Summary
Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola para la recogida de muestras frecuentes en ratones sin restricciones. Este método es útil para evaluar patrones de secreción pulsátil de hormona luteinizante y podría ser adaptado para el análisis de otros factores de circulación.
Abstract
En muchos sistemas endocrinos, circulación factores u hormonas no son liberadas continuamente, pero son secretadas como un discreto impulso en respuesta a un factor de liberación. Muestreo de un solo punto las medidas es insuficiente para comprender el significado biológico del patrón secretor de hormonas pulsátiles bajo condiciones fisiológicas normales o en condiciones de desregulación. La hormona luteinizante (LH) es sintetizada por las células del gonadotrope pituitario anterior y secretada en forma pulsátil que requiere frecuente recolección de muestras de sangre para la evaluación del pulso. Esto no ha sido posible en los ratones hasta que recientemente, debido al desarrollo de un análisis de LH de alta sensibilidad y progreso en una técnica de frecuente recolección de muestras de bajo volumen, inicialmente descrita por Steyn y colegas. 1 aquí se describe un protocolo para la recogida de muestras frecuentes de sangre periférica de ratones con aclimatación de manejo suficiente para detectar la secreción pulsátil de LH. El actual protocolo de detalles de un período de aclimatación ampliada que permite la evaluación de pulsos sólidas y continuadas de LH durante varias horas. En este protocolo, la punta de la cola se recorta y se recoge la sangre de la cola con una pipeta de mano. Para la evaluación de la LH pulsátil en ratones gonadectomized, muestras seriales son recogidos cada 5-6 min. 90-180 minutos, la recolección de sangre y medición de robustos pulsos de LH se pueden lograr en ratones despiertos, comportarse libremente, dados el manejo adecuado aclimatación y el esfuerzo para minimizar los factores de estrés ambientales. Aclimatación suficiente puede lograrse dentro de 4-5 semanas antes de la recogida de sangre. Este protocolo destaca avances en la metodología para recolección de muestras de sangre para la evaluación de los patrones de secreción pulsátiles de LH durante varias horas en el ratón, un modelo animal de gran alcance de investigación neuroendocrina.
Introduction
Función de la gónada en mamíferos depende de la secreción de gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante hormona de la glándula pituitaria. Las gonadotropinas son secretadas en un patrón pulsátil o surge en respuesta a la secreción hipotalámica de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). La síntesis y secreción de LH y FSH están reguladas a través de la acción endocrina, paracrina y autocrina de una variedad de moléculas GnRH hipotalámico, las hormonas esteroides gonadales y el sistema inhibina-activina-folistatina, así como una miríada de condiciones fisiológicas incluyendo balance de tensión y energía. 2
El patrón pulsátil de la LH en sangre surge de una descarga más bien abrupta de la LH en sangre periférica, seguida por aproximadamente exponencial eliminación. Importantes características del modelo incluyen la frecuencia de cada descarga de LH y la amplitud de la respuesta de la LH, que son dictadas, en parte, por la liberación de GnRH. debido a la dificultad en la recolección de sangre portal hipotalámico-hipofisario para la medición de GnRH pulsátil, el muestreo y la medición de la LH se utiliza como proxy para la regulación de GnRH del eje hipotalámico-pituitario-gonadal. Por lo tanto, información crítica está codificada en la frecuencia y amplitud de pulsos de LH, que no se puede determinar de una sola muestra.
Análisis de la secreción pulsátil de LH ha sido históricamente limitado a grandes mamíferos (seres humanos, primates y ovejas) debido a su volumen de sangre grande y tolerancia para la recogida de muestras de sangre frecuentes. En roedores, tomar muestras de sangre frecuentes se limitaba a la rata y través de la sonda permanente. 3 , 4 el relativamente bajo costo y la disponibilidad de la genética (por ejemplo, cre-lox, CRISPR) y manipulaciones de circuito neuronales complejas (e.g. optogenetics, chemogenetics) ratones un organismo modelo atractivo; sin embargo, obtención de muestras de sangre frecuentes y posterior análisis de las concentraciones de LH ha hasta recientemente, probado evasivos. Esta tarea monumental fue pionero por Steyn y compañeros de trabajo. 1 desde entonces, varios laboratorios han empezado a utilizar el análisis de LH ultra sensibles para evaluar la secreción pulsátil de LH en una variedad de paradigmas experimentales y tomar muestras de sangre frecuentes. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 cabe señalar que la búsqueda de un método práctico de recoger múltiples muestras de sangre de los ratones ha sido en curso por lo menos 40 años10 con múltiples mejoras a lo largo de la manera. 11 , 12
Evaluación de patrones de pulso de LH (es decir, frecuencia y amplitud) representa un refinamiento importante en la supervisión de la secreción de gonadotropina basal en este modelo animal genéticamente manejable. Tradicionalmente, las concentraciones de LH en ratones se determinan en una muestra de sangre solo. Una debilidad de las muestras de un solo punto es un conjunto de datos altamente variable porque las concentraciones de LH son naturalmente fluctuantes durante cada pulso. Otra debilidad es que las mediciones aisladas inherentemente perder información crítica por los patrones de secreción de pulsos de LH. Por lo tanto, un método para recoger muestras de sangre frecuente en comportarse libremente, ratones sin restricciones (excepto la dirección apacible durante el muestreo) proporcionará mayor información y ser útiles a muchos laboratorios de investigación de la regulación pulsátil de la hormona.
