Summary
Her presenterer vi en hale-tips blod prøvetaking protokoll for hyppige prøvetaking i hemningsløs mus. Denne metoden er nyttig for vurdering mønstre av pulsatile luteiniserende hormon sekresjon og kan tilpasses for analyse av andre sirkulerende faktorer.
Abstract
I mange endokrine systemer, sirkulerende faktorer eller hormoner er ikke gitt ut kontinuerlig, men utskilles som et diskret puls svar for lanserer. Ett-punkts prøvetaking er utilstrekkelig å forstå biologiske betydningen av sekretoriske mønster av pulsatile hormoner under normale fysiologiske forhold eller under betingelsene i feilregulering. Luteiniserende hormon (LH) syntetiseres av fremre hypofysen gonadotrope cellene og skilles ut i et pulsatile mønster som krever hyppig samling av blodprøver puls vurdering. Dette er ikke mulig i mus til nylig på grunn av utviklingen av en høy følsomhet LH analysen og fremgang i en teknikk for hyppige lavt volum prøvetaking, først beskrevet av Steyn og kolleger. 1 her beskriver vi en protokoll for hyppige perifert blod prøvetaking fra mus med tilstrekkelig håndtering Akklimatisering å oppdage pulsatile utskillelsen av LH. Gjeldende protokollen detaljer en utvidet Akklimatisering periode der vurdering av robust og kontinuerlig pulser av LH over flere timer. I denne protokollen, spissen av halen er klippet og blod samles fra halen bruker en håndholdt pipette. Vurdering av pulsatile LH i gonadectomized mus, seriell prøver er samlet hver 5-6 minutter i 90-180 min. viktigere, innsamling av blod og måling av robust pulser av LH kan oppnås i våken, fritt oppfører mus, gitt tilstrekkelig håndtering Akklimatisering og forsøk på å minimere miljømessige stressfaktorer. Tilstrekkelig Akklimatisering kan oppnås innen 4-5 uker før blod samling. Denne protokollen fremhever den fører å sikre samling av hele blodprøver for vurdering av pulsatile LH utskillelsen mønstre over flere timer i musen, en kraftig dyr modell for neuroendocrine forskning.
Introduction
Gonad-funksjonen i pattedyr er avhengig av gonadotropin sekresjon, luteiniserende hormon (LH) og follicle stimulerende hormone, fra hypofysen. Gonadotropiner utskilles i enten et pulsatile eller bølge mønster svar på hypothalamus utskillelsen av gonadotropin - lanserer hormone (GnRH). Syntese og sekresjon av både LH og FSH er regulert via endokrine, paracrine og autocrine handling fra en rekke molekyler inkludert hypothalamus GnRH, gonadal steroidhormoner, og activin-inhibin-follistatin systemet, i tillegg til en rekke fysiologiske forhold inkludert stress og energi. 2
Pulsatile mønster av LH i blod oppstår heller brå utslipp av LH i perifert blod, etterfulgt av ca eksponentiell eliminering. Viktige funksjoner av mønsteret inkluderer hyppigheten av hver LH utslipp og amplituden til LH svaret, begge dikteres, delvis av utgivelsen av GnRH. forfallsdato på problemer med å samle hypothalamus-hypofyse portalen blod for måling av pulsatile GnRH, prøvetaking og måling av LH brukes som en proxy for GnRH regulering av hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen. Derfor er viktig informasjon kodet i frekvens og amplitude LH pulser, som ikke kan bestemmes fra en enkelt prøve.
