Summary
여기, 우리 디자인 하 고 서식 파일, 높은 처리량 zebrafish 태아 96 잘 접시에 배열에 대 한 같은 서식 파일의 사용에 자세한 절차 뒤 개 zebrafish 태아 조작 프로토콜을 제시.
Abstract
제 브라는 세계적으로 인정된 민물 유기 체 자주 사용 개발 생물학, 환경 독성, 그리고 인간의 질병에 관련된 연구 분야 이다. 큰 통치, 배아 반투명, 빠르고 동시 개발, 등, 등의 독특한 기능 zebrafish 태아는 종종 대규모 화학 물질의 독성 평가 및 사용 약물/화합물 심사. 일반적인 심사 절차 포함 성인 zebrafish 산란, 배아 선택, 다 잘 판에 배아를 개. 거기에서 태아 노출 및 화학 물질, 독성을 복종 된다 또는 마약/화합물의 효과 phenotypic 관측에 따라 상대적으로 신속 하 게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로세스 중 개 배아 처리량 수준을 제한 하는 가장 시간이 많이 걸리는 하 고 노동 집약적인 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜에서 선물이 3D 인쇄 arraying 서식 파일의 사용과 결합 하 게 진공 속도이 힘 드는 단계를 조작 하는 혁신적인 접근 방식. 본 프로토콜 arraying 템플릿, 상세한 실험 설정 및 대표 결과 다음 단계별 절차의 전반적인 디자인을 설명 합니다. 구현 될 때,이 방법은 테스트 과목으로 zebrafish 태아를 사용 하 여 연구 응용 프로그램의 다양 한에서 도움이 증명 해야 합니다.
Introduction
인기 모델 생물으로 zebrafish 의학 및 독극물1,2,,34의 분야에서 널리 사용 됩니다. 생체 외에서 플랫폼에 비해, zebrafish 제공 훨씬 더 큰 생물 복잡 하나 또는 2 개의 세포 유형 제공 하지 못했습니다. 모델, zebrafish의 큰 통치, 빠르고 동시 배아 개발 및 높은 기관 전체 유기 체 외 반투명 대규모 독성 또는 약/화합물5를 심사에 사용 될이 모델 독특한 이점을 주었다. 매주 성인 zebrafish의 한 쌍에 의해 생성 하는 배아의 수백 다른 모든 동물 모델을 능가 하 고 높은 처리량 검열을 위해 적당 한 만든.
제 브라를 사용 하 여 일반적인 심사 절차 많은 성인 zebrafish 산란, 태아 선택, 그리고 그들이 물 침수를 통해 노출 대상이 되 적당 한 용기에 배아를 개 같은 수동 작업이 포함 됩니다. 태아의 개발은 모니터링 및 사망률, hatchability 등 비정상적인 관찰 끝점 자주 수동으로 평가 화학 물질의 독성 또는의 효과의 표시의 예비 식별으로 사용 약 또는 화합물입니다. 속도 심사 절차를, 자동화 된 이미징 및 컴퓨터 기반 이미지 분석 등 접근은 이전 탐험 되었습니다 있다. 예를 들어 현미경 이미징 기능 높은 콘텐츠로 384 분의 96 잘 접시6에서 다양 한 발달 단계에서 자동화 된 밝은 필드 또는 형광 이미징 zebrafish 태아에 수행 적응 되었습니다. 현미경과 함께 미세 장치는 뇌 뉴런7의 이미징에 대 한 현재 조작을 통해 zebrafish 애벌레를 사용 되었다. 이러한 접근 수 크게 전통적인 수동 작업에 비해 이미지 취득의 효율성을 향상 시킵니다. 또한, 생성 되는 이미지의 큰 숫자, 이미지 분석 도구 또한 개발 되었습니다 속도 데이터 처리를 같이 리 외 와 화 외. 8 , 9.
이미징 및 이미지 분석의 처리량 수준을 증가, 심사에 대 한 속도 제한 단계 96-또는 384-잘 접시에 배열 하는 일반적으로 의미 노출 zebrafish 태아를 준비 하는 과정은 취소 되었습니다. 이 병목 단계를 해결 하기 위해 비전 가이드 로봇 Mandrell 외. 에 의해 개발 되었다 10 와 미국 수동 처리 하지만 악기를 대체 하는 이전11 꽤 되었고 이러한 기술을 구현 하는 깊은 학습 곡선입니다. 따라서, 사용 하기 쉬운 접근 된다 더 zebrafish 심사 처리량 수준을 개선 하는 하나의 중요 한 요소 이며이 작품의 주요 목적은 제공 하기.
