Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

تمازي الآلي أساس جهاز وبروتوكول لتحليل قائم على الجهود وتأخير اتخاذ القرار في القوارض الانتقال الحر

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57895

Summary

يقدم هذا المقال جهاز تمازي الآلي الذي اخترع لنا، وبروتوكول استناداً إلى هذا الجهاز لتحليل عملية صنع القرار القائمة على التأخير وصنع القرار على أساس الجهد في القوارض الانتقال الحر.

Abstract

تظهر العديد من المرضى العصبية والنفسية صعوبات و/أو عجز في عملية صنع القرار. نماذج القوارض مفيدة لتحقيق فهم أعمق للأسباب العصبية الحيوية الكامنة وراء مشاكل صنع القرار. مهمة تمازي استناداً إلى تكلفة والعائد يستخدم لقياس عملية صنع القرار التي تختار القوارض بين ذراع مكافأة عالية (HRA) وذراع مكافأة منخفضة (جيش الرب للمقاومة). وهناك نماذج اثنين من مهمة صنع القرار تمازي، واحد الذي التكلفة تأخير زمني والآخر الذي هو الجهد البدني. كلا النماذج تتطلب إدارة مملة وكثيفة العمالة للحيوانات التجريبية، وأبواب متعددة وبيليه مكافأة وتسليح تسجيلات الاختيار. في العمل الحالي، ونحن اخترع جهاز يستند إلى تمازي التقليدية مع أتمتة كاملة لإنجاز بيليه وإدارة باب التسجيلات خيار. يمكن استخدام هذا الإعداد الآلي لتقييم كلا صنع القرارات المستندة إلى التأخير والجهد في القوارض. مع بروتوكول الموصوفة هنا، لدينا مختبر التحقيق تعمل صنع القرار من الفئران المعدلة وراثيا متعددة. في بيانات تمثيلية، أظهرنا أن الفئران مع أبلاتيد هابينولار الآنسي أظهر أفيرسيونس من التأخير والجهد، وتميل إلى اختيار المكافأة فورا ودون عناء. ويساعد هذا البروتوكول لتقليل التفاوت الناجم عن تدخل المجرب وتعزيز كفاءة التجربة. في الإضافة، ومسبار السليكون المزمن أو ميكروليكترودي تسجيل، تصوير الألياف و/أو التلاعب بالنشاط العصبي ويمكن تطبيقها بسهولة أثناء اتخاذ القرارات المهمة باستخدام الإعداد الموصوفة هنا.

Introduction

البشر والحيوانات الأخرى تقييم التكلفة (بما في ذلك تأخير والجهد والمخاطر) للحصول على مكافأة، ومن ثم اتخاذ قرارهم باختيار مسار معين للعمل. يظهر العجز في عملية صنع القرار في العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك مرض الفصام (س) واضطراب نقص الانتباه فرط النشاط (ADHD)، الوسواس القهري (OCD)، ومرض باركنسون (PD) وإدمان1. وكشفت الدراسات على البشر والقرود أن الدماغ الرئيسية عدة مناطق تشارك في قرار صنع2،،من34. على الرغم من أن الرئيسات الانخراط في ما يؤهلها قرار أكثر تعقيداً، أبلغ القوارض ليتمكن من اتخاذ قرارات التكيف للبقاء على قيد الحياة في بيئة الطوارئ مكافأة حيث تتغير بشكل متكرر. وباﻹضافة إلى ذلك، آليات الدوائر العصبية والآليات الجزيئية الكامنة وراء صنع القرار يمكن دقة التحقيق في نماذج الماوس نظراً لتوافر أدوات تشيموجينيتيك وأدوات أوبتوجينيتيك والفئران المهندسة وراثيا. وهناك العديد من المهام التي تستخدم في تقييم سلوك القوارض صنع القرار، بما في ذلك مهمة تحول مجموعة أتينشونال، افورتفول أو المستندة إلى تأخير مهمة تمازي، المهمة القمار آيوا، عكس التمييز البصري التعلم المهمة5، إلخ. البروتوكولات التكلفة-الفائدة "تمازي مماثلة" كانت وضعت أصلاً من قبل مجموعة بيير6 وقد استخدمت لدراسة آثار هذين النوعين من تكلفة المقرر (التأخير والجهد) على الحرة يتحرك القوارض7،8، 9،10. ميزة خاصة لهذه المهمة أن الحيوانات لا يلزم تدريب على اضغط على دعامتين أو حفر في وعاء. بدلاً من ذلك، الحيوانات على الاختيار بين مكافأة عالية عالية التكلفة الخيار في ذراع واحدة (HRA) أو مكافأة منخفضة خيار منخفض التكلفة في الذراع الأخرى جيش الرب للمقاومة. ولذلك، أسهل بكثير للقيام بهذه المهمة.

في النموذج القائم على التأخير، وعرض باب تقاطع حالما يدخل الحيوان تجريبية واحدة من الأسلحة والهدف، حيث أنه يتم الاحتفاظ الحيوان في الذراع والهدف. إذا اختار الحيوان جيش الرب للمقاومة، هو تراجع الباب الهدف على جيش الرب للمقاومة فورا ويتم تسليم كمية صغيرة من المواد الغذائية. إذا اختار الحيوان المنظمة، هو تراجع عن الباب الهدف في المنظمة بعد التأخير المطلوبة ويتم تسليم كمية كبيرة من الأغذية الكريات (الشكل 1A). في النموذج القائم على الجهد، وهو عرقلة في HRA بحاجز والحيوانات يجب أن تسلق أكثر من ذلك للحصول على كمية كبيرة من الكريات (الشكل 1B). وبصفة عامة، النموذج القائم على تأخير مفيد جداً لاختبار الاندفاع لنماذج حيوانية وواحدة على أساس الجهد يمكن أن يساعد على معرفة الحيوانات مبالي2،4،،من1112، 13-هيثيرتو الباحثون يقومون بهذا الفحص قبل يدوياً عد وقت التأخير، إدراج وسحب الأبواب، يناور الحاجز الجهد، إحصاء عدد بيليه، وضع الكريات في الموقف، ووضع وإعادة الحيوانات ، وتسجيل اختيارات الحيوانات لكل محاكمة. تشكل هذه تكاليف العمل والوقت اختناق شديدة تجريبية للباحثين وتعرقل الاستخدام الواسع النطاق لهذا التحليل السلوكي. في العمل الحالي، قمنا بتطوير إعداد تمازي على أساس تقييم قائم على الجهود أو تأخير اتخاذ القرارات من القوارض، مع كامل الأتمتة وتوحيد القدرات الإنتاجية العالية.