Analyse av pulsatile LH utskillelsen har historisk vært begrenset til store pattedyr (mennesker, primater, og sau) på grunn av deres store blodvolum og toleranse for hyppige blod prøvetaking. I Red, hyppige blodprøve var begrenset til rotta og nådd via indwelling atrial kateter. 3 , 4 relativt lave kostnadene og tilgjengeligheten av genetisk (f.eks grobunn-lox, CRISPR) og kompliserte nevrale krets (f.eks optogenetics, chemogenetics) manipulasjoner mus en attraktiv modell organisme; Men, oppnåelse av hyppige blodprøver og påfølgende analyse av LH konsentrasjoner har inntil nylig vist unnvikende. Denne monumentale oppgaven ble utviklet av Steyn og kolleger. 1 siden da, flere labs har begynt å utnytte hyppige blodprøve og ultra-følsom LH analyser å vurdere pulsatile LH utskillelsen i en rekke eksperimentelle paradigmer. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 det bør bemerkes at jakten på en praktisk metode for å ta flere mus har vært i gang for minst 40 år10 med flere forbedringer gjort underveis. 11 , 12
Vurdering av LH puls mønstre (i.e. frekvens og amplitude) representerer en stor raffinement i overvåkning basale gonadotropin sekresjon i denne genetisk medgjørlig dyremodell. Tradisjonelt, var LH konsentrasjoner i mus bestemt i en enkel blodprøve. En svakhet av ett-punkts prøver er et svært variabelt datasett fordi LH konsentrasjoner er naturlig varierende under hver puls. En annen svakhet er at isolert målinger iboende savner kritiske informasjonen mønstre av LH puls sekret. Således, en metode for innsamling av hyppige blodprøver i fritt oppfører seg, uhemmet mus (unntatt skånsom behandling under prøvetaking) vil gi forbedret og være nyttig for mange laboratorier undersøker pulsatile hormon regulering.
Her beskriver vi en protokoll for innsamling av hyppig (hver 6 min) blod prøver fra våken, uhemmet mus. Viktigere, vi inkluderer en håndtering Akklimatisering protokoll som gir robust og kontinuerlig påvisning av pulsatile LH utskillelsen i hele blodprøver samlet over et tidsrom som før og etter vurdering en akutt Challenge kan bestemmes, som svar på psykososiale stress immobilisering og tilbakeholdenhet. En effektiv analysen for LH konsentrasjoner fra hele blodprøver har blitt beskrevet tidligere; 1 denne protokollen er fokusert på en metode for innsamling av blodprøver for LH pulsmåling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoden beskrevet her er i samsvar med nasjonale institutter for helse Animal Care og bruk retningslinjer og har vært godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved University of California, San Diego.
1. Akklimatisering håndtering
- Håndtering prosedyre
- Plass musen bur i fravær av smittefarlige stoffer skap. Fjern første musen fra buret og sted på en egnet overflate (f.eks ren bur lokk) innen biosikkerhet kabinett.
- Forsiktig holde musen på arbeidsflaten ved å holde foten av halen med pekefingeren og tommelen på en hånd. Deretter fast hjerneslag ventrale overflaten med halen, fra basen til spissen av halen, med pekefingeren og tommelen på den andre siden. Gjenta dette stryke 6 ganger (dvs. 1 sett) og returnere musen til buret sitt.
- Gjenta trinn 1.1.2 vente 6 min.
Merk: Totalt trinn 1.1.2 gjentatt 4 ganger per mus (dvs. 4 sett med 6 slag), slik at hver musen får totalt 24 hale slag på hver dag håndtering.
- Hyppigheten av daglig behandling
- Fra fem til to uker før planlagt blod samling, håndtere mus som beskrevet i trinn 1.1, fem dager per uke (mus ikke behandles på lørdag eller søndag til de siste to ukene av Akklimatisering).
- Hvis eksperimentell behandling i prøvetaking perioden vil omfatte noen ekstra behandling (f.eks scruffing eller intraperitoneal injeksjon), acclimatize mus til denne håndtering aktivitet under hver handling samling.
Merk: For Akklimatisering injeksjon prosedyrer, bruke en avstumpet nål for å utføre en humbug injeksjon. - I to uker før planlagt blod samling, håndtere mus som beskrevet i 1.1, sju dager i uken.
- Minst to uker før den planlagte blod samling dagen, huset mus parvis for å minimere avbrudd til mus under prøvetaking.
2. forberedelse av blod samling rør
- Forberede ultrasensitive LH analysebuffer i ett glassflaske: 0,2% bovin serum albumin og 0,05% Tween-20 i PBS [0.2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (vannfri), 0,24 g KH2PO4, ultrapure vann til 1 L, pH 7.4, filter og autoklav] , lagre på 4° C. 1
Merk: Antall ultrasensitive LH analysebuffer være forberedt kan beregnes basert på hvor mange eksempler og volum per prøve som vist nedenfor (2.2 & diskusjon) - Forberede blod samling rør (0,6 mL microcentrifuge rør). Etiketten rør og aliquot analysebuffer (57 µL av buffer per rør; oppmerksom på dette volumet kan variere avhengig av volumet av blod samles inn eller forholdet mellom blodet til bufferen ønsket). Rør kan være forberedt dager før prøvetaking, lagre på 4 ° C.
