Summary
نقدم هنا بروتوكول أخذ عينات دم الذيل-نصيحة لجمع العينات متكررة في الفئران غير المقيد. هذا الأسلوب مفيداً لتقييم أنماط من إفراز الهرمون نابض ويمكن تكييفه لتحليل للعوامل الأخرى المتداولة.
Abstract
في العديد من أجهزة الغدد الصماء، تعميم العوامل أو الهرمونات لا يتم إصدارها بشكل مستمر، ولكن يتم ويفرز كنبض منفصلة في استجابة لعامل الإفراج. إجراءات أخذ العينات نقطة واحدة لا تكفي لنفهم تماما أهمية نمط الافرازية نابض الهرمونات أما في الظروف الفسيولوجية العادية أو أثناء ظروف التقلبات البيولوجية. الهرمون (LH) هو توليفها من قبل الخلايا جونادوتروبي الغدة النخامية الأمامية ويفرز في نمط نابض مما يتطلب كثرة جمع عينات الدم لتقييم النبض. هذا لم يكن ممكناً في الفئران حتى الآونة الأخيرة، نتيجة لتطور مقايسة LH حساسية عالية ووتيرة النهوض في تقنية لجمع عينة صغيرة الحجم، وفي البداية وصف ستاين والزملاء. 1 هنا يمكننا وصف بروتوكول لجمع عينة الدم المحيطي متكررة من الفئران مع تأقلم معالجة كافية للكشف عن إفراز LH نابض. تفاصيل البروتوكول الحالي فترة تأقلم موسعة التي تتيح تقييم لنبضات قوية ومستمرة من ناحية اليسار على مدى ساعات عدة. في هذا البروتوكول، ويتم قص غيض الذيل ويتم جمع الدم من الذيل باستخدام ماصة اليد. لتقييم LH نابض في الفئران جوناديكتوميزيد، المسلسل عينات جمعت كل دقيقة 5-6 ل 90-180 دقيقة الأهم من ذلك، يمكن أن يتم جمع الدم وقياس نبضات قوية من ناحية اليسار في الفئران مستيقظا، ويتصرف بحرية، نظراً لمعالجة كافية التأقلم والجهود المبذولة للحد من الإجهاد البيئي. تأقلم كافية يمكن أن يتحقق في غضون 4-5 أسابيع قبل جمع الدم. ويبرز هذا البروتوكول السلف في منهجية لضمان جمع عينات الدم كله لتقييم الأنماط إفراز LH نابض على مدى ساعات عدة في الماوس، نموذج حيوان قوية لأبحاث الغدد الصم العصبية.
Introduction
وظيفة الغدد التناسلية في الثدييات متوقفاً على إفراز تروج والهرمون (LH) والهرمون من الغدة النخامية جريب. هي يفرز gonadotropins أما نمط نابض أو الطفرة في الاستجابة لإفراز طائي تروج – الإفراج عن هرمون (GnRH). التوليف وإفراز LH و FSH وينظم عن طريق عمل الغدد الصماء، وباراكريني، وأوتوكريني من مجموعة متنوعة من الجزيئات بما فيها جنره طائي، وهرمونات الستيرويد جوندال، والنظام أضافت-إينهيبين-فوليستاتين، فضلا عن عدد وافر من الظروف الفسيولوجية بما في ذلك توازن الطاقة والإجهاد. 2
نمط نابض LH في الدم ينشأ من إبراء ذمة مفاجئ نوعا من LH في الدم المحيطي، تليها نحو أسي القضاء. هامة تتضمن الميزات نمط تكرار كل تفريغ LH والسعة للاستجابة LH، سواء منها التي تمليها، جزئيا، الإفراج عن جنره. الواجب إلى الصعوبة في جمع الدم طائي النخامية المدخل لقياس جنره نابض، أخذ العينات وقياس LH كوكيل للائحة جنره المحور طائي جوندال الغدة النخامية. ولذلك، يتم ترميز المعلومات الحاسمة في التردد والسعة من البقول LH، الذي لا يمكن تحديده من عينة واحدة.
