Summary
यहाँ हम अनर्गल चूहों में लगातार नमूना संग्रह के लिए एक पूंछ टिप रक्त नमूना प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि गुणवाला luteinizing हार्मोन स्राव के पैटर्न का आकलन करने के लिए उपयोगी है और अन्य परिसंचारी कारकों के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
कई अंत-स्रावी प्रणालियों में, परिसंचारी कारकों या हार्मोन लगातार जारी नहीं कर रहे हैं, लेकिन एक जारी कारक के जवाब में एक असतत पल्स के रूप में स्रावित कर रहे हैं. एकल बिंदु नमूना उपायों को पूरी तरह से सामांय शारीरिक शर्तों के तहत या dysregulation की शर्तों के दौरान या तो गुणवाला हार्मोन के स्रावी पैटर्न के जैविक महत्व को समझने के लिए अपर्याप्त हैं । Luteinizing हार्मोन (LH) पूर्वकाल पिट्यूटरी gonadotrope कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित किया जाता है और एक गुणवाला पैटर्न है जो नाड़ी आकलन के लिए रक्त के नमूनों की लगातार संग्रह की आवश्यकता में स्रावित । यह हाल ही में जब तक चूहों में संभव नहीं किया गया है, एक उच्च संवेदनशीलता LH परख और लगातार कम मात्रा नमूना संग्रह के लिए एक तकनीक में उंनति के विकास के कारण, शुरू में स्टेन और सहकर्मियों द्वारा वर्णित है । 1 यहां हम पर्याप्त हैंडलिंग acclimatization के साथ चूहों से लगातार परिधीय रक्त नमूना संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन LH के गुणवाला स्राव का पता लगाने के लिए । वर्तमान प्रोटोकॉल विवरण एक विस्तारित acclimatization अवधि कि LH के मजबूत और सतत दालों का आकलन कई घंटे से अधिक की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल में, पूंछ की नोक काटा गया है और रक्त पूंछ से एकत्र की है एक हाथ का उपयोग कर पिपेट आयोजित की । gonadectomized चूहों में गुणवाला LH के आकलन के लिए, सीरियल नमूने हर 5-6 मिनट के लिए 90-180 मिनट के लिए एकत्र कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, रक्त और LH की मजबूत दालों की माप के संग्रह जाग में पूरा किया जा सकता है, स्वतंत्र रूप से व्यवहार चूहों, पर्याप्त हैंडलिंग दिया acclimatization और प्रयास पर्यावरण तनाव को कम करने के लिए । पर्याप्त acclimatization 4-5 सप्ताह के भीतर रक्त संग्रह करने से पहले प्राप्त किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल पद्धति में प्रगति पर प्रकाश डाला गया माउस में कई घंटे से अधिक गुणवाला LH स्राव पैटर्न के आकलन के लिए पूरे रक्त के नमूनों का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए, neuroendocrine अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल ।
Introduction
स्तनधारियों में Gonad समारोह गोनॉडोट्रॉफिन स्राव पर निर्भर है, luteinizing हार्मोन (LH) और कूप उत्तेजक हार्मोन, पिट्यूटरी ग्रंथि से. गोनैडोट्रॉपिंस या तो एक गुणवाला या वृद्धि पैटर्न गोनॉडोट्रॉफिन रिलीज हार्मोन (GnRH) के हाइपोथैलेमस स्राव के जवाब में स्रावित कर रहे हैं । संश्लेषण और दोनों LH और FSH के स्राव हाइपोथैलेमस GnRH, जननांगों स्टेरॉयड हार्मोन सहित अणुओं की एक किस्म से अंत में स्रावी, paracrine और autocrine कार्रवाई के माध्यम से विनियमित रहे हैं, और activin-inhibin-follistatin प्रणाली, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक के असंख्य तनाव और ऊर्जा संतुलन सहित शारीरिक स्थिति । 2
