Summary
Hier präsentieren wir ein Schwanzspitze Blut-Probenahme-Protokoll für häufige Musterkollektion in hemmungslose Mäuse. Diese Methode ist nützlich für die Beurteilung der Muster der pulsierender Luteinisierendes Hormon-Sekretion und könnte für die Analyse von anderen zirkulierenden Faktoren angepasst werden.
Abstract
In vielen Hormonsystem zirkulierende Faktoren oder Hormone werden nicht kontinuierlich freigesetzt, aber als diskrete Impuls als Reaktion auf ein Releasing-Faktor sezerniert werden. Einpunkt-Probenahme Maßnahmen ausreichen, um die biologische Bedeutung der sekretorischen Muster von pulsierender Hormonen unter normalen physiologischen Bedingungen oder bei Dysregulation verstehen. Luteinisierendes Hormon (LH) ist durch den vorderen Hypophyse Gonadotrope Zellen synthetisiert und abgesondert in eine pulsierende Muster, die häufige Sammlung von Blutproben für Puls Beurteilung erfordert. Dies ist nicht möglich bei Mäusen bis vor kurzem durch die Entwicklung eines hochempfindliche LH Assays gewesen und Fortschritt in der Technik für die häufigen leise Musterkollektion, zunächst von Steyn und Kollegen beschrieben. 1 hier beschreiben wir ein Protokoll für die Probeentnahme häufige peripherem Blut von Mäusen mit ausreichend Umgang mit Akklimatisation pulsatile Sekretion von LH zu erkennen. Das aktuelle Protokoll beschreibt eine erweiterte Eingewöhnungszeit, die Beurteilung der robusten und kontinuierliche Impulse von LH über mehrere Stunden ermöglicht. In diesem Protokoll die Schwanzspitze wird abgeschnitten und Blut wird aus der Rute mit einer handgeführten Pipette gesammelt. Für die Beurteilung der pulsatile LH bei Gonadectomized Mäusen, serielle Proben sind gesammelt alle 5-6 Minuten für 90-180 min. wichtiger ist, die Ansammlung von Blut und Messung der robuste Impulse von LH in wach, frei Verhalten Mäusen gegeben angemessenen Umgang mit erreicht werden können Akklimatisierung und um Umweltstressfaktoren zu minimieren. Ausreichende Akklimatisierung kann innerhalb von 4 bis 5 Wochen vor der Blutentnahme erreicht werden. Dieses Protokoll zeigt Fortschritte in der Methodik zu Vollblut Probenahmen zur Beurteilung der pulsatile LH-Sekretion Muster über mehrere Stunden in der Maus, eine mächtige Tiermodell für neuroendokrine Forschung zu gewährleisten.
Introduction
Gonade Funktion bei Säugetieren ist abhängig von Gonadotropin-Sekretion, Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierendes Hormon aus der Hypophyse. Die Gonadotropine werden in entweder ein pulsierender oder Welle Muster als Reaktion auf hypothalamische Sekretion von Gonadotropin – Releasing Hormon (GnRH) abgesondert. Die Synthese und Sekretion von LH und FSH sind durch endokrine, Parakrine und Autokrine handeln aus einer Vielzahl von Molekülen einschließlich Hypothalamus GnRH, Gonaden Steroidhormone und Activin Inhibin Follistatin-System sowie eine Vielzahl von geregelt. physiologischen Bedingungen einschließlich Stress und Energiebilanz. 2
Das pulsierende Muster von LH im Blut entspringt eher plötzliche Entlastung von LH in peripherem Blut, gefolgt von ungefähr exponentiellen Beseitigung. Wichtige Merkmale des Musters die Frequenz jeder LH-Entleerung und die Amplitude der LH Antwort sind, sind beide, teilweise durch die Freisetzung von GnRH gebührend zu Schwierigkeiten bei der Hypothalamus-Hypophysen Portal Blutentnahme zur Messung von diktiert pulsatile GnRH, Probenahme und Messung von LH dient als Proxy für GnRH Verordnung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse. Daher wird kritische Information kodiert in Frequenz und Amplitude der LH Impulse, die aus einer einzigen Probe nicht ermittelt werden kann.
