Summary
ここで気ままなマウスで頻繁にサンプル コレクションの尻尾先端血液サンプリング プロトコルを提案します。このメソッドは、拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価パターンに対して有用です、他の循環要因の分析のために合わせることができます。
Abstract
多くの内分泌システム、継続的に放出されていない循環の要因やホルモンが放出因子の応答の離散パルスとして分泌されます。シングル ポイント サンプリング対策は通常生理学的な条件の下でまたは不全の条件時に拍動性ホルモンの分泌のパターンの生物学的意義を十分に理解して適切です。黄体形成ホルモン (LH) が下垂体前葉の gonadotrope 細胞によって合成・ パルスの評価のための血液サンプルを頻繁に回収を必要とする拍動パターンで分泌されます。これは、マウスで最近まで高感度 LH 測定法の開発は、可能なされていないとの技術の進歩は、低ボリュームのサンプル コレクション、最初ジムと同僚によって記述を頻繁に。1ここで LH の律動性分泌を検出する十分な処理環境に順応マウスから頻繁に末梢血サンプルのコレクションのためのプロトコルについて述べる。現在のプロトコルは、複数時間にわたって LH の堅牢で連続パルスの評価を可能にする拡張の馴化期間を詳しく説明します。このプロトコルでは尾の先端がクリップされて、手持ちピペットを使用して尻尾からは採血します。シリアルのサンプルは、ごきぶりマウスで拍動の LH の評価のため重要なは、90-180 分に 5-6 分毎に収集血のコレクションと LH の堅牢なパルスの測定は、十分な処理を与え目を覚まし、自由行動下のマウスで行うことが順化および環境ストレスを最小限にするため。十分な馴化は、採血前に 4-5 週間以内に達成できます。このプロトコルはマウス神経内分泌研究の強力な動物モデルの複数の時間にわたって拍動の LH 分泌パターンの評価の全血試料の収集を確保するための方法論の進歩を強調表示します。
Introduction
哺乳類の生殖腺機能、性腺刺激ホルモン分泌、黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激ホルモンは、脳下垂体からによって異なります。性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) の視床下部分泌への応答での拍動やサージ パターンで、性腺刺激ホルモンが分泌されます。合成と LH と FSH の分泌、視床下部 GnRH、生殖腺ステロイド ホルモン、アクチビン-インヒビン-フォリスタチン システムとの無数を含む分子の様々 な内分泌、パラクリンやオートクリン アクションによって規制されています。生理的ストレスとエネルギーのバランスを含みます。2
血液中の LH 拍動パターンはおよそ指数除去に続いて、末梢血に lh ではなく急激な放電から発生します。重要なパターンの各 LH 放電の頻度と LH 反応の振幅が備わって、どちらのによって決定されます、一部、視床下部下垂体門脈血の測定のための収集の難しさに GnRH。 期限のリリース拍動の GnRH、サンプリングと LH の測定は、視床下部-下垂体-性腺軸の GnRH 調節のプロキシとして使用されます。そのため、重要な情報は、周波数と振幅、LH のパルスは、1 つのサンプルからは判断できないのでエンコードされます。
LH の律動性分泌の解析とその大規模な血液量と頻繁に血液検体採取許容のための大型哺乳類 (ヒト、霊長類、羊) に限定されてきました。齧歯動物、頻繁に採血はラットに限られていたし、心房カテーテルを留置することでいます。3,4比較的低コストと遺伝の可用性 (例えばcre lox、CRISPR) し、複雑な神経回路 (例えばオプトジェネティクス、chemogenetics) 操作するマウス魅力的なモデル有機体;しかし、頻繁に血液サンプルの達成と LH 濃度の後続の分析まで最近、実証してとらえどころのないです。この記念碑的なタスクは、スタインと協力者によって開拓されました。1以来、いくつかのラボは、頻繁に採血と様々 な実験パラダイムの拍動性の LH 分泌を評価する超高感度の LH アッセイを利用し始めています。5,6,7,8,9に留意は道に沿って作った複数の改良と、少なくとも 40 年10に対して進行中のマウスから複数の血液サンプルを集めることの実用的な方法の追求がされていること。11,12
