Developmental Biology

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/57900

Claire Chardès*¹, Raphael Clement*¹, Olivier Blanc¹, Pierre-François Lenne¹

¹CNRS, Institut de Biologie du Développement de Marseille, Aix-Marseille Université

* These authors contributed equally

Summary

Presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, en de uitvoering daarvan om te sonderen cel mechanica zonder kralen in de Drosophila embryo.

Abstract

Morfogenese vereist coördinatie tussen genetische patronen en mechanische krachten krachtig vorm van de cellen en weefsels. Vandaar, is een uitdaging voor een beter begrip morfogenetische direct cellulaire krachten en de te meten mechanische eigenschappen in vivo tijdens de embryogenese. Hier presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, waarmee direct toepassen krachten op cel contacten van het vroege embryo van de Drosophila , terwijl beeldvorming bij een snelheid van verschillende frames per seconde. Deze techniek heeft het voordeel dat het niet nodig de injectie van parels in het embryo, meestal gebruikt als tussenliggende sondes waarop optische krachten worden uitgeoefend. We stap voor stap de uitvoering van de installatie in detail te beschrijven, en voorstellen voor methoden om mechanische informatie extract van de experimenten. Door het toezicht op de verplaatsingen van cel-cel contactpersonen in real time, kan een spanning metingen uitvoeren en cel contacten reologie onderzoeken.

Introduction

Embryonale ontwikkeling is een zeer reproduceerbaar proces waarin de cellen en weefsels vervormen om het toekomstige dier vorm te geven. Dergelijke vervormingen hebben aangetoond dat vereist de actieve generatie van krachten op de cel niveau¹^,². Om te begrijpen morfogenetische processen waarin cellen en weefsels hun vorm wijzigen, is daarom sleutel tot het beoordelen van de mechanische eigenschappen van de cellen die betrokken zijn, en voor het meten van de krachten binnen het weefsel tijdens het proces³^,⁴ . Epitheelweefsel lagen, met name in Drosophila, hebben grote schaal onderzocht als gevolg van hun quasi-2D-geometrie en hun gemakkelijke manipulatie.

Een aantal technieken hebben dus ontwikkeld door ons en anderen om te beoordelen epitheliale mechanica in vivo tijdens de ontwikkeling. Zullen wij een snel overzicht van de drie belangrijkste technieken gebruikt in epitheliale weefsels. Laser ablatie, een veel gebruikte methode, maakt het mogelijk om het onthullen van de lokale mechanische stress op cel kruispunten⁵^,⁶^,⁷^,⁸ of op grotere schaal⁹^,¹⁰^,¹¹door het uitvoeren van lokale bezuinigingen die de mechanische integriteit van het doel verstoren. De dynamiek van de opening na de cut vindt u informatie over de voorafgaande ablatie van stress, zowel de reologie van het weefsel¹²^,¹³. Een nadeel van laser ablatie is dat het invasieve, daar het vereist dat de lokale verstoring van de cortex van de cel. Vandaar, kan een alleen een beperkt aantal ablations uitvoeren, als men wil weefsel integriteit behouden blijft. Een ander nadeel is dat ablations alleen schattingen op te relatieve van spanning op de contacten van de cel, leveren omdat de opening snelheid is afhankelijk van viskeuze wrijving, dat over het algemeen niet bekend is. Magnetische manipulatie heeft ook ontwikkeld en gebruikt in Drosophila, waarbij het gebruik van ferrofluids¹⁴ of¹⁵van de ultramagnetic liposomen. Ze bieden absolute metingen¹⁶^,¹⁷, maar zijn ook invasief in de zin dat zij de injectie van sondes op de gewenste locatie vereisen. Dit kan erg lastig zijn afhankelijk van het systeem, dat niet altijd vatbaar voor precieze injecties is. Een derde techniek, volledig niet-invasieve, is kracht gevolgtrekking¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Kracht gevolgtrekking is gebaseerd op de veronderstelling van mechanisch evenwicht op driedubbele punten (tricellular verbindingen, of hoekpunten) en kunt afleiden spanningen helemaal cel contacten (en eventueel druk in alle cellen) door een omgekeerde probleem op te lossen. Voor spanningen biedt elke vertex twee vergelijkingen (X en Y). Dit levert een grote stelsel van lineaire vergelijkingen, die onder bepaalde omstandigheden te beoordelen van spanning op alle contacten van de cel kan worden omgekeerd. Terwijl deze methode zeer aantrekkelijk, is omdat het vereist alleen een gesegmenteerde afbeelding en geen extra experiment of setup, de juistheid ervan is nog te bepalen, en opnieuw het levert alleen relatieve waarden, tenzij een absolute kalibratie-meting is uitgevoerd.