Analyse der pulsatile LH-Sekretion seit jeher auf große Säugetiere (Schafe, Menschen und Primaten) aufgrund ihrer großen Blutvolumen und Toleranz für die häufige Blutentnahme Probe beschränkt. Bei Nagetieren häufige Blutentnahme beschränkte sich auf die Ratte und erreicht über Innewohnung Vorhofflimmern Katheter. 3 , 4 die relativ niedrigen Kosten und Verfügbarkeit von genetischen (z. B. Cre-Lox, CRISPR) und komplexen neuronalen Schaltung (z.B. optogenetik, Chemogenetics) Manipulationen machen Mäuse ein attraktives Modellorganismus; jedoch erreichen von häufigen Blutproben und anschließende Analyse der LH-Konzentrationen bis vor kurzem schwer fassbaren bewährt. Diese gewaltige Aufgabe wurde erstmals von Steyn und Mitarbeitern. 1 , da dann mehrere Labore haben damit begonnen, häufige Blutentnahme und ultra-sensitive LH-Assays einzuschätzen pulsatile LH-Sekretion in einer Vielzahl von experimentellen Paradigmen zu nutzen. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 es sei darauf hingewiesen, dass das Streben nach einer praktischen Methode des Sammelns mehrere Blutproben von Mäusen für mindestens 40 Jahre10 mit mehreren Verbesserungen auf den Weg machte ausgeführt wurde. 11 , 12
Bewertung des LH Pulsmuster (d. h. Frequenz und Amplitude) stellt eine wichtige Verfeinerung bei der Überwachung der basalen Gonadotropin-Sekretion in dieser genetisch gefügig Tiermodell. Traditionell wurden die LH-Konzentrationen in den Mäusen in einer einzigen Blutprobe bestimmt. Eine Schwäche des Einpunkt-Proben ist ein sehr variabel Datensatz weil LH-Konzentrationen sind natürlich bei jedem Impuls schwankt. Eine weitere Schwäche ist, dass isolierte Messungen von Natur aus wichtige Informationen vermittelt durch die Muster des LH-Puls-Sekretion verpassen. So eine Methode zum Sammeln von häufigen Blutproben in frei verhält, hemmungslose Mäuse (außer schonender Umgang während der Probenahme) Erweiterte Informationen und für viele Labors untersucht pulsatile Hormon Verordnung als nützlich erweisen.
Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Sammlung von häufigen (alle 6 min) Blutproben von wach, hemmungslose Mäuse. Wichtig ist, sind wir ein Handling Akklimatisation Protokoll, das ermöglicht eine stabile und kontinuierliche Erkennung der pulsatile LH-Sekretion in Vollblut-Proben eine Länge der Zeit, in der Pre- und Post-Beurteilung auf eine akute Herausforderung bestimmt werden kann gesammelt, wie die Antwort auf die psychosozialen Belastung der Immobilisierung und Zurückhaltung. Ein effektive Assay für die LH-Konzentrationen von Vollblut-Proben wurde zuvor beschrieben; 1 dieses Protokoll auf eine Methode zur Erfassung der Blutproben für LH Pulsmessung ausgerichtet ist.
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Protocol
Die hier beschriebene Methode ist in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Gesundheit Animal Care und Nutzung Richtlinien und sind durch die institutionelle Animal Care und Use Committee an der University of California, San Diego autorisiert worden.
1. Gewöhnung an Handling
- Verfahren
- Legen Sie Maus Käfige in der Biosicherheit Kabinett. Entfernen Sie die erste Maus aus dem Käfig und auf einer geeigneten Fläche (z. B. einen sauberen Käfig Deckel) innerhalb der Biosicherheit Kabinett.