جهاز

بالتعاون مع شركة تجارية (انظر الجدول للمواد)، وضعنا تعديل الآلي جهاز تمازي التي تستخدم المستندة إلى البرامج أداة التحكم (الشكل 2). على وجه الخصوص، قدمنا "باب الخلفي" و "الطريق مرة أخرى" بالمقارنة مع تمازي التقليدية (الشكل 2)، حيث أن الحيوانات يمكن أن يذهب مرة أخرى إلى البدء نقطة أنفسهم وبدء محاكمة جديدة. تمازي ماتي الرمادية اللون، وعندما يتم تعيين بشكل صحيح بشرط التجربة والبرمجيات، ويمكن الكشف عن الفئران السود والبيض على حد سواء. وتضم الأسلحة الثلاثة: ذراع واحد ابدأ والهدف الثاني الأسلحة، كل 410 مم في الطول مع الجدران على شكل V من عيار 155 ملم في الطول، وقاعدة من 30 ملم في العرض، وأعلى مفتوحة من عيار 155 ملم في العرض. الممر على شكل V فعالية منع الفئران من القفز. وبالإضافة إلى ذلك، ممر على شكل V يسهل تطبيق في فيفو تسجيل مع الكابلات. يتم إرفاق مربع ابدأ إلى نهاية الذراع ابدأ. يتم إرفاق مربع هدف إلى نهاية كل ذراع الهدف. موزع غذاء تلقائي مثبت في كل مربع الهدف تسليم عدد معرف مسبقاً من الكريات الغذاء الحلو. تناول بيليه هو الكشف عن طريق جهاز استشعار الأشعة تحت حمراء، ويتم تسجيلها تلقائياً من جهاز كمبيوتر. كل مربع الهدف متصل بالمربع البدء بممر مستقيم. الحيوانات مستقلة العودة إلى المربع البدء عبر الممر بمجرد الانتهاء من محاكمة. وهناك أبواب إنزلاقية من عيار 155 مم في الارتفاع في مدخل ومخرج من المربعين البدء والهدف. بالإضافة إلى ذلك، يقع باب انزلاق عند مدخل كل ذراع الهدف لمنع الحيوانات من الانتقال إلى الوراء بعد الاختيار (الشكل 2A). جميع أبواب إنزلاقية يسيطر عليها جهاز كمبيوتر، ويمكن فتحه تلقائياً ومغلقة. حساسية عالية 1/2 "تهمة إلى جانب جهاز (CCD) مونوكل تم تعيين كاميرا أعلاه على جهاز لتعقب سلوك الحيوانات. البعد البؤري للعدسة 2.8 – 12 مم. وموقف الكاميرا حوالي 1.9 مترا. نظراً لارتفاع المتاهة 0.5 متر من الكلمة، المسافة بين الكاميرا والمتاهة حوالي 1.4 متر (الشكل 2). يتم استخدام بيانات التتبع التي تم الحصول عليها من كاميرا CCD للعيش-مراقبة تمازي، فتح وإغلاق أبواب محددة عند الحيوانات أدخل بعض المناطق ذات الاهتمام (رويس). الحواجز المستخدمة لنموذج قائم على الجهود في شكل مثلث ذو زاوية يمنى ثلاثي الأبعاد (الشكل 2)، الذي يناسب تماما في الجدران على شكل V، وهي حوالي 155 ملم في الطول. الحيوانات يجب قياس الجانب الرأسي لكنها قادرة على النزول منحدر 45 درجة. الجهاز مضاءة في لوكس 100 أثناء التجربة. السكر الكريات التي استخدمت في التجربة (انظر الجدول للمواد)، وهلام السليكا (انظر الجدول للمواد) يستخدم للاحتفاظ الكريات الجافة.

Protocol

وافق جميع البروتوكولات التجريبية بالعناية بالحيوان واستخدام لجان لمعهد علوم المخ بتبريد.

1-إعداد الحيوان

  1. اختيار الجنس والعمر، والتركيب الوراثي والعلاجات الدوائية للفئران التجريبية (أو الفئران) تبعاً للغرض التجريبية.
    ملاحظة: هنا أثبتنا أداء أربعة ذكور الفئران C57B/6 من 2 أشهر من العمر.
  2. بيت الفئران في غرفة تحت الظروف القياسية (12 h الضوء/12 ح دورة الظلام، الأضواء على بين 08:00 ص و 08:00 م، 22 ± 1 درجة مئوية).
    ملاحظة: إذا كان الغرض مقارنة الفرق بين اثنين من الأنماط الجينية، المجموعة 4 الفئران في قفص وتشمل الفئران 2 من كل الوراثي.
  3. التعامل مع الفئران ل 2 دقيقة في اليوم لمدة 5 أيام لتعريفهم بالاتصال البشري. اطعامهم بقياس الحصص حيث أنه يتم الاحتفاظ وزن الجسم تقريبا حوالي 80-85% الوزن تغذية مجاناً في جميع أنحاء هذه التجربة. توفر المياه libitum الإعلانية.
  4. روض الفئران إلى الغرفة التجريبية بنقل جميع الفئران من الماوس السكن غرفة إلى غرفة تجريبية 30 دقيقة قبل التجربة كل يوم.
  5. بدء تجارب في نفس الوقت كل يوم لتجنب آثار إيقاعات circadian على أداء الحيوان.