Om sommige van deze beperkingen te overwinnen, voeren we in dit artikel een opstelling van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop toe te passen gecontroleerde krachten op de schaal van de cel in de embryonale epitheel van Drosophila melanogaster. Optisch pincet zijn gebruikt voor tal van biologische toepassingen met inbegrip van de metingen op één eiwitten en manipulatie van organellen en cellen²¹. Hier, rapporteren we toegepaste krachten in de range van een paar dozijn pN, die klein is nog voldoende induceren van lokale deformaties van mobiele contacten en mechanische metingen in vivouitvoeren. Wij gebruiken meestal loodrecht doorbuiging van cel contacten, gevolgd door de analyse van kymographs, kracht op vervorming. Nog belangrijker is, vereist onze opstelling geen injectie van kralen op de gewenste locatie in het weefsel, aangezien optisch pincet kunnen direct oefenen krachten op cel contacten. De koppeling van de optisch pincet om een lichte blad Microscoop kan men voor het uitvoeren van snelle beeldvorming (aantal frames per seconde), die zeer merkbaar voor een mechanische analyse op korte tijd schalen, en met beperkte fototoxiciteit, sinds de verlichting van is de monster is beperkt tot het vlak van imaging²².

Algemene, optisch pincet zijn een niet-invasieve manier toe te passen gecontroleerde krachten op cel contacten in vivo in de Drosophila embryo, en mechanische gegevens zoals stijfheid en spanning op cel contacten²³, Rheologische eigenschappen^{extraheren 24}, en verloop- of anisotropie van spanning²³.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. instellen van het lichte blad Microscoop

Verwijzen naar de omschrijving van de instellingen in eerdere publicatie²⁵.
Opmerking: De installatie bestaat uit een rechtop Microscoop stadium en een lichte blad module produceren een lichte vel in het horizontale vlak. Een 10 X excitatie objectief regisseert het lichte blad in een cuvet van glas (Figuur 4). De detectie-objectief heeft een hoge nb (1.1), die noodzakelijk is voor de efficiënte pincet (zie hieronder).

2. instellen van het pad optisch pincet

Opmerking: Figuur 1 geeft een algemene regeling van de optische setup.

Plaats de 1070 nm laser-unit en herstellen van de vezel op optische tafel met een V-clamp koppeling. Zorg ervoor dat de vezels collimator parallel aan de optische tabel (vandaar, horizontale) en dat de hoogte hier geselecteerd zal de hoogte van alle optische componenten uitgelijnd op de optische tafel.
Opmerking: 100 mm kan worden een goede keuze voor deze hoogte.
Draai de sleutel van de infrarood laser-unit en druk op de "Select" knop om te schakelen op de uitlijning aanwijzer. Het licht moet worden horizontale uitgaande van de vezel.
Plaats de sluiter in de optische weglengte en repareren aan de optische tabel, zodat de infrarood laserstraal de opening van de sluiter passeert. Zorgen ervoor dat de afstand tussen de optische tafel en het centrum van de opening van de sluiter is de hoogte gekozen in de stap 2.1.
Draai de sleutel van de sluiter controller, selecteer het handmatige modus met de pijlen en druk op de knop "Enable" te openen van de sluiter.
Plaatsen, uitlijnen en monteren van de eerste galvanometer spiegel.
Opmerking: De twee galvanometer spiegels moeten worden geconjugeerd met het terug diafragma van de detectie-doelstelling, zodat wanneer één van de mirrors is draaien, de laserstraal niet uit de rug diafragma van de doelstelling gaat. Opmerking dat de afstand tussen de eerste galvanometer en het terug diafragma van de doelstelling moet worden berekend om te evalueren van de positie van deze galvanometer ten opzichte van het doel (f1 + f1 + f2 + f2 + f3 + f3 + f4 + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = 1550 mm; fi = brandpuntsafstand van de lens n ° ik).
Schakel de voeding van de galvanometer. Zorg ervoor dat er voor de rest van het protocol van de uitlijning de galvanometers worden aangedreven.
De galvanometers ingesteld op nul vervorming (zie stap 3 voor galvanometer verbindingen met NIMAX of optische pincetten software -).
Plaatsen, uitlijnen en monteren van de relay-telescoop samengesteld uit de twee objectieven met een brandpuntsafstand van 30 mm.
Plaatsen, uitlijnen en monteren van de tweede galvanometer mirror. Merk op dat de afstand tussen de twee galvanometers 4f = 4 x 30 mm = 120 mm (f = brandpuntsafstand).
Plaatsen en monteren van de telescoop.
Opmerking: De telescoop is samengesteld uit twee lenzen die de bundel uit te tot een breedte van ten minste gelijk is aan de diameter van de achterste opening van het objectief breiden. De lens met de kleinste brandpuntsafstand moet voorop staan.
Plaatsen, uitlijnen en monteren van de periscoop die de optische weglengte van dichter naar de ingang van de spoorstaaf dichroïde spiegel omhoog te brengen.
De hete spiegel vast in de rail, plaatst u het spoor in de Microscoop. Ervoor zorgen dat het spoor is gezaagd aan de rechterkant om de ingang van de infrarood laser (Figuur 2).
Controleer dat het laserlicht uit de Microscoop, eerst zonder het doel dan met als doel gaat. De positie van de laser voor het doel met de spiegel van de onderkant van de periscoop corrigeren. De positie van de laser te corrigeren na het doel met de bovenste spiegel van de periscoop.
Zet 1 µL van 500 nm fluorescerende parels in de glas-cuvette en voeg 10 mL gedestilleerd water. Zet de cuvette onder de doelstelling in de meetcel houder en de focus van het doel (Z-positie) zodanig aanpassen dat de doelstelling het wateroppervlak raakt.
Start de zelfgemaakte software van overname beheersen de AOTF, de camera en de piëzo-elektrische fase. Een gratis software zoals micromanager kan ook worden gebruikt. De levende acquisitie-modus inschakelen door op de "Live" drukknop.
Aanpassen van de kracht van de laser IR 1 W.
Zet op de bril (en verwijder het niet vóór het einde van het experiment) en zet de laser. Een kraal moet worden gevangen in de laser focus.
1. Als geen kraal is gevangen in de laser focus, controleren als de rode laserpointer (dat is collineair met de IR-laser) uit het doel komt. Zo niet, start opnieuw de uitlijning stappen, met name stap 2.13. Of de IR laser macht vergroten.
2. Als de parel is gevangen onscherp (van de beeldvorming vlak), zachtjes verplaatst u de positie van de laatste lens van de laatste telescoop (L4 in Figuur 1) langs de optische as om de parel in de focus met de beeldvorming vliegtuig. Als dat niet genoeg is, zet de eerste lens van de laatste telescoop (L3 in Figuur 1) langs de optische as.
3. Als gevangen kraal is niet gecentreerd in de afbeelding, gebruikt u de 2 periscoop spiegels aan de positie van de overvulling aanpassen. Als de positie van de parel is gewijzigd door het veranderen van de hoek van de eerste spiegel, ook de richting van de lichtbundel te compenseren door het veranderen van de overeenkomstige hoek van de tweede mirror. Corrigeer de X-positie alleen (1 schroef voor elke spiegel verstrekken) en vervolgens de Y-positie (1 schroef voor elke spiegel verstrekken) corrigeren.
Pas indien nodig de positie van de lens 2^nd telescoop te observeren van de parel in focus.
Pas indien nodig de hoek van de periscoop spiegels te hebben van de parel in de afbeelding wordt gecentreerd.

