Summary
光シート顕微鏡とショウジョウバエの胚でビーズなし細胞力学をプローブへの実装に結合光ピンセットのセットアップを紹介します。
Abstract
形態形成には、遺伝的パターン形成と細胞や組織をしっかり形に機械力間の調整が必要です。したがって、地形形成過程を理解するための課題は、胚発生の間に細胞の力と体内の力学的性質を直接測定するためです。ショウジョウバエの初期胚の細胞間の接触の力を直接適用することができます、光シート顕微鏡と結合した光ピンセットのセットアップを提案するここでは、いくつかのフレーム/秒の速度でイメージングしながら。この手法には、胚は、通常の光学力が行使が中間のプローブとして使用ビーズの注入を必要としない利点があります。我々 は、ステップバイ ステップのセットアップの実装の詳細し、実験から力学的情報を抽出するためのツールを提案します。細胞細胞の接触リアルタイムの変位を監視することによって張力測定を実行、細胞の接触のレオロジーを調査できます。
Introduction
萌芽期の開発は、その中に細胞や組織を将来の動物の形に変形再現性の高いプロセスです。このような変形は、セル レベル1,2では、軍のアクティブな世代を必要とする示されています。地形形成過程中に細胞や組織は、その形状を変更して、それしたがってキー関係の細胞の力学特性を評価するために、プロセス3,4の間に組織内で力を測定するには.擬 2次元のジオメトリと簡単操作に、ショウジョウバエ、特に上皮の層は広く研究されています。
テクニックの数は、われわれや他の開発中に体内の上皮の力学評価このように開発されています。我々 は上皮組織で使用される 3 つの主要な技術の概要を与えます。セル接合5,6,7,8または9,スケール大きい10,11 のローカルの機械的ストレスを明らかにすることにより、レーザー焼灼、広く使用されている方法ターゲットの力学的整合性を混乱させる地方のカットを実行することによって。カットの次拡大のダイナミクスは、ストレス前アブレーションと組織12,13のレオロジーの両方の情報を提供します。レーザーアブレーションの欠点は、ことだが、侵襲的な細胞の皮質のローカルの中断を必要とです。したがって、試練の限られた数は、1 つは組織の整合性を保持したい場合 1 つのみ実行できます。別の欠点は、開離速度は、一般的に知られていない粘性摩擦に依存なので試練だけ細胞の接触の張力の相対的な見積もりを提供です。磁気操作はまた開発し、ショウジョウバエ、磁性14の使用または ultramagnetic リポソーム15のいずれかを含むで使用されます。彼らは絶対測定16,17を提供することができますが、目的の位置にプローブの注入を要求することの意味で侵襲も。これは常に正確な注射に従順ではないシステムによって非常に難しいことができます。3 番目の手法は、完全に非侵襲的は力の推定18,19,20です。力の推論はトリプル ポイント (tricellular 接合または頂点) で力学的平衡の仮定に依存していると推論する緊張まったく細胞連絡先 (おそらく、すべての細胞圧力) によって逆問題を解くことができます。緊張、各頂点には、2 つの方程式 (X と Y) が用意されています。これにより、大規模な連立一次方程式をすべての細胞の接触の張力を評価するためにいくつかの条件の下で反転することができます。それだけ分割イメージがない余分な実験やセットアップを必要と、この方法は非常に魅力的で、その精度は調べるには、まだ、再び絶対校正測定が行われていない限り、それはのみ相対値を提供します。
これらの制限の一部を克服するために紹介するこの記事の光ピンセットのセットアップキイロショウジョウバエの胚上皮細胞のスケールで制御された力を適用する光シート顕微鏡と結合しました。光ピンセットは、単一蛋白質および細胞内小器官や細胞の21の操作で測定を含む多数の生物学的応用のために使用されています。ここで、報告は小さい少数のダース pN の範囲で応用力まだ細胞の接触のローカル変形を誘発して体内の機械計測を実行するのに十分な。通常、力を変形に関連するのに細胞の接触、kymographs の分析を通して監視の垂直偏向を使用します。重要なは、我々 のセットアップには、光ピンセットは直接細胞間の接触に力を発揮することができる、組織内の目的の場所でビーズの注入は不要です。光シート顕微鏡光学ピンセットのカップリングの照明は非常に減らされた毒性との短い時間スケールで、機械的分析のためかなり高速イメージング (フレーム数/秒) を実行することができます、サンプル画像22の平面に制限されます。