LH パルス パターン (すなわち周波数、振幅) の評価は、この遺伝的扱いの動物モデルの基底のゴナドトロピン分泌の監視の主要な改良を表します。従来、単一の血液サンプルにマウスで LH 濃度を測定しました。シングル ポイントのサンプルの 1 つの弱点は、LH 濃度は、当然のことながら各パルス中に変動非常に可変データ セット。もう一つの弱点は、孤立した測定は本質的に lh パルスのパターンによって伝えられる重要な情報を逃すことです。したがって、自由行動下で頻繁に血液サンプルを集めるための方法、気ままなマウス (サンプリング中に穏やかな処理) を除いて、拡張情報を提供し、有用性拍動性ホルモンの規則を調べる多くの研究所を。
ここでは、頻繁のコレクションのためのプロトコルについて述べる (6 分毎) 血液サンプル目を覚まし、気ままなマウスから。重要なは、我々 は、処理を含める全血試料中の拍動の LH 分泌の堅牢で連続検出は、事前および事後評価急性チャレンジにする時間の長さを決定することができますで収集できる順化プロトコルなど固定化と抑制の心理社会的ストレスに対する応答です。全血中 LH 濃度の効果的なアッセイが以前に記載されています。1この議定書は LH パルス測定のための血液サンプルを集めるための方法に焦点を当てた。
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Protocol
ここで説明したメソッドは国家機関の動物医療と使用ガイドラインに一致して、機関動物ケアとカリフォルニア大学サン ディエゴ校利用委員会によって承認されています。
1. 馴化処理
- 処理手順
- キャビネット、バイオ セーフティにおけるマウス ケージを配置します。ケージとバイオ セーフティ キャビネット内の適切な表面 (例えばきれいなケージ蓋) 上の場所から最初のマウスを削除します。
- そっと人差し指と 1 つの手の親指で尾のベースを保持することによって作業面の上にマウスを抑制します。その後、しっかりと人差し指ともう一方の手の親指で、尾の先端にベースから、尾の腹側表面をストロークします。6 回をなでるこの手順を繰り返します (すなわち1 セット) マウスをケージに戻ります。
- 6 分待ってし、1.1.2 の手順を繰り返します。
注: 合計では、1.1.2 のステップごと繰り返されます 4 回マウス (6 ストロークのすなわち 4 セット)、それぞれのマウス処理の各日で 24 尾ストロークの合計を受信します。
- 毎日の処理の頻度
- 1.1、手順 (マウスは土曜日または日曜日順化の最終 2 週間までには処理されない) 週 5 日で 2 週間前に計画された血液収集日まで 5、マウスを処理します。
- サンプリング期間中に実験的治療に任意の追加処理 (例えばスクラッフィングまたは腹腔内投与) を含める場合は、各処理のセッション中にこの処理アクティビティにマウスを慣らします。
注: 馴化の注入法、シャム注射を実行するのに鈍い針を使用します。 - 前述の 1.1 では、週 7 日間計画された血液収集日の前に 2 週間の間にマウスを処理します。
- 計画された血液収集日の前に少なくとも 2 週間のサンプリング中にマウスに混乱を最小限に抑えるためにペアでマウスを家します。
2. 採血管の準備
- ガラス瓶の中の超高感度 LH アッセイバッファーを準備: 0.2% ウシ血清アルブミンと 0.05% 【 0.2 g KCl、8 g, 塩化ナトリウム 1.44 g ナ2HPO4 (無水)、0.24 g KH2PO4純水 1 L、pH 7.4、フィルター、オートクレーブに PBS でトゥイーン 20、4 ° C で保存1
注: 覚悟の超高感度 LH アッセイバッファー ボリュームことができますに基づいて計算されます数のサンプルとサンプル (2.2 & ディスカッション) 下記のとおりあたりにボリューム - 毛細血管の血液コレクターズ (0.6 mL マイクロ遠心チューブ用) を準備します。チューブと割り切れるアッセイバッファー ラベル (57 μ L 管ごとにバッファーの注意してください、このボリュームは集められた血の量や必要なバッファーへの血液の比率に応じて異なる場合があります)。チューブは日サンプリング前準備、4 ° C で保存
