Summary
Hier presenteren we een staart-tip bloed bemonstering protocol voor frequente sample collectie in ongebreidelde muizen. Deze methode is nuttig voor het beoordelen van patronen van Pulsatiele luteïniserend hormoon afscheiding en voor analyse van andere circulerende factoren zou kunnen worden aangepast.
Abstract
In vele endocriene systemen, circulerende factoren of hormonen niet continu worden vrijgegeven, maar als een afzonderlijke puls in reactie op een releasing factor worden uitgescheiden. Single-point bemonstering maatregelen zijn ontoereikend is om de biologische betekenis van de secretoire patroon van Pulsatiele hormonen in normale fysiologische omstandigheden of onder vervoersomstandigheden disregulatie volledig te begrijpen. Luteïniserend hormoon (LH) wordt gesynthetiseerd door de anterieure hypofyse de gonadotrope cellen en uitgescheiden in een Pulsatiele patroon waarvoor frequente verzameling van bloedmonsters voor beoordeling van de pols. Dit niet mogelijk is geweest in muizen totdat onlangs, als gevolg van de ontwikkeling van een hoog-gevoeligheids LH-test en vooruitgang in een techniek voor frequente laag-volume sample collectie, oorspronkelijk beschreven door Steyn en collega's. 1 hier beschrijven we een protocol voor de frequente perifeer bloed monster collectie van muizen met voldoende behandeling acclimatisatie te detecteren Pulsatiele secretie van LH. Het huidige protocol gegevens een uitgebreide acclimatisatie periode waarmee beoordeling van robuust en continue pulsen van LH over meerdere uren. In dit protocol, het puntje van de staart is geknipt en bloed wordt verzameld uit de staart met behulp van een precisiepipet hand-held. Voor de beoordeling van Pulsatiele LH in gonadectomized muizen, seriële monsters worden verzameld elke 5-6 min voor 90-180 min. nog belangrijker is, de inzameling van bloed en meting van robuuste pulsen van LH kunnen worden bereikt in wakker, vrij gedragend muizen, passende behandeling gegeven acclimatisatie en inspanning om te minimaliseren milieustressoren. Voldoende acclimatisatie kan binnen 4-5 weken voorafgaand aan de bloedinzameling worden bereikt. Dit protocol onderstreept voorschotten in de methodologie om bloed monsters voor evaluatie van Pulsatiele LH secretie patronen over meerdere uren in de muis, een krachtige diermodel voor neuro-endocriene onderzoek.
Introduction
Gonaden functie bij zoogdieren is afhankelijk van choriongonadotrofine secretie, luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon, uit de hypofyse. De gonadotrofinen worden uitgescheiden in een gepulseerde of Golf patroon in reactie op de hypothalamische secretie van gonadotropin - releasing hormone (GnRH). De synthese en secretie van zowel LH als FSH worden geregeld via een actie van de verstoringen van de hormoonhuishouding, paracrine en autocrine uit een aantal moleculen met inbegrip van hypothalame GnRH, gonadale steroïde hormonen, en de activin-inhibine-follistatin systeem, evenals een groot aantal fysiologische omstandigheden, waaronder stress en energiebalans. 2
Het Pulsatiele patroon van LH in het bloed vloeit voort uit een nogal abrupte lozing van LH in perifeer bloed, gevolgd door ongeveer exponentiële eliminatie. Belangrijke kenmerken van het patroon zijn de frequentie van elke LH kwijting en de amplitude van de LH-reactie, die beide worden gedicteerd, gedeeltelijk door de release van GnRH. Due to de moeilijkheid bij het verzamelen van hypothalame-hypofyse portal bloed voor meting van Pulsatiele GnRH, de monsterneming en de meting van het LH wordt gebruikt als een proxy voor GnRH regulering van de hypothalamische-hypofyse-gonadale as. Daarom is kritieke informatie gecodeerd in de frequentie en amplitude van LH pulsen, die uit een enkelvoudige steekproef kan niet worden bepaald.