全体的にみて、光ピンセットは、ショウジョウバエ胚の in vivo 細胞の接触力制御を適用して剛性と携帯連絡先23、張力レオロジー特性などの機械情報を抽出する非侵襲的な方法24、グラデーションや異方性張力23。
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Protocol
1. 設定光シート顕微鏡
- 以前の文書25の設定の説明を参照してください。
注: セットアップは正立顕微鏡ステージの水平面内光シートを生産光シート モジュールで構成されます。励起対物レンズ × 10 ガラスキュベット (図 4) に光のシートに指示します。検出の対物レンズは高 NA (1.1) 効率的な tweezing (下記参照) のために必要があります。
2. 設定光ピンセットのパス
注:図 1の光のセットアップの一般的な方式を与えます。
- 1070 nm のレーザー ユニットを配置し、V クランプ マウント光学テーブルに繊維を修正します。ファイバー コリメータ光学テーブルに平行であることを確認 (それ故に、水平) 光学テーブルに配置されますと、ここで選択した高さのすべての光学コンポーネントの高さになります。
注: 100 mm はこの高さのためのよい選択をすることができます。 - 赤外レーザー ユニットのキーを回すし、配置ポインターをオンにする「選択」ボタンを押します。光は、光ファイバーの水平発信しなければなりません。
- 光路内シャッターを置き、シャッターの開口部を通過する赤外線レーザー光線をので光学テーブルにそれを修正します。光学テーブル間の距離を確認し、シャッターの絞りの中心は高さ 2.1 の手順で選択します。
- シャッター コント ローラーのキーを回す、矢印とマニュアル モードを選択、シャッターを開くには、「有効にする」ボタンを押します。
- 配置、配置および最初のガルバノ ミラーを修正します。
注: 2 つのガルバノ メーター ミラーある検出の目的の背面の開口部に共役するのでレーザー ビームは目的のバック絞りの出ていないミラーの 1 つが回転。最初の検流計と目的の背面の開口部間の距離が計算を目的に関連してこの検流計の位置を評価し保持している (f1 + f1 + f2 + f2 キー + f3 + f3 キー + f4 キー + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = 1550 mm; fi =n ° のレンズの焦点距離私)。 - 検流計の電源をオンにします。配置プロトコルの残りの電源、検流計がいることを確認します。
- ゼロの偏向に、検流計を設定 (NIMAX または光学ピンセット ソフトウェア - 検流計接続の手順 3 を参照)。
- 配置、配置およびリレー望遠鏡 30 ミリメートルの焦点距離で 2 つのレンズの構成を修正します。
- 配置、配置および 2 番目のガルバノ ミラーを修正します。オシログラフの 2 つの間の距離は 4 f = 4 × 30 mm = 120 mm (f = 焦点距離)。
- 配置し、望遠鏡を修正します。
注: 望遠鏡は、対物レンズの背面の開口部の直径に等しいかそれ以上の幅にビームを展開 2 つのレンズで構成されます。最小の焦点距離を持つレンズを最初に来る必要があります。 - 配置、配置および上向きにダイクロイック ミラー レールの入り口に近い光パスをもたらすペリスコープを修正します。
- レールにホットミラーを修正、顕微鏡でレールを配置します。赤外線レーザー (図 2) の入り口を許可するように右側のレールをひきを確認します。
- レーザー光はという顕微鏡の最初を目的とし、目的以外にもチェックしてください。潜望鏡の下のミラー目的の前にレーザーの位置を修正します。潜望鏡のトップのミラーの目的後レーザーの位置を修正します。
- 500 nm の蛍光ビーズの 1 μ L をガラス キュベットに入れ、蒸留水 10 mL を加えます。キュベット ホルダーに目的としてキュベットを入れ目的水表面に触れる目的 (Z 位置) の焦点を調整します。
- AOTF、カメラおよび圧電ステージ制御獲得自家製ソフトウェアを起動します。たがりなどフリーソフトを使用もできます。「ライブ」のプッシュ ボタンを押すことによってライブ集録モードをオンにします。
- W. 1 IR レーザー パワーを調整します。
-