3. interfacing het Instrument

Let op: Afbeelding 3 geeft een algemene regeling van de nationale instrumenten (NI) kaart verbindingen.

Plaats de uitvoer kaart (NI-9263) in de eerste groef van het chassis (cDAQ-9178). Merk op dat de andere modellen van NI kaarten met ten minste 2 analoge uitgangen en 3 analoge ingangen kunnen worden gebruikt.
Plaats de input (NI-9215)-kaart in de tweede sleuf van het chassis.
De eerste galvanometer sluit aan op de analoge uitgang van de AO0 en de analoge input AI0 met BNC kabels. Merk op dat een T-adapter 2 BNC Kabels verbinden met een gebruikt kan worden. Raadpleeg de handleiding van de galvanometer te lokaliseren de pinnen op het bord van de bestuurder galvanometer.
Op dezelfde manier, verbinden met de tweede galvanometer AO1 en AI1.
Sluit PFI1 aan de trigger van de sluiter (achterkant van de controller).
Sluit PFI0 aan het vuur van de camera en op AI2.
AI3 verbinden met de trigger uit de sluiter (achterkant van de controller).
Pas de instellingen van de controller van de sluiter. Gebruik de pijlen op de "Select" knop te valideren van de keuze en doorgeven aan de volgende parameter te wijzigen van de parameterwaarden worden doorgegeven. Breng de 000.000 parameter "tijd open sec", "tijd gesloten sec" te 000.000, "modus" SINGLE, en "trigger" op EXT. toestaan de controle van de sluiter door de "Enable" knop te drukken.
Open QtCreator (gedownload van https://www.qt.io/, gratis versie).
Opmerking: QtCreator is de Integrated Development Environment gebruikt in C++ het optisch pincet om software te ontwikkelen. Qt bibliotheek wordt hier gebruikt voor het maken van widgets.
Open het bestand van de OT.pro (waarin de Qt-bestanden). Deze actie wordt het project geopend. Verandering van de naam van de input en output in het bestand AOGenerator.cpp volgens de kaart(en) NI gebruikt.
Compileren en uitvoeren van de OT-software.