2-الحيوان التعود على المتاهة

  1. بدء عملية تعود إلى المتاهة في وقت واحد مع الماوس المناولة (2 دقيقة في اليوم). إبقاء جميع الأبواب مفتوحة في هذه المرحلة. إجراء عملية تعود لمدة 5 أيام.
  2. في يوم 1، مبعثر الكريات الأغذية في جميع أنحاء المتاهة.
  3. وفي أيام 2 و 3، مبعثر الكريات على طول الأسلحة هما الهدف.
  4. في أيام 4 و 5، وضعت الكريات في المربعين الهدف اثنين فقط.
  5. وضع الفئران في المربع البدء في تمازي في مجموعات من أربعة كل يوم، بعد وضع الكريات، والسماح للفئران لاستكشاف المتاهة لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: التعود الفئران في مجموعات من أربعة سوف تساعدهم على التعلم من بعضها البعض وتسريع تدريب.

3-الحيوان التمييز HRA من جيش الرب للمقاومة

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول الاختبارات اتخاذ القرارات المستندة إلى تأخير سواء على أساس الجهد. ومع ذلك، تبعاً للغرض، يمكنك اختبار الباحثين واحد منهم فقط، أو كليهما. برنامج حاسوبي لمراقبة (جدول المواد) يستخدم للتحكم تلقائياً الإعداد تمازي للخطوات التالية. إذا كان سيتم اختبار اتخاذ القرار القائم على الجهد، إدخال الحواجز HRA وجيش الرب للمقاومة في مرحلة الدخول القسري الذراع. ثم سيتم تدريب الحيوانات للتمييز والجدار تسلق في وقت واحد. الفئران يتضورون جوعاً بنشاط تسلق الحواجز وبعد هذه المرحلة، كل منها يمكن أن يصعد بمهارة. ولذلك ليس من الضروري للبدء من حاجز أقل مع هذا البروتوكول.

  1. مرحلة الدخول القسري الذراع
    1. فتح نافذة معلمة التسجيل لبرامج التحكم وقم بإعداد معلمات على النحو التالي (الشكل 3).
      1. اختر الخيار "المرحلة". تعيين "عدد تجريبي" إلى 10، حيث سوف تذهب كل الحيوانات من خلال محاكمات 10 في اليوم الواحد لمدة 5 أيام متواصلة.
        ملاحظة: واحد اختر عدد المحاكمات مختلفة في صفحته/صفحتها التجارب الخاصة.
      2. تعيين "المدة" إلى 900 s حيث أن تدريب ماوس واحدة يوميا لا يتجاوز 900 س. تعيين في "وقت البدء الافتراضي تأخير" إلى 3 s، حيث أنه سيتم فتح الباب ابدأ 3 s بعد الكشف عن الحيوان في منطقة ابدأ.
      3. تعيين "رقم بيليه" للمنظمة وجيش الرب للمقاومة بحيث دائماً تلقائياً يتم الاستغناء عن الكريات 4 في المنظمة وهو الاستغناء عن بيليه 1 في جيش الرب للمقاومة.
        ملاحظة: في تجاربنا، وجدنا أن 1:4 هي أفضل نسبة عندما يتم استخدام حبيبات السكر 10 ملغ. إذا استخدمنا الكريات 6 إلى 10، الفئران لا يمكن الانتهاء من تناول كل منهم وسوف يكون هناك تقصير يحدث.
      4. تعيين "وقت تأخير" إلى 0 ثانية، حيث أنه سيكون هناك أي تأخير لكل من المنظمة وجيش الرب للمقاومة خلال هذه المرحلة.
    2. فتح إطار "معرف التسجيل" لمراقبة البرامج. سجل معرف لكل الماوس الفردية للبرامج وفقا لموقع HRA، أما من الجانب الأيسر أو الجانب الأيمن. (الشكل 4).
      ملاحظة: يجب أن تعوض الموقع فيما يتعلق بمجموعات التركيب الوراثي. 50% من كل مجموعة النمط الوراثي، HRA دائماً على اليسار وجيش الرب للمقاومة دائماً على الحق. لل 50 ٪ الأخرى، HRA دائماً على الحق وجيش الرب للمقاومة دائماً على اليسار.
    3. فتح نافذة التطبيق للبرنامج، حدد "صنع القرار" من قائمة "المهام" في القائمة المنسدلة. إدخال معرف الموضوع وحدد "المرحلة الثانية" من القائمة المنسدلة "المرحلة". حدد عدد اليوم من القائمة المنسدلة "اليوم". اضغط الزر "موافق" لإدخال إطار واجهة التجربة.
    4. في إطار التجربة واجهة، اضغط "جيتبج" لتسجيل المعلومات الأساسية للمتاهة حيث أنه سيتم تعقب الحيوان بدقة بغض النظر عن الخلفية للبيئة. اضغط على الزر "بدء الدورة" (الشكل 5).
    5. ضع الماوس في المربع البدء والشروع التدريب عن طريق الضغط على الزر "ابدأ" جهاز التحكم عن بعد.
      1. لاحظ أن الباب ابدأ، باب تقاطع واحد (يسار أو يمين) سيتم فتحه تلقائياً بعد 3 s; مرة واحدة الماوس يدخل منطقة مفرق، سيتم تلقائياً إغلاق الباب ابدأ.
      2. ويلاحظ أنه وبمجرد الماوس يدخل مجال التأخير (يسار أو يمين)، سيتم تلقائياً إغلاق الباب تقاطع وفتح الباب الهدف تلقائياً.
      3. نلاحظ أن مجرد الماوس يأخذ بيليه، الباب الخلفي والباب قبل بدء سيتم فتحه تلقائياً. مرة واحدة الماوس يدخل المنطقة مرة أخرى، سيتم تلقائياً إغلاق الباب الخلفي.
      4. ويلاحظ أنه بمجرد الماوس يدخل مربع ابدأ، سيتم تلقائياً إغلاق الباب قبل البدء، وسوف تبدأ محاكمة جديدة.
        ملاحظة: ضمن 10 تجارب كل يوم خلال هذه المرحلة التدريب، البرنامج تلقائياً سيضمن أن كل الماوس الزيارات HRA للمحاكمات 5 وجيش الرب للمقاومة للمحاكمات 5.
    6. تنظيف المتاهة دقة كل يوم.
  2. مرحلة دخول الذراع الحرة
    1. تسجيل المعلمات ومعرف الموضوع بنفس الطريقة كما تفعل في مرحلة الدخول القسري (الخطوة 3.1.1 و 3.1.2). اختر خيار المرحلة "". تعيين "رقم المحاكمة" إلى 20، حيث أن كل الحيوانات سوف تذهب من خلال محاكمات 20، يوميا لمدة 7 أيام متواصلة.
    2. في إطار التطبيق، حدد "المرحلة الثالثة" من القائمة المنسدلة "المرحلة". تعيين معلمات أخرى وفقا للخطوة 3.1.3.
    3. في إطار التجربة واجهة، تعيين قيمة "معدل نجاح" ك 80% حيث أن التدريب تستمر تلقائياً إلى تحديد الماوس HRA في 80 ٪ محاكمات، أو عند انتهاء المحاكمات 20 يوميا (كما هو مسجل في إعداد معلمات) من الماوس. تطبيق عمليات أخرى حسب الخطوة 3.1.4.
    4. السماح بالماوس لتختار بحرية ذراع واحدة، أما HRA أو جيش الرب للمقاومة.
      1. لاحظ أن الباب ابدأ، اثنين من الأبواب مفرق تلقائياً سيتم فتح بعد 3 s; مرة واحدة الماوس يدخل منطقة مفرق، سيتم تلقائياً إغلاق الباب ابدأ.
      2. ويلاحظ أنه وبمجرد الماوس اختار ذراع واحدة ويدخل منطقة التأخير (يسار أو يمين)، سيتم تلقائياً إغلاق الباب تقاطع وفتح الباب الهدف تلقائياً.
      3. نلاحظ أن مجرد الماوس يأخذ بيليه، الباب الخلفي والباب قبل بدء سيتم فتحه تلقائياً. مرة واحدة الماوس يدخل المنطقة مرة أخرى، سيتم تلقائياً إغلاق الباب الخلفي.
      4. ويلاحظ أنه بمجرد الماوس يدخل مربع ابدأ، سيتم تلقائياً إغلاق الباب قبل البدء، وسوف تبدأ محاكمة جديدة.