3. 採血
- 血のコレクションの材料の準備。
- 用安全キャビネットを準備し、フードや近隣のカートの次の材料をアレンジ: 10 μ L ピペット (3 μ L または必要な採血量に設定)、ピペット チップ、無駄に使用されるピペット チップ、タイマー、動物数とサンプル数 (印刷の箱サンプリングまたは動物の問題についてメモ)、採血管、はさみ、小さなガーゼ (2"× 2") とバケツを氷します。
研究室のタイマーにメモ:「カウント アップ」機能役マウスを乱すことができる可聴アラームはありませんので - 永久的なマーカーを使用して、サンプリング中に正しいマウスの迅速な同定を支援する (麓) 各マウスの尾をマークします。
- 用安全キャビネットを準備し、フードや近隣のカートの次の材料をアレンジ: 10 μ L ピペット (3 μ L または必要な採血量に設定)、ピペット チップ、無駄に使用されるピペット チップ、タイマー、動物数とサンプル数 (印刷の箱サンプリングまたは動物の問題についてメモ)、採血管、はさみ、小さなガーゼ (2"× 2") とバケツを氷します。
- 尾と前の血のコレクションの準備のクリッピング。
- 血のコレクションの開始前に 45 分で檻から最初のマウスを削除し、バイオ セーフティ内の適切な表面 (きれいなケージ蓋がうまく) にキャビネットを配置します。
- シャープ、滅菌はさみを使用して次の無菌調製、鼠の尻尾の先端の 1-2 mm を削除する (すなわち、アルコールや betadine とスクラブ)。
注: これは、目を覚まし動物穏やかな拘束やイソフルラン麻酔下で実現できます。 さらに、ローカル IACUC の推奨事項に従う、鎮痛が提供されるかもしれない。 - 前述のようにマウスの尾を慎重にストローク (1.1.2; 1-2 ストロークが一般的に十分な) 尾先端の血液のフォームの液滴まで。
- きれいな先端のピペットを使用して尻尾先端から 3 μ L の血液を収集、血でピペット チップを破棄します。
- マウスをケージに戻す前に、血流が停止したことを確認します。必要な場合は、滅菌ガーゼで穏やかな圧力を適用します。
- 3.2.1 - すべてのマウスの 3.2.5 の手順を繰り返します。尾の先端に血液形態の水滴までしっかりとねずみのしっぽをなでるによって後続の血液サンプルを収集できます。
注: しっかりしたストローク後血液滴を形成していない、尾が生理食塩水に浸したガーゼのパッドで濃くことができます。血栓が多いフォームにそれほど頻繁にサンプリング中 (すなわち > 15 分間隔)。血栓が静脈からクリアされると、サンプリングを続行できます。 - 各マウスはこの前採血準備期間中に約 45 分の 6 分毎に上記から 3 μ L の血液を収集し続けます。血とピペットの先端を破棄します。
- 採血
- 前述のように尻尾先端から 3 μ L の血液を収集します。(泡の寝具汚染有無) ピペット チップに全体 3 μ L サンプルが取得できるように注意してください。ラベル付き管内アッセイバッファーに血液サンプルを取り出します。逆解析による混合し、氷にチューブを返します。
- マウスをケージに戻す前に、血流が停止したことを確認します。必要な場合は、滅菌ガーゼで穏やかな圧力を適用します。
- 所定のサンプリング期間手順 3.3.1 - 6 分毎、各マウスの 3.3.2 を繰り返します。苦痛 (例えば部分的に閉じたまぶた、[その他の治療が原因でない] 背を丸めての位置または処理への応答の欠如) の印をそれぞれの動物を監視し、必要に応じてサンプリングを終了します。
注: は行動の苦痛やサンプリングの終了を必要とする他の合併、当研究室でに非常に稀に発生します。 - 動物はない次の採血安楽死させて、尻尾先端から血流が完全に停止したことを確認します。それぞれの動物のケージ (または変更ケージ) の中からこぼれた血を拭く、ハウジング ラックに動物のケージを戻ります。
4. サンプルの処理と解析
- 分析まで、-20 ° C で血液サンプルを格納します。
注: LH です; アッセイバッファーで希釈した全血サンプルで試金します。血清または血漿の分離はストレージや分析の前に必要ありません。 - 超高感度 elisa 法による血液検体は上記 ng/ml の全血アッセイ バッファーのサンプル ボリュームの希釈のための補正を次の1およびレポートの値です。
