검사 선정 되었다: 피 질과 해 마 CA3 (그림 4). 각 지역, 수 세 하위 영역에 대 한 그림 4에 표시 된 대로 셀 및 점 번호를 기록 합니다. 각 지역에 대해 약 400 세포 총에서 계산 하 고 점/셀 비율을 계산 하는 데 사용 했다. Nf1 exon 23a의 AS 식 패턴 PSI로 계산 됩니다.
분 신호 3으로 얻은 n f 1 피 질에 프로브와 CD1 쥐의 해 마는 그림 5A에 나와-5 층 와 표 3. C57BL/6J에서 피 질 지역 n f 1+ + 및 n f 123aIN/23aIN 마우스는 또한 분석된 (그림 6).
이러한 실험의 결과 몇 가지 결론에 지도 했다. 첫째, 신호, 점/셀, 엑손 23a 포함 및 건너뛰는 관련 프로브 같음 3 프로브는 와 함께 때 교배 제안 두 isoforms (표 3) 하 교배 시키는 조사에 의해 감지 하 여 감지로 표시 합 N f 1 비슷한 효율 성적표. 둘째, 피 질, 10%, 엑손 23a의 PSI 값은 이전에 보고 된 RT-PCR 결과, 총 RNA 격리 및 RT-PCR 분석14,15C57BL/6J 마우스 뇌에서 피 했다 해 부와 일치. 이 결과 BaseScope 분 조직 섹션에서 성적 수준에 뿐만 아니라 식 패턴으로 양적 분석을 사용할 수 있습니다 제안 합니다. 셋째,에 모든 Nf1 성적표 포함 exon 23a14,15, n f 123aIN/23aIN 돌연변이 뇌 조직으로 얻은 결과 보였다 신호 때 포함 전용의 고 N f 1 총 프로브 사용 되었다 고 건너뛰는 전용 프로브 사용 되었다 때 신호 (그림 6), exon 포함을 대상으로 하거나 건너뛰는 두 프로브는 매우 구체적인 것을 나타내는.
그림 1: 장비 사용 분. (A) 접시를 세척 하 고 랙 세척. (B) 교 잡 오븐. (C) 검색 비 커, 핫 플레이트 세트를 대상. (D) 습도 및 트레이 제어 랙 얼룩. (E) 습도 제어 트레이 안에 빨간 화살촉으로 표시 종이가 습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 프로브 Nf1 exon 23a 식 패턴으로 검색 하는 데 사용. 모든 프로브에의 한 ZZ 쌍 oligonucleotide 포함. 포함-관련 조사 (레드) 대상 exons의 23a와 24, 건너뛰는 관련 조사 (녹색)을 대상으로 23, 24, exons의 접합 및 Nf1 총 조사 (블루) exons 26, 27의 대상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 틱은 음수 (A-B)와 긍정적인 (C D) 컨트롤 3T3 세포를 사용 하 여. 3T3 세포를 포함 하는 컨트롤 슬라이드 2 (샘플 전처리) 및 프로토콜에서 (분 절차) 3 단계 처리 했다. 긍정적인 신호는 빨간색 화살표로 표시 된 빨간색 punctate 점으로 표시 됩니다. B와 D의 이미지 확대 된 A와 C, 각각. 눈금 막대 = 20 µ m (A와 C); 5 μ (B와 D) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 마우스 뇌 코로나 섹션의 그림. 빨간 상자 피 질과 해 마 CA3 영역에 셀 및 신호 수의 계산에 대 한 선택 영역을 나타냅니다. 눈금 막대 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: RNA 분 신호 n f 1를 사용 하 여 검출-특정 프로브와 마우스 뇌 섹션. CD1 두뇌 프로토콜에 1-4 단계를 통해 처리 되었습니다. 빨간 punctate 점 긍정적인 나타냅니다 때 신호 3 n f 1-특정 프로브 ( 그림 3참조)이 사용 됩니다. 피 질 (A C)과 마 (D-F) 표시 됩니다. Nf1 총 조사는 A에서 사용 되었다와 D, B와 e, 포함 전용 프로브 및 C와 F. 규모 바에서 건너뛰는 전용 프로브 = 40 µ m (A-C); 400 µ m (D-F) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: RNA 분 신호 감지 n f 1+ + 및 n f 123aIN/23aIN 뇌 섹션. 두 마우스 긴장 C57BL/6J 배경에 있습니다. 두뇌는 프로토콜에서 1-4 단계를 통해 처리 되었습니다. A-C. N f 1+ + 피 질. D-F. N f 123aIN/23aIN 피 질. N f 1 총 조사는 A에서 사용 되었다와 D, B와 e, 포함 전용 프로브 및 C와 F. 규모 바에서 건너뛰는 전용 프로브 = 40 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 외피의 순서 | TT 접시에 화학 물질 | 시간 |
| 1 | 크 실 렌의 250 mL | 5 분 |
| 2 | 크 실 렌의 250 mL | 5 분 |
| 3 | 100% 에탄올의 250 mL | 2 분 |
| 4 | 100% 에탄올의 250 mL | 2 분 |
표 1: 단계 2.1.1의 인큐베이션 절차.
