Summary
Her præsenterer vi en hale-spids blod prøvetagningsprotokol for hyppige prøvetagning i uhæmmet mus. Denne metode er nyttig for vurderingen af mønstre af pulsatile luteiniserende hormon sekretion og kunne tilpasses til analyse af andre cirkulerende faktorer.
Abstract
I mange endokrine systemer, cirkulerende faktorer eller hormoner frigives ikke kontinuerligt, men udskilles som en diskret puls som reaktion på en releasing faktor. Enkelt punkt prøveudtagning foranstaltninger ikke er tilstrækkelige til fuldt ud at forstå den biologiske betydning af den sekretoriske mønster af pulsatile hormoner enten under normale fysiologiske betingelser eller under betingelser af dysregulering. Luteiniserende hormon (LH) er syntetiseret ved de forreste hypofyse gonadotrope celler og udskilles i en pulsatile mønster, hvilket kræver hyppige samling af blodprøver for puls vurdering. Dette har ikke været muligt i mus indtil for nylig, på grund af udviklingen af en højfølsom LH assay og avancement i en teknik til hyppige lav-volumen prøvetagning, oprindeligt beskrevet af Steyn og kolleger. 1 her beskriver vi en protokollen for samlingen hyppige perifert blod prøve fra mus med tilstrækkelig håndtering akklimatisering til at opdage pulsatile sekretionen af LH. Den nuværende protokol detaljer en udvidet akklimatisering periode, der giver mulighed for vurdering af robust og kontinuerlig pulser af LH over flere timer. I denne protokol, spidsen af halen er klippet og blod er indsamlet fra halen ved hjælp af en håndholdt pipette. For vurdering af pulsatile LH i gonadectomized mus, seriel prøver er indsamlet hver 5-6 min. til 90-180 min. vigtigere, indsamling af blod og måling af robust pulser af LH kan ske i vågen, frit opfører mus, givet tilstrækkelig håndtering akklimatisering og indsats for at minimere miljømæssige stressfaktorer. Tilstrækkelig akklimatisering kan opnås inden for 4-5 uger før blod samling. Denne protokol fremhæver fremskridt inden for metoder til at sikre indsamling af fuldblod prøver til vurdering af pulsatile LH sekretion mønstre over flere timer i musen, en kraftfuld dyremodel for neuroendokrine forskning.
Introduction
Gonade funktion i pattedyr er afhængige af gonadotropin sekretion, luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon fra hypofysen. Gonadotropiner udskilles i enten en pulsatile eller bølge mønster i svar til hypothalamisk udskillelse af gonadotropin - releasing hormon (GnRH). Syntese og sekretion af både LH og FSH er reguleret via endokrine, paracrine og autocrine indsats fra en række forskellige molekyler herunder hypothalamus GnRH, gonadale steroidhormoner, og activin-inhibin-follistatin systemet, samt et utal af fysiologiske tilstande, herunder stress og energi balance. 2
Den pulsatile mønster af LH i blodet opstår fra en temmelig brat afslutning af LH i perifert blod, efterfulgt af omtrent eksponentiel afskaffelse. Vigtige funktioner i mønstret omfatter hyppigheden af hver LH decharge og amplituden af LH svar, som begge er dikteret, en del af udgivelsen af GnRH. behørig at er vanskeligheden at indsamle hypothalamus-hypofyse portal blodet til måling af pulsatile GnRH, prøvetagning og måling af LH bruges som en proxy for GnRH regulering af hypothalamus-hypofyse-gonadale akse. Derfor er kritiske oplysninger kodet i frekvens og amplitude af LH impulser, som ikke kan bestemmes ud fra en enkelt prøve.