3. blod samling
- Utarbeidelse av blod samling materialer.
- Forberede biosikkerhet skap for bruk og ordne følgende materialer i panseret eller på en vogn i nærheten: 10 µL Pipetter (satt til 3 µL eller ønsket blod samling volum), pipette-spisser, avfall hyllen brukte pipette-spisser, tidtaker, utskriften dyr tall og prøve tall ( i notater om prøvetaking og dyr), iskrem bøtte med blod samling rør, saks og små gasbind (2 "x 2").
Merk: Den "teller"-funksjonen på en laboratorium timer er nyttig fordi den ikke har en hørbar alarm som kan forstyrre mus - Bruke en permanent markør for å merke halen av hver mus (nær bunnen) for å hjelpe med rask identifikasjon av riktig musen under prøvetaking.
- Forberede biosikkerhet skap for bruk og ordne følgende materialer i panseret eller på en vogn i nærheten: 10 µL Pipetter (satt til 3 µL eller ønsket blod samling volum), pipette-spisser, avfall hyllen brukte pipette-spisser, tidtaker, utskriften dyr tall og prøve tall ( i notater om prøvetaking og dyr), iskrem bøtte med blod samling rør, saks og små gasbind (2 "x 2").
- Utklipp av halen og pre blod samling utarbeidelse.
- 45 minutter før starten av samlingen blod, Fjern første musen fra buret sitt og plasser på en egnet overflate (ren bur lokk fungerer bra) i fravær av smittefarlige stoffer skap.
- Bruk skarpe, sterile saks for å fjerne 1-2 mm spissen av musen halen, etter aseptiske forberedelse (i.e. skrubbe med alkohol og betadine).
Merk: Dette kan oppnås i våken dyr med svak beherskelse eller under isoflurane anestesi. I tillegg kan analgesi leveres etter anbefaling fra den lokale IACUC. - Forsiktig stryke halen av musen som beskrevet ovenfor (1.1.2; 1-2 strøk er vanligvis tilstrekkelig) til slippverktøyet av blod på halen spissen.
- Bruke en pipette med ren tips å samle 3 µL av blod fra halen spissen og forkaste pipette spissen med blod.
- Før retur musen til buret sitt, kan du sikre at blodstrøm har stoppet. Om nødvendig kan du bruke lett trykk med sterilt gasbind.
- Gjenta trinn 3.2.1 - 3.2.5 for alle mus. Påfølgende blodprøver kan samles ved fast stryke musen er halen til en dråpe blod skjemaer på spissen av halen.
Merk: Hvis en blod dråpe ikke utgjør etter fast slag, halen kan være dytter med en gauze pute dynket i saltvann. Clots er mer sannsynlig å danne under sjeldnere prøvetaking (dvs. > 15 min intervaller). Når blodpropp fjernes fra blodåre, kan prøvetaking fortsette. - Fortsett å samle 3 µL av blod fra hver mus som beskrevet over hver 6 min i ca 45 min i denne pre blodgivning forberedelse perioden. Kast blod og pipette spissen.
- Blodprøve
- Samle 3 µL av blod fra halen spissen som beskrevet ovenfor. Ta forsiktig å sikre at hele 3 µL prøven tas i pipette spissen (uten bobler eller sengetøy forurensning). Løse ut blodprøve i analysebuffer i et merket rør. Blande av inversjon og returnere røret til is.
- Før retur musen til buret sitt, kan du sikre at blodstrøm har stoppet. Om nødvendig kan du bruke lett trykk med sterilt gasbind.
- Gjenta trinn 3.3.1 - 3.3.2 for hver musen, hver 6 min, for hele forhåndsbestemt prøvetaking. Overvåke hvert dyr for underskriver av smerte (f.eks delvis lukkede øyelokk, bøyd posisjon [ikke forårsaket av annen behandling] eller manglende respons håndtering) og avslutte prøvetaking, om nødvendig.
Merk: Atferdsmessige lidelse eller andre komplikasjoner som krever oppsigelse av prøvetaking forekommer svært sjelden i vårt laboratorium. - Hvis dyr ikke euthanized etter blodprøve, sikre at blodgjennomstrømningen fra det hale-tipset har helt sluttet. Tørk noen sølt blod på innsiden av hvert dyr bur (eller endre bur) og returnere det dyr burene til bolig rack.
