Summary
在这里, 我们提出了一个尾巴尖端血液取样协议, 以频繁样本收集在无约束的小鼠。该方法对评估脉动性促黄体激素分泌模式有一定的参考价值, 可用于其他循环因素的分析。
Abstract
在许多内分泌系统中, 循环因子或荷尔蒙不会连续释放, 而是作为一种离散的脉搏分泌, 以响应释放因子。单点取样措施不足以充分理解正常生理条件下或失调条件下脉动激素分泌模式的生物学意义。促黄体激素 (LH) 是由垂体前 gonadotrope 细胞合成的, 在脉动模式下分泌, 需要经常采集血液样本进行脉搏评估。这是不可能的, 直到最近, 由于开发了高灵敏度 LH 检测和先进的技术, 频繁的低量样本收集, 最初描述的 Steyn 和同事。1在这里, 我们描述了一个协议, 从小鼠频繁的外周血标本收集, 充分的处理驯化, 以检测 LH 的脉动分泌。目前的协议详述了一个扩大的驯化期, 允许评估的健壮和连续脉冲的 LH 在多个小时。在这个协议中, 尾巴的尖端被修剪, 血液是从尾部收集使用手持吸管。为了评估 gonadectomized 小鼠的搏动性 LH, 每隔5-6 分钟收集一系列样品, 90-180 分钟. 重要的是, 在清醒、自由行为的小鼠体内, 采集血液和测定 lh 的健壮脉冲, 给予适当的处理驯化和努力, 以尽量减少环境压力。在采血前4-5 周内可以达到足够的驯化。本议定书强调了方法的进展, 以确保收集全血样本, 以评估在老鼠的多小时内脉动 LH 分泌模式, 一个强大的动物神经内分泌研究模型。
Introduction
哺乳动物性腺功能依赖于促性腺激素分泌, 促黄体激素 (LH) 和卵泡刺激激素, 从垂体腺。促性腺激素是以脉动或浪涌模式分泌促性腺激素释放荷尔蒙 (促性腺素) 的下丘脑分泌物。LH 和 FSH 的合成和分泌都是通过内分泌、分泌和分泌作用来调节的, 包括下丘脑促性腺激素、性腺激素和激活-抑制素-卵泡抑素系统, 以及无数包括应力和能量平衡在内的生理条件。2
lh 在血液中的脉动模式产生于一个相当突然的 lh 放电到外周血, 其次是近似指数消除。该模式的重要特征包括每个 lh 放电的频率和 lh 反应的振幅, 这两者都是由释放促性腺激素. 由于收集下丘脑-垂体门血的困难, 测量搏动性促性腺激素, LH 的取样和测量被用来作为促性腺激素调节下丘脑-垂体-性腺轴的代表。因此, 关键信息编码的频率和幅度的 LH 脉冲, 这不能确定从一个单一的样本。
对搏动性 LH 分泌物的分析历史上仅限于大型哺乳动物 (人类、灵长类动物和绵羊), 原因是它们的血容量大, 而且对频繁的血样采集有耐受性。在啮齿动物中, 频繁的血液取样仅限于大鼠, 通过留置心房导管实现。3,4相对较低的遗传成本和可用性 (例如, CRISPR) 和复杂的神经回路 (如光遗传学、chemogenetics) 操作使小鼠成为具有吸引力的模型有机体;然而, 获得频繁的血液样本和随后的 LH 浓度分析, 直到最近, 证明是难以捉摸的。这项艰巨的任务是由 Steyn 和同事开创的。1从那以后, 几个实验室已经开始使用频繁的血液取样和超敏 lh 检测, 以评估脉冲 LH 分泌物在各种实验范式。5,6,7,8,9应指出的是, 寻求一种实用的方法来收集来自小鼠的多份血样已经进行了至少40年的10 , 并进行了多次改良。11,12
对 LH 脉冲模式 (即频率和振幅) 的评估, 是监测这种遗传听话动物模型中的基础促性腺激素分泌的一个重要的改进。传统上, 小鼠的 LH 浓度在单个血液样本中测定。单点样本的一个缺点是高度可变的数据集, 因为 LH 浓度在每个脉冲期间自然波动。另一个缺点是, 孤立的测量本身就忽略了 LH 脉冲分泌模式所传达的关键信息。因此, 在自由行为, 无约束的小鼠收集频繁的血液样本 (除了在取样过程中温和处理) 的方法将提供增强的信息, 并证明有用的许多实验室研究搏动激素调节。
在这里, 我们描述了一个协议, 收集频繁 (每6分钟) 血液样本从清醒, 无拘无束的老鼠。重要的是, 我们包括一个处理习得协议, 允许强健和连续检测脉冲 LH 分泌物在整个血液样本收集的时间内, 对急性挑战的前期和事后评估可以确定,如对固定化和克制的社会心理压力的反应。对全血标本 LH 浓度进行了有效的测定;1本协议的重点是收集血液样本的 LH 脉冲测量方法。
