Summary
Här presenterar vi en svans-spetsen blod provtagning protokoll för frekventa provinsamling i ohämmad möss. Denna metod är användbar för bedömningen av mönster av pulserande luteiniserande hormon och kan anpassas för analys av andra cirkulerande faktorer.
Abstract
I många endokrina system, cirkulerande faktorer eller hormoner frigörs inte kontinuerligt, men utsöndras som en diskret puls som svar på en releasing factor. Enpunkts-provtagning åtgärder är otillräckliga till fullo förstå den biologiska betydelsen av sekretoriska mönstret av pulserande hormoner antingen under normala fysiologiska förhållanden eller under förhållanden av dysreglering. Luteiniserande hormon (LH) syntetiseras av främre hypofys gonadotrope celler och utsöndras i en pulserande mönster som kräver frekvent insamling av blodprov för puls bedömning. Detta har inte varit möjligt i möss tills nyligen, på grund av utvecklingen av en hög känslighet LH analys och avancemang i en teknik för frekventa låg volym provtagning, inledningsvis beskrivs av Steyn och kollegor. 1 här beskriver vi ett protokoll för provsamlingen frekvent perifert blod från möss med tillräcklig hantering acklimatisering att upptäcka pulserande utsöndringen av LH. Det nuvarande protokollet Detaljer en utökad acklimatisering period som möjliggör bedömning av robust och kontinuerlig pulser av LH över flera timmar. I detta protokoll, spetsen av svansen klipps och blod som samlas in från svansen med handhållna pipett. För bedömning av pulserande LH i gonadectomized möss, seriell proverna är insamlade varje 5-6 min för 90-180 min. viktigt, insamling av blod och mätning av robust pulser av LH kan åstadkommas i vaken, fritt beter sig möss, ges adekvat hantering acklimatisering och försök att minimera miljöfaktorer. Tillräcklig acklimatisering kan uppnås inom 4-5 veckor innan blodinsamling. Detta protokoll belyser framsteg i metoden för att säkerställa uppbörd av hela blodprov för bedömning av pulserande LH sekretion mönster över flera timmar i musen, en kraftfull djurmodell för neuroendokrina forskning.
Introduction
Gonad funktion hos däggdjur är beroende av gonadotropin sekretion, luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon från hypofysen. Gonadotropiner utsöndras i antingen ett pulserande eller våg mönster som svar på hypotalamus utsöndringen av gonadotropinfrisättande hormon (GnRH). Syntes och sekretion av både LH och FSH regleras via endokrin, parakrin och autokrin handling från en mängd olika molekyler inklusive hypotalamus GnRH, gonadala steroidhormoner, activin-inhibin-follistatin systemet, samt och en myriad av fysiologiska förhållanden inklusive stress och energibalans. 2
Den pulserande mönstret av LH i blodet uppstår ganska abrupt ansvarsfrihet av LH i perifert blod, följt av ungefärligt exponentiell eliminering. Viktiga egenskaper hos mönstret är frekvensen av varje LH ansvarsfrihet och amplituden av LH svar, som båda är betingade, delvis av frisläppandet av GnRH. vederbörlig till svårigheten att samla in hypotalamus-hypofys portal blod för mätning av pulserande GnRH, provtagning och mätning av LH används som proxy för GnRH förordning av den hypotalamus-hypofysaxeln. Därför är kritisk information kodad i frekvens och amplitud av LH pulserar, som inte kan fastställas från ett enda prov.