Analyse van Pulsatiele LH secretie van oudsher beperkt tot grote zoogdieren (mens, primaten en schapen) te wijten aan hun grote bloed volume en tolerantie voor frequente bloed monster collectie. Bij knaagdieren, frequente bloedmonsters was beperkt tot de rat en bereikt via inwoning atriale katheter. 3 , 4 de relatief lage kosten en beschikbaarheid van genetische (bijvoorbeeld cre-lox, CRISPR) en complexe neurale (b.v. optogenetics, chemogenetics) manipulaties maken muizen een aantrekkelijk model-organisme; verwezenlijking van frequente bloedmonsters en na diverse analyses van LH concentraties heeft echter tot onlangs bewezen ongrijpbaar. Deze monumentale taak was gepionierd door Steyn en collega's. 1 sinds dan, verschillende labs zijn begonnen om frequente bloedmonsters en ultra gevoelige LH-testen om te beoordelen Pulsatiele LH secretie in een verscheidenheid van experimentele paradigma's te gebruiken. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 opgemerkt moet worden dat het nastreven van een praktische manier van het verzamelen van meerdere bloedmonsters van muizen is geweest in de vooruitgang van ten minste 40 jaar10 met meerdere verfijningen gemaakt langs de weg. 11 , 12
Beoordeling van LH pulse patronen (d.w.z. frequentie en amplitude) vertegenwoordigt een grote verfijning bij het toezicht op basale gonadotrofinen secretie in dit genetisch hanteerbare diermodel. Traditioneel, werden LH concentraties in muizen vastgesteld in een enkel bloedmonster. Een zwak punt van single-point monsters is een zeer variabel gegevensverzameling omdat LH concentraties natuurlijk tijdens elke puls schommelt zijn. Een ander zwak punt is dat geïsoleerd metingen inherent kritische informatie die door de patronen van de LH secretie van de pols missen. Dus, een methode voor het verzamelen van frequente bloedmonsters in vrij gedraagt, ongebreidelde muizen (met uitzondering van zachte behandeling gedurende de bemonstering) zal voorzien van uitgebreide informatie en nuttig zijn voor veel laboratoria onderzoeken Pulsatiele hormoon verordening.
Hier beschrijven we een protocol voor het verzamelen van frequente (elke 6 min) bloed monsters van wakker, ongebreidelde muizen. Nog belangrijker is, ook een afhandeling acclimatisatie protocol waarmee robuuste en continu detectie van Pulsatiele LH secretie in volbloed monsters verzameld een lengte van tijd waarin pre-en post beoordeling aan een acute uitdaging kan worden vastgesteld, zoals de reactie op de psychosociale stress van immobilisatie en terughoudendheid. Een effectieve assay voor LH concentraties van monsters van volbloed is bestempeld eerder; 1 die dit protocol is gericht op een methode voor het verzamelen van de bloedmonsters voor LH polsmeting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier beschreven methode is in overleg met de nationale instituten van gezondheid Animal Care en de richtsnoeren voor het gebruik en door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de University of California, San Diego zijn gemachtigd.
1. de acclimatisatie aan behandeling
- Afhandelen van de procedure
- Plaats de muis kooien in het biosafety kabinet. Verwijder de eerste muis uit de kooi en de plaats op een daartoe geschikte werkvloer (bijvoorbeeld een schone kooi deksel) binnen het biosafety kabinet.
- Zachtjes de muis op het werkvlak te beperken door de basis van de staart met de wijsvinger en de duim van één hand te houden. Vervolgens stevig beroerte het ventrale oppervlak van de staart, vanaf de basis naar het uiteinde van de staart, met de wijsvinger en de duim van de andere hand. Herhaal dit streelde 6 keer (dat wil zeggen 1 set) en de muis terug te keren naar haar kooi.
- 6 min wachten en herhaalt u stap 1.1.2.
Opmerking: In totaal stap 1.1.2 zal herhaald worden 4 keer per muis (dat wil zeggen 4 sets van 6 lijnen), zodat elke muis een totaal van 24 lijnen van de staart op elke dag van de behandeling krijgt.
- De frequentie van de dagelijkse afhandeling
- Verwerken van vijf tot twee weken vóór de geplande bloed collectie dag, muizen zoals beschreven in stap 1.1, vijf dagen per week (muizen worden niet behandeld op zaterdag of zondag tot de laatste twee weken van acclimatisatie).