Aquí, describimos un protocolo para la recogida de frecuentes muestras de ratones despiertos, libre de la sangre (cada 6 minutos). Lo importante, incluimos una dirección Protocolo de aclimatación que permite detección sólida y continua de la secreción pulsátil de LH en muestras de sangre entera recogida durante un período de tiempo en el que pre- y post-evaluación un reto agudo puede ser determinado, como la respuesta al estrés psicosocial de inmovilización y sujeción. Un ensayo eficaz para determinar las concentraciones de LH de muestras de sangre entera se ha descrito anteriormente; 1 el presente Protocolo se centra en un método para la recolección de las muestras de sangre para la medición del pulso de LH.
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Protocol
El método descrito aquí está de acuerdo con el nacional institutos de Salud Animal Care y directrices de uso y han sido autorizados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, San Diego.
1. aclimatación a la dirección
- Procedimiento de control
- Ratón de lugar jaulas en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Retire el primer ratón de la jaula y el lugar en una superficie adecuada (por ejemplo una tapa de la jaula limpia) en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
- Frenar suavemente el mouse sobre la superficie de trabajo manteniendo la base de la cola con el dedo índice y pulgar de una mano. Luego, firmemente movimiento la cara ventral de la cola, desde la base hasta la punta de la cola, con el índice y el pulgar de la otra mano. Repetir esto 6 veces de caricias (es decir, 1 juego) y retomar el ratón de su jaula.
- Esperar 6 minutos y repita el paso 1.1.2.
Nota: En total, paso 1.1.2 se repetirá 4 veces por ratón (es decir, 4 grupos de 6 golpes), para que cada ratón recibirán un total de 24 movimientos de la cola en cada día de manejo.
- La frecuencia de manejo diario
- De cinco hasta dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, manejar ratones como se describe en el paso 1.1, cinco días por semana (los ratones no se manejan en el sábado o el domingo hasta las últimas dos semanas de aclimatación).
- Si el tratamiento experimental durante el periodo de muestreo incluirá cualquier manejo adicional (e.g. scruffing o inyección intraperitoneal), aclimatarse a los ratones a esta actividad de manipulación durante cada sesión de tratamiento.
Nota: Para la aclimatación a los procedimientos de inyección, utilizar una aguja blunted para realizar una inyección simulada. - Durante las dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, manejar ratones como se describe en 1.1, siete días por semana.
- Por lo menos dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, casa ratones en pares para minimizar las interrupciones a los ratones durante el muestreo.
2. preparación de tubos de sangre
- Preparar el tampón de ensayo LH ultrasensible en una botella de vidrio: albúmina de suero bovino 0,2% y 0.05% Tween-20 en PBS [0,2 g de KCl, 8 g de NaCl, 1,44 g de Na2HPO4 (anhidro), 0,24 g KH2PO4, agua ultrapura a 1 L, pH 7,4, filtro y autoclave] , almacenar a 4° C. 1
Nota: Volumen de tampón de ensayo LH ultrasensible para estar preparados puede calcularse basándose en el número de muestras y el volumen por ejemplo como se indica a continuación (2.2 y discusión) - Preparar tubos (tubos de microcentrífuga de 0,6 mL) de sangre. Etiqueta de tubos y buffer de ensayo alícuota (57 μl de tampón por tubo; de nota, este volumen puede variar dependiendo del volumen de sangre recogida o la relación de la sangre en el búfer deseado). Tubos puede ser preparado días antes de la toma de muestras, almacenar a 4 ° C.
3. sangre
- Preparación de materiales de colección de sangre.