Analys av pulserande LH-utsöndring har historiskt varit begränsad till stora däggdjur (människor, primater och får) på grund av deras stora blodvolym och tolerans för frekventa blod provinsamling. Hos gnagare, täta blodprov var begränsat till råtta och uppnås via kvarliggande förmaksflimmer katetern. 3 , 4 den relativt låg kostnad och tillgänglighet av genetiska (e.g. cre-lox, CRISPR) och komplex neural krets (e.g. optogenetik, chemogenetics) manipulationer gör möss en attraktiv modellorganism; förverkligandet av täta blodprov och efterföljande analys av LH koncentrationer har dock tills nyligen visat svårfångade. Denna monumentala uppgift var pionjärer av Steyn och medarbetare. 1 sedan sedan, flera labs har börjat utnyttja täta blodprov och ytterst känsliga LH analyser att bedöma pulserande LH sekretion i en mängd olika experimentella paradigm. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 det bör noteras att strävan efter en praktisk metod att samla flera blodprov från möss pågår för minst 40 år10 med flera finesser gjort längs vägen. 11 , 12
Bedömning av LH puls mönster (dvs frekvens och amplitud) representerar en större förfining i övervakning basala gonadotropin sekretion i denna genetiskt eftertraktansvärda djurmodell. Traditionellt, har LH koncentrationer i möss fastställts i ett enda blodprov. En svaghet av enpunkts-prover är en mycket varierande uppsättning data eftersom LH koncentrationer naturligt fluktuerar under varje puls. En annan svaghet är att enstaka mätningar inneboende missar viktig information förmedlas av mönster av LH puls sekretion. Således, en metod för att samla in täta blodprov i fritt bete, ohämmad möss (förutom varsam hantering under provtagning) ger förbättrad information och vara användbara för många laboratorier undersöker pulserande hormon förordning.
Här beskriver vi ett protokoll för insamling av täta (varje 6 min) blod prover från vaken, ohämmad möss. Ännu viktigare, inkluderar vi en hantering acklimatisering protokoll som möjliggör robust och kontinuerlig detektering av pulserande LH sekretion i helblod prover som samlats in under en tidsperiod där före och efter bedömning på en akut utmaning kan bestämmas, såsom svar på psykosociala stress immobilisering och återhållsamhet. Ett effektivt test för LH koncentrationer från helblod prover har beskrivits tidigare; 1 detta protokoll är inriktad på en metod för att samla in blodprover för LH puls mätning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den metod som beskrivs här är överens med de nationella institut av djur vård och användning riktlinjer och har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid University of California, San Diego.
1. acklimatisering hantering
- Hantering av förfarandet
- Placera musen burar i biosäkerhet skåp. Ta bort den första musen från buren och plats på en lämplig yta (t.ex. en ren bur locket) inom biosäkerhet skåp.
- Försiktigt hålla musen på ytan med arbete genom att hålla basen av svansen med pekfingret och tummen på ena handen. Sedan fast stroke ventrala ytan av svansen, från basen till spetsen av svansen, med pekfingret och tummen på den andra handen. Upprepa detta strök 6 gånger (dvs. 1 set) och återgå musen till sin bur.
- Vänta 6 min och upprepa steg 1.1.2.
Obs: Totalt steg 1.1.2 upprepas 4 gånger per mus (dvs 4 uppsättningar av 6 linjer), så att varje mus får sammanlagt 24 svans penseldrag på varje dag av hantering.
- Frekvensen av daglig hantering
- Från fem till två veckor före den planerade blod insamling, hantera möss som beskrivs i steg 1.1, fem dagar per vecka (möss inte hanteras på lördag eller söndag fram till de sista två veckorna av acklimatisering).
- Om experimentell behandling under provtagningsperioden ska inkludera någon extra hantering (t.ex. scruffing eller intraperitoneal injektion), acklimatisera sig mössen att denna hantering aktivitet under varje hantering session.
Obs: För acklimatisering till injektion förfaranden, Använd en avtrubbad nål för att utföra en simulerad injektion. - Under två veckor före den planerade blod insamling, hantera möss som beskrivs i punkt 1.1, sju dagar i veckan.
- Minst två veckor före den planerade blod insamling, hus möss i par för att minimera störningar till möss under provtagning.
2. upprättande av blod insamling rör
- Förbereda ultrasensitive LH analysbuffert i en glasflaska: 0,2% bovint serumalbumin och 0,05% Tween-20 i PBS [0,2 g kaliumklorid, 8 g NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (vattenfri), 0.24 g KH2PO4, ultrarent vatten 1 L, pH 7,4, filter och autoklav] , lagras vid 4° C. 1
Obs: Volymen av ultrasensitive LH analysbuffert förberedas kan beräknas baserat på antalet prover och volym per prov enligt nedan (2.2 & diskussion) - Förbereda blod insamling rör (0,6 mL mikrocentrifugrör). Märk rören och alikvotens analysbuffert (57 µL buffert per röret; Observera att denna volym kan variera beroende på volymen blod som samlats in eller förhållandet av blod till bufferten önskas). Rören kan förberedas dagar före provtagning, förvaras vid 4 ° C.