रक्त में lh के गुणवाला पैटर्न परिधीय रक्त में एक नहीं बल्कि अचानक निर्वहन lh से उठता है, लगभग घातीय उंमूलन के बाद । पैटर्न के महत्वपूर्ण सुविधाओं प्रत्येक lh निर्वहन की आवृत्ति और lh प्रतिक्रिया के आयाम, दोनों जिनमें से तय कर रहे हैं, भाग में, GnRH की रिहाई के द्वारा शामिल हैं । हाइपोथैलेमस के माप के लिए-पिट्यूटरी पोर्टल रक्त एकत्रित करने में कठिनाई के कारण गुणवाला GnRH, नमूना और LH की माप हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-जननांगों अक्ष के GnRH विनियमन के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किया जाता है । इसलिए, महत्वपूर्ण जानकारी आवृत्ति और LH दालों, जो एक ही नमूने से निर्धारित नहीं किया जा सकता है की आयाम में एंकोडेड है ।
गुणवाला LH स्राव का विश्लेषण ऐतिहासिक रूप से अपने बड़े रक्त मात्रा और अक्सर रक्त नमूना संग्रह के लिए सहिष्णुता के कारण बड़े स्तनधारियों (मनुष्यों, रहनुमाओं, और भेड़) तक ही सीमित किया गया है । कुतर में, लगातार रक्त नमूना चूहे को सीमित किया गया था और निवास अलिंद कैथेटर के माध्यम से हासिल की । 3 , 4 अपेक्षाकृत कम लागत और आनुवंशिक की उपलब्धता (जैसे cre-लोक्स, CRISPR) और जटिल तंत्रिका सर्किट (जैसे optogenetics, chemogenetics) जोड़तोड़ चूहों एक आकर्षक मॉडल जीव बनाने; हालांकि, लगातार रक्त के नमूनों की प्राप्ति और LH सांद्रता के बाद विश्लेषण हाल ही में जब तक है, सिद्ध मायावी । इस महासंग्राम टास्क को लेकर स्टेन और सह कार्यकर्ताओं ने बीड़ा उठाया था. 1 तब से, कई प्रयोगशालाओं प्रयोगात्मक मानदंड की एक किस्म में गुणवाला LH स्राव का आकलन करने के लिए अक्सर रक्त नमूना और अति संवेदनशील LH परख का उपयोग करने के लिए शुरू कर दिया है । 5 , 6 , 7 , 8 , 9 यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चूहों से कई रक्त के नमूनों को इकट्ठा करने की एक व्यावहारिक विधि की खोज के लिए प्रगति में कम से ४० साल10 के लिए कई तरह के साथ बनाया शोधन के साथ किया गया है । 11 , 12
LH पल्स पैटर्न का आकलन (यानी आवृत्ति और आयाम) इस आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय पशु मॉडल में बेसल गोनॉडोट्रॉफिन स्राव की निगरानी में एक प्रमुख शोधन का प्रतिनिधित्व करता है । परंपरागत रूप से, चूहों में LH सांद्रता एक एकल रक्त के नमूने में निर्धारित किया गया । एक कमजोरी एकल बिंदु नमूनों की एक उच्च चर डेटा सेट है क्योंकि LH सांद्रता स्वाभाविक रूप से प्रत्येक पल्स के दौरान उतार चढ़ाव कर रहे हैं । एक और कमजोरी यह है कि अलग माप स्वाभाविक महत्वपूर्ण जानकारी LH पल्स स्राव के पैटर्न से अवगत याद आती है । इस प्रकार, स्वतंत्र रूप से व्यवहार में अक्सर रक्त के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक विधि, अनर्गल चूहों (नमूना के दौरान कोमल हैंडलिंग के लिए छोड़कर) बढ़ाया जानकारी प्रदान करेगा और कई गुणवाला हार्मोन विनियमन की जांच प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी साबित.