- Preparar el gabinete de seguridad para su uso y organizar los materiales en la campana o en un carrito cerca de: 10 μl de pipeta (set 3 μl o volumen de la colección de sangre deseado), las puntas de pipeta, cubo de basura para puntas de pipeta usadas, temporizador, impresión con el número de animales y muestra números ( Notas sobre problemas de muestreo o animales), cubo con tubos sangre, tijeras y gasas pequeñas (2 "x 2") de hielo.
Nota: El "contar hasta" función de un temporizador de laboratorio es útil porque tiene una alarma audible que podría molestar a los ratones - Utilice un marcador permanente para marcar la cola de cada ratón (cerca de la base) para ayudar en la identificación rápida del ratón correcto durante el muestreo.
- Preparar el gabinete de seguridad para su uso y organizar los materiales en la campana o en un carrito cerca de: 10 μl de pipeta (set 3 μl o volumen de la colección de sangre deseado), las puntas de pipeta, cubo de basura para puntas de pipeta usadas, temporizador, impresión con el número de animales y muestra números ( Notas sobre problemas de muestreo o animales), cubo con tubos sangre, tijeras y gasas pequeñas (2 "x 2") de hielo.
- Recorte de la preparación de la cola y la sangre de la colección.
- A 45 minutos antes del inicio de la colección de sangre, quite el primer ratón de su jaula y coloque sobre una superficie adecuada (una tapa de la jaula limpia funciona bien) dentro de la bioseguridad gabinete.
- Utilizar tijeras afiladas, estériles para eliminar 1-2 mm de la punta de la cola de ratón, siguiendo la preparación aséptica (es decir, frote con alcohol y betadine).
Nota: Esto puede lograrse en animales despiertos con sujeción suave o bajo anestesia isoflurano. Además, la analgesia puede ser proporcionada siguiendo las recomendaciones de la IACUC local. - La cola del ratón del movimiento cuidadosamente como se describió anteriormente (1.1.2; son generalmente suficientes trazos 1-2) hasta la gota de sangre en la punta de la cola.
- Utilice una pipeta con una punta limpia para recoger 3 μl de sangre desde la punta de la cola y deseche la punta de la pipeta con sangre.
- Antes de regresar el ratón a su jaula, asegúrese de que ha detenido el flujo de sangre. Si es necesario, aplique una presión suave con gasa estéril.
- Repita los pasos 3.2.1 - 3.2.5 para todos los ratones. Pueden recoger muestras de sangre subsecuente por firmemente acariciando la cola del ratón hasta una gota de sangre en la punta de la cola.
Nota: Si una gota de sangre no se forma después de trazos firmes, la cola puede ser secó con una gasa empapada en solución salina. Los coágulos tienen más probabilidades de forma durante el muestreo menos frecuente (es decir, > intervalos de 15 min). Una vez que se elimina el coágulo de la vena, puede continuar el muestreo. - Seguir recoger 3 μl de sangre de cada ratón como descrito cada 6 minutos durante aproximadamente 45 minutos, durante este período de preparación de muestras de sangre antes. Deseche la punta de sangre y pipeta.
- Muestra de sangre
- Recoger 3 μl de sangre desde la punta de la cola como se describió anteriormente. Tener precaución para asegurar que toda la muestra de 3 μl se tiene en la punta de la pipeta (sin burbujas o contaminación de la ropa de cama). Extraer la muestra de sangre en el buffer de ensayo en un tubo etiquetado. Mezclar por inversión y devolver el tubo en hielo.
- Antes de regresar el ratón a su jaula, asegúrese de que ha detenido el flujo de sangre. Si es necesario, aplique una presión suave con gasa estéril.
- Repita los pasos 3.3.1 - 3.3.2 para cada ratón, cada 6 minutos, durante el tiempo de muestreo predeterminado. Seguimiento de cada animal para detectar signos de sufrimiento (e.g. parcialmente cerrados párpados, posición jorobada [no causado por otro tratamiento] o falta de respuesta al tratamiento) y terminar el muestreo, si es necesario.
Nota: Dificultades conductuales u otras complicaciones que requieren terminación de muestreo ocurren muy raramente en nuestro laboratorio. - Si los animales no son sacrificados después de tomar muestras de sangre, asegúrese de que el flujo de sangre desde la punta de la cola se haya detenido completamente. Limpie cualquier sangre derramada desde el interior de cada animal jaula (o cambio jaulas) y volver a las jaulas de animales a la cremallera de la cubierta.
4. procesamiento y análisis de la muestra
- Almacenar las muestras de sangre a-20 ° C hasta su análisis.