ゴーグルを置く (と実験の終わりの前にそれを削除しないでください)、レーザーに切り替えます。ビーズは、レーザーの焦点でトラップする必要があります。
- レーザーの焦点にビードが閉じ込められてない場合 (これは IR レーザーと同一線上) 赤色レーザー ポインターが目的に出ているかどうかを確認します。そうでなかったら、再度配置の手順を開始、特にステップ 2.13。また、IR レーザー力を高めます。
- 最後の最後のレンズの位置をそっと移動ビーズが (画像の平面) の焦点が合っていないトラップされた場合、画像の面で焦点にビーズをもたらす光軸に沿って (図 1の L4) を望遠鏡します。望遠鏡の光軸に沿って (図 1で L3)、十分に移動最後の最初のレンズない場合。
- 閉じ込められたビーズが画像の中央に来ない場合は、トラップの位置を調整する 2 ペリスコープのミラーを使用します。ビードの位置を変更するには、最初のミラーの角度を変更する、2 番目のミラーの対応する角度を変えることによってビームの方向を補正も。正しいのみ (1 各ミラー用ねじ)、X 位置、Y 位置 (ミラーごとに 1 ネジ) を修正します。
- 必要に応じて、フォーカスのビードを観察する 2nd望遠鏡のレンズの位置を調整します。
- 必要に応じて、画像の中心としたビーズとペリスコープ ミラーの角度を調整します。
3. 計測器のインタ フェース
注:図 3 (NI) カードの接続の一般的な方式を与えます。
- シャーシ (cDAQ-9178) の最初のスロットで出力カード (NI 9263) を挿入します。NI カードを少なくとも 2 つのアナログ出力、アナログ入力 3 の他のモデルを使用できることに注意してください。
- 入力カード (NI 9215) をシャーシの 2 番目のスロットに挿入します。
- アナログに最初の検流計を接続出力 AO0 と BNC ケーブルとアナログ入力 AI0。T アダプターを 1 つに 2 本の BNC ケーブルを接続する使用ことができることに注意してください。検流計ドライバー基板のピンをローカライズする検流計のマニュアルを参照してください。
- 同じように、2 番目の検流計を AO1 と AI1 に接続します。
- (コント ローラー) 背部のシャッターのトリガーの PFI1 に接続します。
- カメラの火災と AI2 は、PFI0 を接続します。
- AI3 を (コント ローラー) 背部のシャッターをトリガーに接続します。
- シャッター コント ローラーの設定を調整します。矢印を使用して、パラメーター値を変更し、「選択」ボタンを押して選択を検証し、次のパラメーターに渡します。単一、および内線許可するシャッターのコントロールに「トリガー」を「有効にする」ボタンを押して 000.000」時間オープン秒"パラメーター、000.000 に「閉じた時間秒」、「モード」を置きます。
- QtCreator (https://www.qt.io/、無料版からダウンロード) を開きます。
注: QtCreator は、光ピンセット ソフトウェアを C++ で開発するために使用統合開発環境です。Qt ライブラリは、ウィジェットを作成するここで使用されます。 - (Qt コード ファイルで提供) OT.pro ファイルを開きます。このアクションは、プロジェクトをオープンします。NI カードによると AOGenerator.cpp ファイルの入出力の名前を変更を使用します。
- コンパイルし、OT のソフトウェアを実行します。
4. ビーズの光トラップ位置の校正
-
校正映画の記録
- ガラス キュベットに 500 nm 赤蛍光ビーズの 1 μ L を入れ、10 mL の蒸留水でキュヴェットを埋めます。図 4観測においてキュベットのビューを提供します。
- 圧電ステージのキュヴェットを修正します。
- 検出の目的は、水で浸るキュヴェットの Z 位置を調整します。
- 赤外線レーザーをオンにし、電力を 1 w. に設定
- 画像集録ソフトウェアをオンにします。
- 時間経過画像を取得するには、露光時間、ゲイン、レーザー出力、取得する画像の数 2 つの画像間の時間を選択します。ビーズ ピンセット校正照明レーザーに注意してください (561 nm) は必要ありません。赤外線レーザーによる 2 光子の効果は、閉じ込められたビードの蛍光性を刺激するのに十分です。
- 光ピンセットの自家製ソフトウェアを起動します。