यहां, हम जाग, अनर्गल चूहों से लगातार (हर 6 मिनट) रक्त के नमूने के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । महत्वपूर्ण बात, हम एक हैंडलिंग acclimatization प्रोटोकॉल है कि पूरे रक्त में समय की एक लंबी अवधि के लिए एक तीव्र चुनौती के लिए मूल्यांकन और निर्धारित किया जा सकता है की लंबाई से अधिक एकत्र पूरा खून नमूनों में गुणवाला LH स्राव के मजबूत और निरंतर पता लगाने के लिए अनुमति देता है शामिल हैं, जैसे कि स्थिरीकरण और संयम के मनोसामाजिक तनाव की प्रतिक्रिया. पूरे रक्त के नमूनों से LH सांद्रता के लिए एक प्रभावी परख पहले वर्णित किया गया है; 1 यह प्रोटोकॉल LH पल्स माप के लिए रक्त के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक विधि पर ध्यान केंद्रित है ।
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Protocol
विधि यहां वर्णित स्वास्थ्य पशु देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ समझौते में है और संस्थागत पशु देखभाल और कैलिफोर्निया, सैन डिएगो विश्वविद्यालय में उपयोग समिति द्वारा अधिकृत किया गया है ।
1. Acclimatization से निपटने के लिए
- हैंडलिंग प्रक्रिया
- जगह माउस पिंजरों में सुरक्षा कैबिनेट । एक उपयुक्त सतह पर पिंजरे और जगह से पहले माउस निकालें (उदाहरण के लिए एक साफ पिंजरे ढक्कन) के भीतर सुरक्षा कैबिनेट ।
- धीरे से काम की सतह पर माउस तर्जनी और एक हाथ की अंगूठे के साथ पूंछ के आधार पकड़ कर नियंत्रित करते हैं । फिर, मजबूती से पूंछ के ventral सतह स्ट्रोक, आधार से पूंछ की नोक करने के लिए, तर्जनी और दूसरे हाथ के अंगूठे के साथ । दोहराएं इस पथपाकर 6 बार (यानी 1 सेट) और उसके पिंजरे में माउस को वापस ।
- 6 मिनट रुको और 1.1.2 कदम दोहराएँ.
नोट: कुल में, 1.1.2 कदम माउस प्रति 4 बार दोहराया जाएगा (6 स्ट्रोक के अर्थात् 4 सेट), ताकि प्रत्येक माउस से निपटने के प्रत्येक दिन पर 24 पूंछ स्ट्रोक की कुल प्राप्त होगा ।
- दैनिक हैंडलिंग की आवृत्ति
- पांच से दो सप्ताह तक नियोजित रक्त संग्रह दिवस से पहले, १.१ कदम में वर्णित के रूप में चूहों को संभाल, प्रति सप्ताह पांच दिन (चूहों acclimatization के अंतिम दो सप्ताह तक शनिवार या रविवार को नियंत्रित नहीं कर रहे हैं).
- नमूना अवधि के दौरान प्रयोगात्मक उपचार किसी भी अतिरिक्त हैंडलिंग (जैसे scruffing या intraperitoneal इंजेक्शन) शामिल होंगे, तो प्रत्येक हैंडलिंग सत्र के दौरान इस हैंडलिंग गतिविधि के लिए चूहों acclimatize.
नोट: इंजेक्शन प्रक्रियाओं के लिए acclimatization के लिए, एक कुंद सुई का उपयोग करने के लिए एक शम इंजेक्शन प्रदर्शन. - के दौरान दो सप्ताह से पहले की योजना बनाई रक्त संग्रह दिन, १.१ में वर्णित के रूप में चूहों को संभालने, सात दिन प्रति सप्ताह.
- की योजना बनाई रक्त संग्रह दिन से कम दो सप्ताह पहले, जोड़े में घर चूहों नमूने के दौरान चूहों को व्यवधान को कम करने के लिए.