- Sanft Zurückhalten der Maus auf die zu bearbeitende Fläche durch die Schwanzwurzel mit Zeigefinger und Daumen einer Hand halten. Dann, fest die ventrale Oberfläche der Rute, von der Basis bis zur Spitze der Rute, mit Zeigefinger und Daumen der anderen Hand zu streicheln. Wiederholen Sie dies 6 Mal streicheln (d. h. 1 Satz) und die Maus wieder in seinen Käfig.
- Warten Sie 6 min und wiederholen Sie Schritt 1.1.2.
Hinweis: Insgesamt werden Schritt 1.1.2 4 mal per Mausklick (d.h. 4 Sets mit 6 Schläge), wiederholt werden, dass jede Maus insgesamt 24 Schweif Striche an jedem Tag der Behandlung erhalten.
- Die Häufigkeit der täglichen Umgang
- Von fünf bis zwei Wochen vor dem geplanten Blut Sammlung behandeln Sie Mäuse wie unter Schritt 1.1, fünf Tage pro Woche (Mäuse sind nicht am Samstag oder Sonntag bis zu den letzten beiden Wochen Eingewöhnungszeit behandelt).
- Wenn experimenteller Behandlung während der Probenahme-Zeit keine weitere Behandlung (z.B. scruffen oder intraperitoneale Injektion) enthalten soll, akklimatisieren Sie die Mäuse mit dieser Handhabung Aktivität während jeder Behandlung Sitzung.
Hinweis: Zum akklimatisieren, Injektionsverfahren, mithilfe einer stumpfen Nadel eine Scheininjektion ausführen. - Während der zwei Wochen vor dem geplanten Blut Sammlung behandeln Sie Mäuse wie unter 1.1, sieben Tage die Woche.
- Mindestens zwei Wochen vor dem geplanten Blut Sammlung, Haus Mäuse paarweise Störungen für die Mäuse bei der Probenahme zu minimieren.
2. Vorbereitung des Blutentnahmeröhrchen
- Gromer LH testpuffer in einer Glasflasche vorbereiten: 0,2 % Rinderserumalbumin und 0,05 % Tween 20 in PBS [0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (wasserfrei), 0,24 g KH2PO4, Reinstwasser, 1 L, pH 7,4, Filter und Autoklaven] , bei 4° c Lagern 1
Hinweis: Volumen des empfindsamen LH testpuffer vorbereitet werden kann basierend auf der Anzahl der Proben und das Volumen pro Probe wie unten (2.2 & Diskussion) angegeben berechnet werden - Blutentnahmeröhrchen (0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen) vorzubereiten. Beschriften Sie Rohre und aliquoten testpuffer (57 µL Puffer pro Röhre; beachten Sie, dass dieses Volumen variieren je nach Blutvolumen gesammelt oder das Verhältnis des Blutes in den Puffer gewünscht). Rohre können bereit Tage vor der Probenahme, Lagerung bei 4 ° C.
3. Blutentnahme
- Vorbereitung der Blut Sammlung Materialien.
- Biosafety-Kabinett für den Einsatz vorzubereiten, und ordnen Sie die folgenden Materialien in der Haube oder auf einem Wagen in der Nähe: 10 µL pipette (Set 3 µL oder gewünschte Blutvolumen Sammlung), Pipettenspitzen, Abfallbehälter für gebrauchte Pipettenspitzen, Timer, Ausdruck mit Tierzahlen und Probe-Nummern ( für Hinweise zur Probenahme oder tierischen Fragen) Eis-Eimer mit Blutentnahmeröhrchen, Schere und kleine Gaze (2 "x 2").
Hinweis: Die "hochzählen" Funktion auf einem Labor-Timer ist nützlich, weil sie nicht über ein akustisches Signal, das die Mäuse stören könnten - Verwenden Sie eine dauerhafte Markierung zum Ende jeder Maus (in der Nähe der Basis) zu markieren, um schnelle Identifizierung der richtigen Maus während der Probenahme zu unterstützen.