4. اختبار المستندة إلى تأخير اتخاذ القرار

  1. تسجيل المعلمات ومعرف الموضوع بنفس الطريقة كما تفعل في مرحلة دخول الذراع الحرة (الخطوة 3.2.1). تعيين "وقت تأخير" إلى 5، 10,15 ق في اليوم 1، يوم 2 ويوم 3 على التوالي، حتى أنه سيكون هناك 5 s تأخير للمنظمة في اليوم 1، 10 s تأخير HRA على تأخير s يوم 2 و 15 للمنظمة في يوم 3.
  2. في إطار التطبيق، حدد "المرحلة 4" من القائمة المنسدلة "المرحلة". تعيين معلمات أخرى بنفس الطريقة كما هو الحال في 3.2.2.
  3. في إطار التجربة واجهة تطبيق جميع العمليات وفقا للخطوة 3.2.3.
  4. السماح بالماوس لتختار بحرية ذراع واحدة، أما HRA أو جيش الرب للمقاومة.
    1. لاحظ أن الباب ابدأ، اثنين من الأبواب مفرق تلقائياً سيتم فتح بعد 3 s; مرة واحدة الماوس يدخل منطقة مفرق، سيتم تلقائياً إغلاق الباب ابدأ.
    2. ويلاحظ أن مجرد الماوس اختار ذراع واحدة ويدخل منطقة التأخير (يسار أو يمين)، سيتم تلقائياً إغلاق الباب مفرق.
      ملاحظة: إذا كان الماوس اختار جيش الرب للمقاومة، الباب الهدف سيتم فتحه تلقائياً فورا. ومع ذلك، إذا اختار الماوس HRA، الباب الهدف سيتم فتحه تلقائياً بعد 5 ق، 10 s، و 15 ثانية في الأيام 1، 2، 3 على التوالي.
    3. نلاحظ أن مجرد الماوس يأخذ بيليه، الباب الخلفي والباب قبل بدء سيتم فتحه تلقائياً. مرة واحدة الماوس يدخل المنطقة مرة أخرى، سيتم تلقائياً إغلاق الباب الخلفي.
    4. ويلاحظ أنه بمجرد الماوس يدخل مربع ابدأ، سيتم تلقائياً إغلاق الباب قبل البدء، وسوف تبدأ محاكمة جديدة.
      ملاحظة: هنا، وقمنا بتدريب الفئران لمدة 5-7 أيام مع كل شرط التأخير. ومع ذلك، استناداً إلى تجربتنا في اختبار خطوط متعددة من الفئران المحورة وراثيا أو تحور، يوم 1 (محاكمات 20) على الإطلاق بما يكفي لمعرفة الفرق بين الفئران من الأنماط الجينية المختلفة وهناك لا معنى لتمديد فترة التدريب (انظر الشكل 6 سبيل مثال). ولذلك، حاليا نطبق سوى يوم واحد لكل وقت التأخير وأنه يعمل بشكل جيد. لن تكون هناك مشكلة إذا كان الباحثون يريدون تمديد أيام التدريب تبعاً لأغراضهم الخاصة.
  5. اختياري: إجراء الاختبار مع HRA عكسه. لاختبار ما إذا كان الاختيار الماوس هو نتيجة تفضيل التوجه، بدل موقف اليسار/اليمين في HRA وجيش الرب للمقاومة (الذي يمكن أن يتحقق تلقائياً من البرنامج) والسماح للفئران أن يختار بحرية ذراع واحدة كما هو الحال في 4.4.
  6. اختياري: إجراء اختبار عنصر تحكم من تأخير. لاختبار ما إذا لاحظت أي عجز نتيجة لتغيير الذاكرة المكانية أو حساسية مكافأة وليس نتيجة للتغيرات في مجال صنع القرار، إدخال تأخير 15 ثانية جيش الرب للمقاومة، فضلا عن المنظمة، والسماح للفئران أن يختار بحرية ذراع واحدة كما هو الحال في 4.4.