- Als experimentele behandeling gedurende de bemonstering extra behandeling (bijvoorbeeld scruffing of intraperitoneale injectie) opneemt zal, acclimatiseren de muizen aan deze behandeling activiteit tijdens de sessie van elke behandeling.
Opmerking: Voor acclimatisatie aan injectie procedures, gebruiken een afgestompte naald voor het uitvoeren van een schijnvertoning injectie. - Tijdens de twee weken vóór de geplande bloed collectie dag, muizen te behandelen zoals beschreven in punt 1.1, zeven dagen per week.
- Ten minste twee weken vóór de geplande bloed collectie dag, huis muizen in paren om te minimaliseren van onderbrekingen van de muizen gedurende de bemonstering.
2. voorbereiding van de bloedinzameling buizen
- Ultrasensitive LH assay buffer in een glazen fles bereiden: 0,2% bovien serumalbumine en 0,05% Tween-20 in PBS [0.2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g nb2HPO4 (watervrij), 0,24 g KH2PO4, ultrazuiver water tot 1 L, pH 7.4, filter en autoclaaf] , bewaren bij 4° C. 1
Opmerking: Volume van ultrasensitive LH assay buffer worden voorbereid kan worden berekend op basis van het aantal monsters en het volume per monster zoals hieronder (2.2 & discussie) - Bereiden bloed collectie buizen (0,6 mL microcentrifuge buizen). Label buizen en aliquoot assay buffer (57 µL van buffer per buis; Let op, dit volume kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid bloed, verzameld of de verhouding van het bloed aan de buffer gewenst). Buizen kan worden bereid dagen vóór de bemonstering, bewaren bij 4 ° C.
3. de bloedinzameling
- Voorbereiding van bloed collectie materialen.
- Bioveiligheid kabinet voorbereiden voor gebruik en regelen de volgende materialen in de motorkap of op een kar in de buurt: 10 µL Pipetteer (ingesteld op 3 µL of gewenste bloed collectie volume), Pipetteer tips, afval bak voor gebruikte Pipetteer tips, timer, afdruk met dierlijke cijfers en getallen () monster voor de noten met betrekking tot bemonstering of dier) wordt ijs emmer met bloed collectie buizen, schaar en kleine gaas (2 "x 2").
Opmerking: De "tellen" functie op een laboratorium timer is handig omdat het geen een hoorbaar alarm dat de muizen verstoren kan - Gebruik een permanent marker te markeren de staart van elke muis (in de buurt van de basis) om te helpen met snelle identificatie van de juiste muis gedurende de bemonstering.
- Bioveiligheid kabinet voorbereiden voor gebruik en regelen de volgende materialen in de motorkap of op een kar in de buurt: 10 µL Pipetteer (ingesteld op 3 µL of gewenste bloed collectie volume), Pipetteer tips, afval bak voor gebruikte Pipetteer tips, timer, afdruk met dierlijke cijfers en getallen () monster voor de noten met betrekking tot bemonstering of dier) wordt ijs emmer met bloed collectie buizen, schaar en kleine gaas (2 "x 2").
- Knippen van de staart en pre bloed collectie voorbereiding.
- 45 min voor aanvang van de bloedinzameling, het verwijderen van de eerste muis uit zijn kooi en plaats op een daartoe geschikte werkvloer (een schone kooi deksel werkt goed) binnen het biosafety kabinet.
- Gebruik van scherpe, steriele schaar voor het verwijderen van 1-2 mm van het uiteinde van de staart van de muis, na aseptische voorbereiding (d.w.z. schrobben met alcohol en betadine).
Opmerking: Dit kan worden bereikt in wakker dieren met zachte terughoudendheid of onder Isofluraan verdoving. Bovendien, kan analgesie worden verleend na de aanbeveling van de lokale IACUC. - Zorgvuldig omlijnen de staart van de muis zoals hierboven beschreven (1.1.2; 1-2 lijnen zijn over het algemeen voldoende) tot de druppel bloed vormen op het puntje van de staart.
- Gebruik een pipet met een schone tip te verzamelen 3 µL bloed vanaf de punt van de staart en negeren het uiteinde van de pipet met bloed.
- Voordat u de muis terugkeert naar zijn kooi, zorgen ervoor dat de bloedtoevoer is gestopt. Indien nodig, toepassing zachte druk met een steriel gaas.