- データ セットの LH パルスを識別します。計算し、データ セットに応じて平均パルス振幅とパルス周波数 (またはパルス間間隔) を比較します。
注意: プログラム基準13,14 15、16 LH パルスを検出するためご利用。
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Representative Results
4 マウスから代表的な LH パルス パターンは、図 1 (データ転載ヤンら2017) に表示されます。LH は、急性の心理社会的ストレス チャレンジへの応答を決定するため頻繁に血液サンプルで測定しました。大人女性 C57/Bl6 マウスが卵巣摘出、頻繁に血のコレクションのこのプロトコルの詳細として処理します。LH の律動性分泌の治療前のベースラインを確立するすべての動物の最初の 90 分の血液を採取しました。サンプリングの 2 番目の 90 分間制御 (非強調) 動物が檻の中で残ったと拘束ストレス動物齧歯動物の拘束デバイスに配置され、新しいケージに隔離。対照動物は、全体のサンプリング期間中の明瞭ではっきりと LH パルスを示した。対照的に、拘束の心理社会的ストレスは、迅速かつ明確に抑制 LH の律動性分泌です。
図 1: 卵巣摘出マウスから代表的な LH パルス パターン。(C)非重点を置かれたマウスを制御します。(B、D)0-90 分 (灰色の灰色の領域) から課された抑制、マウスを強調し、LH を測定しました。開いているデータ ポイントは、DynPeak で識別されるパルスを表します。15この図はヤンら、内分泌学 158(11) から変更されている: 3716-3723 2017 内分泌学会、著作権 2017年の権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで全血尻尾先端サンプル マウスの拍動の LH 分泌の評価のための頻繁に血のコレクションのためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、心理社会的ストレスへの暴露に続く拍動の LH 分泌の急性変化の検出のためのサンプルの収集を有効し、LH パルスの他の急性または慢性の操作の評価に適しています。
このプロトコル LH パルスの信頼性と堅牢性のプロファイルを達成するための重要なコンポーネントは、処理順化期間。ストレスの処理がホルモンの分泌を低下することが考えは、文学、17の時に推測しますが、明示的にテストされています。ただし、最近の出版物に描かれた代表的な LH パルス パターンの分析は明らかに徹底的な馴化処理する利点を示します。処理の 10 日間を利用した初期の研究で LH パルスがどのなしの LH のパルスが検出された長期間の不規則な間隔で発生しました。1その精液の出版物にそれに続く傾向があった、文献で長い処理期間 (すなわち3 または 4 週間の毎日の処理)。5,6,8プロトコルがここで説明した処理の 5 週間の合計が、同様数セッションを処理とプロテオームの週末の作業負荷を最小限に抑えることを達成することにより、最初 3 週末処理を省略します。検証済みのしきい値の数を提供できないがセッションを処理に必要な LH パルスの検出拡張順化期間を考慮するこの手順の新たな実践をお勧めでしょう。特定の実験パラダイム (例えば若い動物で LH パルスを勉強)、下は、順化処理の数週間を実用的なできない場合があります。これらの実験のため十分な処理順化が達成されることが重要です。おそらく一日あたり複数の処理セッションは十分でしょう。
血のコレクション期間中に環境ストレスを最小限に抑えることもこのプロトコルの成功に重要です。この目標を追求全体順化期間中にビバリウム内の静かな部屋で、マウスを家します。サンプリングの日動物の部屋のドアの外側に「静かなお願い」記号配置は、予期しない中断を除去するために助けるかもしれない。血のコレクション期間中には、布バイオ セーフティ キャビネットの残りピペット、ピペットのヒントとペン、それにより、これらの項目を操作することによって発生するノイズを最小化する場所を提供するために使用できます。最後に、一人する必要があります、マウスを処理し、実験の日にすべての血液サンプルを収集をお勧めします。