Nota: LH se evaluaron en muestras de sangre entera diluidas en tampon de ensayo; no hay separación de sueros o plasma es requerida antes de almacenamiento o análisis. - Las muestras de sangre de análisis por ELISA ultrasensible como describen previamente1 e informe valores en ng/mL de sangre después de corrección por dilución del volumen de muestra en el tampón de ensayo.
- Identificar los pulsos de LH en el conjunto de datos. Calcular y comparar la amplitud de pulso promedio y frecuencia del pulso (o intervalo de inter-pulso) según corresponda para el conjunto de datos.
Nota: Programas y criterios publicados13,14 ,15,16 para la detección de pulsos de LH están disponibles.
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Representative Results
Representante patrones de pulso de LH de 4 ratones se muestran en la figura 1 (datos reimprimidos de Yang et al., 2017). LH se midió en muestras de sangre frecuentes para determinar la respuesta a un desafío de estrés psicosocial agudo. Ratones C57/Bl6 hembra adultos fueron ovariectomizadas y manejados como se detalla en el presente Protocolo para la recogida de sangre frecuentes. Se recolectaron muestras de sangre para los primeros 90 minutos en todos los animales para establecer una línea base de un tratamiento previo de la secreción pulsátil de LH. Durante el segundo minuto 90 de muestreo, control (no tensionado) animales permanecieron en sus jaulas y animales de tensión de seguridad se colocaron en roedores de sujeción y aislados en jaulas nuevas. Animales de control demostraron claras y sin ambigüedades pulsos de LH durante el período de muestreo todo. Por el contrario, el estrés psicosocial de contención rápidamente y sin ambigüedades suprimió la secreción pulsátil de LH.
Figura 1: patrones de pulso de LH representante de ratones ovariectomizadas. (A, C) Control de ratones no destacó. (B, D) Hincapié en ratones en el que se impuso restricción de 0-90 min (región sombreada gris) y LH fue probada. Puntos de datos representan pulsos identificados por DynPeak. 15 esta figura ha sido modificada de Yang et al., 158(11) de Endocrinología: 2017 3716-3723, con permiso de la sociedad de Endocrinología, 2017 Copyright. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí se describe un protocolo para recogida de sangre frecuente de muestras de sangre entera cola de punta para la evaluación de la secreción pulsátil de LH en ratones. Este protocolo permite la recogida de muestras para la detección de cambios agudos en la secreción pulsátil de LH después de la exposición a estrés psicosocial y es adecuado para la evaluación de pulsos de LH bajo otras manipulaciones agudas o crónicas.
Un componente fundamental de este protocolo para lograr perfiles fiables y robustos de pulsos de LH es el manejo periodo de aclimatación. La idea que manejo el estrés puede afectar la secreción de la hormona se ha especulado sobre la literatura,17 pero no explícitamente probado. Sin embargo, análisis de los patrones de pulso de LH representante en publicaciones recientes demuestra claramente una ventaja a la aclimatación completa al manejo. En estudios iniciales, utilizando 10 días de manejo, los pulsos de LH ocurrieron a intervalos irregulares con períodos prolongados en que no hay LH fueron detectados pulsos. 1 con posterioridad a dicha publicación seminal, ha habido una tendencia en la literatura durante más tiempo de manipulación (es decir, 3 o 4 semanas de tratamiento diario). 5 , 6 , 8 el protocolo aquí descrito implica un total de 5 semanas de tratamiento pero omite manejo los 3 primeros fines de semana, por lo tanto, lograr que un número similar de manejo de sesiones y la minimización de cargas de trabajo de fin de semana para experimentadores. Aunque no podemos dar un número umbral validadas de manejo de sesiones necesarios para acertada detección de pulsos de LH, animamos a nuevos practicantes de este procedimiento a tener en cuenta un periodo de aclimatación extendido. Bajo determinados paradigmas experimentales (e.g. estudio de pulsos de LH en animales jóvenes), varias semanas de aclimatación de manipulación pueden no ser prácticas. Para estos experimentos, es crítico que se logra el suficiente manejo de aclimatación; tal vez varias sesiones de tratamiento por día sería suficientes.