- 円を描く光ピンセットのパラメーターを設定します。250 サンプ/秒、1000、波形 1 パラメーター (ガルバノ 1) として bufferSize 正弦波、nbPeriod 1、振幅 0.5 V、相 0.0 rad としてオフセット 0.0 V、波形 2 パラメーター (ガルバノ 2) 正弦波、nbPeriod 1、0.5 V 振幅、位相オフセット 0.0 V 1.57 rad としてサンプリングを設定します。
- ...「AI パラメーター」ボックスと「それを待つ」をチェック ボックス。
- 画像の取得 (など 10 fps の高フレーム レート 500 または 1000 の画像) を開始します。
- 「生成!」のプッシュ ボタン押すと光ピンセットに切り替えます。
- 少なくとも 2 つの完全な円を完了し、解除キーを押す「生成する!」によって光学ピンセットを停止に閉じ込められたビーズを許可するボタン。
- 画像の取得を停止します。Tiff 映画と検流計電圧を持つテキスト ファイルがデフォルトで作成されているに注意してください"c:/TEMP/"フォルダー (しない限り、カスタムの場所を指定すると)。必要な場合は、関連付けられているデータ ファイルといくつかのキャリブレーション映画を作成できることに注意してください。
- 円が完了しない場合、ビーズは円軌道の中に失われます。多分、速度が高すぎます。OT ソフトウェアでサンプリング レートを減少させることによって減少します。または、レーザー全体の円軌道の間に目的の出ているかどうかは赤外線レーザーの赤色レーザー ポインターを使用してチェックします。されていない場合は、対物レンズの後焦点面で、ガルバノ メーター ミラーを共役しない可能性があります。2.5 の手順から再度配置手順を開始、目標の後焦点面に関連して検流計の位置を修正します。
- 振幅をゼロに設定し、修正位置にビーズをトラップにレーザーを切り替えます。トラップの設置場所に目印を置きます。
-
画像解析と位置の補間
- Matlab を開き校正フォルダーに移動 (Matlab コード ファイルで提供)"position2tension"のスクリプトを実行します。このスクリプトは、ガルバノ光学トラップの位置に電圧を変換の補間関数を計算します。
- 校正映画の数が使用されますを選択します。いくつかの映画は、2 つの垂直な楕円などの異なる軌道を選択できます。一般的に、円軌道を持つ単一校正映画は十分です。
- 最初と最後の画像を提供するダイアログ ボックス (映画あたり 1 つダイアログ ボックス)、明確な軌道と良好な信号対雑音比のシーケンス番号します。
- 各映画の買収時に電圧を含むテキスト ファイルのパスを提供します。スクリプト ファイルを読み込み、各イメージの 2 つの検流計の平均電圧を計算することに注意してください。
- 対応する校正映画のパスを提供します。
注: スクリプトは、MTT26から抽出された関数とカスタム関数を使用して、ビードに 2D ガウス関数をフィッティングしてサブピクセルの解像度とフレームごとにビーズを検出します。ビーズの軌道を示すグラフが表示されます。 - それをクリックして任意の悪い検出されたポイント (飛び地) を排除します。
- チェック x の補間をマップする場合、y レーザー位置計算され、スクリプトによって表示が完了。不足している値 (マップ内の白い領域) のたくさんある場合より良い信号対雑音比、新しい校正映画と操作を繰り返しますまたは/と、検流計の速度。
注: これらのイメージと補間値自動的に名前 convertFct.mat と、画像と同じフォルダーに保存されます。
5. 取付ショウジョウバエ胚27
- 25 ° C で培養、ケージからショウジョウバエの胚を収集します。
- ふるい板内容を渡す、酵母を削除 (気孔のサイズは約 100 μ m をする必要があります)。
- 45 のため 100% の漂白剤 (2.6% ナトリウム次亜塩素酸) を持つ胚を洗う s 絨毛膜を削除します。
- 2 分間水で胚を洗います。
- ブラシで寒天パッドに胚を置きます。
- 目的のステージによると約 10 胚を選択し、パイクや湿ったブラシで胚を揃えます。
注: 興味関心領域検出目的に可能な限り近い) の地域に合わせて配置を行う必要があります。 - 1 mm3x 20 x 10 のスライド ガラスの部分をカット、ダイヤモンド マーキング ペンを使用します。
- カット部分の片側に接着剤を追加し、20 で乾燥させる s。