Analyse af pulsatile LH sekretion har historisk set været begrænset til store pattedyr (mennesker, primater og får) på grund af deres store blodvolumen og tolerance for hyppige blod prøve samling. I gnavere, hyppige blod prøveudtagning var begrænset til rotten og opnået via indlagte atrieflimren kateter. 3 , 4 forholdsvis lav pris og tilgængelighed af genetiske (f.eks. cre-lox, CRISPR) og komplekse neurale kredsløb (f.eks. optogenetics, chemogenetics) manipulationer gøre mus en attraktiv model organisme; men opfyldelsen af hyppige blodprøver og efterfølgende analyse af LH koncentrationer har indtil for nylig vist undvigende. Denne monumentale opgave var banebrydende Steyn og kollegaer. 1 siden så flere laboratorier er begyndt at udnytte hyppige blod prøveudtagning og ultra-følsomme LH assays til at vurdere pulsatile LH sekretion i en række forskellige eksperimentelle paradigmer. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 det skal bemærkes, at udøvelse af en praktisk metode til at indsamle flere blodprøver fra mus har været i gang for mindst 40 år10 med flere justeringer lavet undervejs. 11 , 12
Vurdering af LH puls mønstre (dvs. frekvens og amplitude) repræsenterer en større raffinement i overvågning basal gonadotropin sekretion i denne genetisk tractable dyremodel. Traditionelt, blev LH koncentrationer i mus fastlagt i en enkelt blodprøve. En svaghed ved single-point prøver er en meget varierende datasæt, fordi LH koncentrationer naturligvis svingende under hver puls. En anden svaghed er, at isolerede målinger i sagens natur gå glip af vigtige oplysninger i mønstre af LH puls sekretion. Således, en metode til indsamling af hyppige blodprøver i frit opfører sig, uhæmmet mus (undtagen for skånsom håndtering under prøvetagningen) vil give øget information og vise sig nyttigt for mange laboratorier undersøger pulsatile hormon regulering.
Her, vi beskriver en protokol for samlingen af hyppige (hver 6 min) blodprøver fra vågen, uhæmmet mus. Vigtigere, vi medtager en håndtering akklimatisering protokol, der giver mulighed for robust og kontinuerlig registrering af pulsatile LH sekretion i fuldblod prøver indsamlet over en længde af tid til præ- og post vurderingen til en akut udfordring kan bestemmes, som svar på den psykosociale stress af immobilisering og tilbageholdenhed. En effektiv analyse for LH koncentrationer fra hele blodprøver er blevet beskrevet tidligere; 1 denne protokol er fokuseret på en metode til indsamling af blodprøver til LH puls måling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoden beskrevet her er i overensstemmelse med de nationale institutter for sundhed Animal Care og brug retningslinjer og er godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på University of California, San Diego.
1. akklimatisering til håndtering
- Håndtering af procedure
- Placer musen bure i biosikkerhed kabinet. Fjern den første mus i bur og sted på et passende underlag (f.eks. en ren bur låg) inden for Biosikkerhed kabinet.
- Forsigtigt dy mus på arbejdsoverflade ved at holde bunden af halen med pege- og tommelfinger én hånd. Derefter, slagtilfælde fast den ventrale overflade af halen fra bunden til spidsen af halen, med pege- og tommelfinger på anden side. Gentag dette strøg 6 gange (dvs. 1 sæt) og returnere musen til sit bur.
- Vente 6 min og Gentag trin 1.1.2.
NOTE: I alt trin 1.1.2 gentages 4 gange pr. mus (dvs. 4 sæt af 6 streger), således at hver mus vil modtage ialt 24 hale strøg på hver dag i håndtering.
- Hyppigheden af daglige håndtering
- Fra fem indtil to uger før den planlagte blod samling dag, håndtere mus som beskrevet i trin 1.1, fem dage om ugen (mus ikke håndteres på lørdag eller søndag indtil de sidste to uger på akklimatisering).
- Hvis eksperimentel behandling i stikprøveperioden vil omfatte noget yderligere håndtering (f.eks. scruffing eller intraperitoneal injektion), akklimatisere mus til denne håndtering aktivitet under hver håndtering session.
Bemærk: Til akklimatisering til injektion procedurer, bruge en afrundede nål til at udføre en fingeret injektion. - I to ugerne før den planlagte blod samling dag håndtere mus som beskrevet i punkt 1.1, syv dage om ugen.
- Mindst to uger før den planlagte blod samling dag, hus mus parvis at minimere forstyrrelser til mus under prøvetagningen.
2. forberedelse af blod indsamling rør
- Forberede ultrasensitive LH analysebuffer i en glasflaske: 0,2% bovint serumalbumin og 0,05% Tween-20 i PBS [0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (vandfri), 0,24 g KH2PO4, ultrarent vand til 1 L, pH 7,4, filter og autoklave] , opbevares ved 4° C. 1
Bemærk: Volumen af ultrasensitive LH analysebuffer skal forberedes kan beregnes baseret på antallet af prøver og volumen pr. sample som angivet nedenfor (2.2 & diskussion) - Forberede blod indsamling rør (0,6 mL microcentrifuge rør). Label rør og alikvot analysebuffer (57 µL af buffer pr tube; Bemærk, denne diskenhed kan variere afhængigt af mængden af blod indsamlet eller forholdet mellem blodet til bufferen ønskes). Rør kan være forberedt dage forud for prøveudtagning, opbevares ved 4 ° C.