이 작품에서는, 우리는 설계 및 3D 인쇄 하 여 서식 파일을 배열 하는 배아를 조작. 이러한 arraying 서식 파일 표준 96 잘 접시와 맞는 우물으로 zebrafish 태아를 모 함 하도록 설계 되었습니다. 배아를 선택 하 고 개별 음 하나 하나에 그들을 배열, 대신 하나를 수행할 수 배아 함정 및 배열 모든 96 배아 multiwall 격판덮개로 한 번에. 이 서식 파일 및 다음 프로토콜을 사용 하 여, 하나 크게 어느 것이 기간 부스트 심사 용량 적어도 열 배, 수동 조작에 비해 multiwall 접시에 배아를 배열의 효율성을 증가할 수 있었다. 프로토콜 아래에 설명 된 템플릿, zebrafish 산란, 배아 수집, 배열 및 배열에 대 한 전반적인 디자인을 포함 한다. 그림 1 에서는 arraying 서식 파일의 전반적인 디자인. 그림 2 는 부품 3 및 4에 설명 된 서식 파일을 사용 하 여 단계별 프로토콜에 대 한 개요를 보여 줍니다.
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Protocol
1. 디자인 및 템플릿 개 Zebrafish 태아의 제조
-
8에서 12, 96-잘 레이아웃을 표준 96 잘 접시를 맞는 arraying 서식 파일을 디자인 합니다. 크기는 위 태아 함정 챔버에 대 한 그림 1A 에 나열 된 사용 (보조 파일 참조).
- 함정에 대 한 잘 그림 1B 및 1 D 에 표시 된 크기를 사용 합니다.
- 그림 1C 의 크기를 사용 하 여 바닥 진공 챔버에 대 한.
- 그림 1B 에서 치수를 사용 하 여에 어에 대 한 / 콘센트.
- (0.1 m m 정밀도)로 3D 프린터를 사용 하 여 인쇄 서식 파일; 인쇄에 사용할 권장된 수 지에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
참고: 0.1 m m 정밀 3D 프린터 arraying 서식 파일의 제작에 대 한 권장 ( 재료의 표참조). 서식 파일의 표면에 대 한 제안 된 색상은 어두운 회색 또는 검은색.
2. Zebrafish 태아 산란
- 두 켤레 상자 1 일 산란 전에 짝짓기 당 남성과 여성의 물고기를 놓습니다. 별도 남성 그리고 투명 한 플라스틱 분배기에 의해 여성.
- 벗을 디바이 더 아침에 남성과 여성의 생선을 혼합.
- 남성과 여성의 물고기를 제거 하 고 zebrafish 태아 파인 메쉬 스 트레이너를 사용 하 여 수집 합니다. 세척 배아를 250 mL 계란 물 ( 재료의 표참조).
- 접시 (직경 90 mm) Holtfreter의 솔루션에 수집 된 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 죽음과 unfertilized 배아는 stereomicroscope를 사용 하 여 제거.
- 28.5 ° C 인큐베이터에 배아를 놓습니다. 게시물 수정 (hpf)에서 4 h, 배아 관찰 하 고 모든 죽은 건강에 해로운 배아를 제거. 배아는 다음 단계에 대 한 준비가 지금입니다.
3입니다. 개 서식 파일의 준비
- 템플릿 2-3 시간 500 mL 이온을 제거 된 물으로 세척 하 고 5 분 동안 건조 오븐 (45 ℃)에 넣어.
- 테이프 씰링 필름 (그림 21 단계)의 조각으로 하단 챔버.
- 서식 파일의 아래쪽에 공기 출구를 통해 진공 펌프를 연결 합니다.
참고: 권장된 최대 진공 진공 펌프에 대 한 0.1 Mpa 이다. 사용 하는 진공의 강도 알고 있어야 합니다. 부정적인 압력 너무 강한 경우에, 압력을 낮은 씰링 필름에 있는 십자가 모양의 구멍을 잘라.