تحليل لإفراز LH نابض تاريخيا محدودة للثدييات الكبيرة (البشر والقرود والأغنام) نظراً لحجم كبير من الدم والتسامح لجمع عينة الدم المتكرر. في القوارض، أخذ عينات من الدم المتكرر تقتصر على الفئران ويتحقق عن طريق سكني القسطرة أذينية. 3 , 4 بتكلفة منخفضة نسبيا وتوافر الوراثية (مثل لجنة المساواة العرقية-لوكس، كريسبر) والتلاعب الدارة العصبية المعقدة (مثل أوبتوجينيتيكس، تشيموجينيتيكس) جعل الفئران كائن نموذج جذاب؛ ومع ذلك، تحقيق عينات الدم المتكررة والتحليل اللاحق لتركيزات LH حتى مؤخرا، أثبت بعيد المنال. كان رائدا في هذه المهمة الضخمة ستاين وزملاء العمل. وقد بدأت 1 منذ ذلك الحين، عدد من معامل الاستفادة من أخذ عينات من الدم المتكررة وفحوصات LH فائقة الحساسية لتقييم إفراز LH نابض في مجموعة متنوعة من النماذج التجريبية. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 تجدر بالسعي إلى طريقة عملية لجمع عينات الدم متعددة من الفئران في التقدم لمالا يقل عن 40 سنة10 مع التحسينات المتعددة المقدمة على طول الطريق. 11 , 12
يمثل تقييم أنماط نبض LH (أي من التردد والسعة) صقل كبرى في رصد إفراز تروج القاعدية في هذا النموذج الحيواني يستهدف وراثيا. تقليديا، تم تحديد تركيزات LH في الفئران في عينة دم واحدة. إحدى نقاط الضعف لعينات نقطة واحدة مجموعة البيانات اختلافاً كبيرا نظراً لأن تركيزات LH بطبيعة الحال متقلبة خلال كل نبضة. ضعف آخر وأن القياسات المعزولة أصلاً افتقد المعلومات الحاسمة التي تنقلها إلى أنماط إفراز LH نبض. وهكذا، طريقة لجمع عينات الدم المتكرر في التصرف بحرية، الفئران غير المقيد (باستثناء معالجة لطيف أثناء أخذ العينات) ستوفر معلومات معززة وتكون مفيدة للعديد من مختبرات التحقيق في تنظيم هرمون نابض.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لجمع متكررة (كل دقيقة 6) الدم عينات من الفئران مستيقظا، غير المقيد. الأهم من ذلك، أننا تشتمل التعامل مع تأقلم البروتوكول الذي يسمح بالكشف عن القوى والمستمر لإفراز LH نابض في عينات الدم كله جمعت على مدى يمكن تحديد طول الوقت الذي ما قبل وما بعد التقييم التحدي حاد، مثل الاستجابة للإجهاد النفسي والاجتماعي لتجميد وضبط النفس. وقد وصفت مقايسة فعال لتركيزات LH من عينات الدم كله سابقا؛ 1 هذا البروتوكول وتركز على أسلوب لجمع عينات الدم لقياس نبض LH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأسلوب الموصوفة هنا هو الاتفاق مع الوطني معاهد للرعاية الصحية والحيوانية واستخدام المبادئ التوجيهية، وقد إذن بها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو.
1-التأقلم للمناولة
- التعامل مع الإجراء
- ضع أقفاص الماوس في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. إزالة الماوس أول من القفص والمكان على سطح مناسبة (مثل غطاء قفص نظيفة) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
- كبح جماح بلطف الماوس على سطح العمل بعقد قاعدة الذيل مع السبابة والإبهام من جهة. ثم السكتة الدماغية بقوة على السطح البطني من الذيل، من القاعدة إلى طرف الذيل، بالسبابة والإبهام من جهة أخرى. كرر هذا الجرة 6 مرات (أي 1 من مجموعة) والعودة الماوس إلى قفصة.