- Biosafety-Kabinett für den Einsatz vorzubereiten, und ordnen Sie die folgenden Materialien in der Haube oder auf einem Wagen in der Nähe: 10 µL pipette (Set 3 µL oder gewünschte Blutvolumen Sammlung), Pipettenspitzen, Abfallbehälter für gebrauchte Pipettenspitzen, Timer, Ausdruck mit Tierzahlen und Probe-Nummern ( für Hinweise zur Probenahme oder tierischen Fragen) Eis-Eimer mit Blutentnahmeröhrchen, Schere und kleine Gaze (2 "x 2").
- Zuschneiden der Schweif und Pre-Blut Sammlung Zubereitung.
- 45 min vor dem Start der Blutentnahme entfernen Sie die erste Maus aus seinem Käfig und legen Sie auf einer geeigneten Oberfläche (ein sauberen Käfig Deckel eignet sich gut) innerhalb der Biosicherheit Kabinett.
- Scharfe, sterile Schere verwenden, um 1-2 mm von der Maus Schwanzspitze, nach aseptische Präparation zu entfernen (z.B. mit Alkohol und Betadine scrub).
Hinweis: Dies kann die wach Tiere mit sanften Zurückhaltung oder Isoflurane Narkose erfolgen. Darüber hinaus kann Analgesie erfolgen, entsprechend der Empfehlung des lokalen IACUC. - Ende der Maus vorsichtig zu streicheln, wie oben beschrieben (1.1.2; 1-2 Striche sind in der Regel ausreichend) bis das Tröpfchen Blut Formen an der Schwanzspitze.
- Verwenden Sie eine Pipette mit einer sauberen Spitze, 3 µL Blut aus der Schwanzspitze zu sammeln und entsorgen Sie die PIPETTENSPITZE mit Blut.
- Sicherzustellen Sie vor der Rückkehr der Maus in seinem Käfig, dass die Durchblutung gestoppt hat. Falls erforderlich, üben Sie sanften Druck mit steriler Gaze.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.5 für alle Mäuse. Fest der Maus Rute streicheln, bis ein Tropfen Blut Formen an der Spitze der Rute können nachfolgende Blutproben gesammelt werden.
Hinweis: Wenn ein Tröpfchen Blut nicht nach festen Schlägen gehört, kann die Rute mit einem Tupfer getränkt in Kochsalzlösung abgetupft werden. Klumpen sind wahrscheinlicher zu bilden, während der weniger häufigen Probenahme (d. h. > 15 Minuten-Intervallen). Sobald das Gerinnsel aus der Vene deaktiviert ist, kann die Probenahme fortfahren. - Weiterhin 3 µL Blut aus jedem Mausklick wie beschrieben alle 6 min für ca. 45 min in dieser Vorbereitungsphase vor Blutentnahme zu sammeln. Entsorgen Sie den Blut und Pipette Tipp.
- Die Blutabnahme
- Sammeln Sie 3 µL Blut aus der Schwanzspitze wie oben beschrieben. Vorsicht um sicherzustellen, dass die gesamte 3 µL Probe die PIPETTENSPITZE (ohne Bläschen oder Bettwäsche Kontamination) berücksichtigt wird. Werfen Sie die Blutprobe in der Assay-Puffer in einem beschrifteten Röhrchen. Durch Umkehrung mischen und das Rohr zu Eis zurück.
- Sicherzustellen Sie vor der Rückkehr der Maus in seinem Käfig, dass der Blutfluss gestoppt hat. Falls erforderlich, üben Sie sanften Druck mit steriler Gaze.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1 - 3.3.2 für jede Maus, alle 6 min. für die Dauer der vorgegebenen Probenahme. Überwachen Sie jedes Tier für Zeichen der Bedrängnisses (z. B. teilweise geschlossenen Augenlider, Buckliger Position [nicht verursacht durch eine andere Behandlung] oder mangelnde Reaktion auf Umgang) zu und kündigen Sie Probenahme, zu, falls erforderlich.