- Herhaal stap 3.2.1 - 3.2.5 voor alle muizen. Latere bloedmonsters kunnen worden verzameld door stevig strelen van de muis staart tot een druppel bloed vormen op het puntje van de staart.
Opmerking: Als een druppel bloed geen na stevige lijnen vormt, de staart kan worden aangebracht met een gaas-zeem gedrenkt in een zoutoplossing. Stolsels hebben meer kans op formulier gedurende de minder frequente bemonstering (d.w.z. > 15 min. intervallen). Zodra de klonter wordt gewist uit de ader, kunt bemonstering doorgaan. - Doorgaan met het verzamelen van 3 µL bloed van elke muis als beschreven boven elke 6 min voor ongeveer 45 min in deze pre bloedinzameling voorbereidingsperiode. Gooi de bloed en Pipetteer tip.
- Bloedmonsters
- 3 µL bloed ophalen op het puntje van de staart zoals hierboven beschreven. Nemen voorzichtigheid om ervoor te zorgen dat het hele 3 µL monster is genomen in het uiteinde van de Pipet (zonder bubbels of beddengoed besmetting). Werpen het bloedmonster in de buffer van de bepaling in een gelabelde buis. Meng door inversie en terug te keren van de buis aan ijs.
- Voordat u de muis terugkeert naar zijn kooi, zorgen ervoor dat de bloedtoevoer is gestopt. Indien nodig, toepassing zachte druk met een steriel gaas.
- Herhaal stap 3.3.1 - 3.3.2 voor elke muis, elke 6 min, voor de duur van de vooraf bepaalde bemonstering. Elk dier voor tekenen van nood (bijvoorbeeld gedeeltelijk gesloten oogleden, gebogen positie [niet veroorzaakt door andere behandeling] of gebrek aan respons op behandeling) controleren en beëindigen van bemonstering, indien nodig.
Opmerking: Behavioral nood of andere complicaties waarvoor beëindiging van bemonstering komen zeer zelden in ons laboratorium. - Als de dieren zijn niet euthanized na bloedmonsters, zorgen ervoor dat de doorbloeding van de staart-tip volledig is gestopt. Veeg eventuele gemorst bloed vanaf de binnenkant van de kooi van elk dier (of verandering kooien) en de dierlijke kooien terug te keren naar het rack behuizing.
4. genieten van de verwerking en analyse
- Bewaren van bloedmonsters bij-20 ° C tot analyse.
Opmerking: LH is vehiculumcontrolegroep in volbloed monsters verdund in assay buffer; geen scheiding van de sera of plasma is vereist voorafgaand aan opslag of analyse. - Assay bloedmonsters door ultrasensitive ELISA als eerder beschreven1 en verslag waarden in ng/mL bloed na correctie voor verdunning van het monstervolume in de buffer assay.
- Identificeren van LH pulsen in de gegevensset. Berekenen en vergelijken van de amplitude van de gemiddelde hartslag en pulse frequentie (of inter pulsinterval) in voorkomend geval voor de gegevensset.
Opmerking: Gepubliceerde criteria13,14 en programma's,15,,16 voor het opsporen van LH pulsen zijn beschikbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve LH pulse patronen van 4 muizen worden weergegeven in Figuur 1 (gegevens herdruk van Yang et al., 2017). LH werd gemeten in frequente bloedmonsters om te bepalen het antwoord op de uitdaging van een acute psychosociale stress. Volwassen vrouwelijke C57/Bl6 muizen waren ovariectomized en behandeld zoals beschreven in dit protocol voor frequente bloed collectie. Bloedmonsters werden verzameld gedurende de eerste 90 min. in alle dieren vast te stellen van de basislijn van een voorbehandeling van Pulsatiele LH secretie. Tijdens de tweede 90 min van bemonstering, controledieren (niet-benadrukte) bleef in hun kooien en terughoudendheid stress dieren werden geplaatst in knaagdier terughoudendheid apparaten en geïsoleerd om nieuwe kooien. Controledieren toonde duidelijke, ondubbelzinnige LH pulsen gedurende de hele bemonstering. In tegenstelling, onderdrukt de psychosociale stress van terughoudendheid snel en ondubbelzinnig Pulsatiele LH secretie.