- انتظر 6 دقيقة وكرر الخطوة 1.1.2.
ملاحظة: في المجموع، خطوة 1.1.2 سوف تتكرر 4 مرات للماوس (أي 4 مجموعات من السكتات الدماغية 6)، حيث أن كل الماوس سوف تتلقى ما مجموعة 24 ذيل ضربات في كل يوم للتعامل.
- تواتر المناولة اليومية
- من خمس سنوات حتى أسبوعين قبل اليوم جمع الدم المخططة، التعامل مع الفئران كما هو موضح في الخطوة 1، 1، خمسة أيام في الأسبوع (لا تتم معالجة الفئران يوم السبت أو الأحد حتى الأسبوعين الأخيرين من التأقلم).
- إذا كان العلاج التجريبي خلال فترة أخذ العينات سوف تشمل أي معالجة إضافية (مثل سكروفينج أو الحقن داخل)، التأقلم الفئران لهذا النشاط المناولة خلال كل دورة معالجة.
ملاحظة: للتأقلم لإجراءات الحقن، استخدام إبرة يتثلم القيام حقن شام. - خلال الأسبوعين الماضيين قبل اليوم جمع الدم المخططة، التعامل مع الفئران كما هو موضح في 1.1، سبعة أيام في الأسبوع.
- منزل على الأقل أسبوعين قبل يوم جمع الدم المخططة، الفئران في أزواج لتقليل الاختلالات في الفئران أثناء أخذ العينات.
2-إعداد أنابيب جمع الدم
- إعداد المخزن المؤقت لفحص LH أولتراسينسيتيفي في زجاجة زجاج: ألبومين المصل البقري 0.2% و 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني [ز 0.2 بوكل، ز 8 كلوريد الصوديوم، ز 1.44 غ2هبو4 (لا مائي)، 0.24 ز خ2ص4، الماء عالي النقاوة إلى 1 لتر وتصفية ودرجة الحموضة 7.4 اﻷوتوكﻻف] ، تخزين في 4 درجات مئوية. 1
ملاحظة: حجم LH أولتراسينسيتيفي الإنزيم المخزن المؤقت إعداد يمكن حساب استناداً إلى عدد العينات وحجم كل عينة كما هو مبين أدناه (2.2 والمناقشه) - إعداد أنابيب جمع الدم (0.6 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب). تسمية أنابيب والمقايسة الكوة المخزن المؤقت (57 ميليلتر من المخزن المؤقت كل أنبوب؛ الملاحظة، وحدة التخزين هذه قد تختلف تبعاً لحجم الدم التي يتم جمعها أو نسبة الدم إلى المخزن المؤقت المطلوب). أنابيب يمكن أن يكون مستعدا أيام قبل أخذ العينات، وتخزين في 4 درجات مئوية.
3. جمع الدم
- إعداد مواد جمع الدم.
- يعد مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لاستخدامها، وترتيب المواد التالية في غطاء محرك السيارة أو عربة القريبة: 10 ميليلتر "الماصة؛" نصائح ماصة (مجموعة 3 ميليلتر أو حجم جمع الدم المطلوب)، والنفايات بن لنصائح الماصة المستخدمة، الموقت، والنسخة المطبوعة مع إعداد الحيوانات وعينه (أرقام ملاحظات بشأن قضايا أخذ العينات أو الحيوان)، الثلجية دلو مع أنابيب جمع الدم ومقص وشاش صغير (2 "x 2").
ملاحظة: "العد" الدالة على جهاز ضبط وقت مختبر مفيد لأنه لم يكن لديه إنذار مسموعة يمكن أن تخل بالفئران - استخدام علامة دائمة للاحتفال بذيل الماوس كل (بالقرب من القاعدة) للمساعدة في التعرف السريع على الماوس الصحيح أثناء أخذ العينات.