3. blod insamling
- Beredning av blod insamling material.
- Förbereda biosäkerhet skåp för användning, och ordna följande material i huven eller på en vagn i närheten: 10 µL Pipettera (satt till 3 µL eller önskad blodvolym samling), pipettspetsar, avfall bin för begagnade pipettspetsar, timer, utskrift med antalet djur och prov nummer ( för anteckningar angående provtagning eller djurs problem), is hink med blod insamling rör, sax och små gasväv (2 ”x 2”).
Obs: Den ”räkna” funktionen på ett laboratorium timer är användbar eftersom den inte har ett ljudlarm som kan störa möss - Använda en permanent spritpenna för att markera svansen av varje mus (nära basen) för att bistå med snabb identifiering av rätt musen under provtagning.
- Förbereda biosäkerhet skåp för användning, och ordna följande material i huven eller på en vagn i närheten: 10 µL Pipettera (satt till 3 µL eller önskad blodvolym samling), pipettspetsar, avfall bin för begagnade pipettspetsar, timer, utskrift med antalet djur och prov nummer ( för anteckningar angående provtagning eller djurs problem), is hink med blod insamling rör, sax och små gasväv (2 ”x 2”).
- Klippning av svans och före blod insamling preparatet.
- På 45 min innan samlingen blod, ta bort den första musen från sin bur och placera på en lämplig yta (en ren bur locket fungerar bra) inom biosäkerhet skåp.
- Använda skarp, steril sax för att ta bort 1-2 mm av spetsen på mus svansen, efter aseptisk beredning (dvs skrubba med alkohol och betadine).
Obs: Detta kan åstadkommas i vaket djur med skonsam fasthållning eller under isofluran anestesi. Dessutom kan analgesi tillhandahållas efter rekommendation av den lokala IACUC. - Noggrant stroke svansen av musen som beskrivs ovan (1.1.2; 1-2 drag är vanligen tillräckligt) tills droplet-programmet av blod former på svans-spetsen.
- Använd en pipett med ren spets att samla 3 µL blod från svans spets och kassera pipettspetsen med blod.
- Innan du återvänder musen till sin bur, kontrollera att blodflödet har stoppats. Om det behövs, applicera lätt tryck med steril gasbinda.
- Upprepa steg 3.2.1 - 3.2.5 för alla möss. Efterföljande blodprov kan tas av fast strök musens svans tills en droppe blod former på spetsen av svansen.
Obs: Om en blod droplet inte bildar efter fasta linjer, svansen kan vara dabbed med en kompress indränkt i saltlösning. Blodproppar är mer benägna att bilda under mindre frekvent provtagning (dvs. > 15 min intervaller). När proppen rensas från venen, kan provtagning fortsätta. - Fortsätta att samla in 3 µL blod från varje mus som beskrivs ovan varje 6 min för ca 45 min under denna före blodinsamling förberedelsetiden. Kassera blod och pipett spetsen.
- Blodprovstagning
- Samla 3 µL blod från svans spets som beskrivs ovan. Var försiktig så att det hela 3 µL provet tas i pipettspetsen (utan bubblor eller sängkläder kontaminering). Mata ut blodprovet i analysbuffert i en märkt tub. Blanda genom inversion och tillbaka röret till is.
- Innan du återvänder musen till sin bur, kontrollera att blodflödet har stoppats. Om det behövs, applicera lätt tryck med steril gasbinda.
- Upprepa steg 3.3.1 - 3.3.2 för varje mus, varje 6 min, under förutbestämda provtagning. Övervaka varje djur tecken på ångest (t.ex. delvis slutna ögonlock, böjd position [inte orsakas av annan behandling] eller brist på svar till hantering) och avsluta provtagning, om nödvändigt.
Obs: Behavioral ångest eller andra komplikationer som kräver uppsägning av provtagning förekommer ytterst sällan i vårt laboratorium. - Om djuren inte är avlivas efter blodprovstagning, se till att blodflödet från svans-spetsen helt har slutat. Torka någon spillt blod från insidan av varje djurets bur (eller ändra burar) och returnera djurburar bostäder rack.
4. prova bearbetning och analys
- Lagra blodprov vid-20 ° C fram till analys.