2. रक्त संग्रह ट्यूबों की तैयारी
- एक गिलास की बोतल में ultrasensitive LH परख बफर तैयार: ०.२% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन और ०.०५% के बीच-पंजाब में 20 [०.२ g KCl, 8 g NaCl, १.४४ g Na2HPO4 (निर्जल), ०.२४ g KH2पीओ4, ultrapure पानी 1 L, pH ७.४, फ़िल् टर और आटोक्लेव] , 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । 1
नोट: ultrasensitive LH परख बफर की मात्रा तैयार किया जा करने के लिए नमूनों की संख्या और नीचे संकेत के रूप में प्रति नमूना मात्रा के आधार पर गणना की जा सकती है (२.२ & चर्चा) - रक्त संग्रह ट्यूबों (0.6 ml microcentrifuge ट्यूबों) तैयार करें । लेबल ट्यूबों और aliquot परख बफर (५७ ट्यूब प्रति बफर के µ एल; ध्यान दें, यह मात्रा एकत्र रक्त की मात्रा या वांछित बफर करने के लिए रक्त के अनुपात के आधार पर भिन्न हो सकते हैं) । ट्यूबों नमूना के आगे दिन तैयार किया जा सकता, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
3. रक्त संग्रह
- रक्त संग्रह सामग्री की तैयारी ।
- उपयोग के लिए सुरक्षा कैबिनेट तैयार है, और हुड में या एक गाड़ी के पास निंनलिखित सामग्री की व्यवस्था: 10 µ l पिपेट (3 µ l या वांछित रक्त संग्रह की मात्रा के लिए सेट), पिपेट टिप्स, अपशिष्ट बिन प्रयुक्त पिपेट टिप्स, टाइमर, प्रिंटआउट के साथ पशु संख्या और नमूना संख्या ( नमूना या पशु मुद्दों के बारे में नोटों के लिए), रक्त संग्रह ट्यूबों, कैंची, और छोटे धुंध (2 "x 2") के साथ बर्फ बाल्टी ।
नोट: एक प्रयोगशाला टाइमर पर "गिनती" समारोह उपयोगी है क्योंकि यह एक श्रव्य अलार्म है कि चूहों को परेशान कर सकता है नहीं है - नमूना के दौरान सही माउस की तेजी से पहचान के साथ सहायता करने के लिए प्रत्येक माउस की पूंछ (आधार के पास) चिह्नित करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें.
- उपयोग के लिए सुरक्षा कैबिनेट तैयार है, और हुड में या एक गाड़ी के पास निंनलिखित सामग्री की व्यवस्था: 10 µ l पिपेट (3 µ l या वांछित रक्त संग्रह की मात्रा के लिए सेट), पिपेट टिप्स, अपशिष्ट बिन प्रयुक्त पिपेट टिप्स, टाइमर, प्रिंटआउट के साथ पशु संख्या और नमूना संख्या ( नमूना या पशु मुद्दों के बारे में नोटों के लिए), रक्त संग्रह ट्यूबों, कैंची, और छोटे धुंध (2 "x 2") के साथ बर्फ बाल्टी ।
- पूंछ की कतरन और पूर्व रक्त संग्रह की तैयारी ।
- ४५ मिनट में रक्त संग्रह के शुरू होने से पहले, अपने पिंजरे और एक उपयुक्त सतह पर जगह से पहले माउस को हटाने (एक साफ पिंजरे ढक्कन अच्छी तरह से काम करता है) के भीतर सुरक्षा कैबिनेट ।
- उपयोग तेज, बाँझ कैंची माउस पूंछ की नोक के 1-2 mm हटाने के लिए, अपूतित तैयारी के बाद (शराब और betadine के साथ सफ़ाई यानी).