- カット部分を裏返しにし、スライドの端にそれを固執する胚の線の上に置きます。
- サンプル ホルダーにこの準備をインストールし、キュヴェットに配置します。図 4観測コンテキストでキュヴェットのビューを提供します。
- 圧電ステージにキュヴェットを置きます。
6. In Vivo実験トラップ
-
細胞の接触のトラップ-振動 (図 5)
- 組織内の関心のある場所を見つけます。
注: カドヘリンが分類されるハエを使用して有用な 1 つはアドヘレンスジャンクションの平面で動作する必要がある場合できます。 - トラップの位置 (ランドマーク セット ステップ 4.1.14 で) ターゲット ジャンクションの中点の移動ピエゾ ステージを使用しています。
- 接触線に垂直な振動を達成するためにトラップを設定します。ゼロとしてフェーズを設定します。設定振幅 X と Y 方向接触線に垂直移動を持っています。振幅は通常 0.1 V をする必要があります。
- (10 fps などの高速フレーム レート) に取得を開始します。
- 「生成!」のプッシュ ボタン押すと光ピンセットに切り替えます。
- 完了したら、ピンセットや停止画像の取得をオフします。映画と集録時に検流計電圧を含むテキスト ファイルが指定のフォルダーに表示されます。
- 細胞の接触のトラップ-プル リリース (図 6)
- 組織内の関心のある場所を見つけます。
- 中点は、通常トラップ位置 (ランドマーク セット ステップ 4.1.14 で) から 1 μ m ピエゾ ステージを使用してターゲット ジャンクションを移動します。
- 振幅を安定したトラップを持っている 0 に設定します。
- (10 fps などの高速フレーム レート) と画像の取得を開始します。
- 「生成!」のプッシュ ボタン押すと光ピンセットに切り替えます。
- 希望の時間後トラップをオフに切り替えるし、リラクゼーションが発生するを待ちます。
- 画像の取得を停止します。映画と集録時に検流計電圧を含むテキスト ファイルが指定のフォルダーに表示されます。
- 組織内の関心のある場所を見つけます。
-
半自動 kymograph 世代とインターフェイス位置検出。
- 校正手順 (4 b) の中に生成された補間マップをロード Matlab のコマンド ウィンドウで: load('convertFct.mat')。これは fx と年度の変数を提供します。
- Matlab のコマンド ウィンドウで Matlab コード ファイルで提供される、autokymo(fx,fy) を実行します。この関数の目的は、レーザーの軌道に沿って kymograph を生成し、各フレームのサブピクセルの解像度を持つ連絡先の行の位置を検出します。
- 電圧値を含むメッセージが表示されたらテキスト ファイルのパスを選択します。
- 分析する映画の最初と最後のフレーム番号を選択します。
- Tiff 形式のムービーファイルを選択します。2 つの新しい図が表示されます: 最初の 1 つは、kymograph のイメージ。2 つ目は、画像の番号と接触のラインとレーザーの位置の検出のグラフです。
注意: 関数は、サンプルの位置とイメージの数 (matlab の図, jpg)、kymograph (tiff イメージ)、kymograph とレーザーの位置とレーザーの位置 (tiff イメージ) を表すグラフを保存します。安定したトラップ実験のため、kymograph は例えば ImageJ を使用して手動で行われます。Kymograph から、インターフェイスの検出することができるし、同じアルゴリズムを使用します。
7. 機械計測
-
剛性と張力の測定
- 振動実験 (ステップ 6.1) と時間経過映画の対応する解析 (ステップ 6.3) を実行します。
- インターフェイス位置をプロット
トラップの位置の関数として
Matlab プロット関数または任意のデータのグラフ作成ソフトを使用しています。
注: これは線形近似する必要があります。 - 線形フィット、Matlab"ezfit"無料ツールボックスまたは適合を許可する任意のソフトウェアを使用してを実行します。フィットの傾きの逆数が平均比を提供します
。 - これで与えられると仮定すると小さい変形と二次トラップの潜在的なインターフェイスの明白な曲げ剛性の推定を実行
。
トラップ剛性は (トラップ剛性校正手順 8 を参照してください)。 - 23として定義することができる張力の推定を実行します。
.