3. blodet samling
- Forberedelse af blod samling materialer.
- Forberede biosikkerhed kabinet til brug, og arrangere de følgende materialer i emhætten eller på en vogn i nærheden: 10 µL pipetteres (sat til 3 µL eller ønskede blodvolumen samling), pipette tips, affald bin for brugt pipette tips, timer, udskrift med animalsk numre og prøven numre ( noter til prøvetagning eller dyrs spørgsmål), ice spand med blod indsamling rør, saks og små gaze (2 "x 2").
Bemærk: Den "tælle" funktion på et laboratorium timeren er nyttig, fordi den ikke har en lydalarm, der kunne forstyrre mus - Bruge en permanent markør til at markere halen af hver mus (nær bunden) for at hjælpe med hurtigt at identificere de korrekte mus under prøvetagningen.
- Forberede biosikkerhed kabinet til brug, og arrangere de følgende materialer i emhætten eller på en vogn i nærheden: 10 µL pipetteres (sat til 3 µL eller ønskede blodvolumen samling), pipette tips, affald bin for brugt pipette tips, timer, udskrift med animalsk numre og prøven numre ( noter til prøvetagning eller dyrs spørgsmål), ice spand med blod indsamling rør, saks og små gaze (2 "x 2").
- Klipning af hale og pre blod samling forberedelse.
- 45 min. før starten af samlingen blod, fjerne den første mus fra sit bur og Placer på et passende underlag (rent bur låg fungerer godt) inden for Biosikkerhed kabinet.
- Bruge skarp, steril saks til at fjerne 1-2 mm af toppen af musen hale, efter aseptisk forberedelse (dvs. Skrub med alkohol og betadine).
Bemærk: Dette kan opnås i vågen dyr med blid tilbageholdenhed eller under isofluran anæstesi. Analgesi kan derudover ydes efter anbefaling fra den lokale IACUC. - Omhyggeligt slagtilfælde halen af musen som beskrevet ovenfor (1.1.2; 1-2 streger er generelt tilstrækkelig) indtil dråbe blod former på halespidsen.
- Bruge en pipette med en ren tip til at indsamle 3 µL af blod fra halespidsen og kassér pipette tip med blod.
- Før returnere musen til sit bur, sikre at blodgennemstrømningen er stoppet. Om nødvendigt anvende blide tryk med steril gaze.
- Gentag trin 3.2.1 - 3.2.5 for alle mus. Efterfølgende blodprøver kan indsamles af fast strøg musens hale indtil en dråbe blod former på spidsen af halen.
Bemærk: Hvis en blod droplet ikke udgør efter faste streger, halen kan være dabbed hos en gauze afrivningsblok dyppet i saltvand. Blodpropper er mere tilbøjelige til at danne under mindre hyppige prøvetagningen (dvs. > 15 min. intervaller). Når størkne er ryddet fra venen, kan prøveudtagning fortsætte. - Fortsætte med at indsamle 3 µL af blod fra hver mus som beskrevet ovenfor hver 6 min for ca. 45 min. i denne pre blod samling forberedelsesperiode. Kassér blod og pipette spidsen.
- Udtagning af blodprøve
- Indsamle 3 µL af blod fra halespids som beskrevet ovenfor. Tage forsigtighed for at sikre, at hele 3 µL prøven tages pipette tip (uden bobler eller sengetøj forurening). Skubbe blodprøven i analysebuffer i en mærket tube. Mix af inversion og retur røret til is.
- Før returnere musen til sit bur, sikre at blodgennemstrømningen er stoppet. Om nødvendigt anvende blide tryk med steril gaze.
- Gentag trin 3.3.1 - 3.3.2 for hver musen, hver 6 min, for forudbestemt prøveudtagning varighed. Overvåge hvert enkelt dyr for tegn på angst (fx delvist lukkede øjenlåg, foroverbøjet stilling [ikke forårsaget af andre behandling] eller manglende respons til håndtering) og opsige prøveudtagning, hvis det er nødvendigt.
Bemærk: Adfærdsmæssige angst eller andre komplikationer, der kræver ophævelse af prøveudtagning forekommer ekstremt sjældent i vores laboratorium. - Hvis dyr ikke er aflivet efter udtagning af blodprøve, sikre, at blod flyde fra halespidsen er helt stoppet. Tør nogen spildte blod fra indersiden af enkelte dyrs bur (eller Skift bure) og returnere de animalske bure til boliger rack.