4. prøve behandling og analyse
- Lagre blodprøver på 20 ° C før analysen.
Merk: LH er assayed i hele blodprøver fortynnet i analysebuffer; ingen separasjon av sera eller plasma er nødvendig før lagring eller analyse. - Analysen blodprøver ved ultrasensitive ELISA som beskrevet tidligere1 og rapporten verdier i ng/mL fullblod etter korrigering for fortynning av prøven i analysen bufferen.
- Identifisere LH pulser i datasettet. Beregne og sammenligne gjennomsnittlig puls amplitude og puls frekvens (eller Inter puls intervall) avhengig av datasettet.
Merk: Publisert kriterier13,14 og programmer,15,16 for å oppdage LH pulser er tilgjengelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant LH puls mønstre fra 4 mus er vist i figur 1 (data gjengitt fra Yang et al., 2017). LH ble målt i hyppige prøver å finne svaret på en akutt psykososiale stress utfordring. Voksne kvinnelige C57/Bl6 mus var ovariectomized og behandlet som beskrevet i denne protokollen for hyppige blod samling. Blodprøver ble samlet inn for den første 90 min i alle dyr å fastsette baseline forbehandling av LH pulsatile sekret. Under den andre 90 min av sampling, kontrollen (ikke-stresset) dyr forble i deres burene og tilbakeholdenhet stress dyr ble plassert i gnager tilbakeholdenhet enheter og isolert til nye burene. Kontrollen dyr viste klar og entydig LH pulser gjennom hele prøvetaking perioden. Derimot undertrykt psykososiale stress tilbakeholdenhet raskt og utvetydig pulsatile LH utskillelsen.
Figur 1: representant LH puls mønstre fra ovariectomized mus. (A, C) Kontroll ikke-stresset mus. (B, D) Stresset mus som tilbakeholdenhet ble innført fra 0-90 min (grå skyggelagt område) og LH var assayed. Åpne datapunkter representerer pulser identifisert av DynPeak. 15 dette tallet har blitt endret fra Yang et al., endokrinologi 158(11): 3716-3723, 2017 med tillatelse fra The endokrine Society, Copyright 2017. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for hyppige blod samling av hale-tips-blodprøver fra hele vurdering av pulsatile LH utskillelsen i mus. Dette muliggjør innsamling av prøver for påvisning av akutte endringer i pulsatile LH utskillelsen etter eksponering for psykososial stress og er godt egnet for vurdering av LH pulser under andre akutt eller kronisk manipulasjoner.
En kritisk komponent i denne protokollen for å oppnå driftssikker og robust profiler LH pulser er håndtering Akklimatisering periode. Ideen at håndtere stress kan svekke hormon sekresjonen har vært spekulert på i litteraturen,17 men ikke eksplisitt testet. Imidlertid viser analyse representant LH puls mønstre i siste publikasjoner tydelig en fordel å grundig Akklimatisering håndtering. I tidlige studier, utnytte 10 dager etter håndtering, skjedde LH pulser uregelmessig med lengre perioder i som ingen LH pulser ble oppdaget. 1 etter banebrytende publikasjonen, det er en trend i litteraturen for lengre håndtering perioder (dvs. 3 eller 4 uker daglig håndtering). 5 , 6 , 8 protokollen beskrevet her innebærer totalt fem uker med behandling, men utelater håndtering i de første 3 helgene, dermed å oppnå en lignende håndtering økter og minimere helg arbeidsbelastninger for experimentalists. Selv om vi ikke kan gi et valideres terskelverdi for antall kreves håndtering økter for vellykket påvisning av LH pulser, vi vil oppfordre nye utøvere av denne prosedyren til å vurdere en utvidet Akklimatisering periode. Under visse eksperimentelle paradigmer (f.eks studere LH pulser i ung dyrene), alltid flere uker å håndtere Akklimatisering ikke praktisk. Disse eksperimentene er det kritisk at tilstrekkelig håndtering Akklimatisering er oppnådd; kanskje ville håndtering økter per dag være tilstrekkelig.