4. kalibratie van de positie van de optische Trap met kralen

Opname van een kalibratie-film
1. Zet 1 µL van 500 nm rood fluorescerende parels in de glas-cuvette, vul dan de Cuvet met 10 mL gedestilleerd water. Figuur 4 geeft een beeld van de cuvette in het kader van de observatie.
2. Fix de cuvette op de piëzo-elektrische fase.
3. De Z-positie van de Cuvet zodanig aanpassen dat de doelstelling van de detectie dips in het water.
4. De infrarood laser inschakelen en stel de macht om 1 W.
5. Zet de afbeelding acquisitie software.
6. Selecteer de belichtingstijd, de winst, de tijd tussen twee afbeeldingen, het aantal afbeeldingen te verwerven en de kracht van de laser om te krijgen tijd lapse beelden. Merk op dat de verlichting voor de kalibratie van de optische pincetten met kralen, laser (561 nm) is niet vereist. Het effect van de 2-foton geïnduceerd door de infrarood laser is genoeg om het prikkelen van de fluorescentie van een gevangen kraal.
7. Start de zelfgemaakte software van optisch pincet.
8. Stel de optisch pincet parameters te traceren van een cirkel. Stel SamplingRate zoals 250 samp/s, het schrijven als 1000, Waveform1 parameters (galvo 1) Sinusoidal, nbPeriod 1, amplitude 0,5 V, fase 0,0 rad, 0.0 V, golfvorm 2 parameters (galvo 2) als Sinusoidal, nbPeriod 1, 0,5 V amplitude, fase 1.57 rad, Offset 0.0 V offset.
9. Selectievakje de "AI Parameters" en de "wachten"... vak.
10. Start de Beeldacquisitie (500 of 1000 beelden met een hoge framesnelheid, zoals 10 fps).
11. De optisch pincet inschakelen door te drukken op de knop "Genereren!".
12. Toestaan dat de gevangen parel te voltooien ten minste twee volledige cirkels en stop de optisch pincet door VN-dringende de "genereren!" knop.
13. Stop de Beeldacquisitie. Merk op dat een TIFF-film en een tekstbestand met galvanometer spanningen zijn gemaakt in de standaard "C:/TEMP /" map (tenzij een aangepaste locatie is opgegeven). Merk op dat er verschillende kalibratie films met bijbehorende gegevensbestanden kunnen worden gemaakt indien nodig.
  1. De cirkel is niet compleet, gaat de kraal verloren als tijdens het traject van de cirkel. Misschien is de snelheid te hoog. Verlagen door het verlagen van de samplefrequentie in de OT-software. Of, Controleer met de rode laserpointer van de infrarood laser als de laser uit de doelstelling tijdens het traject van de hele cirkel komt. Als dat niet het geval is, de spiegels van de galvanometer niet kunnen worden vervoegd met het terug brandvlak van het objectief. Corrigeren van de posities van de galvanometers met betrekking tot het terug brandvlak van de doelstelling, de uitlijning stappen opnieuw te beginnen vanaf stap 2.5.
14. De amplitudes ingesteld op nul en de laser te vangen een kraal op de positie van een correctie inschakelen. Plaats een mijlpaal op de locatie van de trap.
Positie interpolatie met beeldanalyse
1. Matlab openen, ga naar de kalibratie-map en voer het script van de "position2tension" (in de Matlab-codebestanden aangeleverd). Dit script berekent de functie van de interpolatie vertalen galvanometer spanningen naar optische val positie.
2. Kies dat het aantal kalibratie films zal worden gebruikt. Verschillende films kunnen worden geselecteerd met verschillende trajecten, zoals twee loodrecht ellipsen. In het algemeen, een interne kalibratie-film met een cirkelvormige baan is genoeg.
3. Bieden van de eerste en de laatste afbeelding in het dialoogvenster dialoogvenster (één per film), genummerd van sequenties met een duidelijk traject en goede signaal / ruisverhouding.
4. Geef het pad voor het tekstbestand met de spanningen tijdens de overname voor elke film. Merk op dat het script wordt het bestand gelezen en de gemiddelde spanningen van de twee galvanometers voor elke afbeelding berekent.
5. Geef het pad van de overeenkomstige kalibratie-film.
  Opmerking: Het script detecteert de kraal voor elk frame met een subpixel resolutie door het aanbrengen van een 2D Gaussiaan naar de kraal, met behulp van aangepaste functies en functies MTT²⁶is onttrokken. Het toont een grafiek met het traject van de kraal.
6. Elimineren elk slecht gevonden punt (uitschieters) door erop te klikken.
7. Controleer of de interpolatie voor x kaart en y laser-posities berekend en weergegeven door het script is voltooid. Als er een heleboel ontbrekende waarden (witte gebieden in de kaart), herhaalt u de bewerking met een nieuwe kalibratie-film, met een betere signaal / ruisverhouding, of / en met een lagere snelheid van de galvanometers.
  Opmerking: Deze beelden en de interpolatie-waarden worden automatisch opgeslagen in dezelfde map als de afbeelding met de naam convertFct.mat.