4. prøve behandling og analyse
- Gemme blodprøver på-20 ° C indtil analyse.
Bemærk: LH er analyseret i hele blodprøver fortyndet i analysebuffer; ingen adskillelse af sera eller plasma er nødvendig forud for opbevaring eller analyse. - Assay blodprøver af ultrasensitive ELISA som beskrevet tidligere1 og rapporten værdier i ng/mL fuldblod efter korrektion for fortynding af prøven volumen i analysebuffer.
- Identificere LH pulser i datasættet. Beregn og Sammenlign gennemsnitlig puls amplitude og puls frekvens (eller Inter puls interval) som passende for datasæt.
Bemærk: Offentliggjorte kriterier13,14 og programmer,15,16 til påvisning af LH pulser er tilgængelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative LH puls mønstre fra 4 mus er vist i figur 1 (data Genoptrykt fra Yang et al., 2017). LH blev målt i hyppige blodprøver til at bestemme reaktion på en akut psykosocialt stress udfordring. Voksen C57/Bl6 hunmus blev ovariectomized og håndteres som beskrevet i denne protokol for hyppige blod samling. Blodprøver blev indsamlet for de første 90 min i alle dyr at etablere en forbehandling baseline af LH pulsatile sekretionen. Under den anden 90 min for sampling, kontrol (ikke-stressede) dyr forblev i deres bure og tilbageholdenhed stress dyr blev placeret i gnavere fastholdelsesanordninger og isoleret over i nye bure. Kontroldyr viste klar og utvetydig LH pulser i hele hele stikprøveperioden. Derimod undertrykt de psykosocialt stress tilbageholdenhed hurtigt og utvetydigt pulsatile LH sekretion.
Figur 1: repræsentative LH puls mønstre fra ovariectomized mus. (En, C) Kontrol ikke-understregede mus. (B, D) Understregede mus hvor tilbageholdenhed blev indført fra 0-90 min (grå skraverede område) og LH blev analyseret. Åbne datapunkter repræsenterer pulser identificeret ved DynPeak. 15 denne figur er blevet ændret fra Yang et al., endokrinologi 158(11): 3716-3723, 2017 med tilladelse fra The Endocrine Society, Copyright 2017. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokol for hyppige blod samling af hele halespids blodprøver til vurdering af pulsatile LH sekretion i mus. Denne protokol giver mulighed for udtagning af prøver til påvisning af akutte ændringer i pulsatile LH sekretion efter udsættelse for psykosocial stress og er velegnet til vurdering af LH pulser under andre akutte eller kroniske manipulationer.
Et afgørende element i denne protokol for at opnå pålidelige og robuste profiler af LH pulser er håndteringen akklimatisering periode. Tanken om at håndtere stress kan forringe hormon sekretion er blevet spekuleret på i litteratur,17 men ikke udtrykkeligt testet. Analyse af de repræsentative LH puls mønstre afbildet i de seneste publikationer viser dog klart en fordel at grundig akklimatisering til håndtering. I tidlige undersøgelser, udnytter 10 dage af behandling, opstod LH pulser med uregelmæssige intervaller med længere perioder, i hvilke ingen LH pulser blev opdaget. 1 efter denne skelsættende publikation, der har været en tendens i litteraturen for længere tid håndtering perioder (dvs. 3 eller 4 uger af daglige håndtering). 5 , 6 , 8 protokollen beskrevet her indebærer alt 5 uger behandlinger men udelader håndtering på de første 3 weekender, derved, at opnå et tilsvarende antal håndtering sessioner og minimere weekend arbejdsmængder for experimentalists. Selv om vi ikke kan give en valideret tærskel antal kræves håndtering sessioner for succesfuld registrering af LH pulser, vi vil tilskynde nye udøvere af denne procedure til at overveje en udvidet akklimatisering periode. Under visse eksperimentelle paradigmer (f.eks. at studere LH pulser i unge dyr), kan flere uger at håndtere akklimatisering ikke være praktiske. For disse forsøg er det kritisk, at der opnås tilstrækkelig håndtering akklimatisering; måske ville flere håndtering sessioner per dag være tilstrækkelig.