-
レオロジー測定
- プル リリース実験 (ステップ 6.2) と対応する解析 (ステップ 6.3) を実行します。
- カスタムのレオロジー モデルの結果のカーブに合います。
トラップの位置の関数として
Matlab プロット関数または任意のデータのグラフ作成ソフトを使用しています。
。
。
トラップ剛性は (トラップ剛性校正手順 8 を参照してください)。
.8. トラップ剛性の校正
注: 絶対的な力の定量には、インターフェイスのトラップ剛性の知識が必要です。これは、2 段階の手続きを経てビーズを使用してアクセスできます。
-
細胞質の粘度の測定方法
- ハロカーボン油で胚を置き、蛍光のポリスチレン ビーズ (1:1, 000 の株式の希薄化, 0.46 μ m 径)23,27マイクロインジェクション セットアップを使用してそれらを注入します。
- 顕微鏡下で注入された胚を配置します。
- 細胞質は、単一のビーズの動きを追跡します。ビーズ (多数の軌跡 > 100 ビーズの使用) の平均二乗変位を抽出します。平均二乗変位の斜面からビーズの拡散係数を決定します。ストークス ・ アインシュタイン方程式による拡散定数を粘性に関連、細胞質の効果的な粘度を推測します。初期胚で約 3.5 Pa.s の粘度は報告された23です。
-
ビーズのトラップ剛性の定量
- 光学ピンセットで細胞質に 1 つのビーズをトラップします。
- 0.5 μ m で区切られた 2 つのトラップの位置の間の段階的な方法でビーズを移動します。
- 抗力係数と他に 1 つのトラップの位置からビーズ緩和時間の比率としてビーズ、トラップ剛性を決定します。
注: 抗力係数は、
、 
(8.1) で決定した粘度と
ビーズ半径。緩和時間は、Matlab または適合を許可する任意のソフトウェアを使用して、ビーズの位置の指数フィットから取得されます。トラップ剛性の典型的な値は 200 mW レーザー励起で 120 ± 50 pN.µm-1 です。
-
セル インターフェイスのトラップ剛性の定量
- 接触線のレーザーの焦点し、(手順 6 で詳述) としてそれをかわします。変位振幅を測定します。これは代表的な平均値を取得するいくつかの接触線を繰り返す必要があります。
- 接触線に対してプッシュ ビーズによって誘導と作り出された変形を比較します。変形はトラップ剛性に反比例するため、細胞の接触のトラップ剛性を推測します。
注: 細胞の接触のトラップ剛性通常発見された 2 〜 3 倍より小さいビーズ (0.46 μ m 径) に。
、 
(8.1) で決定した粘度と
ビーズ半径。緩和時間は、Matlab または適合を許可する任意のソフトウェアを使用して、ビーズの位置の指数フィットから取得されます。トラップ剛性の典型的な値は 200 mW レーザー励起で 120 ± 50 pN.µm-1 です。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 5は、トラップに正弦波の動きを課すことによって得られた実験データを示しています。トラップには、3 連続インターフェイス位置 (図 5 a)23を表示 3 のスナップショットが例示として、インタ フェースのたわみが生成されます。録画したムービーは kymograph (図 5 b) の生成に使用され、さらに分析され、サブピクセルの解像度, ガウス分布を使用してインターフェイスの位置がフレームごとに x 方向に合わせて決定します。小さい変形の政権でトラップとインターフェイスの位置に比例している (図 5)。トラップ (図 5) の相対的なインタ フェースのたわみの振幅は、界面張力や剛性にアクセス (手順 7.1 を参照)。
図 6が示すプルを実行することによって得られた実験データは、実験を解放します。光のトラップは、トラップの位置 (図 6 a)24へそらすためにインターフェイスを引き起こす 2 つのセル間のインタ フェースの中心から約 1 μ m になっています。トラップは、希望時間後オフになります。Kymographs (図 6) からインターフェイス (図 6B) の位置の xm が得られ、各フレームの x 方向に沿ってフィット ガウスを使用しています。結果のグラフは、仮説のレオロジー モデル、例えば、Maxwell モデル (図 6) と比較できます。