- يعد مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لاستخدامها، وترتيب المواد التالية في غطاء محرك السيارة أو عربة القريبة: 10 ميليلتر "الماصة؛" نصائح ماصة (مجموعة 3 ميليلتر أو حجم جمع الدم المطلوب)، والنفايات بن لنصائح الماصة المستخدمة، الموقت، والنسخة المطبوعة مع إعداد الحيوانات وعينه (أرقام ملاحظات بشأن قضايا أخذ العينات أو الحيوان)، الثلجية دلو مع أنابيب جمع الدم ومقص وشاش صغير (2 "x 2").
- لقطة لإعداد مجموعة الذيل والدم قبل.
- في 45 دقيقة قبل بدء جمع الدم، إزالة الماوس أول من قفصة ووضعه على سطح مناسبة (غطاء قفص نظيف يعمل بشكل جيد) إطار السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
- استخدام مقص حاد، والعقيمة لإزالة 1-2 مم طرف ذيل الماوس، بعد إعداد العقيم (أي فرك الكحول وتدين).
ملاحظة: هذا يمكن أن يتحقق في الحيوانات مستيقظا مع ضبط النفس لطيف أو تحت التخدير إيسوفلوراني. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم توفير التسكين بناء على توصية إياكوك المحلية. - السكتة الدماغية ذيل الماوس بعناية كما هو موضح أعلاه (1-1-2؛ 1-2 السكتات الدماغية كافية عموما) حتى الحبرية أشكال الدم على طرف الذيل.
- استخدام ماصة مع تلميح نظيفة لجمع 3 ميليلتر من الدم من طرف الذيل وتجاهل نصيحة ماصة بالدم.
- قبل أن تعود الماوس إلى قفصة، ضمان أن توقف تدفق الدم. إذا لزم الأمر، تطبيق ضغط لطيف مع شاش معقم.
- كرر الخطوات 3.2.1-3.2.5 لجميع الفئران. ويمكن جمع عينات الدم اللاحقة بشدة الجرة ذيل الماوس حتى قطره دم أشكال في الطرف الذيل.
ملاحظة: إذا كان لا تشكل معالجة تجميعية دم بعد ضربات ثابتة، يمكن مست الذيل مع وسادة شاش غارقة في المياه المالحة. الجلطات أكثر احتمالاً للنموذج أثناء أخذ العينات أقل تواترا (أي > فواصل زمنية 15 دقيقة). مرة واحدة يتم مسح الجلطة من هذا السياق، يمكن مواصلة أخذ العينات. - مواصلة جمع 3 ميليلتر من الدم من كل الماوس كما هو موضح أعلاه كل دقيقة 6 لحوالي 45 دقيقة خلال هذه الفترة إعداد جمع الدم قبل. تجاهل نصيحة الدم وماصة.
- أخذ عينات من الدم
- جمع 3 ميليلتر من الدم من طرف الذيل كما هو موضح أعلاه. أخذ الحيطة والحذر لضمان أخذ العينة 3 ميليلتر الكامل في تلميح ماصة (بدون فقاعات أو تلوث الفراش). إخراج عينة الدم في المخزن المؤقت للفحص في أنبوب مسمى. مزيج من انعكاس والعودة على أنبوب للجليد.
- قبل أن تعود الماوس إلى قفصة، ضمان أن توقف تدفق الدم. إذا لزم الأمر، تطبيق ضغط لطيف مع شاش معقم.
- كرر الخطوات 3.3.1-3.3.2 لكل الماوس، كل دقيقة 6، خلال مدة محددة سلفا في أخذ العينات. رصد كل الحيوانات لإشارات الاستغاثة (الجفون مغلقة جزئيا مثل، موقف متحدب [لم يسببها العلاج الأخرى] أو عدم الاستجابة للمعالجة) وإنهاء أخذ العينات، إذا لزم الأمر.