Figuur 1: vertegenwoordiger LH pulse patronen van ovariectomized muizen. (A, C) Controle niet-benadrukte muizen. (B, D) Muizen in die terughoudendheid was opgelegd vanaf 0-90 min (grijs gearceerde regio) benadrukt en LH werd bepaald. Open gegevenspunten vertegenwoordigen pulsen aangeduid met DynPeak. 15 dit cijfer is gewijzigd van Yang et al., endocrinologie 158(11): 3716-3723, 2017 met toestemming van de endocriene Society, Copyright 2017. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor frequente bloedinzameling volbloed staart-tip monsters voor evaluatie van Pulsatiele LH secretie in muizen. Dit protocol maakt het verzamelen van monsters voor detectie van acute veranderingen in Pulsatiele LH secretie na blootstelling aan psychosociale stress en is geschikt voor de beoordeling van LH pulsen onder andere acute of chronische manipulaties.
Een essentieel onderdeel van dit protocol voor het bereiken van betrouwbare en robuuste profielen van LH pulsen is de behandeling acclimatisatie periode. Het idee dat behandeling van stress kan afbreuk doen aan de secretie van het hormoon is gespeculeerd op in de literatuur,17 maar niet expliciet getest. Analyse van de representatieve LH pulse patronen afgebeeld in recente publicaties blijkt echter duidelijk een voordeel aan grondige acclimatisatie aan behandeling. In vroege studies, gebruik makend van de tiendaagse behandeling, LH pulsen opgetreden met onregelmatige tussenpozen met langdurige periodes in welke geen LH pulsen werden ontdekt. 1 na dat rudimentaire bekendmaking, is er een trend in de literatuur voor een langere behandeling (dat wil zeggen 3 of 4 weken dagelijkse behandelingen). 5 , 6 , 8 het protocol hier beschreven betreft het in totaal van 5 weken van de behandeling, maar verzuimt handling op de eerste 3 weekenden, daarmee een vergelijkbaar aantal behandeling van sessies en het minimaliseren van weekend werkbelasting voor experimentalisten bereiken. Hoewel we geen een gevalideerde minimumaantal vereist behandeling van sessies voor succesvolle detectie van pulsen LH, wij raden nieuwe beoefenaars van deze procedure te overwegen van een uitgebreide acclimatisatie periode. Onder bepaalde experimentele paradigma's (bijvoorbeeld studeren LH pulsen in jonge dieren), enkele weken voor de behandeling van de acclimatisatie mogelijk niet praktisch. Voor deze experimenten is het van cruciaal belang dat voldoende behandeling acclimatisatie wordt bereikt; Misschien zou meerdere behandeling sessies per dag voldoende.
Minimaliseren van de milieudruk in de periode van de collectie bloed is ook cruciaal voor het welslagen van dit protocol. Bij het nastreven van dit doel huis we onze muizen in een stille ruimte binnen de vivarium gedurende de gehele acclimatisatie. Plaatsing van een "Rustige Please"-teken op de buitenkant van de deur van de dierlijke kamer op de dag van de monsterneming kan bijdragen tot het elimineren van onbedoelde onderbrekingen. Deperiode bloed collectie, kan een doek worden gebruikt in het kabinet biosafety waarmee een plek om te rusten van de pipet, Pipetteer tips en pennen, daardoor, minimaliseren van lawaai veroorzaakt door deze items manipuleren. Tot slot, is het raadzaam dat één persoon moet omgaan met de muizen en verzamelen van alle bloedmonsters op de experimentele dag. Deze persoon moet worden ijverig in de behandeling van dieren met zorg, en op een consistente tijd van dag (dat moet ongeveer gelijk zijn aan het bemonsteringstijdstip), aangezien de circadiane ingangen zijn gekend om te beïnvloeden van stress reacties. 18 als LH pulsen zijn zeldzaam of niet detecteerbaar, bronnen van vreemde stress moeten worden geïdentificeerd en kan worden geminimaliseerd. Een ander procedurele detail aan het minimaliseren van de stress tijdens de periode van de collectie bloed gerelateerde is de hoeveelheid tijd die verstrijkt tussen het knippen van de staart en het verzamelen van monsters worden vehiculumcontrolegroep LH. We knippen de staart van elke muis 45 min voor het verzamelen van monsters voor LH assay. Deze vertraging serveert stoffelijk scheiden de stress geassocieerd met staart knippen van eventuele extra behandelingen opgelegd gedurende de bemonstering, als de staart alleen knippen is aangetoond te verheffen van circulerende corticosterone concentraties. 19 bloedmonsters worden ingetrokken (maar weggegooid) tijdens dit 45-min venster verder acclimatiseren van de muizen aan de procedure van de behandeling en voorkoming van bloedstolsel ontstaan tijdens deze vertraging.