Minimere miljømæssige stress samling i perioden blod er også afgørende for succes i denne protokol. I forfølgelsen af dette mål hus vi vores mus i et stille rum inden for vivarium periode hele akklimatisering. Placering af et "Stille venligst" tegn på ydersiden af animalsk døren på dagen for prøveudtagning kan medvirke til at eliminere utilsigtede afbrydelser. Samling-perioden blod, kan en klud bruges i biosikkerhed kabinet til et sted at hvile pipetten, afpipetteres tips og penne, dermed minimere støj forårsaget ved at manipulere disse elementer. Endelig, det tilrådes, at en person bør håndtere mus og indsamle alle blodprøver på den eksperimenterende dag. Denne person skal være flittig i håndtering af dyr med omhu, og på en konsekvent tidspunkt på dagen (som bør svare til Prøvetagningstiden), da døgnrytmen indgange er kendt for at påvirke stress svar. 18 hvis LH pulser er sjældne eller målbart, kilder til uvedkommende stress skal identificeres og minimeres. En anden proceduremæssige detaljer relateret til at minimere stress samling i perioden blod er mængden af tid, at tidsrummet mellem klipning af hale og indsamling af prøver skal analyseres for LH. Vi klip halen af hver mus 45 min før indsamling af prøver til LH assay. Denne forsinkelse serverer tidsligt adskille den stress i forbindelse med halen avisudklip fra enhver yderligere behandlinger pålagt under prøvetagningen, som halen klipning alene er blevet påvist for at ophøje cirkulerende corticosterone koncentrationer. 19 blodprøver trækkes (men kasseres) under denne 45-min vindue at akklimatisere mus til proceduren for håndtering og forebygge blodpropdannelse under denne forsinkelse.
En sidste overvejelse når beskæftiger denne protokol for hyppige blod samling i mus er, at den lille blodvolumen af denne art vil begrænse antallet og omfanget af hver prøve indsamles. Mus har ifølge USDA dyr inspektion Guide, 72 mL blod per kg kropsvægt. 20 for overlevelse eksperimenter, 7,5% af blodvolumen kan indsamles i en enkelt stikprøveperioden givet en 1-ugers tilbagebetalingsperioden og 10% af blodvolumen kan indsamles med en 2-ugers tilbagebetalingsperioden. Vi rutinemæssigt indsamler < 7,5% af den anslåede blodvolumen musen ved hjælp af de aktuelle hyppige blod samling protokol (herunder repræsentative resultater vist her), uden nogen negativ virkning på LH sekretoriske mønstre. I vores vivarium voksne C57/Bl6 ovariectomized mus vejer ca 22 g (teoretisk blodvolumen på 1,58 mL), giver mulighed for 118.5 µL af blod skal indsamles. I tilføjelse til 7 før samling håndtering prøver (der ikke er analyseret eller analyseret), er 30 prøver indsamlet over 180 min. i alt 111 µL af blod (3 µL pr. prøve), hvilket er under grænsen på 7,5% blod volumen. Det skal bemærkes, at mængden af blodprøven muligvis skal justeres for at opdage LH i visse betingelser når LH koncentrationer forventes at være lav. I gonadectomized mus er 3 µL fuldblod tilstrækkeligt til at påvise LH. Indsamler en større blodvolumen bør overvejes når LH koncentrationen er lav og derfor forventes at være tættere på følsomheden af LH assay. Således, trods den lille blodvolumen musen, tilstrækkelig blodprøver kan indsamles for at vurdere en kompromisløs profil af pulsatile LH sekretion over en periode på 180-min.
Til sidst, håndtering denne hyppige blodprøvetagning protokol højdepunkter en udvidet akklimatisering periode for at sikre, at vurderingen af pulsatile LH sekretion i mus over en længere periode. Vi har vist, at denne protokol er tilstrækkelig til at karakterisere robust og regelmæssig pulser af LH, der kan overvåges forud for og efter eksponering for psykosocialt stress. Denne protokol kan tilpasses for at vurdere LH svar til andre typer af stress eller andre behandlinger, der kan ændre reproduktive hormon sekretion. Desuden kunne dette blod samling protokol tilpasses til måling af andre cirkulerende faktorer, der varierer i koncentration over tid, som er blevet rapporteret til væksthormon. 21 det er en bemærkelsesværdig bidrag til området af neuroendocrinology sekretion mønster af LH kan nu overvåges i en art, hvor kompleks genetisk og i vivo molekylære metoder til at studere LH puls forordning er tilgængelige og praktiske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Drs. Jennifer Yang og Alexander (Sasha) Kauffman for teknisk bistand med denne teknik samt mange nyttige og vigtige diskussioner. Serum hormon assays blev udført af Yang et al., 2017 ved The University of Virginia Center for forskning i reproduktion Ligand Assay og analyse kerne, støttet af Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Kilder til forskning Support: R01 NICHD 86100 (KMB), Ringmekanismer blev støttet af T32 NICHD 007203.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