5-اختبار اتخاذ القرار القائم على الجهد

  1. عرض الحاجز إلى المنظمة كما هو موضح في الرسم التخطيطي (الشكل 1).
  2. قم بإعداد جميع المعلمات وتطبيق جميع العمليات وفقا للخطوة 3، 2 – الحرة مرحلة دخول الذراع واختبار الحيوانات لمدة 3 أيام متواصلة.
  3. السماح للفئران أن يختار بحرية ذراع واحدة، أما HRA أو جيش الرب للمقاومة.
    ملاحظة: هنا، وقمنا بتدريب الفئران لمدة 14 يوما. ومع ذلك، استناداً إلى تجربتنا في اختبار خطوط متعددة من الفئران المحورة وراثيا أو تحور، 3 أيام على الإطلاق بما يكفي لمعرفة الفرق بين الفئران من الأنماط الجينية المختلفة وهناك لا معنى لتمديد وقت التدريب (انظر الشكل 6 كمثال ). ولذلك حاليا نطبق فقط 3 أيام للاختبار على أساس الجهد وأنه يعمل بشكل جيد. لن تكون هناك مشكلة إذا كان الباحثون يريدون تمديد أيام التدريب تبعاً لأغراضهم الخاصة.
  4. اختياري: إجراء الاختبار مع HRA عكسه. لاختبار ما إذا كان الاختيار الماوس هو نتيجة تفضيل التوجه، بدل موقف اليسار/اليمين في HRA وجيش الرب للمقاومة (الذي يمكن أن يتحقق تلقائياً من البرنامج) والسماح للفئران أن يختار بحرية ذراع واحدة كما هو الحال في الخطوة 5، 3.
  5. اختياري: إجراء اختبار جهد التحكم. لاختبار ما إذا لاحظت أي عجز نتيجة لتغيير الذاكرة المكانية أو حساسية مكافأة وليس نتيجة للتغييرات في صنع القرارات، وإدخال حاجز جيش الرب للمقاومة، فضلا عن HRA، والسماح للفئران أن يختار بحرية ذراع واحدة كما هو الحال في الخطوة 5، 3.

6-بيانات التحليل

  1. الحصول على البيانات والنتائج مباشرة من البرنامج عنصر التحكم.
    1. لاحظ أن البرنامج تلقائياً سجل التاريخ التجريبي، وبدء وانتهاء الوقت، المدة، عدد المحاكمات، موقع HRA، رقم بيليه في HRA وجيش الرب للمقاومة، والموقف (X, Y) وتتبع تتحرك إلخ، كل بالماوس في مجلد "البيانات" .
    2. تحقق من أن البرنامج قد تلقائياً تحليل البنود التالية، وسجل لهم في المجلد "النتيجة" تحت كل الحيوانات معرف: المدة، عدد المحاكمات، HRA اختيار رقم جيش الرب للمقاومة خيار، HRA خيار النسبة المئوية، جيش الرب للمقاومة خيار النسبة المئوية، رقم مجموع المسافة تتحرك، وتقاطع مجموع الوقت.
  2. إجراء تحليل إحصائي عن البيانات من تجارب كل من ANOVA مختلطة (تقسيم الأرض ANOVA)، مع يوم/دورة كعامل ضمن هذا الموضوع والمجموعة (مجموعة النمط الوراثي أو المجموعات مع ظروف تجريبية مختلفة) كعامل بين الموضوع.
  3. تحليل الأثر الرئيسي للفريق العامل إذا لم يكن هناك أي تفاعل بين/جلسة اليوم مع فريق عامل. تطبيق مقارنات عشوائية وظيفة المخصصة إذا كان هناك تفاعل كبير بين/جلسة اليوم مع فريق عامل.

Representative Results

مثال التأخير والجهد على أساس اتخاذ القرارات المهمة التي يؤديها الفئران الآنسي هابينولار أبلاتيد (mHb:DTA الفئران)14 مع تلك الفئران السيطرة البرية من نوع ليتيرماتي (CT الفئران) ويرد في الشكل 6. MHb:DTA الفئران والفئران CT اثنين اثنين قد شارك مساكن في قفص واحد بعد الفطام.

في المستندة إلى تأخير اتخاذ القرار الاختبار (الشكل 6A)، كان هناك أي تفاعل كبير بين النمط الوراثي ودورة في أي مرحلة، بما في ذلك مرحلة التدريب التمييز (عندما كان وقت تأخير HRA 0) واختبار اتخاذ القرار القائم على التأخير المرحلة (عندما كان وقت تأخير HRA 5 ق، 10 s، و 15 ثانية، على التوالي). الأثر الرئيسي للنمط الوراثي لم يكن كبيرا عندما كان وقت التأخير 5 s. ومع ذلك، عندما كان ممدود وقت التأخير إلى 10 ق وق 15، mHb:DTA والفئران أظهرت انخفاض كبير في النسبة المئوية للزيارات HRA مقارنة بالفئران CT. وكشفت هذه النتائج أن الاجتثاث محب انخفض تفضيل الفئران للانتظار لمكافأة أكبر، وبدلاً من ذلك عرض ميل لتحديد مكافأة صغيرة على الفور، عندما كانت أوقات الانتظار 10 ثوان أو حتى أطول. وتشير البيانات إلى أن مهب قد تكون بنية الدماغ هامة في السيطرة على الاندفاع و/أو الوقت تقييم التكاليف والفوائد، مما يجعل الحيوانات أكثر عرضه لتسمح بالوصول المتأخر للحصول على مكافأة كبيرة.

في القائم على الجهد صنع القرار الاختبار (الشكل 6B)، النسبة المئوية ل HRA انخفضت الزيارات كانت إلى حد كبير في الفئران mHb:DTA عندما وضعت حاجزاً في المنظمة، بغض النظر عن توطين HRA (س 1 الحاجز مرحلة وعكس يسار/يمين ). وهذا يعني أن النمط الظاهري للفئران mHb:DTA ليس بسبب عجز في تفضيل المكانية والذاكرة. في جهد الاختبار التحكم، ووضعت حواجز في كلا ذراعيه الهدف (2 × الحواجز المرحلة) وجيش الرب للمقاومة والمنظمة على حد سواء كانت ترتبط بالجهد العالي. ولذلك، كانت تكلفة الجهد نفسه بالنسبة للحيوانات تحديد أجر منخفض أو مكافأة عالية. الفئران mHb:DTA زار HRA شكل متكرر أكثر من جيش الرب للمقاومة، والذي تم التوصل إليه المقارنة HRA زيارة عدد في الدورة النهائية (الدورة 5). هذه النتيجة تشير إلى أن حساسية مكافأة والذاكرة المكانية في الفئران mHb:DTA كان سليما. أوضحت البيانات أن محب قد تلعب دوراً هاما في تقييم التكاليف والفوائد الجهد، مما يسمح لوضع المزيد من العمل للحصول على مكافآت أكبر الحيوانات.