Obs: LH har analyserats i helblod prover utspätt i analysbuffert; Ingen separering av serum eller plasma krävs före lagring eller analys. - Blodprov för analys av ultrasensitive ELISA som beskrivs tidigare värdena1 och rapport i ng/mL helblod efter korrigering för utspädning av provvolymen i analysbuffert.
- Identifiera LH pulser i datauppsättningen. Beräkna och jämför medelvärdet pulsamplitud och puls frekvens (eller mellan puls intervall) som är lämpligt för datauppsättningen.
Obs: Offentliggjorda kriterier13,14 och program,15,16 för att påvisa LH pulser finns tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa LH puls mönster från 4 möss visas i figur 1 (data omtryckt från Yang et al., 2017). LH mättes i täta blodprov för att bestämma svaret på en akut psykosocial stress utmaning. Vuxna kvinnliga C57/Bl6 möss var ovariectomized och hanteras som beskrivs i detta protokoll för frekventa blodinsamling. Blodprov samlades för första 90 min i alla djur att upprätta en förbehandling baslinje på LH pulserande sekretion. Under den andra 90 min för provtagning, kontroll (icke-stressade) djur kvar i sina burar och återhållsamhet stress djur placerades in gnagare fasthållningsanordningar och isolerade till nya burar. Djuren i kontrollgruppen visade tydliga och entydiga LH pulser under hela provtagningsperioden. Däremot undertryckta den psykosociala stressen återhållsamhet snabbt och otvetydigt pulserande LH-utsöndring.
Figur 1: representativa LH puls mönster från ovariectomized möss. (A, C) Styra icke-stressade möss. (B, D) Stressade möss där infördes återhållsamhet från 0-90 min (grå skuggade regionen) och LH var analyseras. Öppna datapunkter representerar pulser som identifieras med DynPeak. 15 denna siffra har ändrats från Yang et al., endokrinologi 158(11): 3716-3723, 2017 med tillstånd från The Endocrine Society, Copyright 2017. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för frekventa blodinsamling av helblod svans-spetsen prov för bedömning av pulserande LH sekretion hos möss. Detta protokoll möjliggör insamling av prover för att upptäcka akuta ändringar i pulserande LH-utsöndring efter exponering för psykosociala stress och är väl lämpad för bedömning av LH pulser under andra akuta eller kroniska manipulationer.
En kritisk komponent i detta protokoll för att uppnå tillförlitliga och robusta profiler av LH pulser är hanteringen acklimatisering period. Idén att hantera stress kan försämra hormon har spekulerat på i litteraturen,17 men inte uttryckligen testade. Analys av de representativa LH puls mönster avbildas på senare publikationer visar dock klart en fördel att grundlig acklimatisering hantering. I tidiga studier, utnyttja 10 dagar av hantering, inträffade LH pulser med oregelbundna intervaller med långa perioder i vilka ingen LH pulser upptäcktes. 1 efter att nyskapande offentliggörande, det har varit en trend i litteraturen för hantering längre (dvs. 3 eller 4 veckors daglig hantering). 5 , 6 , 8 protokollet beskrivs här innebär totalt 5 veckor av hantering men utelämnar hantering på 3 första helgerna, därmed, att uppnå ett liknande antal hantering sessioner och minimera helgen arbetsbelastningar för experimentalisterna. Även om vi inte kan tillhandahålla en validerad tröskelvärdet för antal krävs hantering sessioner för framgångsrika detektion av LH pulser, vi vill uppmuntra nya utövare av detta förfarande att överväga en utökad acklimatisering period. Under vissa experimentella paradigm (t.ex. studera LH pulser i unga djur), kan flera veckor av hantering acklimatisering inte vara praktiskt. För dessa experiment är det kritiskt att uppnås tillräcklig hantering acklimatisering; kanske skulle flera hantering sessioner per dag vara tillräckligt.