नोट: यह कोमल संयम के साथ या isoflurane संज्ञाहरण के तहत पशुओं को जाग में पूरा किया जा सकता है । साथ ही, analgesia स्थानीय IACUC की अनुशंसा के बाद प्रदान किया जा सकता है । - सावधानी से ऊपर वर्णित के रूप में माउस की पूंछ स्ट्रोक (1.1.2; 1-2 स्ट्रोक आम तौर पर पर्याप्त है) पूंछ टिप पर रक्त रूपों की छोटी बूंद तक ।
- पूंछ टिप से रक्त के 3 µ एल इकट्ठा और रक्त के साथ पिपेट टिप त्यागने के लिए एक साफ टिप के साथ एक पिपेट का प्रयोग करें ।
- अपने पिंजरे के लिए माउस लौटने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि रक्त प्रवाह बंद कर दिया है । यदि आवश्यक हो, बाँझ धुंध के साथ कोमल दबाव लागू होते हैं ।
- सभी चूहों के लिए चरण 3.2.1-3.2.5 दोहराएँ. बाद में रक्त के नमूनों की पूंछ की नोक पर रक्त रूपों की एक छोटी बूंद तक दृढ़ता से माउस की पूंछ को पथपाकर द्वारा एकत्र किया जा सकता है ।
नोट: यदि एक रक्त छोटी बूंद फर्म स्ट्रोक के बाद फार्म नहीं करता है, पूंछ एक धुंध खारा में लथपथ पैड के साथ dabbed जा सकता है । थक्के कम अक्सर नमूने के दौरान (यानी > 15 मिनट अंतराल) के रूप में अधिक होने की संभावना है । एक बार जब थक्का नस से साफ हो जाए तो सैंपलिंग जारी रह सकती है । - प्रत्येक माउस से रक्त के 3 µ एल इकट्ठा करने के लिए जारी रखने के रूप में लगभग ४५ मिनट के लिए इस पूर्व रक्त संग्रह की तैयारी अवधि के दौरान हर 6 मिनट ऊपर वर्णित है । रक्त और पिपेट टिप त्यागें ।
- रक्त का नमूना
- ऊपर वर्णित के रूप में पूंछ टिप से रक्त की 3 µ एल लीजिए । सावधानी रखना सुनिश्चित करें कि पूरे 3 µ एल नमूना पिपेट टिप (बुलबुले या बिस्तर संक्रमण के बिना) में लिया जाता है । एक लेबल ट्यूब में परख बफर में रक्त का नमूना बाहर निकालें । उलटा करके मिश्रण और बर्फ के लिए ट्यूब वापस ।
- माउस को अपने पिंजरे में लौटने से पहले यह सुनिश्चित करें कि रक्त का प्रवाह रुक गया है । यदि आवश्यक हो, बाँझ धुंध के साथ कोमल दबाव लागू होते हैं ।
- दोहराएं चरण 3.3.1-3.3.2 प्रत्येक माउस के लिए, हर 6 मिनट, पूर्व निर्धारित नमूना अवधि के लिए । संकट के संकेत के लिए प्रत्येक जानवर की निगरानी (जैसे आंशिक रूप से बंद पलकें, कूबड़ स्थिति [अंय उपचार के कारण नहीं] या हैंडलिंग के लिए प्रतिक्रिया की कमी) और नमूना समाप्त, यदि आवश्यक हो ।
नोट: व्यवहार संकट या अंय जटिलताओं कि नमूने की समाप्ति की आवश्यकता होती है बहुत कम ही हमारी प्रयोगशाला में होते हैं । - यदि पशुओं के रक्त का नमूना निम्नलिखित euthanized नहीं हैं तो यह सुनिश्चित करें कि पूँछ से रक्त का प्रवाह-टीप पूरी तरह रुक गया हो. प्रत्येक जानवर के पिंजरे के अंदर से किसी भी गिरा रक्त पोंछ (या पिंजरों बदल) और आवास रैक के लिए पशु पिंजरों वापस ।
4. नमूना प्रसंस्करण और विश्लेषण
- विश्लेषण तक-20 डिग्री सेल्सियस पर रक्त के नमूनों की दुकान ।
नोट: LH पूरे रक्त परख बफर में पतला नमूनों में परख है; कोई जुदाई सीरा या प्लाज्मा का भंडारण या विश्लेषण करने से पहले की आवश्यकता है । - ultrasensitive एलिसा द्वारा परख रक्त के नमूनों के रूप में पहले वर्णित1 और पूरे रक्त की एनजी/एमएल में रिपोर्ट मूल्यों परख बफर में नमूना मात्रा के कमजोर पड़ने के लिए सुधार के बाद ।
- डेटा सेट में LH दालों की पहचान करें । गणना और डेटा सेट के लिए उपयुक्त के रूप में मतलब पल्स आयाम और पल्स आवृत्ति (या अंतर-पल्स अंतराल) की तुलना करें.
