Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Prøvende celle mekanikk med perle-fri optisk pinsett i Drosophila Embryo

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/57900
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1CNRS, Institut de Biologie du Développement de Marseille, Aix-Marseille Université
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer et oppsett optisk pinsett kombinert lys ark mikroskop, og gjennomføringen å undersøke celle mekanikk uten perler i Drosophila embryo.

Abstract

Morphogenesis krever koordinering mellom genetisk mønstre og mekaniske krefter til robust celler og vev. Derfor er en utfordring å forstå Morfogenetiske prosesser direkte måle mobilnettet styrker og mekaniske egenskaper i vivo under embryogenesis. Her presenterer vi et oppsett optisk pinsett koplet til en lys ark mikroskop, som tillater direkte bruke styrker på celle-celle kontakter av tidlig Drosophila embryoet, mens bildebehandling med en hastighet på flere bilder per sekund. Denne teknikken har fordelen at det ikke krever injeksjon av perler inn i fosteret, vanligvis brukt som mellomliggende sonder som optisk styrker er utøves. Vi detalj trinnvis gjennomføringen av installasjonen og foreslår verktøy for å trekke ut mekanisk informasjon fra eksperimenter. Ved å overvåke forskyvningene celle-celle kontakter i sanntid, kan utføre spenning målinger og undersøke celle kontaktene Reologi.

Introduction

Embryonale utvikling er en svært reproduserbar prosess der celler og vev deformere forme fremtiden dyret. Slike deformasjoner har vist å kreve aktive styrkegenerering på cellen nivå1,2. For å forstå Morfogenetiske prosesser der celler og vev endrer form, er det derfor viktig å vurdere de mekaniske egenskapene cellene involvert, og å måle styrkene i vevet under prosessen3,4 . Epiteliale lag, spesielt i Drosophila, har vært mye studert deres kvasi-2D geometri og for deres lett manipulasjon.

En rekke teknikker har dermed blitt utviklet av oss og andre å vurdere epithelial mekanikken i vivo under utvikling. Vi vil gi en rask oversikt over de tre viktigste teknikkene brukes i epithelial vev. Laser ablasjon, brukte metode, kan avdekke lokale mekanisk stress på cellen veikryss5,6,7,8 eller større skala9,10,11 ved å utføre lokale kutt som forstyrrer mekanisk integriteten til målet. Dynamikken i åpningen etter kuttet inneholder informasjon både stress tidligere ablasjon og Reologi vev12,13. En ulempe ved laser ablasjon er at det er invasiv, som det krever lokale avbrudd i cellen cortex. Derfor kan en bare utføre et begrenset antall ablations hvis man ønsker å bevare vev integritet. En annen ulempe er at ablations bare gi relativ estimater av spenning på cellen kontakter, siden åpningen hastigheten er avhengig av tyktflytende friksjon, som vanligvis ikke er kjent. Magnetisk manipulasjon har også blitt utviklet og brukt i Drosophila, som involverer enten bruken av ferrofluids14 eller ultramagnetic liposomer15. De kan gi absolutt mål16,17, men er også invasjonen i den forstand at de krever injeksjon av sonder på ønsket plassering. Dette kan være veldig vanskelig avhengig av systemet, som ikke alltid er mottakelig for presis injeksjoner. En tredje teknikk, fullstendig ikke-invasiv, er styrke slutning18,19,20. Force slutning baserer seg på antagelsen av mekanisk likevekt på tre poeng (tricellular veikryss eller toppunkt), og kan antyde spenninger hele celle-celle kontakter (og muligens press i alle celler) ved å løse en omvendt problem. For spenninger gir hvert toppunkt to ligningene (X og Y). Dette gir et stort system av lineære ligninger som kan inverteres under noen omstendigheter å vurdere spenning på alle cellen kontakter. Denne metoden er svært attraktive, som det bare krever en segmentert bilde og ingen ekstra eksperiment eller oppsett, nøyaktigheten er ennå å fastslå, og igjen det bare gir relative verdier, med mindre en absolutt kalibrering måling utføres.

For å overvinne noen av disse begrensningene, vi introduserer i denne artikkelen en setup optisk pinsett koblet til lys ark mikroskop gjelder kontrollerte styrkene i cellen skala i embryonale epitel i Drosophila melanogaster. Optisk pinsett har blitt brukt til mange biologiske inkludert målinger på én proteiner og manipulasjon organeller og celler21. Her rapporterer vi anvendt styrker mellom et par dusin pN, som er små tilstrekkelig til å indusere lokal forvrengning av cellen kontakter og utføre mekanisk målinger i vivo. Vi bruker vanligvis vinkelrett nedbøyning av cellen kontakter, overvåkes gjennom analyse av kymographs, relatere kraft til deformasjon. Viktigere, kreve våre installasjon ikke injeksjon av perler på ønsket plassering vev, som optisk pinsett kunne utøve direkte styrker på celle-celle kontakter. Koblingen av optisk pinsett til lys ark mikroskop gjør det mulig å utføre raske imaging (flere bilder per sekund), som er veldig merkbar for en mekanisk analyse på korte tidsskalaer, og med redusert Phototoksisitet, siden belysning av den prøven er begrenset til flyet Imaging22.

Samlet, optisk pinsett er en ikke-invasiv måte å bruke kontrollert styrker på cellen kontakter i vivo i Drosophila embryo, og trekke ut mekanisk informasjon stivhet og spenning på cellen kontakter23, reologiske egenskaper 24, og gradering eller anisotropy av spenning23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sette opp lys ark mikroskopet

  1. Se beskrivelsen av oppsettet i forrige publikasjonen25.
    Merk: Oppsettet består av en oppreist mikroskop scene og en lys ark modul produserer en lys ark vannrett. En 10 X eksitasjon linsen leder lys arket i glass søppel (Figur 4). Den oppdagelsen linsen har en høy NA (1.1), som er nødvendig for effektiv tweezing (se nedenfor).

2. sette opp optisk pinsett banen

Merk: Figur 1 gir en generelle ordningen for optisk.

  1. Plasser 1070 nm laser enhet, og fastsette fiber i tabellen optisk med en V-klemmefestet. Kontroller at fiber-collimator er parallell til tabellen optisk (derfor vannrett) og at høyden valgt her blir høyden for alle optisk komponentene justert i tabellen optisk.
    Merk: 100 mm kan være et godt valg for denne høyden.
  2. Slå nøkkelen av infrarød laserenheten og trykk på "Velg" for å slå på justering pekeren. Lyset må være vannrett utgående av fiber.
  3. Plasser lukkeren i den optiske banen, og fikse det i tabellen optisk, slik at infrarød laserstrålen passerer gjennom åpningen av nedleggelse. At avstanden mellom tabellen optiske sentrum av åpningen av lukkeren er høyden valgt i trinn 2.1.
  4. Vri nøkkelen av lukkeren kontrolleren, Velg manuell modus med pilene og trykk på "Aktiver"-knappen for å åpne skodde.
  5. Plassere, justere og fastsette første galvanometer speilet.
    Merk: To galvanometer speil har å bli bøyd til den tilbake blenderåpningen av gjenkjenning målet, slik at når ett av speilene roterer, laserstrålen ikke går ut av ryggen blenderåpning for målsettingen. Merk at avstanden mellom den første galvanometer og tilbake blenderåpning for målsettingen har regnet for å vurdere plasseringen av denne galvanometer i forhold til målet (f1 + f1 + f2 + f2 + f3 + f3 + f4 + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = 1550 mm; fi = brennvidden på objektivet n ° jeg).
  6. Slå på strømforsyningen galvanometer. Kontroller at galvanometers er drevet for resten av justering protokollen.
  7. Satt på galvanometers til null nedbøyning (NIMAX eller optiske tweezer programvare - se trinn 3 for galvanometer tilkoblinger).
  8. Plassere, justere og fastsette relé teleskopet består av to objektiver med en brennvidde på 30 mm.
  9. Plassere, justere og fastsette andre galvanometer speilet. Merk at avstanden mellom de to galvanometers 4f = 4 x 30 mm = 120 mm (f = brennvidde).
  10. Plasser og fikse teleskopet.
    Merk: Teleskopet består av to linser som utvider strålen til en bredde minst lik diameteren på den tilbake blenderåpningen på objektivet mål. Linsen med minste brennvidden bør komme først.
  11. Plassere, justere og fastsette periscope bringe oppover den optiske banen nærmere til inngangen dichroic speil skinnen.
  12. Reparere varmt speilet i tog, jernbane i mikroskopet. Kontroller at skinnen er saget til høyre slik at inngangen til infrarød laser (figur 2).
  13. Kontroller at laserlys kommer ut av mikroskopet, først uten målet så med målet. Rette plasseringen av laser før målet med bunnen speilet av periscope. Rette plasseringen av laser etter målet med topp speilet av periscope.
  14. Sett 1 µL av 500 nm fluorescerende perler i glass cuvette og tilsett 10 mL destillert vann. Sett cuvette mål i cuvette holderen og justere fokus på målet (Z posisjon) slik at målet berører vannflaten.
  15. Start oppkjøpet hjemmelaget programvaren kontrollere AOTF, kameraet og piezoelektrisk scenen. En gratis programvare som micromanager kan også brukes. Slå på live kjøp ved å trykke på "Live" trykknapp.
  16. Justere IR laser makt til 1 W.
  17. Sette på briller (og ikke fjerne den før slutten av forsøket) og slå på laser. En perle bør være fanget på laser fokus.
    1. Hvis ingen perle er fanget på laser fokus, sjekk hvis det rød laser pekestokk (som kollineare med IR laser) kommer ut av målet. Hvis ikke, starter igjen punktene justering, spesielt trinn 2.13. Du kan eventuelt øke IR laser makt.
    2. Hvis perle er fanget uskarpt (av tenkelig flyet), forsiktig flytte siste lens siste teleskop (L4 i figur 1) langs den optiske aksen å bringe perlen i fokus med imaging flyet. Hvis ikke nok, flytte den første linsen av siste teleskop (L3 i figur 1) langs den optiske aksen.
    3. Hvis fanget perle ikke er sentrert i bildet, kan du bruke 2 periscope speilene for å justere plasseringen av fellen. Hvis plasseringen av perlen endres ved å endre vinkelen på første speilet, også kompensere strålen retning ved å endre den tilsvarende vinkelen i andre speilet. Korrigere X posisjonen bare (1 skrue for hver speil), så riktig Y-posisjon (1 skrue for hver speil).
  18. Om nødvendig kan du justere plasseringen av 2nd teleskop linsen å observere perlen i fokus.
  19. Eventuelt justere vinkelen på periscope speil har perle sentrert i bildet.

3. grensesnitt instrumentet

Merk: Figur 3 gir en generell ordning med National Instruments (NI) kort tilkoblinger.

  1. Sett ut kortet (NI-9263) i det første sporet av kabinettet (cDAQ-9178). Merk at andre modeller av NI kort med minst 2 analoge utganger og 3 analoge innganger kan brukes.
  2. Sett inn kortet (NI-9215) i det andre sporet av kabinettet.
  3. Koble den første galvanometer til analog AO0 og analog input AI0 med BNC kabler. Merk at en T-adapter kan brukes til å koble 2 BNC kabler til en. Se håndboken til galvanometer å lokalisere pinnene på galvanometer driver styret.
  4. På samme måte, kobler du den andre galvanometer til AO1 og AI1.
  5. Koble PFI1 til utløser IN av nedleggelse (baksiden av kontrolleren).
  6. Koble PFI0 til brann på kameraet og AI2.
  7. Koble AI3 til avtrekkeren av lukkeren (baksiden av kontrolleren).
  8. Juster innstillingene for nedleggelse kontrolleren. Bruk pilene til å endre parameterverdiene og trykk på "Select" knappen for å bekrefte valget og gå til den neste parameteren. Sette "tid åpen sec" parameter 000.000, "tid stengt sec" til 000.000, "modus" enkelt og "trigger" EXT. Tillat kontroll av lukkeren ved å trykke på "Aktiver"-knappen.
  9. Åpne QtCreator (lastet ned fra https://www.qt.io/, gratis versjon).
    Merk: QtCreator er integrerte utviklingsmiljøet brukt til å utvikle i C++ optisk pinsett programvaren. QT bibliotek brukes her til å lage widgeter.
  10. Åpne filen OT.pro (følger med på de Qt filene). Denne handlingen vil åpne prosjektet. Endre navnet på inn- og utdataene i filen AOGenerator.cpp i henhold til NI kortene brukes.
  11. Kompilere og kjøre programmet OT.