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Protocol
这里描述的方法是与国立卫生动物护理和使用指南的协议, 并已授权的机构动物护理和使用委员会在加州大学圣地亚哥分校。
1. 处理的驯化
- 处理过程
- 把老鼠笼放在安全柜里。将第一只老鼠从笼子里移开, 放在安全柜内合适的表面 (如干净的笼盖上)。
- 用一只手的食指和拇指握住尾部的底座, 轻轻地抑制工作表面上的鼠标。然后, 将尾巴的腹面, 从底座到尾端, 用食指和拇指牢牢地描出尾部。重复此抚摸6次 (即1 集), 并将鼠标返回到其笼中。
- 等待6分钟并重复步骤1.1.2。
注: 总计, 步骤1.1.2 将重复4次, 每只鼠标 (即4套6笔画), 使每一个鼠标将收到总共24尾中风的每一天的处理。
- 日常处理频率
- 从五至计划采血日前两个星期, 处理鼠标, 如步骤 1.1, 每周五天 (小鼠在星期六或星期日没有处理, 直到最后两周的驯化)。
- 如果在取样期间进行的实验性治疗将包括任何额外的处理 (如scruffing 或腹腔注射), 在每次处理过程中使老鼠适应这种处理活动。
注: 为适应注射程序, 使用钝针进行假注射。 - 在计划采血日的两周内, 每周处理1.1、七天的老鼠。
- 至少在计划的采血日前两周, 小鼠在配对时尽量减少对小鼠在取样过程中的干扰。
2、采血管的制备
- 在玻璃瓶中制备超灵敏 LH 检测缓冲器: 0.2% 牛血清白蛋白和 0.05% Tween-20 在 PBS [0.2 克氯化钾, 8 克氯化钠, 1.44 克 Na2HPO4 (无水), 0.24 克的 PO2, 超纯水到4升, pH 1, 过滤器和蒸压釜], 贮藏在4°c。1
注: 超灵敏 LH 检测缓冲器的体积可根据样品数量和样品体积计算, 如下所示 (2.2 & 讨论) - 准备采血管 (0.6mL 离心管)。标签管和整除检测缓冲器 (每管57µL 缓冲器; 注意, 这一体积可能因所收集的血液量或血液与所需的缓冲液的比例而异)。管可以提前几天准备取样, 贮存在4°c。
3. 收集血液
- 收集采血材料的准备工作。
- 准备使用的生物安全柜, 并安排以下材料在敞篷或在附近的手推车:10 µL 吸管 (设置为3µL 或需要的血液收集量), 吸管提示, 垃圾桶的使用吸管提示, 定时器, 打印与动物数量和样本数 (有关取样或动物问题的说明), 带有采血管、剪刀和小纱布的冰桶 (2 "x 2")。
注意: 在实验室计时器上的 "计数" 功能是有用的, 因为它没有一个可以干扰老鼠的声音警报。 - 使用永久性标记标记每个鼠标的尾部 (靠近底座), 以帮助在取样过程中快速识别正确的鼠标。
- 准备使用的生物安全柜, 并安排以下材料在敞篷或在附近的手推车:10 µL 吸管 (设置为3µL 或需要的血液收集量), 吸管提示, 垃圾桶的使用吸管提示, 定时器, 打印与动物数量和样本数 (有关取样或动物问题的说明), 带有采血管、剪刀和小纱布的冰桶 (2 "x 2")。
- 尾部和采血前准备的修剪。
- 在血液收集开始前45分钟, 将第一只老鼠从笼子里移开, 在安全柜内的适当表面 (干净的笼盖工作良好)。
- 使用锋利, 无菌剪刀删除1-2 毫米的鼠标尾部的尖端, 以下无菌制剂 (即用酒精和 betadine 擦洗)。
注: 这可以在清醒的动物, 温和克制或在异氟醚麻醉下完成。 此外, 还可以根据当地 IACUC 的建议提供镇痛。 - 小心地抚摸鼠标的尾部如上所述 (1.1.2; 1-2 冲程通常是足够的), 直到血滴在尾部尖端形成。
- 使用一个干净的提示吸管收集3µL 的血液从尾部尖端和丢弃的吸管尖端与血液。
- 在把老鼠送回笼子之前, 要确保血流停止。如有必要, 用无菌纱布轻轻按压。
- 对所有老鼠重复步骤 3.2.1 3.2.5。随后的血液样本可以通过牢牢地抚摸老鼠的尾巴来收集, 直到尾巴尖端形成一滴血。
注: 如果血滴在结实的笔触后不形成, 尾巴可以用盐水浸泡的纱布垫擦拭。血栓更可能形成在不太频繁的取样 (即 > 15 分钟间隔)。一旦血栓从静脉中清除, 取样就可以继续进行。 - 继续收集每只老鼠3µL 的血液, 如上文所述, 每6分钟约45分钟, 在这个前采血准备期间。扔掉血和吸管尖。
- 采血
- 从尾端收集3µL 的血, 如上文所述。注意确保将整个3µL 样品带入吸管尖端 (没有气泡或床上用品污染)。将血液样本喷射到标记管中的化验缓冲器中。混合通过反转, 并返回到冰的管。
- 在把老鼠送回笼子之前, 要确保血流停止。如有必要, 用无菌纱布轻轻按压。
- 对每个鼠标重复步骤 3.3.1 3.3.2, 每隔6分钟为预定的取样持续时间。监测每一个动物的窘迫迹象 (例如, 部分闭合的眼睑, 驼背的位置 [不是由其他治疗引起的) 或缺乏对处理的反应) 和终止抽样, 如果必要的话。
注意: 行为困扰或其他需要终止取样的并发症在我们的实验室极少发生。 - 如果动物在血液取样后不被安乐死, 请确保尾部的血流完全停止。将每只动物笼内的溅出的血液擦掉 (或更换笼子), 并将动物笼返回到外壳架上。
4. 样品处理和分析
- 将血液样本储存在-20 摄氏度直到分析。
注: 在检测缓冲液稀释的全血标本中, LH 测定;在贮存或分析之前, 不需要分离血清或血浆。 - 用超灵敏 ELISA 法测定血液样本, 如前所述1 , 并报告全血中 ng/毫升的值, 并对测定缓冲区中样品容积的稀释进行校正。
- 识别数据集中的 LH 脉冲。根据数据集的不同, 计算和比较平均脉冲振幅和脉冲频率 (或脉间间隔)。
注: 已发布标准13,14和程序,15,16检测 LH 脉冲可用。
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Representative Results
典型的 LH 脉冲模式从4小鼠显示在图 1 (数据重印从杨等, 2017)。LH 是在频繁的血液样本测量, 以确定对急性社会压力挑战的反应。成年雌性 C57/Bl6 小鼠被卵巢切除, 并在本议定书中详细处理, 以便频繁采血。为所有动物的前90分钟收集血液样本, 以建立 LH 搏动分泌物的预处理基线。在取样的第二个90分钟内, 控制 (非受压) 动物留在笼子里, 限制压力动物被放置在老鼠的克制装置中, 并被隔离到新的笼子里。控制动物在整个取样期间显示清楚, 明确的 LH 脉冲。与此相反, 约束的心理社会压力迅速而明确地抑制了脉动 LH 分泌物。
图 1: 卵巢切除小鼠的典型 LH 脉冲模式。(A、C)控制无应力小鼠。(B、D)用0-90 分钟 (灰色阴影区) 和 LH 测定的压力小鼠。开放数据点表示由 DynPeak 标识的脉冲。15这一数字已从杨等人, 内分泌学 158 (11): 3716-3723, 2017 经内分泌学会许可, 版权所有2017。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们描述了一个经常性的血液收集的全血尾端样本, 以评估脉冲 LH 分泌的小鼠的协议。该协议可以收集样本, 以检测在受心理社会压力照射后搏动性 lh 分泌物的急性变化, 并且很适合在其他急性或慢性操作下对 lh 脉冲进行评估。
该协议的关键组成部分, 以实现可靠和健壮的 LH 的配置文件是处理驯化期。在文献中推测, 处理压力会损害激素分泌的想法在17 , 但没有明确的测试。然而, 对最近的出版物中描述的 LH 脉冲模式的分析清楚地显示了对处理的彻底驯化的好处。在早期的研究中, 利用10天的处理, lh 脉冲发生在不规则的时间间隔, 长时间内没有发现 lh 脉冲。1在那以后那精的出版物有一个趋向在文学为更长的处理期间 (即3 或4星期每日处理)。5,6,8此处所述的协议涉及总共5周的处理, 但在前3个周末忽略了处理, 从而实现了类似数量的处理会话, 并将实验家的周末工作量降至最低。虽然我们不能为成功检测 LH 脉冲所需的处理会话提供一个经过验证的阈值数, 但我们鼓励这一程序的新从业者考虑延长的驯化期。在某些实验范式下 (例如, 研究年轻动物的 LH 脉冲), 几个星期的处理驯化可能是不切实际的。对于这些实验, 有足够的处理驯化是至关重要的;也许每天多处理会话就足够了。