Hinweis: Behavioral Ängste oder andere Komplikationen, die Beendigung der Probenahme verlangen auftreten extrem selten in unserem Labor. - Wenn Tiere nicht nach Blutentnahme eingeschläfert werden, sicherzustellen Sie, dass der Blutfluss aus der Schwanzspitze zum Stillstand gekommen ist. Wischen Sie Verschüttetes Blut aus dem Inneren des Tieres Käfig (oder Änderung Käfige) und die Tierkäfige ins Rack Gehäuse.
4. Probieren Sie Verarbeitung und Analyse
- Speichern Sie Blutproben bei-20 ° C bis zur Analyse.
Hinweis: LH ist in Vollblut-Proben in testpuffer verdünnt untersucht; keine Trennung von Sera oder Plasma ist vor der Lagerung oder Analyse erforderlich. - Assay Blutproben von empfindsamen ELISA als zuvor beschriebenen Werte1 und Bericht in ng/mL Vollblut nach Korrektur für die Verdünnung von Probenvolumen im Assay-Puffer.
- LH-Pulse im DataSet zu identifizieren. Berechnen Sie und vergleichen Sie, mittlere Puls Amplitude und Pulsfrequenz (oder Inter Impulsabstand) je nach Bedarf für den Datensatz.
Hinweis: Veröffentlichten Kriterien13,14 , Programme,15,16 zur Erkennung von LH Hülsenfrüchte sind verfügbar.
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Representative Results
Repräsentative LH Pulsmuster aus 4 Mäuse sind in Abbildung 1 (Daten nachgedruckt von Yang Et Al., 2017) dargestellt. LH war in häufige Blutproben, die Reaktion auf eine akute psychosoziale Belastung Herausforderung bestimmen gemessen. Erwachsene weibliche C57/Bl6 Mäuse wurden ovariectomized und behandelt wie in diesem Protokoll für häufige Blutentnahme. Blutproben wurden für die ersten 90 min. bei allen Tieren herstellen eine Vorbehandlung Baseline der LH pulsatile Sekretion gesammelt. Während der zweiten 90 min der Probenahme Kontrolltieren (betont) blieben in ihren Käfigen und Zurückhaltung Stress Tiere wurden in Nagetier Rückhaltemittel gelegt und zu neuen Käfigen isoliert. Kontrolltieren zeigten klare, eindeutige LH Impulse während des gesamten Abtastzeitabschnitts. Im Gegensatz dazu unterdrückt der psychosozialen Belastung der Zurückhaltung schnell und eindeutig pulsatile LH-Sekretion.
Abbildung 1: Repräsentative LH Pulsmuster aus ovariectomized Mäuse. (A, C) Kontrollmäusen nicht belasteten. (B, D) Mäuse in denen Zurückhaltung von 0-90 min (grau schattierten Region) verhängt wurde betont und LH wurde untersucht. Open-Data-Punkte stehen für Impulse, die durch DynPeak gekennzeichnet. 15 diese Zahl wurde von Yang Et Al., Endokrinologie 158(11) geändert: 3716-3723, 2017 mit freundlicher Genehmigung von The Endocrine Society, Copyright 2017. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die häufige Blutentnahme Vollblut Schwanzspitze Proben für die Bewertung der pulsatile LH-Sekretion in den Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Entnahme von Proben für die Erkennung von akuten Veränderungen in pulsatile LH-Sekretion nach Exposition gegenüber psychosozialer Stress und eignet sich gut zur Beurteilung der LH Impulse unter anderen akuten oder chronischen Manipulationen.
Ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls für zuverlässige und robuste Profile von LH Impulsen zu erreichen ist der Umgang mit Eingewöhnungszeit. Die Idee, dass Umgang mit Stress Hormonsekretion beeinträchtigen kann wurde spekuliert auf in der Literatur,17 aber nicht explizit getestet. Analyse der repräsentativen LH Pulsmuster dargestellt in neueren Publikationen deutlich gründliche Akklimatisation zur Handhabung von Vorteil. In frühen Studien, unter Verwendung 10 Tage Behandlung trat LH Impulse in unregelmäßigen Abständen mit längere Zeiträume in denen kein, die LH Impulse erkannt wurden. 1 im Anschluss an dieser bahnbrechenden Veröffentlichung gab es ein Trend in der Literatur für längere Behandlung (z.B. 3 oder 4 Wochen im täglichen Umgang). 5 , 6 , 8 das Protokoll hier beschrieben umfasst insgesamt 5 Wochen der Behandlung aber lässt Handhabung an den ersten 3 Wochenenden damit, eine ähnliche Anzahl von Sitzungen Handhabung und Minimierung Wochenende Arbeitslasten für Experimentatoren zu erreichen. Obwohl wir eine validierte Schwellenwert Anzahl von zur Verfügung stellen können erforderlich Umgang mit Sitzungen für erfolgreiche Erkennung des LH-Impulse, wir neue Praktiker dieses Verfahrens zu prüfen, eine längere Eingewöhnungszeit fördern würde. Unter bestimmten experimentellen Paradigmen (z.B. LH-Pulse bei jungen Tieren zu studieren) können mehrere Wochen Umgang mit Akklimatisierung nicht praktikabel. Für diese Untersuchungen ist es wichtig, dass ausreichend Umgang mit Akklimatisierung erreicht wird; Vielleicht würde mehrere Umgang mit Sessions pro Tag ausreichen.
Minimierung der Umweltbelastung während des Zeitraums der Blut ist auch entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Bei der Verfolgung dieses Ziels beherbergen wir unsere Mäuse in einem ruhigen Raum im Vivarium während der gesamten Eingewöhnungszeit. Platzierung eines Zeichens "Ruhe bitte" an der Außenseite der Tür Tier am Tag der Probenahme kann helfen, um unbeabsichtigte Störungen zu beseitigen. Während des Zeitraums der Blut kann ein Tuch in die Biosicherheit Schrank verwendet werden, bieten einen Platz zum Ausruhen der Pipette, pipette Tipps und Stifte auf, dadurch Minimierung der Lärmbelästigung durch die Manipulation dieser Elemente. Zu guter Letzt ist es ratsam, dass eine Person sollte die Mäuse zu behandeln und sammeln Sie alle Blutproben am experimentellen Tag. Diese Person sollte sorgfältig im Umgang mit Tieren, mit Sorgfalt und eine konsequente Tageszeit (die ähnlich wie die Abtastzeit sein sollte), da circadiane Eingänge bekannt sind, um Stressreaktionen zu beeinflussen. 18 wenn LH Hülsenfrüchte sind selten oder nicht nachweisbar, Quellen von überflüssigen Stress erkannt und minimiert werden sollte. Ein weiteres Verfahren Detail im Zusammenhang mit Stress während des Zeitraums der Blut zu minimieren ist die Zeitspanne, die vergeht zwischen den Schwanz abschneiden und Sammeln von Proben für LH untersucht werden. Wir clip Ende jeder Maus 45 min vor dem Sammeln von Proben für die LH-Test. Diese Verzögerung dient dazu, den Stress mit Schweif clipping aus jeder Zusatzbehandlungen verhängt während der Probenahme, zeitlich zu trennen als die Rute clipping allein hat nachgewiesen, dass um zirkulierenden Corticosteron Konzentration zu erhöhen. 19 Blutproben sind zurückgezogen (aber verworfen) während dieser 45-min-Fenster weiter akklimatisieren die Mäuse zum Umgang mit Verfahren und verhindert Blutgerinnselbildung während dieser Verzögerung.