Figure 1
رقم 1: رسم تخطيطي لجهاز تمازي التقليدية لصنع القرار test. (أ) جهاز اختبار اتخاذ القرار القائم على التأخير. ووضعت في الذراع ابدأ الحيوانات واختيار بين اثنين من الأسلحة الهدف، HRA وجيش الرب للمقاومة. عند اختيار الحيوانات المنظمة، كان عليهم أن الانتظار (تبعاً لتأخير الوقت بالثواني) للحصول على مكافأة أكبر. يحتاج الباحثون يدوياً التعامل مع الحيوانات، والكريات، والأبواب لكل محاكمة. (ب) جهاز اختبار اتخاذ القرار القائم على الجهد. ووضعت في الذراع ابدأ الحيوانات واختيار بين اثنين من الأسلحة الهدف، HRA وجيش الرب للمقاومة. عند اختيار الحيوانات المنظمة، كان عليهم أن تسلق حاجز ثلاثي للحصول على مكافأة أكبر. يحتاج الباحثون يدوياً التعامل مع الحيوانات، والكريات، والأبواب والحواجز لكل محاكمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الآلي تمازي الإعداد لصنع القرار test. (أ) عرض أعلى من الإعداد الآلي. (ب) "عرض الجانب" من الإعداد الآلي. حاجز (ج) مثلث زاوية ثلاثية الأبعاد المستخدمة لاختبار اتخاذ القرار القائم على الجهد، من اليسار إلى اليمين، هي الجانب، عرض الجانب المعاكس ومنظر جانبي الوتر، على التوالي. الصور الفنية الأصلية تحريرها بإذن من الشركة المصنعة التجارية. GBL: مربع الهدف (على اليسار)، المملكة المتحدة: مربع الهدف (على اليمين)، GDL: الباب الهدف (على اليسار)، إصدار التوزيع العام: الهدف (على اليمين)، باب الدال: تأخير المنطقة (على اليسار)، دار: تأخير المنطقة (يمين)، جدل: تقاطع باب (يسار)، جدر: تقاطع باب (يمين)، مصرف لبنان: الباب الخلفي (يسار)، حرس الحدود: الباب الخلفي (يمين)، اتفاقية مكافحة التصحر: التهمة إلى جانب جهاز الكاميرا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: "معلمة" التسجيل نافذة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: نافذة التسجيل "معرف الموضوع". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: نافذة واجهة التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: صنع القرارات المستندة إلى التأخير والقائم على الجهد في الفئران mHb:DTA. (أ) اختبار صنع القرار مستندة إلى التأخير في الفئران mHb:DTA (الفئران كانت الأشهر 12 – 14-n القديمة، = 8/النمط الوراثي). وكانت نسبة الاختيار HRA قابلة للمقارنة بين الأنماط الجينية عند وقت التأخير كان s 0 و 5، ولكن انخفضت إلى حد كبير في الفئران mHb:DTA عندما كان وقت التأخير 10 s و 15 ثانية. عندما كان وقت التأخير 5 ق، النمط الوراثي × يوم التفاعل: F(1,14) = 0.594، ف = 0، 236؛ تأثير النمط الوراثي: F(1,14) = 0.61، p = 0.45؛ عندما كان وقت التأخير الوراثي ق: 10 × اليوم التفاعل: F(1,14) = 37.5، p = 0.346؛ تأثير النمط الوراثي: F(1,14) = 32.4، ف < 0.0001؛ عندما كان الوقت تأخير ق 15: F(1,14) = 38.7، p = 0.243؛ تأثير النمط الوراثي: F(1,14) = 31.6، و ≤0.0001 ف . (ب) على أساس جهد الاختبار صنع القرار في الفئران mHb:DTA (الفئران كانت الأشهر 12-14-القديمة، n = 9/النمط الوراثي). خلال 1 × المرحلة الحاجز، كان هناك وجود تفاعل كبير بين النمط الوراثي والدورة (النمط الوراثي × يوم التفاعل: F(1,16) = 2.11، ف = 0.015)، وكشفت مقارنة عشوائية وظيفة المخصص أن HRA ٪ من الفئران mHb:DTA انخفض بشكل كبير في جميع الدورات. مرحلة تراجع، وكان هناك أي تفاعل كبير بين النمط الوراثي والدورة (النمط الوراثي × يوم التفاعل: F(1,16) = 1.61، ف = 0.08). الفئران mHb:DTA زار HRA إلى حد كبير أقل من الفئران CT (تأثير النمط الوراثي الرئيسي: F(1,16) = 8.18، p = 0.01). أثناء مرحلة الحواجز × 2، كان هناك وجود تفاعل كبير بين الأنماط الجينية والدورات، واختلاف كبير في الدورة 3 والدورة 4 (2 × المرحلة الحواجز: النمط الوراثي × يوم التفاعل: F(1,16) = 3.9، ف = 0.0067). الفئران mHb:DTA الذي تم التوصل إليه HRA زيارة عدد مماثل للفئران CT في الدورة النهائية، الدورة 5. وتمثل البيانات يعني ± sem. * * ف < 0.01؛ ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: مخطط انسيابي المقرر إجراء اختبار (تأخير الجهد القائم أو).

Discussion

صنع القرار عملية معرفية شديدة المحافظة أثناء تطور15. البشر والحيوانات يمكن تقييم تكلفة خيارات العمل المتنافسة بالنسبة للمكافأة المحتملة وثم جعل يختارونها. المرضى الذين يعانون من عدد من الأمراض العصبية والاضطرابات النفسية إثبات العجز في أشكال مختلفة لصنع القرار16. ولذلك من المهم أن التحقيق الآليات العصبية الحيوية والفيزيولوجية المرضية الكامنة في عملية صنع القرار. في السنوات القليلة الماضية، تأخير الجهد القائم وصنع القرار وجذب أكثر البحوث الفائدة. وعلاوة على ذلك، القوارض، خاصة من الفئران قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة هذين الشكلين من صنع القرار17.