4. 96 잘 접시에 Zebrafish 태아 개
- 그림 2, 2 단계에서에서와 같이 약 150 배아는 서식 파일에 장소 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여.
- 3.3 단계에서 씰링 필름에 의해 봉인 챔버에 부정적인 압력 생성 하 공기 출구에 진공 펌프를 연결 합니다.
- 각 잘 한 배아 속은 (그림 2, 3 단계) 때까지 가로 전체 템플릿 흔들.
참고: 경우에 Holtfreter의 솔루션은 배아 각 우물에 갇혀 있다 전에 마르면, 함정 챔버에 추가 Holtfreter의 솔루션을 추가 하 고이 단계를 반복. - 여분의 Holtfreter 솔루션 및 웰 스 (그림 2, 4 단계)에 침투 하지 배아 폐기.
- 해제을 진공 펌프를 분리 합니다.
- (그림 2, 5 단계) 서식 파일에 대 한 표준 96 잘 접시를 거꾸로 배치 하 고 (그림 2, 6 단계) 동시에 회전.
- 서식 파일의 아래쪽을 누르거나 공기 연결 콘센트 압축된 가스 뿌리에 96 잘 접시 (그림 2, 6 단계)에 서식 파일에서 모든 갇힌된 배아를 전송 할 수 있는.
- 4.1 4.8 추가 멀티 잘 접시 준비 단계를 반복 합니다.
- 씰링 필름을 제거 하 고 차후 사용을 위해 500 mL 이온된 물으로 아래로 위에서 3 번 템플릿 세척.
참고: 서식 파일 청소 같은 에탄올, 어떤 유기 용 매를 사용 하지 마십시오.
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Representative Results
그림 3 은 전형적인 3D 인쇄 arraying 템플릿을 보여준다. 이 감광 성 수 지 원료로 사용 하 여 템플릿과 3D 프린터;에 의해 만들어진 블랙 페인트의 레이어 배아의 색상에 더 나은 대조를 제공 하기 위해 적용 되었습니다. 96 웰 스 (8으로 12)의 위치는 표준 96 잘 접시와 맞게 설계 되었다. 마찬가지로, 384 (16 24) 잘 서식 파일 또한 디자인 될 수 하 고 동일한 방법을 사용 하 여 조작 합니다. 거꾸로 챔버는 더 나은 적합을 제공 하기 위해 표준 96 잘 접시 보다 약간 더 큰. 홈 또한 배열 하는 동안 여분의 배아를 개최 하도록 설계 되었습니다.
겸손 한 속도로 20 접시만 2 ~ 3 접시 수동으로 준비 될 수 있는 하는 동안 30 분 이내 3D 인쇄 arraying 서식 파일을 사용 하 여 준비 수 있습니다. 표 1 은 수동, 로봇, 및 arraying 템플릿 작업을 비교를 보여준다. 그림 4 는 두 접시, 3D 인쇄 arraying 템플릿에 의해 짓고, 수동으로 준비 하는 것을 비교. Arraying 템플릿을 사용 하 여, 또한 추가 노출 실험에 대 한 편리 하 게 만든 배아 전송 액체의 금액을 무시할 수 있었다.
그림 5 에서는 수동 및 arraying 템플릿 방법으로 도금 되 고 후 태아의 전반적인 건강 상태에 중요 한 효과 없이 했다. 배아 같은 arraying 프로세스에 의해 영향을 받지 했다 다는 것을 확인 하십시오, 우리는 3 일 동안 96 잘 접시에 그들을 개 후 배아 개발 따라. 부 화 율, 생존 율, 및 24, 48, 및 72에서 zebrafish 태아의 기형 율 hpf 모두 수동으로 짓고 배아와 비교 했다.
그림 1: 디자인 서식 파일을 배열 zebrafish 태아의. (A 와 C) 3 차원 최대 도면 템플릿의 개요를 보여주는. (B) 횡단면 서식 파일의 보기. (D) A는 서식 파일의 부분 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 일반적인 단계 arraying 서식 파일을 사용 하는 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 3D 인쇄 arraying 템플릿의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 96 잘 접시에 후 배아의 현미경 이미지. 서식 파일에 짓고 96 잘 접시의 (A) 부분 이미지. (B) 수동으로 짓고 96 잘 접시의 부분 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 수동 및 arraying 템플릿 방법으로 도금 되 고 후 태아의 전반적인 건강 상태. 후 비정상적인, 해칭 및 배아의 생존 율에 따라 수동 또는 arraying 템플릿 메서드를 사용 하 여 도금, 태아의 전반적인 건강에 중요 한 효과 없이 두 경우에서 관찰 되었다. 오차 막대는 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 수동 | 로봇 플랫폼 | 배열 템플릿 | |
| 도금 시간 | 10-30 분/접시 | 5-10 분/접시 | 1-2 분/접시 |
| 비용 | 낮은 | 높은 | 낮은 |
| 필요한 교육 | 최소 | 높은 | Minumum |
| 작업 영역 | 작은 | 큰 | 작은 |
| 태아에 영향 | 거의 없음 | 거의 없음 | 거의 없음 |
| 잘 당 추가 하는 액체의 양 | 무작위 | 5-10 Μ L | 최소 |
표 1: 수동, 로봇, 및 arraying 템플릿 작업의 비교.
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Discussion
3D 인쇄 템플릿 개 zebrafish 태아의 성공적인 구현에 대 한 세심 한 관심을 필요로 하는이 프로토콜에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다.
Arraying 서식 파일의 디자인에서 가장 중요 한 요소는 함정을 잘 이다. 확실 하 게 하는 단 하나의 배아 각 우물에 갇혀, 하나 지름과 함정 우물의 깊이 통해 구멍의 지름에 세심 한 관심을 기울여야 한다. 권장된 직경 내에서 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 1.5 ~ 2 배입니다. 잘 함정의 깊이 이어야 한다 내 2 시간 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 같은 우물에서 배아의 스태킹 피하기 위해. 통해 구멍의 지름을 이어야 한다 약 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 절반을 배아는 구멍을 통해 부정적인 압력에 의해 압력을 받고 피하기 위해. 디자인의 복잡성 때문에 3D 인쇄 기술은 arraying 서식 파일의 제작에 대 한는 것이 좋습니다.
Arraying 서식 파일의 지정 된 위치, 즉 96-또는 384-잘 접시와 맞는 위치에 개별 배아를 모 함 것입니다. 장소에서 그들을 손상 없이 개별 배아를 적절 한 부정적인 압력을 만들려면 하나 진공 장치에 의해 생성 된 부정적인 압력을 조정 해야 합니다. 너무 작은 압력 우물에 그들을 트래핑 되지 수 하는 동안 너무 많은 압력, 배아를 파괴 수 있습니다. 따라서, 그것은 좋습니다 multiwell 격판덮개에 그들을 전송 하기 전에 stereomicroscope 아래 서식에 속은 태아를 관찰 하는 것. 또한, 함정, 동안 배아 수에 노출 될 공기가 과정. 이 생긴다면, 추가 Holtfreter 추가 단계 4.3에 따라 함정 챔버에 매체. 또한, 공기에 노출 되는 배아의 가능성 때문에 현재 프로토콜 dechorionated zebrafish 태아에 작동 하지 않습니다.
이 작품에서 제시 arraying 템플릿은 zebrafish 태아를 사용 하 여 낮은 비용과 높은 처리량 검열 플랫폼 구축을 위한 혁신적인 접근을 제공 합니다. 이전 설립된 로봇 플랫폼 또는 상용 교류 cytometry 기반 악기에 비해,이 메서드는 사용 하기 쉬운 고 정교한 훈련을 필요로 하지 않습니다. 3D 인쇄 기술의 복용 장점, 하나 쉽게 다른 목적에 맞게 arraying 서식 파일의 포맷을 바꿀 수 있었다.
서식 파일 및 그것의 현재 모양에 프로토콜 여전히 일부 수동 작업이 필요합니다. 절차를 간소화 수 또한 처리량 수준을 향상 고 시간의 짧은 기간 내 준비 multiwell 격판덮개의 양을 증가 합니다.
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Disclosures
저자는 설명된 3D 인쇄 서식 파일에 대 한 특허를 가득 있다.
Acknowledgments
이 작품은 "1000plan" 프로그램, Tongji 대학, 그리고 NSFC 부여 # 21607115에서 시작 자금 및 21777116 (린)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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