この個人する必要がありますケアと一貫した時間帯 (これはサンプリング時間のようにする必要があります) は、動物の処理において勤勉である概入力がストレス反応に影響を与える知られているので。18場合 LH のパルス頻度や検出不可能な余分なストレスの源を識別され、最小化する必要があります。血のコレクション期間中のストレスを最小限に抑えることに関連する別の手続き詳細は、尾のクリッピング、LH のために試金するためのサンプルを集めるまでの経過時間の量です。LH の試金のためのサンプルを収集する前に 45 分各マウスの尾をクリップします。この遅延は、一時的、サンプリング中に課された追加の治療からクリッピングの尾に関連付けられているストレスを区切るため尾として単独でクリッピングに示されている血中コルチコステロン濃度を高めます。19血液サンプル撤退している (ただし破棄) さらに処理プロシージャにマウスを慣らすし、この遅延中の血栓の形成を防ぐためにこの 45 分間。
マウスで頻繁に採血のこのプロトコルを採用する際の最終的な考察はこの種の少量の血液量が数と各試料の量が制限されます。米国農務省の動物検査ガイドによるとは、マウスは体重 kg あたりの血液の 72 ミリリットルを持ってください。20生存実験のため血液量の 7.5% を収集できます 1 週間回復期間を与えられた 1 つのサンプリング期間の 2 週間の回復期間で血液量の 10% を集めることができます。我々 は定期的に収集 < LH 分泌パターンへ悪影響を及ぼすことがなく (ここに示した代表的な結果を含む)、現在の頻繁な血液コレクション プロトコルを使用してマウスの推定出血量の 7.5%。我々 ビバリウムで大人の C57/Bl6 卵巣摘出マウスの重さ約 22 g (1.58 mL の理論的な血液量)、血の 118.5 μ L 全体を収集します。7 前コレクションの処理のサンプル (測定または分析されません) に加え、30 のサンプルは、血液 (サンプルあたり 3 μ L)、7.5% の血量制限下にある 111 μ L の合計 180 分以上が収集されます。それは、血液サンプルのボリュームが LH 濃度は低いことが予想されるとき、一定の条件で LH を検出するために調整する必要があります注意してください。ごきぶりマウス 3 μ L の全血で LH の検出に十分です。大量の血液を収集は、LH 濃度が低く、したがって LH アッセイの感度に近い位置に予想される場合考慮されなければなりません。したがって、180 分間の拍動の LH 分泌の妥協のないプロファイルを評価するために、マウスの少量の血液量、にもかかわらず十分な血液サンプルを収集できます。
結論としては、この頻繁に採血プロトコル ハイライト拡張は、拡張期間にわたってマウスの拍動の LH 分泌の評価を確保するための順化期間を処理します。このプロトコルは前に監視できる LH と心理社会的ストレスへの暴露後の堅牢で正規のパルスの特性を十分説明してきました。このプロトコルは、LH のストレスや生殖ホルモンの分泌を変える可能性のある他の治療法の他のタイプの応答を評価するために合わせることができます。さらに、この血液コレクション プロトコルは、成長ホルモンの報告されているように時間をかけて、濃度の異なる他の循環要因の測定に適用できること。21それは LH の分泌パターンを種で監視今できる神経内分泌学の分野への顕著な貢献複雑な遺伝的、生体内でLH パルス制御を研究への分子アプローチがあり、実用的です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、夫妻ジェニファー ヤンとアレクサンダー (サーシャ) カウフマンの多くの有用な重要な議論と同様に、この手法でテクニカル サポートをありがとうございます。血清ホルモン アッセイは、再現リガンド アッセイ研究解析コア、ユーニス · ケネディ · シュライバー NICHD/NIH (NCTRI) グラント P50 HD28934 によってサポートされているヴァージニアの大学センターで 2017 ヤンら、によって行われました。
研究支援の源: R01 NICHD 86100 (巴)、RBM T32 NICHD 007203 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
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