العديد من الدراسات التي أدت إلى اكتشافات مثيرة للاهتمام باستخدام مهمة سلوكية التي تنطوي على جهاز تمازي مع HRA وجيش الرب للمقاومة2،،من67،،من89،10، 18 , 19 , 20 , 21 , 22-في هذه المهمة، يؤيد HRA المكافآت كبيرة مع أما وقت التأخير أو الجهد الجهد المبذول. في جيش الرب للمقاومة، يمكن الحصول على الحيوانات صغيرة مكافأة فورا دون أي إبطاء الوقت والجهد البدني. النهج التقليدي الذي يعتمد على الإنسان المجرب التدخل اليدوي. في كل محاكمة، المجرب يحتاج لعد الكريات ووضعها في علب الطعام HRA وجيش الرب للمقاومة، ضع أبواب الهدف HRA وجيش الرب للمقاومة، ثم ثم ضع الحيوان في نهاية الذراع ابدأ. عند الحيوان يدخل أي من الأسلحة، باب مفترق طرق يجب أن يوضع لتقييد الحيوان إلى الجهاز الهدف. تبعاً للبروتوكول، المجرب يحتاج إلى الاعتماد الوقت وفتح الباب الهدف بعد تأخير تعيين. بعد الحيوان يدخل منطقة الهدف، ولم يحصل pellet(s)، المجرب يحتاج إلى إعادته إلى القفص، وتسجيل اختيار الذراع الحيوان والسلوك. ثم المجرب يحتاج إلى إعداد الأبواب تمازي وبيليه للمحاكمة القادمة. كل تدريب واختبار العمليات تستهلك كثيرا من الوقت وحزب العمل. وعلاوة على ذلك، عدم وجود توحيد عبر مختبرات مختلفة مصدر قلق آخر.

في هذه الورقة، قدمنا بروتوكول استناداً إلى جهاز تمازي الآلي مع نظام التعقب بالفيديو (الشكل 7) لحل مشاكل البروتوكولات التقليدية معدلة. عن طريق إدخال من "الباب الخلفي" و "الممر الخلفي" تمازي التقليدية، حصلنا على المتاهة بشكل إيسوسيليس منطقتي مثلث ". المزايا لهذا الإعداد (1) أتمتة كاملة للسلوكية التدريب والاختبار. وهذا يزيل أثر الذاتية المجرب ويقلل من وقت الإنسان والتزامات العمل. لدينا الأجهزة الأربعة في المختبر، حيث أنه يمكن تدريب الفئران الأربعة أو اختبارها في نفس الوقت بالمجرب واحد، التي من المستحيل إنجازه باستخدام البروتوكولات التقليدية. (2) هناك مرونة البرنامج كبرنامج السيطرة يسمح المجربون لبحرية إعداد معلمات متعددة، بما في ذلك رقم بيليه وتأخير الوقت، فتح الباب وإغلاق، الإعداد للمحاكمة، والمدة ووضع التتبع. ولذلك، يمكن تلبية هذا النظام أنواع مختلفة من الاحتياجات التجريبية. (3) هناك توافق واسع جميع أبواب إنزلاقية في تمازي صممت ليتم تخزينها تحت قاعدة المتاهة عندما تكون مفتوحة. ولذلك، يمكن أن تكون متكاملة الإعداد بسهولة مع نظم فسيولوجية متنوعة، بما في ذلك التلاعب أوبتوجينيتيك/البصري، في فيفو تسجيل الكهربية، وميكرودياليسيس. وبالإضافة إلى ذلك، لاستبعاد إمكانية أن الفئران اختيار HRA سبب تفضيل موقف، نوصي بتطبيق اختبار عنصر تحكم مقايسة أساس كل تأخير-والجهد. بمساواة تكاليف الأسلحة هما الهدف، الحيوانات لديها الفرصة لتجربة كل النتائج مكافأة على نفس التكلفة. يمكن أن يتم الاختيار ببساطة على أساس المكافأة التفاضلية، مما يزيل الحاجة إلى إدماج كل من التكاليف والفوائد قبل اتخاذ أي قرار. وهذا أيضا اختبار ما إذا كان أي تغيير في خيارات الحيوانات نتيجة لعدم القدرة على قياس التكلفة أو مكافأة، أو العجز في الذاكرة بدلاً من تغيير في الطريقة التي قاموا بتقييم قراراتهم.

في المختبر لدينا، قمنا بتحليل حوالي 10 سلالات من الفئران مع هذا الإعداد. وأبدى مثال واحد بيانات تمثيلية، أظهرت الفئران mHb:DTA النمط الظاهري قوية في كل تأخير-ويستند إلى جهد-صنع القرار. فهو بقوة مخفضة قيمة المكافأة بالوقت والجهد في الفئران mHb:DTA. وكشفت النتيجة الدور الهام لمحب على الاندفاع التحكم عن بعد. وبالإضافة إلى ذلك، نحن طبقت تسجيلات التحقيق السيليكون على الفئران تتحرك مجاناً خلال عملية صنع القرار (بيانات غير منشورة). جميع التجارب التي قدمت معايير التحقق من الصحة للقدرة على إعداد المؤتمتة. وهكذا، بروتوكول موحد تمازي على أساس صنع القرار مع الجهاز الآلي مناسبة للكشف عن الآثار الوراثية والتأثيرات الدوائية والآثار الدارة العصبية على التأخير وجهد خصم من القوارض. وباختصار، الإعداد مزايا عديدة لتكون بمثابة نظام مثالي لفحوصات صنع القرارات المستندة إلى التأخير والجهد.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونود أن أشكر الدكتور ماثيو و S روشفورث (قسم علم النفس التجريبي، جامعة أكسفورد)، والدكتور ماساميشي ساكاجامي (مركز أبحاث علوم المخ، وجامعة تماجاوا) على نصائحهم القيمة على البدء في المشروع، وعلى تفاصيل من البروتوكولات. ونحن نشكر الدكتور ليلى يو للتعليقات الانتقادية وتحرير المخطوطة. هذا المشروع كان يدعمها "المشروع البحثي حافز بتبريد" (100226201701100443) إلى Q.Z، مشروع علوم المخ، ومركز للعلم رواية المبادرات، المعاهد الوطنية للعلوم الطبيعية (BS291003) إلى Q.Z، (مشروع الشيخوخة بتبريد 10026-201701100263-340120) إلى Q.Z ومعونات كاكينهي JSPS للعلماء الشباب (ب) (17841749) إلى Q.Z.