図 1: 光ピンセット (赤のパス) セットアップの模式図は、光シート顕微鏡と組み合わせる。この図は、Bambardekar、k.らから変更されています。23。照明ユニットと検出ユニットで構成される、光シート顕微鏡の説明以前25。スキームの赤の部分に対応する光学ピンセット: 赤外線レーザーを通過光シャッター、2 オシログラフのサンプル内のトラップの位置を制御します。1-fold の望遠鏡は、それらの間の接合を保つために 2 の検流計間置かれます。望遠鏡によるビームのサイズが 2.5 倍増加し、潜望鏡は顕微鏡の高さにそれをもたらします。赤外線レーザーは、ダイクロイック ミラーのおかげで顕微鏡の検出目的を入力します。光学素子の間の重要な間隔は、図に直接与えられています。最後のレンズの間の距離 (焦点距離 500 mm) 目的の背面の開口部は、500 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: ダイクロイック ミラーと熱いミラーを保持している自家製の変更されたレール。顕微鏡のダイクロイック ミラーのレールは、赤外線レーザーの入り口を許可するように左側にカットされています。ダイクロイック ミラーは、赤外光を反射し、可視光 (蛍光) を送信します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: NI カードに楽器の接続。AO: アナログ出力、AI: アナログ入力、AO0 と AI0 galvo1 に接続、AO1 と AI1 が galvo2 に接続されている、PFI0 AI2 カメラの火に接続されていると PFI1 がシャッターのトリガーに接続されて、AI3 がシャッターのトリガーに接続されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 観察における試料ホルダー 。この図は、Chardès、Cらから変更されています。25. 胚はガラス基板上に固定されました。スライドは、サンプル ホルダーが開催されます。サンプル ホルダーは、保有する圧電ステージに固定ホルダー ガラスキュベットに挿入されます。光のシートは水平で、側から胚を照らします。検出の対物レンズは上記のサンプルでは、垂直な面とキュヴェットにディップします。
図 5: トラップの正弦波の動きによって課された偏向をインタ フェースします。この図は、Bambardekar、k.ら23から変更されています。(A) トラップの移動インターフェイスに正弦波垂直。トラップとインターフェイスの位置は、xt と xm 社は、それぞれ。右側のパネルは表示位置が異なるインターフェイスの 3 つの画像です。レーザー トラップの位置は、黄色の矢印で示されます。インターフェイスは、膜マーカー (GAP43::mcherry) でラベル付けされます。(インターフェイスに垂直) トラップの動きの方向によって定義される軸に沿った (B) Kymograph (期間 = 5 s)。(C) トラップ (赤実線) とインターフェイスの位置 (黒実線) の両方を示す時間対のたわみの代表的なプロット。(D) インターフェイスの数サイクル レーザー発振の中にトラップの位置の関数として位置 (振幅 0.5 μ m を =、期間 = 2 s)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: プル リリース実験の偏向をインタ フェースします。この図は、セルジュ、Aらから変更されています。24します。 (A) トラップはインターフェイスの中間点からの距離で点灯し、再度オフに切り替えます。(B) トラップとインターフェイスの位置は、xt と xm 社は、それぞれ。接触線の中点に垂直な x 方向に沿って kymographs が生成されます。(C) Kymograph プル リリース実験。携帯の連絡先は、Utrophin::GFP とラベル付けされます。(D) トラップ (赤/緑の点線) とインターフェイス位置 (黒実線) の両方を示す時間対のたわみの代表的なプロット。赤い実線は、マックスウェルのようなレオロジー モデル24を用いて適合を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
附則ムービー 1:実験を tweezing します。ピクセル サイズ = 194 nm, 10 fps, トラップ発振周期 = 2 s、表示: Gap43::mCherry。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