ملاحظة: استغاثة السلوكية أو المضاعفات الأخرى التي تتطلب إنهاء لأخذ العينات جداً نادراً ما تحدث في المختبر. - إذا هي euthanized الحيوانات لا بعد أخذ عينات من الدم، التأكد من أن تدفق الدم من الذيل-نصيحة قد توقفت تماما. مسح أي الدم المسكوب من داخل قفص كل الحيوانات (أو أقفاص التغيير) والعودة في أقفاص الحيوانات إلى رف الإسكان.
4-عينة من معالجة وتحليل
- تخزين عينات الدم في-20 درجة مئوية حتى التحليل.
ملاحظة: LH هو جزيئي في عينات الدم كله تضعف في المخزن المؤقت للمقايسة؛ لا يوجد فصل من الأمصال أو البلازما مطلوب قبل التخزين أو التحليل. - فحص عينات الدم قبل أليسا أولتراسينسيتيفي كالموصوفة سابقا القيم1 والتقرير في نانوغرام/مليلتر دم كله بعد تصحيح لتخفيف حجم العينة في المخزن المؤقت للمقايسة.
- تحديد نبضات LH في مجموعة البيانات. حساب ومقارنة نبض يعني السعة وتواتر النبض (أو الفاصل الزمني لنبض بين الوكالات) حسب الاقتضاء لمجموعة البيانات.
ملاحظة: برامج ومعايير نشر13،14 ، تتوفر15،16 للكشف عن نبضات LH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أنماط نبض LH الممثل من الفئران 4 مبينة في الشكل 1 (بيانات طبعها من يانغ et al.، 2017). وتم قياس LH في عينات الدم المتكرر لتحديد الاستجابة لتحدي إجهاد النفسي حاد. أوفاريكتوميزيد فئران C57/Bl6 الإناث الكبار والتعامل معها كما هو مفصل في هذا البروتوكول لجمع الدم المتكرر. تم جمع عينات الدم لأول 90 دقيقة في جميع الحيوانات بإنشاء خط معالجة المسبقة لإفراز LH نابض. خلال 90 دقيقة ثانية لأخذ العينات، ظلت الحيوانات (غير أكد) التحكم في اقفاصها وضبط النفس الإجهاد الحيوانات تم وضعها في أجهزة ضبط النفس القوارض ومعزولة إلى أقفاص جديدة. مراقبة الحيوانات أظهرت البقول LH واضحة، لا لبس فيها طوال فترة أخذ العينات كامل. وفي المقابل، الإجهاد النفسي والاجتماعي لضبط النفس بسرعة ودون لبس قمعت إفراز LH نابض.
رقم 1: أنماط نبض LH الممثل من الفئران ovariectomized. (أ، ج) عنصر التحكم غير شدد على الفئران. (ب، د) وأكد الفئران التي فرضت ضبط النفس من 0-90 دقيقة (المنطقة المظللة الرمادية) وكان جزيئي LH. وتمثل نقاط البيانات المفتوحة البقول حددها دينبيك. 15 وقد تم تعديل هذا الرقم من يانغ et al., 158(11) الغدد الصماء: 3716-3723، 2017 بإذن من "جمعية الغدد الصماء"، حقوق الطبع والنشر عام 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لجمع الدم المتكرر لعينات الدم كل طرف الذيل للتقييم لإفراز LH نابض في الفئران. هذا البروتوكول يتيح جمع العينات للكشف عن التغيرات الحادة في إفراز LH نابض عقب التعرض للإجهاد النفسي ومناسبة تماما لتقييم البقول LH تحت الأخرى التلاعب الحاد أو المزمن.