También es fundamental para el éxito de este protocolo minimizar estrés ambiental durante el periodo de recolección de sangre. En pos de este objetivo, casa de los ratones en una habitación tranquila en el vivero durante el período de aclimatación todo. Colocación de un letrero "Tranquilo por favor" en el exterior de la puerta de la habitación de animales en el día de muestreo puede ayudar a eliminar interrupciones no deseadas. Durante el periodo de recolección de sangre, puede utilizarse un paño en el gabinete de seguridad biológica para proporcionar un lugar para descansar de la pipeta, pipeta consejos y plumas, por lo tanto, minimizar el ruido causado por la manipulación de estos elementos. Por último, se aconseja que una persona debe manejar el ratón y recoge todas las muestras de sangre el día experimental. Este individuo debe ser diligente en el manejo de los animales con cuidado y a la vez consistente de día (que debe ser similar al tiempo de muestreo), ya que los insumos son conocidos por influir en las respuestas de estrés. 18 pulsos de LH si son infrecuentes o indetectable, fuentes de estrés ajeno deben ser identificadas y reducen al mínimo. Otro detalle procesal relacionados con minimizar el estrés durante el periodo de recolección de sangre es la cantidad de tiempo que transcurre entre el corte de la cola y recoger muestras a ensayarse para LH. Clip de la cola de cada ratón 45 minutos antes de recoger muestras para análisis de LH. Este retardo sirve para separar temporalmente el estrés asociado con la cola de recorte de cualquier tratamiento adicional impuesta durante el muestreo, como la cola de recorte solo ha demostrado elevar las concentraciones de corticosterona circulante. 19 muestras de sangre se retiren, pero descartaron durante esta ventana de 45 min para aclimatarse a los ratones para el procedimiento de manejo y prevenir la formación de coágulos sanguíneos durante este retraso.
Una consideración final al emplear este protocolo para la recolección de sangre frecuente en ratones es que el volumen de sangre pequeños de esta especie limita el número y volumen de cada muestra recogida. Según la guía de inspección USDA Animal, ratones tienen 72 mL de sangre por kg de peso corporal. 20 experimentos de supervivencia, el 7,5% de la volemia se pueden recoger en un período de muestreo único dado un período de recuperación de 1 semana y 10% de la volemia puede recogerse con un período de 2 semanas de recuperación. Recogemos rutinariamente < 7.5% el estimación del volumen de sangre del ratón usando el protocolo actual de colección de sangre frecuentes (incluyendo resultados representativos se muestra aquí), sin efectos adversos en los patrones de secreción de LH. En nuestro vivero, ratones C57/Bl6 ovariectomizadas adultos pesan aproximadamente 22 g (volumen de sangre teórica de 1,58 mL), permitiendo 118.5 μl de sangre para ser recogidos. Además de 7 muestras de manipulación de la colección (que no ensayaron ni analizado), 30 muestras se recogen sobre 180 minutos para un total de 111 μl de sangre (3 μl por muestra), que está por debajo del límite del volumen de sangre de 7,5%. Cabe señalar que el volumen de la muestra de sangre puede necesitar ser ajustado para la detección de LH en ciertas condiciones cuando se espera que las concentraciones de LH es baja. En los ratones gonadectomized, 3 μl de sangre entera es suficiente para detectar la LH. Recogida de un mayor volumen de sangre debe considerarse cuando las concentraciones de LH son bajos y por lo tanto esperado a estar más cerca de la sensibilidad de la prueba de LH. Así, a pesar del volumen pequeño de sangre de un ratón, se pueden recoger suficientes muestras de sangre para evaluar un perfil total de la secreción pulsátil de LH durante un período de 180 min.
En conclusión, este muestreo protocolo destaca un extendido de la sangre frecuente manejo de periodo de aclimatación para garantizar la evaluación de la secreción pulsátil de LH en ratones durante un período prolongado de tiempo. Hemos demostrado que este protocolo es suficiente para caracterizar robustos y regulares pulsos de LH que puede ser monitoreado antes y la siguiente exposición a estrés psicosocial. Este protocolo puede ser adaptado para evaluar la respuesta de LH a otros tipos de estrés u otros tratamientos que pueden alterar la secreción de la hormona reproductiva. Además, este protocolo de extracción de sangre podría ser adaptado para la medición de otros factores circulantes que varían en la concentración con el tiempo, como ha sido reportado para la hormona de crecimiento. 21 es una notable contribución al campo de la Neuroendocrinología que el patrón de secreción de LH, ahora puede ser monitoreado en una especie donde hay complejos genéticos y en vivo aproximaciones moleculares para estudiar la regulación del pulso de LH y práctica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los Drs. Jennifer Yang y Kauffman Alexander (Sasha) para asistencia técnica con esta técnica así como numerosas discusiones útiles y críticas. Análisis de la hormona del suero fueron realizados por Yang et al., 2017 en la Universidad de Virginia centro de investigación en reproducción Ligand análisis y base de análisis, apoyado por Eunice Kennedy Shriver NIH/NICHD (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fuentes de apoyo a la investigación: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM fue apoyado por T32 NICHD 007203.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
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