光ピンセットは、非侵襲的な方法で発展途上の胚上皮に直接絶対機械計測を実行する許可します。その意味で、それは、侵襲的と磁気力と、注射を必要とする、相対的な測定を提供するまたは強い仮定に依存する推論の力、また相対提供、レーザーアブレーションなど他の方法上の利点を提示します。測定。
プロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれています。まず、対物レンズは、色収差とレーザー トラップが「下流」オブジェクトをプッシュ表示可能性があります、重要な IR レーザー トラップ画像平面のビーズのことを確認して (ステップ 2.18) で最終的に正しいです。第二に、メソッドは、細胞の接触の位置の測定に依存しています。つまり、コントラストの高い蛍光マーカーを使用することが重要。
対物レンズとレーザ光の品質は、有効なトラップに重要です。対物レンズの開口数は 1.0 を超える必要があります。トラップは効果がない場合は、レーザー光が対物レンズの背面の開口部を埋めることを確認します。
本手法は、いくつかの制限が付属します。まず、わかりにくいものはまさに光学トラップのサポートを提供します。屈折率の不一致を検出すると、その起源はまだ未定します。第二に、校正プロセス 1 つの絶対測定に興味がある場合できますは少し退屈なパッシブ マイクロレオロジー簡易実験とビーズのトラップ剛性の校正が必要です。細胞の接触の剛性の校正実験的不確実性の対象となることを認識することが重要です: それは、細胞質だけではなく細胞の接触のない近くに測定ことができるビーズのトラップ剛性の測定に依存しています。第三に、わかりにくい汎用性の高い光学ピンセットがすることができますどのように。ショウジョウバエ胚細胞を変形することができるが、他の組織が高い張力または (など、キューティクルを通過) より困難なアクセスを提示、したがって光 tweezing に少ないしづらいこと。
光学力が小さい (< pN の少数の 10) こうして十分なまたは非常に緊張した硬い構造を変形するかもしれないし、。大きな粒子の磁気ピンセットでしょうより効果的なこの場合。
我々 はここで光シート顕微鏡光学ピンセットのカップリングは光ピンセットの結合、落射蛍光共焦点回転ディスク顕微鏡などの顕微鏡の他のタイプになります。顕微鏡への IR トラップ レーザーの導入は、顕微鏡の構成によって異なります。主に、イメージング ・光操作のパスを結合するダイクロイック ミラーを追加する可能性が必要です。ほとんどの顕微鏡企業は、この組み合わせをできる 2 層モジュールのモジュール式照明システムを提案します。
改善や技術をアップグレードするいくつかの方向が存在します。いくつかの位置の間でレーザーの滞留時間を分割する可能性は、以上を使用する詳細ホログラフィー技術をいくつかのトラップを生成するか。これは標的細胞に細胞の接触力のより複雑なパターンを作成できます。別の改善は、たわみとトラップの位置との間のリアルタイムのフィードバックを設計することです。これにより適切なクリープ実験適用力は実験を通じて一定維持されます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、FRM エキップ グラント FRM DEQ20130326509、アジャンス ナシオナル デ ラ凝った ANR ブラン グラント Morfor ANR-11-BSV5-0008 (に p. f. l.) によって支えられました。我々 は、フランス国立研究機関 (ANR-10-INBS-04-01, «将来の投資») でサポートされているフランス バイオ イメージング インフラストラクチャを認めます。テクニカル サポート PICSL FBI インフラストラクチャからブライス Detailleur とクロード ・ モレッティに感謝します
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30 mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200 mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500 mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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