5. montage Drosophila embryo's²⁷

Verzamelen van Drosophila embryo's uit een kooi, bij 25 ° c geïncubeerd.
Verwijderen van de gist, de inhoud van de plaat passeren door een zeef (poriegrootte moet ongeveer 100 µm).
Wassen van de embryo's met 100% bleekwater (2,6% natriumhypochloriet) voor 45 s te verwijderen het chorion.
Wassen van de embryo's met water gedurende 2 minuten.
De embryo's op een agar-pad met een borstel gezet.
Selecteer ongeveer 10 embryo's volgens het gewenste werkgebied en uitlijnen van de embryo's met een snoek of een vochtig penseel.
Opmerking: Uitlijning moet worden uitgevoerd volgens de regio van belang (regio van belang zo dicht mogelijk aan de doelstelling van de detectie).
Met een diamant-markering-pen, Knip een stukje van een glasplaatje van 10 x 20 x 1 mm-³.
Voeg lijm aan de ene kant van het gesneden stuk, en laat het drogen voor 20 s.
Draai de geslepen stuk om en plaatst het op de lijn van embryo's, te houden van het aan de rand van de dia.
Installeer deze voorbereiding, in de monsterhouder en plaatst u deze in de meetcel. Figuur 4 geeft een beeld van de Cuvet in kader van de observatie.
De cuvette zetten de piëzo-elektrische fase.

6. overvullen Experiment In Vivo

Overvulling van de cel contacten — oscillaties (Figuur 5)
1. Zoek de locatie van belang in het weefsel.
  Opmerking: Met behulp van vliegen in die worden aangeduid als cadherinen kunnen nuttig zijn als een nodig heeft om te werken in het vlak van adherens kruispunten.
2. Verplaatsen van de kruising van het doel middelpunt op de positie van de trap (landmark vastgesteldop stap 4.1.14) met behulp van de piëzo-fase.
3. Stel de parameters van de trap te bereiken van de oscillaties loodrecht op de rijdraad. Stel de fasen als nul. Instellen van de amplitudes in X en Y richtingen aan het hebben van een beweging loodrecht op de rijdraad. De amplitude moet meestal 0,1 V.
4. Start de verwerving (met een snelle framerate, zoals 10 fps).
5. Schakel de optisch pincet op de "Genereren!" knop te drukken.
6. Wanneer gedaan, zet de pincet en stop Beeldacquisitie. Een film en een tekstbestand met galvanometer spanningen tijdens de overname wordt nu weergegeven in de opgegeven map.
7. Overvulling van de cel contacten — pull-release (Figuur 6)
8. Zoek de locatie van belang in het weefsel.
9. Verplaats de doel-kruising met de piezo-fase, zodat haar middelpunt meestal 1 µm uit de buurt van de val positie (landmark vastgesteldop stap 4.1.14 is).
10. De amplitudes ingesteld op 0 om een gestage val.
11. Start de Beeldacquisitie (met een snelle framerate, zoals 10 fps).
12. Schakel de optisch pincet op de "Genereren!" knop te drukken.
13. Na de gewenste tijd, schakel de val en wachten voor ontspanning optreden.
14. Stop de Beeldacquisitie. Een film en een tekstbestand met galvanometer spanningen tijdens de overname wordt nu weergegeven in de opgegeven map.
Semi-automatische Kymograaf generatie en opsporing van de positie van de interface.
1. In het opdrachtvenster Matlab het laden van de kaart van de interpolatie gegenereerd tijdens de kalibratieprocedure (4b): load('convertFct.mat'). Dit biedt de fx en fy variabelen.
2. Uitvoeren in het opdrachtvenster Matlab autokymo(fx,fy), waarin de codebestanden Matlab. Het doel van deze functie is voor het genereren van een Kymograaf langs het traject van de laser en om op te sporen van de positie van de rijdraad met subpixel resolutie voor elk frame.
3. Selecteer het gevraagd tekst bestandspad met de spanningswaarden.
4. Selecteer de nummers van de eerste en laatste frame van de film worden geanalyseerd.
5. Selecteer het filmbestand tiff. Twee nieuwe cijfers getoond: de eerste is een afbeelding van de Kymograaf. De tweede is een grafiek van de opsporing van de contact lijn en laser posities, versus de beeldnummer.
  Opmerking: De functie slaat u op de grafiek vertegenwoordigt de positie van het monster en de positie van de laser versus de beeldnummer (matlab figuur, jpg), de Kymograaf (TIFF-afbeelding) en de Kymograaf met de positie van de laser (TIFF-afbeelding). Voor gestage val experimenten moet de Kymograaf worden handmatig gedaan, bijvoorbeeld met behulp van ImageJ. De detectie van de interface van de Kymograaf kan dan worden gedaan met behulp van hetzelfde algoritme.