नोट: प्रकाशित मापदंड13,14 और प्रोग्राम,15,16 LH दालों का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं ।
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Representative Results
प्रतिनिधि LH पल्स पैटर्न से 4 चूहों चित्रा 1 में दिखाया गया है (डेटा यांग एट अलसे reprinted, २०१७) । LH एक तीव्र मनोसामाजिक तनाव चुनौती के जवाब का निर्धारण करने के लिए अक्सर रक्त के नमूनों में मापा गया था । वयस्क मादा C57/Bl6 चूहों ovariectomized और अक्सर रक्त संग्रह के लिए इस प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप में संभाला गया था । रक्त के नमूने पहले ९० मिनट के लिए सभी जानवरों में LH गुणवाला स्राव की एक पूर्व उपचार आधार रेखा स्थापित करने के लिए एकत्र किए गए । नमूना के दूसरे ९० मिनट के दौरान, नियंत्रण (गैर बल) जानवरों उनके पिंजरों में बने रहे और संयम तनाव जानवरों कुतर संयम उपकरणों में रखा गया और नए पिंजरों को अलग किया गया । नियंत्रण जानवरों पूरे नमूना अवधि भर में स्पष्ट, अस्पष्ट LH दालों दिखाया । इसके विपरीत संयम का मनोसामाजिक तनाव तेजी से और स्पष्ट रूप से दबा गुणवाला LH स्राव ।
चित्रा 1: ovariectomized चूहों से प्रतिनिधि LH पल्स पैटर्न । (क, ग) नियंत्रण गैर तनाव चूहों । (बी, डी) तनाव में चूहों जिसमें संयम 0-90 मिनट (ग्रे छायांकित क्षेत्र) से लगाया गया था और LH परख की गई थी । ओपन डेटा पॉइंट्स DynPeak द्वारा पहचाने गए दालों का प्रतिनिधित्व करते हैं । 15 यह आंकड़ा यांग एट अलसे संशोधित किया गया है., अंतःस्त्राविका 158 (11): 3716-3723, २०१७ अंत: स्रावी समाज की अनुमति के साथ, कॉपीराइट २०१७ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां हम पूरे रक्त पूंछ के लगातार रक्त संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-चूहों में गुणवाला LH स्राव के आकलन के लिए टिप नमूने । यह प्रोटोकॉल गुणवाला lh स्राव में तीव्र परिवर्तन का पता लगाने के लिए नमूनों के संग्रह को मनोसामाजिक तनाव के लिए सक्षम बनाता है और अंय तीव्र या जीर्ण जोड़तोड़ के तहत lh दालों के मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है ।
LH दालों की विश्वसनीय और मजबूत प्रोफाइल को प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण घटक हैंडलिंग acclimatization अवधि है । विचार है कि हैंडलिंग तनाव हार्मोन स्राव ख़राब कर सकते हैं पर साहित्य में अटकलें लगाई गई है,17 लेकिन स्पष्ट रूप से परीक्षण नहीं. हालांकि, हाल के प्रकाशनों में चित्रित प्रतिनिधि LH पल्स पैटर्न का विश्लेषण स्पष्ट रूप से निपटने के लिए पूरी तरह से acclimatization को एक फायदा दर्शाता है । प्रारंभिक अध्ययन में, हैंडलिंग के 10 दिनों का उपयोग, lh दालें लंबे समय तक जिसमें कोई LH दालों का पता लगाया गया के साथ अनियमित अंतराल पर हुई । 1 कि लाभदायक प्रकाशन के बाद, वहां लंबे समय से निपटने के लिए साहित्य में एक प्रवृत्ति रहा है (यानी 3 या दैनिक हैंडलिंग के 4 सप्ताह) । 