الكتاب مساهمات: Q.Z تصور وبدأ المشروع، Q.Z، Y.K و H.G إجراء التجارب، وتحليل البيانات، H.G تنسيق العمل بين مختبر واوهارا & Co., Ltd.، Q.Z و Y.K وكتب المخطوطة، S.I الإشراف على المشروع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
automated t-maze for decion making testing O’HARA & Co.,ltd no catalog number, customorized Address requested by the reviewer: 4-28-16 Ekoda, Nakano-ku, Tokyo 165-0022
TEL: 81-3-3389-2451 FAX:81-3-3389-2453
slica gel  Nacalai Tesque 1709155
AIN-76A Rodent Tablet 10mg Test Diet 1811213(5TUL) Manufactured for Japan,SLC
Time TM1 software  O’HARA & Co.,ltd no catalog number
SPSS statistics V21.0 IBM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frank, M. J., Scheres, A., Sherman, S. J. Understanding decision-making deficits in neurological conditions: insights from models of natural action selection. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 362 (1485), 1641-1654 (2007).
  2. Prevost, C., Pessiglione, M., Metereau, E., Clery-Melin, M. L., Dreher, J. C. Separate valuation subsystems for delay and effort decision costs. J Neurosci. 30 (42), 14080-14090 (2010).
  3. Kennerley, S. W., Walton, M. E. Decision Making and Reward in Frontal Cortex: Complementary Evidence From Neurophysiological and Neuropsychological Studies. Behavioral Neuroscience. 125 (3), 297-317 (2011).
  4. Kurniawan, I. T., Guitart-Masip, M., Dolan, R. J. Dopamine and Effort-Based Decision Making. Frontiers in Neuroscience. 5, 81 (2011).
  5. Izquierdo, A., Belcher, A. M. Rodent models of adaptive decision making. Methods Mol Biol. 829, 85-101 (2012).
  6. Thiebot, M. H., Le Bihan, C., Soubrie, P., Simon, P. Benzodiazepines reduce the tolerance to reward delay in rats. Psychopharmacology. 86 (1-2), 147-152 (1985).
  7. Green, M. F., Horan, W. P., Barch, D. M., Gold, J. M. Effort-Based Decision Making: A Novel Approach for Assessing Motivation in Schizophrenia. Schizophr Bull. 41 (5), 1035-1044 (2015).
  8. Fatahi, Z., Sadeghi, B., Haghparast, A. Involvement of cannabinoid system in the nucleus accumbens on delay-based decision making in the rat. Behav Brain Res. 337, 107-113 (2018).
  9. Iodice, P., et al. Fatigue modulates dopamine availability and promotes flexible choice reversals during decision making. Sci Rep. 7 (1), 017-00561 (2017).
  10. Rudebeck, P. H., Walton, M. E., Smyth, A. N., Bannerman, D. M., Rushworth, M. F. Separate neural pathways process different decision costs. Nat Neurosci. 9 (9), 1161-1168 (2006).
  11. Bonnelle, V., et al. Characterization of reward and effort mechanisms in apathy. J Physiol Paris. 109 (1-3), 16-26 (2015).
  12. Hartmann, M. N., et al. Apathy but not diminished expression in schizophrenia is associated with discounting of monetary rewards by physical effort. Schizophr Bull. 41 (2), 503-512 (2015).
  13. Lockwood, P. L., et al. Prosocial apathy for helping others when effort is required. Nat Hum Behav. 1 (7), 017-0131 (2017).
  14. Kobayashi, Y., et al. Genetic dissection of medial habenula-interpeduncular nucleus pathway function in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 7 (17), (2013).
  15. Hanks, T. D., Summerfield, C. Perceptual Decision Making in Rodents, Monkeys, and Humans. Neuron. 93 (1), 15-31 (2017).
  16. Lee, D. Decision Making: from Neuroscience to Psychiatry. Neuron. 78 (2), 233-248 (2013).
  17. Carandini, M., Churchland, A. K. Probing perceptual decisions in rodents. Nature Neuroscience. 16 (7), 824-831 (2013).
  18. Denk, F., et al. Differential involvement of serotonin and dopamine systems in cost-benefit decisions about delay or effort. Psychopharmacology. 179 (3), 587-596 (2005).
  19. Walton, M. E., Bannerman, D. M., Rushworth, M. F. S. The Role of Rat Medial Frontal Cortex in Effort-Based Decision Making. The Journal of Neuroscience. 22 (24), 10996-11003 (2002).
  20. Bardgett, M. E., Depenbrock, M., Downs, N., Points, M., Green, L. Dopamine Modulates Effort-Based Decision-Making in Rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 242-251 (2009).
  21. Floresco, S. B., Tse, M. T., Ghods-Sharifi, S. Dopaminergic and glutamatergic regulation of effort- and delay-based decision making. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 1966-1979 (2008).
  22. Assadi, S. M., Yucel, M., Pantelis, C. Dopamine modulates neural networks involved in effort-based decision-making. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 33 (3), 383-393 (2009).

Tags

مجاناً السلوك، العدد 138، صنع القرارات، والتأخير، الجهد، تتحرك، القوارض، تمازي، مكافأة، التكلفة، اللامبالاة، الاندفاع، والأمراض النفسية، و في فيفو
تمازي الآلي أساس جهاز وبروتوكول لتحليل قائم على الجهود وتأخير اتخاذ القرار في القوارض الانتقال الحر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Q., Kobayashi, Y., Goto, H.,More

Zhang, Q., Kobayashi, Y., Goto, H., Itohara, S. An Automated T-maze Based Apparatus and Protocol for Analyzing Delay- and Effort-based Decision Making in Free Moving Rodents. J. Vis. Exp. (138), e57895, doi:10.3791/57895 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter