Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att designa och tillverka ett zebrafiskar embryo arraying mall, följt av en detaljerad procedur på användningen av sådan mall för hög genomströmning zebrafiskar embryo arraying in en plattan med 96 brunnar.
Abstract
Zebrafiskar är en globalt erkänd färskvatten organismen används ofta i utvecklingsbiologi, miljötoxikologi och mänskliga sjukdomar relaterade forskningsområden. Tack vare sina unika egenskaper, inklusive stora fruktsamhet, embryo translucens, snabb och samtidig utveckling, etc., zebrafiskar embryon används ofta för stor skala toxicitet bedömning av kemikalier och läkemedel/förening screening. En typisk screeningförfarande innebär vuxen zebrafiskar lekande, embryon urval och arraying embryon till plattor med flera. Därifrån, embryon utsätts för exponering och kemiska toxicitet eller effektiviteten av de droger/föreningarna kan utvärderas relativt snabbt utifrån fenotypiska observationer. Bland dessa processer är embryon arraying en av de mest tidskrävande och arbetsintensiva steg som begränsar dataflödesnivån. I detta protokoll presenterar vi en nyskapande strategi som gör användningen av en 3D-tryckt arraying mall tillsammans med vakuum manipulation för att påskynda detta mödosamma steg. Protokollet häri beskriver den övergripande utformningen av mallen arraying, detaljerade experiment och stegvisa anvisningar, följt av representativa resultat. När genomförs, bör detta tillvägagångssätt bevisa fördelaktigt i en mängd forskningstillämpningar med zebrafiskar embryon som testning ämnen.
Introduction
Som en populär modellorganism, är zebrafisk allmänt används i fälten för läkemedel och toxikologi1,2,3,4. Jämfört med in vitro- plattformar, zebrafiskar erbjuder mycket större biologiska komplexitet som en eller två celltyper kunde inte erbjuda. Förutom att vara en hel organism modell, zebrafiskars stora fruktsamhet, snabb och samtidiga embryonal utveckling och hög orgel translucens har gett denna modell unika fördelar som ska användas för storskaliga toxicitet eller droger/förening screening5. Hundratals embryon produceras av ett par vuxna zebrafiskar varje vecka överträffa alla andra hela djurmodeller och har gjort det lämpar sig för hög genomströmning screening.
En typisk screeningförfarande med zebrafiskar innebär en betydande mängd manuellt arbete, såsom vuxna zebrafiskar lekande, embryo urval, och arraying embryon i lämpliga behållare där de utsätts för exponering genom nedsänkning i vatten. Utvecklingen av embryon övervakas och observerbara slutpunkter som dödlighet, kläckbarhet och abnormitet ofta utvärderas manuellt och används som identifiering av preliminära toxicitet av kemikalier eller upplysningar av effektivitet droger eller föreningar. För att påskynda screeningen, har lösningar som automatiserad avbildning och datorstödd bildanalys undersökts tidigare. Till exempel, har Mikroskop med hög halt imaging funktioner anpassats till utföra automatiserade ljusa fält eller fluorescens imaging på zebrafiskar embryon i olika utvecklingsstadier från plattor med 96/3846. Mikroflödessystem enheter tillsammans med Mikroskop användes att placera zebrafiskar larver genom nuvarande manipulation för avbildning av hjärnan nervceller7. Dessa metoder kan avsevärt förbättra effektiviteten i bild förvärv jämfört med traditionell manuell drift. Dessutom med stort antal bilder som genereras, har bild analysverktyg också utvecklats för att påskynda databehandlingen, vilket framgår av Liu et al. och Tu o.a. 8 , 9.
Som dataflödesnivån bildbehandling och bildanalys ökar, blev det klart att det hastighetsbegränsande steget för screening ligger håller på att förbereda zebrafiskar embryon för exponering, vilket vanligtvis betyder att arraying dem i 96 - eller 384-bra plattor. För att lösa denna flaskhals steg, vision-guidad robotics har utvecklats av Mandrell o.a. 10 och oss11 tidigare att ersätta manuell hantering men instrumenten var ganska sofistikerad och det finns en djup inlärningskurva att genomföra sådana tekniker. Därför att ge en lätt-till-använda tillvägagångssätt blir en viktig faktor att ytterligare förbättra dataflödesnivån zebrafiskar screening och är huvudsyftet med detta arbete.
I detta arbete, vi utformade och tillverkade ett embryo arraying mall av 3D-utskrifter. En sådan arraying mallen är utformad att snärja zebrafiskar embryo i brunnar som passar med en standard plattan med 96 brunnar. Istället för att välja embryon och arraying dem i enskilda brunn en efter en, kunde en utföra array och embryo klämskador alla 96 embryon i en storsäck av plattan på en gång. Använda den här mallen och följande protokoll, kunde en avsevärt öka effektiviteten av arraying embryon i storsäck av plattor, som skulle i termen boost screening kapacitet minst tiofalt, jämfört med manuell drift. Protokollet beskrivs nedan innehåller en övergripande design för arraying mall, zebrafiskar lekande, embryosamlingsgrupper och arraying. Figur 1 visar den övergripande utformningen av mallen arraying. Figur 2 visar en översikt av stegvisa protokollet på med hjälp av mallen som beskrivs i delarna 3 och 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design och tillverkning av en zebrafiskar embryon Arraying mall
-
Utforma mallen arraying med en 12 av 8, 96 brunnar layout som passar en standard plattan med 96 brunnar. Använd måtten som anges i figur 1A för övre embryo brottsprovokation kammaren (se även kompletterande filen).
- Använd de dimensioner som visas i figur 1B och 1 D för entrapment väl.
- Använda mått i figur 1 c för den nedre vakuumkammare.
- Använda mått i figur 1B för luften i / utlopp.
- Använd en 3D-skrivare (med 0,1 mm noggrannhet) att skriva ut mallen. Se Tabell för material för rekommenderade harts som ska användas för utskrift.
Obs: 3D-skrivare med 0,1 mm noggrannhet rekommenderas för tillverkning av mallen arraying (se Tabell för material). Den föreslagna färgen för ytan av mallen är mörkgrå eller svart.
2. zebrafiskar Embryo lekande
- Placera två par manliga och kvinnliga fisk per parning box en dag före romläggningen. Separat hanar och honor av en klar plast avdelare.
- Ta bort avdelare på morgonen att blanda manliga och kvinnliga fisk.
- Ta bort den manliga och kvinnliga fisken och samla zebrafiskar embryon med en finmaskiga SIL. Tvätta embryona med 250 mL ägg vatten (se Tabell för material).
- Överföra de insamlade embryona till petriskålar (90 mm i diameter) med Holtfreters lösning (se Tabell av material) och ta bort döda och obefruktat embryon använder ett stereomikroskop.
- Placera embryona i en 28,5 ° C inkubator. På 4 h post befruktning (hpf), observerar embryon och ta bort alla döda och ohälsosamma embryon. Embryona är nu redo för nästa steg.
3. förberedelse av Arraying mall
- Tvätta mallen 2 – 3 gånger med 500 mL avjoniserat vatten och sätta den i torkugnen (45 ° C) under 5 minuter.
- Tejpa den undre kammaren med en bit tätning film (figur 2steg 1).
- Anslut en vakuumpump genom luftutsläppet längst ned i mallen.
Obs: Det rekommenderade max vakuumet för vakuumpumpen är 0,1 Mpa. Vara medveten om styrkan i det vakuum som används. Om undertrycket är för stark, skär ett korsformat hål på tätning filmen för att sänka trycket.
4. arraying zebrafiskar embryon till en plattan med 96 brunnar
- Med plast överföring pipett placera cirka 150 embryon i mallen, som visas i figur 2, steg 2.
- Anslut vakuumpumpen till luftutsläppet att generera undertryck i kammaren tätas med tätningsmassa filmen i steg 3.3.
- Skaka hela mallen horisontellt tills alla har väl ett embryo anhållna (figur 2, steg 3).
Obs: Om den Holtfreter lösningen torkar upp innan embryona är instängd i varje brunn, lägga till ytterligare Holtfreters lösning i brottsprovokation kammaren och upprepa detta. - Kassera extra Holtfreters lösning och embryon som inte är anhållna i brunnarna (figur 2, Steg4).
- Stäng av och koppla vakuumpumpen.
- Placera en standard plattan med 96 brunnar upp och ner mot mallen (figur 2, steg 5) och rotera båda samtidigt (figur 2, steg 6).
- Knacka på botten av mallen eller Anslut luft utlopp till en komprimerad gas damning kan överföra alla fångade embryon från mallen till plattan med 96 brunnar (figur 2, steg 6).
- Upprepa steg 4.1 till 4.8 att förbereda ytterligare plattor med flera.
- Ta bort tätning filmen och tvätta mallen 3 gånger från topp till botten med 500 mL avjoniserat vatten för framtida bruk.
Obs: Använd inte organiska lösningsmedel, som etanol, för att rengöra mallen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar en typisk 3D-tryckt arraying mall. Den här mallen använder ljuskänsliga harts som råvara och gjordes av en 3D-skrivare; ett lager svart färg tillämpades för att ge en bättre kontrast till färgen på embryon. Positionen för 96 brunnarna (12 av 8) var utformad för att passa med en standard plattan med 96 brunnar. Likaså en 384 (24 av 16) väl mall kunde också vara utformade och tillverkade med samma metod. Uppåtsidan kammare var något större än en standard plattan med 96 brunnar att ge en bättre passande. Spåren var också utformade för att hålla extra embryon under arraying.
På en blygsam takt, kunde 20 plattor förberedas med hjälp av 3D-tryckt arraying mallen inom 30 min, medan endast två till tre plattor kunde framställas manuellt. Tabell 1 visar en jämförelse mellan manuell, robotic och arraying mall operationer. Figur 4 visar en jämförelse mellan två plattor, en klädd av mallen 3D-tryckta arraying, en förberedd manuellt. Med mallen arraying fanns det en försumbar mängd vätska som överförs med embryon, vilket också gjorde det bekvämt för ytterligare exponering experiment.