من عناصر حاسمة لهذا البروتوكول لتحقيق ملامح قوية وموثوقة من البقول LH هو التعامل مع فترة تأقلم. تم تكهن عليها في الأدب،17 فكرة أن التعامل مع الإجهاد يمكن أن يعوق إفراز هرمون لكن لا صراحة اختباره. ومع ذلك، تحليل أنماط نبض LH الممثل صورت في المنشورات الأخيرة يبين بوضوح ميزة لتأقلم شامل للتعامل. في الدراسات المبكرة، الاستفادة من 10 أيام للمناولة، حدث LH البقول على فترات غير منتظمة مع فترات طويلة في LH لا الذي تم اكتشاف نبضات. 1 بعد ذلك المنشور المنوي، كان هناك اتجاه في الأدب لفترات معالجة أطول (أي 3 أو 4 أسابيع من المعالجة اليومية). 5 , 6 , 8 وصف البروتوكول هنا ينطوي على مجموعة من 5 أسابيع لمعالجة ولكن يحذف المناولة في عطلة نهاية الأسبوع 3 أولاً، وبالتالي تحقيق عدد مماثل من التعامل مع دورات وتقليل عبء العمل في عطلة نهاية الأسبوع التجريبيون. على الرغم من أننا لا يمكن أن توفر عدد عتبة مصادق عليه من التعامل مع الدورات المطلوبة الناجحة كشف نبضات LH، نود أن نشجع الممارسين الجديدة من هذا الإجراء للنظر في فترة تأقلم موسعة. تحت بعض النماذج التجريبية (مثل دراسة LH البقول في صغار الحيوانات)، عدة أسابيع للتعامل مع تأقلم قد لا يكون عمليا. لهذه التجارب، ومن الأهمية بمكان أن يتحقق تأقلم معالجة كافية؛ ربما جلسات معالجة متعددة يوميا ستكون كافية.
التقليل من الإجهاد البيئي أثناء فترة جمع الدم أيضا أهمية حاسمة في النجاح من هذا البروتوكول. سعيا لتحقيق هذا الهدف، ونحن البيت لدينا الفئران في غرفة هادئة داخل فيفاريوم أثناء فترة تأقلم كامل. وضع علامة "هادئة الرجاء" في خارج باب الغرفة الحيوان اليوم لأخذ العينات قد يساعد على القضاء على الانقطاع غير مقصودة. أثناء فترة جمع الدم، يمكن استخدام قطعة من قماش في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء لتوفير مكان للراحة الماصة، "الماصة؛" نصائح والأقلام، وبالتالي تقليل الضجيج الناجم عن التلاعب بهذه البنود. وأخيراً، ينصح بأن شخصا واحداً ينبغي التعامل مع الفئران وجمع جميع عينات الدم في يوم التجريبية. ينبغي أن يكون هذا الفرد الدؤوب في التعامل مع الحيوانات بعناية، وفي وقت يتفق اليوم (التي ينبغي أن تكون مشابهة لوقت أخذ العينات)، حيث المدخلات الإيقاعية معروفة للتأثير على استجابات الإجهاد. 18 البقول LH إذا نادرة أو غير قابلة للكشف، ينبغي تحديد مصادر الإجهاد دخيلة والتقليل إلى أدنى حد. آخر التفاصيل الإجرائية المتعلقة بتقليل الإجهاد أثناء فترة جمع الدم هو مقدار الوقت الذي ينقضي بين القطع من الذيل وجمع العينات تكون جزيئي لناحية اليسار. نحن مقطع ذيل الماوس كل 45 دقيقة قبل جمع العينات لفحص LH. يخدم هذا التأخير لفصل وقتيا الضغوط المرتبطة بذيل القطع من أي علاجات إضافية فرضت أثناء أخذ العينات، الذيل القطع وحدها قد ثبت للارتقاء بتعميم تركيزات القشري. 19 عينات دم سحبت لكن (تجاهل) أثناء هذا الإطار 45 دقيقة لمزيد التأقلم الفئران إلى إجراء معالجة ومنع تشكيل تجلط الدم أثناء هذا التأخير.