5 , 6 , 8 यहां वर्णित प्रोटोकॉल से निपटने के 5 सप्ताह की कुल शामिल है, लेकिन पहले 3 सप्ताहांत पर हैंडलिंग छोड़ता है, जिससे, सत्र से निपटने के एक समान संख्या को प्राप्त करने और प्रायोगिक के लिए सप्ताहांत वर्कलोड ंयूनतम । यद्यपि हम LH दालों का सफल पता लगाने के लिए आवश्यक हैंडलिंग सत्रों की एक मान्य थ्रेशोल्ड संख्या प्रदान नहीं कर सकते हैं, हम एक विस्तारित acclimatization अवधि पर विचार करने के लिए इस प्रक्रिया के नए चिकित्सकों को प्रोत्साहित करेंगे । कुछ प्रायोगिक मानदंड के तहत (युवा जानवरों में LH दालों का अध्ययनउदा ), हैंडलिंग acclimatization के कई हफ्तों के व्यावहारिक नहीं हो सकता है । इन प्रयोगों के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त हैंडलिंग acclimatization हासिल की है; शायद कई हैंडलिंग प्रति दिन सत्र पर्याप्त होगा ।
रक्त संग्रह की अवधि के दौरान पर्यावरण के तनाव को कम करना भी इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । इस लक्ष्य की खोज में, हम पूरे acclimatization अवधि के दौरान vivarium के भीतर एक शांत कमरे में हमारे चूहों घर । एक "चुप कृपया की नियुक्ति" नमूने के दिन पर पशु कमरे के दरवाजे के बाहर पर हस्ताक्षर अवांछित रुकावट को खत्म करने में मदद कर सकते हैं । रक्त संग्रह अवधि के दौरान, एक कपड़े पिपेट, पिपेट सुझावों और कलम पर आराम करने के लिए एक जगह प्रदान करने के लिए, इस प्रकार, इन मदों में हेरफेर की वजह से शोर को कम करने के लिए एक कपड़ा का इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, यह सलाह दी जाती है कि एक व्यक्ति को चूहों को संभालना चाहिए और प्रायोगिक दिन पर सभी रक्त के नमूने एकत्र करना चाहिए । इस व्यक्ति को देखभाल के साथ पशुओं से निपटने में मेहनती होना चाहिए, और दिन के एक सुसंगत समय पर (जो नमूना समय के समान होना चाहिए), के बाद से circadian आदानों तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । 18 यदि LH दालें निराला या undetectable हैं, बाहरी तनाव के स्रोतों की पहचान की जानी चाहिए और छोटे । रक्त संग्रह अवधि के दौरान तनाव को कम करने से संबंधित एक और प्रक्रियात्मक विस्तार उस समय की मात्रा है जो पूंछ की कतरन के बीच बीतने है और नमूनों को LH के लिए परख कर संग्रह किया जाता है । हम LH परख के लिए नमूनों का संग्रह करने से पहले प्रत्येक माउस ४५ मिनट की पूंछ क्लिप । इस देरी अस्थायी किसी भी अतिरिक्त नमूना के दौरान लगाया उपचार से पूंछ कतरन के साथ जुड़े तनाव को अलग करने के लिए कार्य करता है, पूंछ अकेले कतरन के रूप में परिसंचारी corticosterone सांद्रता तरक्की करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. 19 रक्त के नमूनों को वापस ले लिया (लेकिन खारिज कर दिया) इस ४५-ंयूनतम खिड़की के दौरान आगे से निपटने की प्रक्रिया को चूहों acclimatize और इस देरी के दौरान खून का थक्का गठन को रोकने के लिए ।
एक अंतिम विचार जब चूहों में लगातार रक्त संग्रह के लिए इस प्रोटोकॉल को रोजगार है कि इस प्रजाति के छोटे रक्त की मात्रा संख्या और एकत्र प्रत्येक नमूने की मात्रा को सीमित करेगा । USDA पशु निरीक्षण गाइड के अनुसार, चूहों शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम रक्त की ७२ मिलीलीटर है । 20 जीवित रहने के प्रयोगों के लिए, रक्त की मात्रा का ७.