7. mechanische metingen

Stijfheid en spanning metingen
1. Het uitvoeren van een experiment van de trilling (stap 6.1) en de bijbehorende analyse (stap 6.3) van de time lapse film.
2. Uitzetten van de positie van de interface als een functie van de positie van de val gebruik van Matlab perceel functie of gegevens uitzetten van software.
  Opmerking: Dit moet ongeveer lineair zijn.
3. Voer een lineaire passen, gebruik van Matlab "ezfit" vrije toolbox of software waardoor past. De inverse van de pasvorm van helling biedt de gemiddelde verhouding .
4. Uitvoeren van schattingen van de schijnbare buigstijfheid van de interface, die, uitgaande van kleine vervormingen en een kwadratisch potentiële voor overvulling, wordt gegeven door . is de stijfheid van de val (zie stap 8 voor val stijfheid kalibreren).
5. Raming van de spanning, die kan worden gedefinieerd als²³uit te voeren:
  .
Rheologische metingen
1. Pull release experimenten (stap 6.2) en de bijbehorende analyse (stap 6.3)
2. De resulterende kromme met de aangepaste Rheologische model die past.

8. kalibratie van de stijfheid van de Trap

Opmerking: De vaststelling van de absolute krachten vereist de kennis van de stijfheid van de val op interfaces. Dit kan worden betreden gebruikend kralen door middel van een procedure in twee fasen.

Bepaling van de viscositeit van het cytosol
1. Plaats van de embryo's in halonen olie en injecteren ze met behulp van een opstelling microinjection met fluorescerende polystyreen kralen (1:1 000 voorraad verdunning, 0.46 µm diameter)²³^,²⁷.
2. Plaats de ingespoten embryo's onder de Microscoop.
3. De verplaatsing van enkele parels gevonden in het cytosol volgen. Pak de mean square verplaatsing van kralen (gebruik een groot aantal trajecten > 100 kralen). Bepaal de kraal diffusie constante is uit de helling van de mean square verplaatsing. Betreffende de diffusie-constante viscositeit door de Stokes-Einstein-vergelijking, de effectieve viscositeit van het cytosol afleiden. In het vroege embryo is een viscositeit van ongeveer 3,5 Pa.s gerapporteerde²³.
Bepaling van Val stijfheid op kralen
1. Trap één kralen in het cytosol met optisch pincet.
2. De kraal op een stapsgewijze manier verplaatsen tussen twee val posities gescheiden door 0,5 µm
3. De stijfheid van de val op parels, als de verhouding tussen de sleep coëfficiënt en de tijd van de kraal-ontspanning in een val positie naar de andere te bepalen.
  Opmerking: De sleep coëfficiënt is , waarbij is de viscositeit bepaald in (8.1) en de straal van de kraal. De tijd van ontspanning wordt verkregen uit exponentiële vlagen van de kraal positie, met behulp van Matlab of software waardoor past. Typische waarden van de overvul stijfheid zijn 120 ±50 pN.µm^-1op 200 mW laser excitatie.
Bepaling van Val stijfheid op cel interface
1. De laser focus op een rijdraad, en het afbuigen (zoals beschreven in stap 6). Het meten van de amplitude van de vervorming. Dit moet worden herhaald op verschillende contact lijnen te verkrijgen van een representatieve gemiddelde.
2. Vergelijk de geproduceerde vervorming mee geïnduceerd door kralen duwde tegen contact lijnen. Aangezien de vervorming omgekeerd evenredig met de stijfheid van de val is, leid de stijfheid van de val op cel contacten.
  Opmerking: De stijfheid van de val op cel contacten meestal bleek 2 - tot 3-d keer kleiner dan die op parels (0.46 µm diameter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 5 toont experimentele gegevens die zijn verkregen door het opleggen van een sinusoïdale beweging aan de val. De val produceert een afbuiging van de interface is, zoals door de 3 momentopnamen tonen 3 opeenvolgende interface-posities (figuur 5A)²³. Opgenomen films worden gebruikt voor het genereren van een Kymograaf (figuur 5B) en zijn verder geanalyseerd om te bepalen de positie van de interface met subpixel resolutie, met behulp van een Gaussiaan passen langs de x-richting voor elk frame. In het regime van kleine vervormingen, de trap en interface posities zijn evenredig (figuur 5C). De amplitude van de uitwijking van de interface ten opzichte van dat van de val (figuur 5D) geeft toegang tot de interface spanning of stijfheid (zie stap 7.1).

Figuur 6 toont experimentele gegevens verkregen door het uitvoeren van pull vrijgeven experimenten. De optische val is ongeveer 1 µm afstand van het middelpunt van de interface tussen twee cellen, waardoor de interface afbuigen richting de val positie (figuur 6A)²⁴ingeschakeld. De trap wordt dan uitgeschakeld na de gewenste tijd. De xm van de positie van de interface (figuur 6B) wordt verkregen uit kymographs (Figuur 6 c), langs de x-richting voor elk frame opnieuw met Gaussiaans past. De resulterende grafiek kan worden vergeleken met de hypothetische Rheologische modellen, bijvoorbeeld een Maxwell model (figuur 6D).

Figuur 1: schematische voorstelling van de setup optisch pincet (rode pad) gecombineerd met de lichte blad Microscoop. Dit cijfer is gewijzigd van Bambardekar, K. et al. ²³. Het lichte blad Microscoop, gecomponeerd door de eenheid van de verlichting en de detectie-eenheid, wordt beschreven eerder²⁵. De optisch pincet correspondeert met het rode gedeelte van de regeling: de infrarood laser passeert een optische sluiter en 2 galvanometers die de positie van de val in de steekproef bepalen. Een 1-fold telescoop wordt tussen de 2 galvanometers te houden de vervoeging ertussen geplaatst. Vervolgens een telescoop neemt de grootte van de lichtbundel door 2.5-fold en de periscoop brengt het op de hoogte van de Microscoop. De infrarood laser komt de doelstelling van de detectie van de Microscoop dankzij een dichroïde spiegel. Belangrijke afstanden tussen optische elementen krijgen rechtstreeks in de afbeelding. Afstand tussen de laatste lens (focale lengte 500 mm) en het terug diafragma van de doelstelling is 500 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: zelfgemaakte gemodificeerde spoor houden de dichroïde spiegel en de hete spiegel. De rail dichroïde spiegel van de Microscoop heeft bezuinigd op de linkerzijde om de ingang van de infrarood laser. De dichroïde spiegel reflecteert het infrarood licht en stuurt het zichtbare licht (fluorescentie). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: aansluiting van de instrumenten aan de kaarten van de NI. AO: analoge uitgang, AI: analoge ingang, AO0 en AI0 zijn aangesloten op galvo1, AO1 en AI1 zijn aangesloten op galvo2, PFI0 is verbonden met het vuur van de camera, AI2 en PFI1 is verbonden met de trigger in de ontspanknop en AI3 is verbonden met de trigger uit de sluiter. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: monsterhouder in het kader van de observatie. Dit cijfer is gewijzigd van Chardès, C., et al.. ²⁵. de embryo's worden geïmmobiliseerd op de glazen dekglaasje aan. De dia wordt gehouden door de monsterhouder. De monsterhouder wordt ingevoegd in het glas cuvette, gehouden door de houder bevestigd aan de piëzo-elektrische fase. Het lichte blad horizontaal is en verlicht de embryo's van de zijkant. De detectie-objectief verticaal, boven het monster, en dips in de meetcel.

Figuur 5: Interface doorbuiging opgelegd door sinusvormige beweging van de overvulling. Dit cijfer is gewijzigd van Bambardekar, K. et al.²³. (A) de val wordt verplaatst sinusoidally loodrecht op de interface. De val en interface posities zijn xt en xm, respectievelijk. De juiste panelen tonen drie beelden van de interface op verschillende posities. De positie van de overvulling laser wordt gekenmerkt door een gele pijlpunt. Interface worden geëtiketteerd met een membraan marker (GAP43::mcherry). (B) Kymograaf langs de as bepaald door de richting van de trap beweging (loodrecht op de interface) (periode = 5 s). (C) vertegenwoordiger plot van de uitwijking ten opzichte van de tijd waarin zowel de val (rode vaste lijn) en de interface posities (zwarte ononderbroken lijn). (D) Interface positie als functie van de positie van de val tijdens paar cycli van laser trilling (Amplitude = 0,5 µm, periode = 2 s). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: Interface doorbuiging in pull-release experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Serge, A., et al.. ²⁴. (A) de val is ingeschakeld op een afstand van het middelpunt van de interface, dan weer uitgeschakeld. (B) de val en interface posities zijn xt en xm, respectievelijk. Kymographs worden gegenereerd langs de x-richting loodrecht op de rijdraad middelpunt. (C) Kymograaf van een pull-release-experiment. Cel contacten zijn voorzien van Utrophin::GFP. (D) vertegenwoordiger plot van de uitwijking ten opzichte van de tijd waarin zowel de val (de gestippelde lijnen van de rood/groen) en de interface positie (zwarte ononderbroken lijn). De stevige rode lijn toont een pasvorm verkregen met behulp van een Maxwell-achtige Rheologische model²⁴. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende film 1: Experiment pincet. Pixelgrootte = 194 nm, 10 fps, Trap-interstadiaal periode = 2 s, etikettering: Gap43::mCherry. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optisch pincet wil absolute mechanische metingen rechtstreeks in de ontwikkelingslanden embryonale epitheel uitvoeren op een niet-invasieve wijze. In die zin presenteert het voordelen ten opzichte van andere methoden zoals laser ablatie, die zijn invasief en verstrekken van relatieve metingen, magnetische krachten, waarvoor injecties, of dwingen gevolgtrekking, die gebaseerd op sterke veronderstellingen is en bieden ook relatieve metingen.