نظر نهائي عند استخدام هذا البروتوكول لجمع الدم المتكرر في الفئران أن حجم الدم الصغيرة من هذا النوع سوف تحد من عدد وحجم كل عينة التي تم جمعها. وفقا "دليل التفتيش الحيوانية في وزارة الزراعة"، لدى الفئران 72 مل دم كل كغم من وزن الجسم. 20 لإجراء التجارب على البقاء على قيد الحياة، 7.5 في المائة حجم الدم يمكن جمعها في فترة أخذ عينات واحد نظراً لفترة نقاهة مدتها أسبوع واحد ويمكن جمعها مع فترة انتعاش الأسبوع 2 10% حجم الدم. نقوم بشكل روتيني بجمع < 7.5 في المائة حجم الدم المقدرة من الماوس باستخدام بروتوكول جمع الدم المتكرر الحالي (بما في ذلك ممثل النتائج المعروضة هنا)، دون أي تأثير سلبي على الأنماط الافرازية LH. في أعمالنا فيفاريوم، الكبار C57/Bl6 ovariectomized الفئران تزن حوالي 22 ز (حجم الدم النظري لمل 1.58)، مما يسمح ل 118.5 ميليلتر من الدم التي سيتم جمعها. بالإضافة إلى 7 عينات جمع ما قبل المعالجة (التي لم تكن جزيئي أو تحليلها)، يتم جمع عينات 30 ما يزيد على 180 دقيقة لمجموعة من 111 ميليلتر من الدم (3 ميليلتر كل عينة)، وأقل من حد حجم الدم 7.5%. تجدر الإشارة إلى أن حجم عينة الدم قد تحتاج إلى تعديل لكشف LH في ظروف معينة عند تركيزات LH يتوقع أن تكون منخفضة. في الفئران جوناديكتوميزيد، 3 ميليلتر من الدم كله كافية للكشف عن ناحية اليسار. وينبغي النظر جمع حجم دم أكبر عندما تكون التركيزات LH منخفضة ومن المتوقع ولذلك يكون أقرب إلى حساسية فحص LH. وهكذا، على الرغم من حجم الدم الصغيرة بالماوس، يمكن جمع عينات الدم كافية لتقييم صورة كاملة غير منقوصة من إفراز LH نابض على مدى فترة 180 دقيقة.
وفي الختام، معالجة هذا الدم تكرار أخذ العينات تمديد البروتوكول يسلط الضوء على فترة تأقلم لضمان تقييم إفراز LH نابض في الفئران على مدى فترة ممتدة من الوقت. لقد أظهرنا أن هذا البروتوكول لا يكفي لوصف نبضات قوية ومنتظمة LH يمكن رصدها قبل وبعد التعرض للإجهاد النفسي والاجتماعي. هذا البروتوكول يمكن أن تتكيف مع تقييم استجابة LH لأنواع أخرى من الإجهاد أو العلاجات الأخرى التي قد تغير من إفراز هرمون الإنجاب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون هذا البروتوكول جمع الدم تكييفها لقياس العوامل الأخرى المتداولة التي تختلف في التركيز على مر الزمن، وقد تم الإبلاغ عن هرمون النمو. 21 إسهاما ملحوظا في الميدان من نيوروندوكرينولوجي أنه يمكن الآن رصد نمط إفراز LH في أنواع التي تتوافر فيها المجمع الجيني و في فيفو النهج الجزيئية لدراسة تنظيم نبض LH و العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور جنيفر يانغ وكوفمان ألكسندر (ساشا) لتقديم المساعدة التقنية مع هذا الأسلوب، فضلا عن العديد من المناقشات المفيدة والهامة. وأجريت فحوصات هرمون مصل حسب يانغ et al.، 2017 في "جامعة فيرجينيا" مركز للبحوث في الاستنساخ يجند الفحص والتحليل الأساسية، وتؤيد بمنحه يونيس كينيدي شرايفر NICHD/المعاهد الوطنية للصحة (نكتري) P50-HD28934.
مصادر لدعم البحوث: 86100 NICHD R01 (كمب)، والإدارة القائمة على النتائج وأيده T32 NICHD 007203.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