Eine letzte Überlegung beim Einsatz dieses Protokolls für häufige Blutentnahme bei Mäusen ist, dass die kleinen Blutvolumen dieser Art die Anzahl und das Volumen jeder Probe gesammelt beschränken. Nach USDA Tier Inspektion Guide haben Mäuse 72 mL Blut pro kg Körpergewicht. 20 für Überleben Experimente, 7,5 % des Blutvolumens kann abgeholt werden in eine einmalige Probenahme Periode gegeben eine Erholungsphase von 1 Woche und 10 % des Blutvolumens kann mit einer 2-Wochen Erholungszeit gesammelt werden. Sammeln wir routinemäßig < 7,5 % des geschätzten Blutvolumen der Maus über das aktuelle häufig Blut-Sammlung-Protokoll (einschließlich repräsentative Ergebnisse hier gezeigt), ohne nachteilige Auswirkungen auf LH sekretorischen Muster. In unserem Vivarium Erwachsene C57/Bl6 ovariectomized Mäuse wiegen ca. 22 g (theoretische Blutvolumen von 1,58 mL), zulassend 118,5 µL Blut gesammelt werden. Neben 7 Pre-Kollektion Umgang mit Proben (die nicht geprüft oder analysiert werden), sind 30 Proben über 180 min insgesamt 111 µL Blut (3 µL pro Probe), gesammelt, die unterhalb der 7,5 % Blut Lautstärkebegrenzung ist. Es sei darauf hingewiesen, dass das Volumen der Blutprobe muss möglicherweise angepasst werden, um LH unter bestimmten Bedingungen zu erkennen, wenn der LH-Konzentration gering sein dürften. Bei Gonadectomized Mäusen reicht 3 µL Vollblut LH zu erkennen. Sammeln ein größeres Blutvolumen sollte wenn LH-Konzentrationen sind niedrig und daher voraussichtlich näher an die Empfindlichkeit des LH-Tests betrachtet werden. So können trotz des kleinen Blutvolumens einer Maus genügend Blutproben gesammelt werden, um eine kompromisslose Profil der pulsatile LH-Sekretion über einen Zeitraum von 180-min zu beurteilen.
Abschließend Handhabung dieses häufige Blut Probenahme Protokoll Highlights einen längeren Eingewöhnungszeit um Beurteilung der pulsatile LH-Sekretion bei Mäusen über einen längeren Zeitraum hinweg zu gewährleisten. Wir haben gezeigt, dass dieses Protokoll ist ausreichend robust und regelmäßige Impulse der LH, die vor dem überwacht werden kann und folgende Exposition gegenüber psychosozialer Stress zu charakterisieren. Dieses Protokoll kann so angepasst werden, bewerten die Antwort von LH auf andere Arten von Stress oder anderen Behandlungen, die reproduktiven Hormonsekretion verändern können. Außerdem könnte dieses Blut-Sammlung-Protokoll für die Messung von anderen zirkulierenden Faktoren angepasst werden, die Konzentration im Laufe der Zeit variieren, wie für Wachstumshormon berichtet wurde. 21 es ist ein bemerkenswerter Beitrag auf dem Gebiet der Neuroendokrinologie Sekretionsmuster des LH jetzt in einer Art überwacht werden kann wo gibt es genetische komplex und in Vivo Molekulare Ansätze, LH-Puls-Verordnung zu studieren und praktisch.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Jennifer Yang und Alexander (Sasha) Kauffman technische Unterstützung für diese Technik sowie zahlreiche hilfreiche und kritische Diskussionen. Serum-Hormon-Assays wurden von Yang Et Al., 2017 an die University of Virginia Center for Research in Reproduktion Liganden Assay und Analyse-Kern, unterstützt von Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934 durchgeführt.
Quellen der Forschungsförderung: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM von T32 NICHD 007203 unterstützt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
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