Minimere miljøstress i blod samling perioden er også avgjørende for suksessen til denne protokollen. I jakten på dette målet huset vi våre mus i et stille rom i vivarium i hele Akklimatisering perioden. Plassering av en "Quiet Please" skilt på utsiden av dyr rommet døren på dagen for prøvetaking kan bidra til å eliminere uønskede avbrudd. I blod samling perioden, kan en klut brukes i biosikkerhet regjering for å tilby et sted å hvile pipette, Pipetter tips og penner, dermed minimere støy forårsaket av manipulering av disse elementene. Til slutt, er det anbefales at en person bør håndtere mus og samle alle blodprøvene eksperimentelle dag. Denne personen skal være flittig i å håndtere dyr med omhu, og på en konsekvent dag (som skal være lik prøvetidspunkt), siden circadian innganger er kjent for å påvirke stressresponser. 18 hvis LH pulser er sjeldne eller uoppdagbar, kilder av overflødig stress bør identifiseres og minimert. En annen prosessuelle detaljer knyttet til minimere stress i blod samling perioden er tiden mellom klipping av halen og samle prøver å være assayed for LH. Vi klipp halen av hver musen 45 min før samle eksempler for LH analysen. Denne forsinkelsen serverer timelig skille stress forbundet med halen klipping fra noen ekstra behandlinger i prøvetaking, som halen klipping alene har blitt demonstrert for å heve sirkulerende corticosterone konsentrasjoner. 19 blodprøver trekkes (men forkastet) under 45 minutters vinduet til acclimatize musene i håndtering prosedyren og forhindre blodpropp formasjon under denne forsinkelsen ytterligere.
En siste vurdering når ansette denne protokollen for hyppige blodgivning i mus er at små blod volumet av denne arten begrenser antallet og volumet av hver prøve samlet. I henhold til USDA Animal Inspection guiden har mus 72 mL blod per kg kroppsvekt. 20 for overlevelse eksperimenter,-7,5% av blod, kan samles i en enkelt prøve periode, en 1-week restitusjonsperiode og 10% av blod volumet kan samles med en 2-ukers restitusjonsperiode. Vi rutinemessig samler < 7,5% av anslagsvis blod volumet av musen bruker gjeldende hyppige blod samling protokollen (inkludert representant resultater vises her), uten noen negativ effekt på LH sekretoriske mønstre. I vår vivarium, voksen C57/Bl6 ovariectomized mus veier ca 22 g (teoretisk blodvolum 1.58 ml), slik at 118.5 µL av blod inn. I tillegg til 7 pre samling håndtering prøver (som ikke assayed eller analysert), er 30 prøver samlet over 180 min totalt 111 µL av blod (3 µL per prøve), som er under volumbegrensningen 7,5% blod. Det bør bemerkes at volumet av blodprøve må justeres for å oppdage LH i visse betingelser når LH konsentrasjoner er ventet å bli lav. I gonadectomized mus er 3 µL av hele blod tilstrekkelig å oppdage LH. Samle et større blodvolum bør vurderes når LH konsentrasjoner er lav og derfor forventes å være nærmere til følsomheten til LH analysen. Dermed tross små blod volumet av en mus, kan tilstrekkelig blodprøver samles for å vurdere en kompromissløs profil av pulsatile LH utskillelsen over en 180-minutters periode.
Avslutningsvis håndtering dette hyppige blodet prøvetaking protokollen høydepunkter en utvidet Akklimatisering periode for å sikre vurdering av pulsatile LH utskillelsen i mus over lengre tid. Vi har vist at denne protokollen er tilstrekkelig å karakterisere robust og vanlige pulser av LH som kan måles før og følgende eksponering for psykososial stress. Denne protokollen kan tilpasses for å vurdere svaret av LH andre typer stress eller andre behandlinger som kan endre reproduktive hormonet sekret. Videre kan denne blod samling protokollen tilpasses for måling av andre sirkulerende faktorer som varierer i konsentrasjon over tid som er rapportert for veksthormon. 21 det er et bemerkelsesverdig bidrag til feltet neuroendocrinology at utskillelsen mønster av LH nå overvåkes i Art der komplekse genetiske og i vivo molekylær tilnærminger til studere LH puls regulering er tilgjengelige og praktisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Jennifer Yang og Alexander (Sasha) Kauffman for kundestøtte med denne teknikken, samt mange nyttige og viktige diskusjoner. Serum hormon analyser ble utført av Yang et al., 2017 ved University of Virginia Center reproduksjon Ligand analysen og analyse kjernen, støttet av Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Kilder til forskningsstøtte: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM ble støttet av T32 NICHD 007203.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