Minimera miljöbelastning under perioden blod insamling är också avgörande för framgång i detta protokoll. I strävan efter detta mål hus vi våra möss i ett tyst rum inom ett vivarium under perioden hela acklimatisering. Placering av en ”tyst Please” skylt på utsidan av djur room dörren på dagen för provtagning kan hjälpa till att eliminera oönskade avbrott. Under perioden blod insamling, kan en trasa användas i biosäkerhet skåp för att ge en plats att vila pipetten, Pipettera tips och pennor på, därmed, att minimera buller som orsakas av att manipulera dessa objekt. Slutligen, det rekommenderas att en person bör hantera möss och samla alla blodprover på experimentell dagen. Denna person bör vara flitig i hantering av djur med omsorg, och en konsekvent tid på dagen (som bör vara liknande provtagningstiden), eftersom dygnsrytm ingångar är kända att påverka stressreaktioner. 18 om LH pulser är ovanliga eller oidentifierbart, källor till ovidkommande stress bör identifieras och minimeras. En annan processuella detalj relaterade till minimizing betona under perioden blod insamling är mängden tid som förflyter mellan klippning av svansen och samla in prover som analyseras för LH. Vi klippa svansen av varje mus 45 min före insamling av prov för LH assay. Denna försening serverar att tidsmässigt avgränsa stress i samband med svans klippning från någon ytterligare behandlingar som införts under provtagning, som svansen klippning ensam har visat sig höja cirkulerande kortikosteron koncentrationer. 19 blodprov dras tillbaka (men kasseras) under detta 45-min fönster för att ytterligare acklimatisera sig mössen att förfarandet för hantering och förhindra blodpropp under denna försening.
En sista övervägande när anställa detta protokoll för frekventa blodinsamling hos möss är att små blodvolymen av denna art kommer att begränsa antalet och volymen av varje prov insamlade. Enligt USDA djur inspektion guiden har möss 72 mL blod per kg kroppsvikt. 20 för överlevnad experiment, 7,5% av blodvolymen kan samlas i en enda provtagningsperiod ges en 1-veckors återhämtningsperiod och 10% av blodvolymen kan samlas med en 2-veckors återhämtningsperiod. Vi rutinmässigt samla < 7,5% av den uppskattade blodvolymen musen med nuvarande täta blod insamling-protokollet (inklusive representativa resultat visas här), utan någon negativ inverkan på LH sekretoriska mönster. I vår vivarium, vuxna C57/Bl6 ovariectomized möss väga cirka 22 g (teoretiska blodvolym 1.58 ml), vilket möjliggör 118,5 µL blod samlas. I tillägg till 7 före samling hantering prover (som inte analyseras eller analyseras), samlas 30 prover över 180 min totalt på 111 µL blod (3 µL per prov), vilket är lägre än 7,5% blod volymgränsen. Det bör noteras att volymen av blodprovet kan behöva justeras för att påvisa LH i vissa villkor när LH koncentrationer förväntas vara låg. I gonadectomized möss är 3 µL helblod tillräckligt att upptäcka LH. Samla en större blodvolym bör övervägas när LH koncentrationerna är låga och därför förväntas vara närmare LH analysens känslighet. Trots små blodvolymen av en mus, kan således tillräcklig blodprov tas för att bedöma en kompromisslös profil av pulserande LH-utsöndring under en 180-min.
Avslutningsvis hantering detta frekventa blod provtagning protokoll höjdpunkter en utökad acklimatisering perioden för att säkerställa att bedömningen av pulserande LH-utsöndring hos möss över en längre tidsperiod. Vi har visat att detta protokoll är tillräckliga för att karakterisera stabila och regelbundna pulser av LH som kan övervakas före och efter exponering för psykosocial stress. Detta protokoll kan anpassas för att bedöma svaret av LH på andra typer av stress eller andra behandlingar som kan förändra reproduktiv hormon. Dessutom skulle detta blod samling protokoll kunna anpassas för mätning av andra cirkulerande faktorer som varierar i koncentration över tid, har rapporterats för tillväxthormon. 21 är det anmärkningsvärda bidrag till fältet neuroendokrinologi att mönstret utsöndringen av LH nu kan övervakas i en art där komplexa genetiska och i vivo molekylära metoder att studera LH puls förordning finns tillgängliga och praktisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Drs. Jennifer Yang och Alexander (Sasha) Kauffman för tekniskt bistånd med denna teknik samt många hjälpsamma och kritiska diskussioner. Serum hormon analyser utfördes av Yang et al., 2017 på det Universitetar av Virginia Center för forskning i reproduktion Ligand analys och analys kärna, stöds av Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Källor för forskningsstöd: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM stöddes av T32 NICHD 007203.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