Het protocol bevat een paar kritische stappen. Eerst, zoals het objectief kan weergeven chromatische aberraties en dat de laser val het object duwt "downstream", het is belangrijk om te controleren dat de IR-laser de parel in de beeldvorming vlak overlapt, en uiteindelijk correct is voor het (stap 2.18). Ten tweede, de methode is gebaseerd op de metingen van de cel contacten positie. Het is dus cruciaal voor het gebruik van een hoog contrast fluorescerende marker.

De kwaliteit van het objectief en de laserstraal zijn cruciaal voor effectieve overlapping. De numerieke diafragma van de lens doelstelling mag meer dan 1.0. Als overvullen ineffectief is, zorg ervoor dat de laserstraal de achterste opening van het objectief vult.

Onze werkwijze wordt geleverd met verschillende beperkingen. Ten eerste, het is niet duidelijk wat precies biedt de ondersteuning voor optische overlapping. Hoewel een mismatch van de brekingsindex wordt aangetroffen, blijft zijn oorsprong te bepalen. Ten tweede, het kalibratieproces, als men geïnteresseerd is in absolute waarden, kunnen een beetje vervelend, aangezien het vereist passieve microrheology experimenten, en kalibratie van de stijfheid van de val op parels. Het is belangrijk om te erkennen dat de kalibratie van de stijfheid op cel contacten experimentele onzeker is: het is gebaseerd op metingen van de stijfheid van de val op kralen, die alleen in het cytosol, maar niet in de buurt van cel contacten kan worden gemeten. Ten derde, het is onduidelijk hoe veelzijdig optisch pincet kan zijn. Hoewel ze kunnen vervormen van de cellen in het embryo Drosophila , misschien andere weefsels hogere spanning of moeilijker toegang (zoals het doorlopen van een schubbenlaag) overlegt en dus minder vatbaar voor optisch pincet.

Optische krachten zijn klein (< enkele tientallen pN) en kan dus onvoldoende zijn om te vervormen stijf of zeer gespannen structuren. Magnetische pincet op grote deeltjes zou waarschijnlijk doeltreffender zijn in dit geval.

We beschreven hier de koppeling van optisch pincet om een lichte blad Microscoop, maar optisch pincet kan worden gekoppeld aan andere soorten microscopen, zoals een epifluorescence of een confocal draaiende schijf Microscoop. Het binnenbrengen van de laser van de overlapping IR de Microscoop, is afhankelijk van de configuratie van de Microscoop. Het vereist vooral de mogelijkheid om toe te voegen een dichroïde spiegel om de paden voor de beeldvorming en optische manipulatie combineren. De meeste microscopie bedrijven stellen modulaire belichtingssystemen, met een twee-laag-module, waardoor deze combinatie.

Verschillende richtingen bestaan om te verbeteren of een upgrade uitvoert van de techniek. Een mogelijkheid is om te splitsen de verblijftijd van de laser onder verschillende posities of voor het gebruik van meer geavanceerde holografische technieken, om te produceren verschillende vallen. Hierdoor kunnen meer complexe kracht om patronen te creëren op doelcellen of cel contacten. Een andere verbetering zou kunnen zijn voor het ontwerpen van een real-time feedback tussen de uitwijking veroorzaakt en de positie van de overvulling. Kunnen hierdoor goede kruip experimenten waarbij de uitgeoefende kracht gedurende het gehele experiment constant wordt gehandhaafd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door een FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (op P.-F.L.). Wij erkennen de Frankrijk-BioImaging infrastructuur ondersteund door het Franse nationale Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringen voor de toekomst»). Wij danken Brice Detailleur en Claude Moretti van de PICSL-FBI-infrastructuur voor technische bijstand.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW	IPG Laser	YLM-10-LP-SC	including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser
Ø1/2" Optical Beam Shutter	Thorlabs	SH05
Small Beam Diameter Galvanometer Systems	Thorlabs	GVS001	1 for X displacement, 1 for Y displacement
1D or 2D Galvo System Linear Power Supply	Thorlabs	GPS011	galvanometers power supply
2 lenses f = 30 mm	Thorlabs	LB1757-B	relay telescope between 2 galva
Lens f = 200 mm	Thorlabs	LB1945-B	2.5X telescope
Lens f = 500 mm	Thorlabs	LB1869-B	2.5X telescope
Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes	Thorlabs	KCB1E	Periscope
Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style	Thorlabs	LG1
45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror	Edmund Optics	#64-470
Multiphoton-Emitter HC 750/S	AHF	HC 750/SP
CompactDAQ Chassis	National Instruments	cDAQ-9178
C Series Voltage Output Module	National Instruments	NI-9263	Analog output module
C Series Voltage Input Module	National Instruments	NI-9215	Analog input module
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids	ThermoFisher Scientific	F8812	calibration beads
C++ (Qt) home made optical tweezers software			developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).
Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).

Developmental Biology

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.