| AMP 솔루션 | 보육 시간 | 부 화 온도 |
| 1 앰프 | 15 분 | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 분 | 40 ° C |
| 앰프 3 | 30 분 | 40 ° C |
| 앰프 4 | 15 분 | 40 ° C |
| 앰프 5-레드 | 30 분 | 실내 온도 |
| 앰프 6-레드 | 15 분 | 실내 온도 |
표 2: 신호 단계 3.2.2의 확대 절차.
| 지역 | 건너뛰기 | 포함 | 건너뛰는 + 포함 | 총 | PSI |
| 피 질 | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5.56 | 5.65 | 3.71 |
표 3: RNA 분 결과 그림 5에 표시 된 이미지에서 계산. 점/셀에 표시 된 숫자, 피 질과 CA3에 세 개의 하위 영역에 포함 되어 있는 400 개 이상의 셀을 사용 하 여 계산 되었다 (그림 4). 표준 오류 포함 되어 있습니다.
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Discussion
이 통신 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 검사 BaseScope RNA의 사용을 보고 합니다. 그것은 그 반대로 감각 엑손-엑손 접합 프로브 exon 포함 하 고 견고 하 게 하 고 특히 isoforms를 건너뛰는 50 뉴클레오티드 대상 보다 짧은 시연입니다. 또한, 결과 신호 대체 exon의 PSI를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다.
몇 가지 유사 절차에서 테스트 되었습니다. 예를 들어 냉동된 조직 단면도 cryostat 단면에 의해 생성 된 테스트 되었고이 분 프로토콜에 사용 하기 위해 성공 표시. 그러나이 경우에,, deparaffinization 단계 2.1에 PBS 가진 10 월의 5 분 동안 세척로 변경 되었습니다. 또한, ACD에서 제공 하는 교 잡 오븐을 사용 하 여 매우 편리 하다, 비록 immunohistochemistry 사용 트레이 얼룩이 지는 슬라이드와 함께 하는 40 ° C에서 설정 간단한 인큐베이터를 사용 하 여 비교 결과 제공 합니다. 중요 한 것은 젖은 필터 서류 절차를 통해를 포함 하 여 상자에 수 분을 유지.
이 절차에는 한계가 있다. 현재, 그것은 다 색 라벨 같은 조직 슬라이드에 수행 가능입니다. 따라서, 다른 프로브 adjacently 컷, 다른 섹션에만 사용할 수 있습니다. PSI 정확한 값을 얻기 위해 프로브 교 잡의 외피 시간 신호 증폭 및 탐지는 되도록 모든 조직 섹션 같은 중요 하다. 미래에 구현 하는 멀티 컬러 프로브를 사용 하 여 동일한 조직 슬라이드에 RNAscope 절차에서 사용 될 것입니다 매우 바람직한.
이 보고서에 설명 된 RNA 분 양적 분석 식 패턴에서 제자리에서하는 강력한 새로운 도구를 제공 합니다. 이 기술은 많은 양자 택일 exons 연구에 적용할 수 있습니다. 최근 보고서에서 신경 세포와 세포 해상도20oligodendrocytes isoforms 접합 4 ErbB4의 차동 식 패턴을 검사 하 성공적으로 사용 되었다. 이 고 다른 여러 보고서에 표시 된, immunochemistry 함께 BaseScope RNA의 지역화 및 차동 표현된 접합 isoforms6,20의 기능 연구에 대 한 강력한 접근 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심 혼 협회 [H.L.에 특정 0365274B]에 의해 지원 되었다 국립 암 연구소 [Z.W. GI 포자 P50CA150964], 건강의 국가 학회 [사무실의 연구 인프라 공유 계측 그랜트 S10RR031845에 가벼운 현미경 검사 법 케이스 서쪽 예비 대학에서 시설 이미지], [X.G.]를 중국 장학금 위원회.
저자는 슬라이드 스캔 빛 현미경 이미징 핵심 그의 도움에 리처드 리를 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
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