५% एक एक नमूना अवधि में एकत्र किया जा सकता है एक 1 सप्ताह की वसूली की अवधि और रक्त की मात्रा का 10% एक 2 सप्ताह वसूली अवधि के साथ एकत्र किया जा सकता है । हम नियमित रूप से, LH स्रावी पैटर्न पर किसी भी प्रतिकूल प्रभाव के बिना वर्तमान अक्सर रक्त संग्रह प्रोटोकॉल का उपयोग कर माउस की अनुमानित रक्त मात्रा का < 7.5% इकट्ठा (प्रतिनिधि परिणाम यहां दिखाया गया है सहित) । हमारे vivarium में, वयस्क C57/Bl6 ovariectomized चूहों लगभग 22 जी (१.५८ मिलीलीटर की सैद्धांतिक रक्त मात्रा), रक्त की ११८.५ µ एल के लिए अनुमति एकत्र किया जा करने के लिए वजन । 7 पूर्व संग्रह हैंडलिंग नमूनों के अलावा (जो परख या विश्लेषण नहीं कर रहे हैं), 30 नमूनों में से एक कुल के लिए १८० मिनट पर एकत्र कर रहे हैं १११ रक्त के µ एल (नमूना प्रति 3 µ एल), जो नीचे है ७.५% रक्त मात्रा सीमा. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रक्त के नमूने की मात्रा को कुछ शर्तों में lh का पता लगाने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है जब lh सांद्रता कम होने की उंमीद है । gonadectomized चूहों में, पूरे रक्त के 3 µ l LH का पता लगाने के लिए पर्याप्त है । जब lh सांद्रता कम कर रहे है और इसलिए lh परख की संवेदनशीलता के करीब होने की उंमीद एक बड़ा रक्त की मात्रा का संग्रह माना जाना चाहिए । इस प्रकार, एक माउस के छोटे रक्त की मात्रा के बावजूद, पर्याप्त रक्त के नमूने एक १८०-ंयूनतम अवधि में गुणवाला LH स्राव के एक uncompromised प्रोफ़ाइल का आकलन करने के लिए एकत्र किया जा सकता है ।
अंत में, इस बार रक्त नमूना प्रोटोकॉल एक विस्तारित हैंडलिंग acclimatization अवधि के लिए समय की एक विस्तारित अवधि में चूहों में गुणवाला LH स्राव का आकलन सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश डाला गया । हमने दिखा दिया है कि इस प्रोटोकॉल को LH की मजबूत और नियमित रूप से दालों की विशेषता है कि पहले से नजर रखी जा सकता है और मनोसामाजिक तनाव को निंनलिखित प्रदर्शन के लिए पर्याप्त है । इस प्रोटोकॉल के तनाव या अंय उपचार है कि प्रजनन हार्मोन स्राव बदल सकता है के अंय प्रकार के लिए LH की प्रतिक्रिया का आकलन अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा, इस रक्त संग्रह प्रोटोकॉल अंय परिसंचारी कारकों है कि समय के साथ एकाग्रता में बदलती है, के रूप में वृद्धि हार्मोन के लिए सूचित किया गया है की माप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । 21 यह neuroendocrinology के क्षेत्र में उल्लेखनीय योगदान है कि lh के स्राव पैटर्न अब एक प्रजाति में नजर रखी जा सकती है जहां जटिल आनुवंशिक और vivo में आणविक दृष्टिकोण को LH पल्स विनियमन का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध है और व्यावहारिक.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । जेनिफर यांग और अलेक्जेंडर (साशा) इस तकनीक के साथ ही कई उपयोगी और महत्वपूर्ण विचार विमर्श के साथ तकनीकी सहायता के लिए Kauffman । सीरम हार्मोन परख प्रजनन Ligand परख और विश्लेषण कोर, Eunice कैनेडी श्राइवर niched/NIH (NCTRI) अनुदान P50-HD28934 द्वारा समर्थित में अनुसंधान के लिए वर्जीनिया सेंटर के विश्वविद्यालय में यांग एट अल., २०१७ द्वारा प्रदर्शन किया गया ।
अनुसंधान के समर्थन के स्रोत: R01 niched ८६१०० (KMB), RBM T32 niched ००७२०३ द्वारा समर्थित था ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
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