Een laatste overweging wanneer dit protocol voor frequente bloedinzameling in muizen in dienst is dat het volume van de kleine bloed van deze soort Beperk het aantal en het volume van elk monster verzameld. Volgens het USDA dier inspectie gids hebben muizen 72 mL bloed per kg lichaamsgewicht. 20 voor overleving experimenten, 7,5% van het volume van het bloed kan worden verzameld in een enkele bemonstering termijn, uitgaande van een 1-weekse herstelperiode en 10% van het volume van het bloed kan worden verzameld met een 2 weken durende herstelperiode. We verzamelen routinematig < 7,5% van het volume van de geschatte bloed van de muis met het huidige collectie-protocol voor frequente bloed is (met inbegrip van representatieve resultaten die hier worden weergegeven), zonder nadelige effecten op LH secretoire patronen. In onze vivarium, volwassen C57/Bl6 ovariectomized muizen Weeg ongeveer 22 g (theoretische bloed volume van 1,58 mL), waardoor voor 118,5 µL van bloed te verzamelen. In aanvulling op 7 pre collectie behandeling monsters (die zijn niet bepaald of geanalyseerd), worden 30 monsters genomen meer dan 180 min voor een totaalbedrag van 111 µL bloed (3 µL per monster), hetgeen lager is dan het bloed van 7,5% overschrijden. Opgemerkt moet worden dat het volume van het bloedmonster wellicht worden aangepast om het detecteren van LH in bepaalde voorwaarden wanneer LH concentraties verwachting laag. Bij gonadectomized muizen is 3 µL van volbloed voldoende om het detecteren van LH. Het verzamelen van een groter volume van het bloed moet worden beschouwd wanneer de LH concentraties zijn laag en dus verwachte dichter bij de gevoeligheid van de LH-test. Dus, ondanks de kleine bloed volume van een muis, voldoende bloedmonsters kunnen worden verzameld om te evalueren van een compromisloze Profiel van Pulsatiele LH secretie over een periode van 180-min.
Kortom, behandeling dit frequent bloed bemonstering protocol hoogtepunten een uitgebreide acclimatisatie periode zodat beoordelingvan Pulsatiele LH secretie in muizen gedurende een langere periode van tijd. We hebben aangetoond dat dit protocol voldoende is om het karakteriseren van de robuuste en regelmatige pulsen van LH die kan worden gecontroleerd voorafgaand aan en na blootstelling aan psychosociale stress. Dit protocol kan worden aangepast om te kunnen beoordelen van de reactie van LH op andere soorten stress of andere behandelingen die reproductieve hormoon afscheiding kunnen wijzigen. Bovendien, dit bloed collectie protocol kan worden aangepast voor het meten van andere circulerende factoren die in concentratie na verloop van tijd, variëren zoals heeft gemeld voor groeihormoon. 21 het is een opmerkelijke bijdrage aan het veld van neuroendocrinologie dat het patroon van de secretie van LH nu kan worden gecontroleerd in een soort waar complexe genetische en in vivo moleculaire benaderingen ter studie van LH pulse verordening zijn beschikbaar en praktisch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Drs. Jennifer Yang en Alexander (Sasha) Kauffman voor technische bijstand met deze techniek, evenals tal van nuttige en kritische discussies. Serum hormoon tests werden uitgevoerd door Yang et al., 2017 bij de Universiteit van Virginia Center for Research in reproductie Ligand Assay en analyse Core, ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Bronnen van steun voor onderzoek: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM's werd gesteund door T32 NICHD 007203.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