Figur 5 visar att det fanns inga signifikanta effekter på det allmänna hälsotillståndet för embryon efter att vara klädd med mall för manuell och arraying metoder. Kontrollera att embryon inte påverkades av sådan arraying process, följde vi embryots utveckling efter arraying dem plattorna 96 brunnar i 3 dagar. Den kläckning rate, överlevnad och missbildning andelen zebrafiskar embryon vid 24, 48 och 72 hpf var alla jämförbara med embryon klädd manuellt.
Figur 1: Design av en zebrafiskar embryo arraying mallen. (A och C) 3-d Max ritning som visar en översikt över mallen. (B) tvärsnitt Visa av mallen. (D), ett delvis skymd utsikt över mallen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: typiska steg när du använder mallen arraying. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fotografier av en 3D-tryckt arraying mall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: mikroskopiska bilder av embryon efter överförts till plattan med 96 brunnar. (A) partiell bild av en plattan med 96 brunnar klädd av mallen. (B) partiell bild av en plattan med 96 brunnar klädd manuellt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: övergripande hälsostatus av embryon efter att vara klädd med manuell och arraying mall metoder. Baserat på kläckning, onormal, och överlevnaden av embryon efter att ha varit klädd med antingen manuell eller arraying mall metoderna, observerades inga signifikanta effekter på hälsan av embryon i båda fallen. Felstaplar är standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Handbok | Robotic Platform | Arraying mall | |
| Plätering tid | 10 – 30 min/plåt | 5 – 10 min/plåt | 1 – 2 min/plåt |
| Kostnad | Låg | Hög | Låg |
| Erforderlig utbildning | Minsta | Hög | Minumum |
| Arbets område | Liten | Stora | Liten |
| Effekt på embryon | Lite till ingen | Lite till ingen | Lite till ingen |
| Mängd vätska tillsatts per brunn | Slumpmässiga | 5 – 10 ΜL | Minsta |
Tabell 1: Jämförelse av manuell, robotic och arraying mall operationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två kritiska steg i detta protokoll som kräver stor uppmärksamhet för ett framgångsrikt genomförande av 3D-tryckt mall för arraying zebrafiskar embryon.
Den viktigaste faktorn om utformningen av mallen arraying är entrapment väl. Till gör att det finns bara ett embryo instängd i varje brunn, en bör ägna stor uppmärksamhet åt diametern och djupet av entrapment brunnen, och diametern på den genomgående hål. Rekommenderade diametern är inom 1,5 till 2 gånger av en typisk embryo (inklusive chorion) diameter. Djupet av entrapment väl bör vara inom 2 gånger av diametern på en typisk embryo (inklusive chorion) att undvika stapling av embryon i samma brunn. Den genomgående hål diameter bör vara ungefär hälften av diametern på en typisk embryo (inklusive chorion) att undvika embryon att pressas genom hålet av undertrycket. På grund av komplexiteten i designen rekommenderas 3D tryckteknik för tillverkning av mallen arraying.
Kärnan i mallen arraying är att snärja enskilda embryon på utsedda platser, dvs positioner som passar med en 96 - eller 384-bra platta. För att skapa ett korrekt undertryck att hålla enskilda embryon på plats utan att skada dem, måste man justera det negativa trycket som genereras av vakuum enheten. För mycket tryck kan förstöra embryon, medan för lite tryck inte kan fånga dem i brunnarna. Därför rekommenderas det att iaktta de embryon som anhållna i mallen under ett stereomikroskop innan du överför dem rundbottnade plattorna. Dessutom under brottsprovokation, kan embryon exponeras för luft under processen. Skulle detta hända, lägga till ytterligare Holtfreter's medium i brottsprovokation kammaren enligt steg 4,3. Också, på grund av möjligheten av embryon som utsätts för luft, det nuvarande protokollet fungerar inte på dechorionated zebrafiskar embryon.
Mallen arraying presenteras i detta arbete ger en innovativ metod för att fastställa en låg kostnad och hög genomströmning screening platform med zebrafiskar embryon. Jämfört med tidigare etablerade robotliknande plattformar eller kommersiellt tillgängliga flödet flödescytometri-baserade instrument, denna metod är enkel att använda och kräver inte sofistikerad utbildning. Ta fördelarna med den 3D trycktekniken, en kunde enkelt ändra formatet för mallen arraying för att passa olika ändamål.
Mallen och protokollet i dess nuvarande form fortfarande kräver lite manuellt arbete. Effektivisera förfarandet kan ytterligare förbättra dataflödesnivån och öka mängden rundbottnade plattor tillredas inom en kort tidsperiod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har fyllt ett patent på mallen beskrivs 3D-tryckta.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av programmet ”1000plan ungdom”, start medlen från Tongji University och NSFC Grant # 21607115 och 21777116 (Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