在采血期间尽量减少环境压力对本议定书的成功也是至关重要的。为了追求这个目标, 我们把老鼠放在 vivarium 的一个安静的房间里, 在整个驯化期内。在取样当天, 在动物房门外放置一个 "安静的请" 标志可以帮助消除意外的中断。在采血期间, 可以在生物安全柜中使用布, 以提供一个地方休息的吸管, 吸管的提示和钢笔, 从而减少了操作这些项目造成的噪音。最后, 建议一个人在实验日处理小鼠并收集所有血样。这个人应该勤奋地处理动物的照顾, 并在一天的一致时间 (这应该是类似的取样时间), 因为生理输入是已知的影响压力反应。18如果 LH 脉冲很少或无法检测到, 则应确定并最小化外部压力源。另一个与在采血期间尽量减少压力有关的程序性细节是尾部修剪和采集样品的时间间隔。在采集样品前, 我们先将每只老鼠的尾部45分钟夹紧。这种延迟服务于世俗地将与尾部修剪相关的压力与取样过程中施加的任何附加处理分开, 因为单独的尾部修剪已经证明可以提高循环皮质酮的浓度。在这个45分钟的窗口中, 19个血样被撤回 (但被丢弃), 以进一步适应小鼠的处理程序, 防止在这种延迟过程中形成血栓。
在使用本议定书进行频繁的小鼠采血时, 最后的考虑是这个物种的小血量会限制收集的每个样本的数量和体积。根据美国农业部动物检查指南, 老鼠每公斤体重有72毫升的血。20为生存实验, 7.5% 的血容量可以收集在一个单一的取样期间, 给予1周的恢复期, 10% 的血容量可以收集到2周的恢复期。我们经常收集 < 7.5% 的估计血量的老鼠使用目前频繁的血液收集协议 (包括这里显示的代表性结果), 没有任何不利影响 LH 分泌模式。在我们的 vivarium, 成年 C57/Bl6 去卵巢小鼠体重约22克 (理论血容量1.58 毫升), 允许118.5 µL 的血液收集。除了7个预收集处理样本 (未化验或分析), 30 个样本收集超过180分钟总共111µL 的血液 (3 µL 每个样本), 这是低于7.5% 血容量限制。应该指出的是, 血液样本量可能需要调整, 以检测 lh 在某些情况下, 当 lh 浓度预计低。在 gonadectomized 小鼠中, 3 µL 的全血足以检测 LH。当 lh 浓度较低时, 应考虑收集更大的血容量, 因此预期更接近 lh 测定的灵敏度。因此, 尽管老鼠的血量小, 可以收集足够的血液样本来评估180分钟内搏动性 LH 分泌物的不折不扣剖面。
总之, 这一频繁的血液取样协议突出了一个延长处理适应期, 以确保评估的脉搏 LH 分泌物的小鼠在一段时间内。我们已经证明, 这个协议足以描述在心理压力暴露之前和之后可以监测的 LH 的健壮和常规脉冲。该协议可用于评估 LH 对其他类型的压力或其他可能改变生殖激素分泌的治疗方法的反应。此外, 这种血液收集协议可以调整, 以测量其他循环因素, 随着时间的推移浓度变化, 如已报告的生长激素。21这是一个显着的贡献, 神经内分泌学的领域, lh 的分泌模式现在可以监测在一个物种, 复杂的遗传和体内分子方法研究 LH 脉冲调节是可用的, 并实际。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Drs. 珍妮弗. 杨和亚历山大 (萨沙) 考夫曼为技术协助与这项技术并且许多有用和关键的讨论。血清激素测定是由2017在弗吉尼亚大学的生殖配体检测和分析核心研究中心进行的, 由尤尼斯肯尼迪发育研究院/NIH (NCTRI) 赠款 P50-HD28934 支持。
研究支持来源: R01 发育研究院 86100 (九巴), 成果管理制得到 T32 发育研究院007203的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
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