4. kalibrering av optisk felle posisjon med perler

  1. Opptak av en kalibrering film
    1. Sett 1 µL av 500 nm røde fluorescerende perler i glass cuvette og fylle cuvette med 10 mL destillert vann. Figur 4 gir utsikt over cuvette i observasjon sammenheng.
    2. Fastsette cuvette på piezoelectric scenen.
    3. Juster Z-posisjonen til cuvette slik at oppdagelsen målet dypper i vannet.
    4. Aktivere infrarød laser og sette makt til 1 W.
    5. Slå på image oppkjøpet programvare.
    6. For å hente tid lapse bilder, Velg eksponeringstid, gevinst, tiden mellom to bilder, antall bilder ervervet og laser makt. Merk at for optisk tweezer kalibrering med perler, belysning laser (561 nm) er ikke nødvendig. 2-fotonet effekten indusert av infrarød laser er nok å opphisse fluorescens av en fanget perle.
    7. Start optisk pinsett hjemmelaget programvare.
    8. Angi parameterne optisk pinsetter å spore en sirkel. Angi angitt SamplingRate som 250 samp/s, bufferSize som 1000, Waveform1 parametere (galvo 1) Sinusoidal, nbPeriod 1, amplitude 0,5 V fase 0.0 rad, Offset 0,0 V, bølgeform 2 parametere (galvo 2) som Sinusoidal, nbPeriod 1, amplitude 0,5 V, fase 1,57 rad, forskyvning 0,0 V.
    9. Sjekk boksen "AI parametere" og "Wait for det"... boksen.
    10. Starte bildeopptak (500 eller 1000 bilder med en høy bildefrekvens, som 10 fps).
    11. Slå på optisk pinsett ved å trykke "Generere!"-knapp.
    12. Tillate fanget perlen å fullføre minst to full sirkler og stoppe optisk pinsett av un trykke på "generere!" knappen.
    13. Stopp bilde oppkjøpet. Merk at en tiff-film og en tekstfil med galvanometer spenninger opprettes i standard "C:/temperament /" brosjyre (med mindre en egendefinert plassering er angitt). Merk at flere kalibrering filmer med tilknyttede datafiler kan opprettes hvis nødvendig.
      1. Hvis sirkelen ikke er komplett, er perlen tapt under sirkel banen. Kanskje er hastigheten for høy. Redusere det ved å redusere samplingsfrekvensen i OT programvaren. Eller bruk det rød laser pekestokk av infrarød laser kontrollere hvis laser kommer ut av målet under hele kretsen banen. Hvis ikke, galvanometer speil kan ikke være konjugert med tilbake fokalplanet av målet linsen. Rette plasseringen av galvanometers i forhold til tilbake fokalplanet i målet, starter igjen justering trinnene fra trinn 2.5.
    14. Angi amplituder til null og slå på laser å fange en perle på en fastsette posisjon. Plass et landemerke på trap stedet.
  2. Posisjon interpolering med bildeanalyser
    1. Åpne Matlab, gå til mappen kalibrering og kjøre skriptet "position2tension" (forutsatt i Matlab kodefiler). Dette skriptet beregner funksjonen interpolering oversette galvanometer spenninger optisk felle posisjon.
    2. Velg antall kalibrering filmer vil bli brukt. Flere filmer kan velges med forskjellige baner, som to vinkelrett ellipser. Vanligvis er en enkelt kalibreringsstøt film med en sirkulær bane nok.
    3. Gi den første og siste bildet tall i dialogboksen (én dialogboks per film), sekvenser med en klar bane og godt signal til støyforhold.
    4. Angi banen til tekstfilen som inneholder spenninger under oppkjøpet for hver film. Merk at skriptet leser filen og beregner gjennomsnittlig spenninger i de to galvanometers for hvert bilde.
    5. Angi banen til den tilsvarende kalibrering filmen.
      Merk: Skriptet oppdager perlen for hver ramme med en underpiksel oppløsning ved å montere en 2D Gaussian bead, bruke funksjonene utvunnet fra MTT26og egendefinerte funksjoner. Det viser en graf som viser perle banen.
    6. Eliminere enhver dårlig oppdaget (outliers) ved å klikke den.
    7. Sjekk om interpolering kart for x og y laser posisjoner beregnes og vises av skriptet er fullført. Hvis det er mange mangler verdier (hvite områder på kartet), gjenta operasjonen med en ny kalibrering film med et bedre signal til støyforhold, eller / og med en lavere hastighet av galvanometers.
      Merk: Disse bildene og interpolering verdier lagres automatisk i samme mappe som bildet, med navnet convertFct.mat.

5. montering Drosophila embryo27

  1. Samle Drosophila embryoer fra et bur, ruges på 25 ° C.
  2. Fjerne gjær, passerer plate innholdet gjennom en sil (porestørrelse bør være ca 100 µm).
  3. Vask embryoer med 100% blekemiddel (2,6% natriumhypokloritt) for 45 s fjerne plasmocitara.
  4. Vask embryo med vann i 2 minutter.
  5. Sette embryoene på en agar pad med pensel.
  6. Velg 10 embryo etter ønsket scenen og justerer embryoene med en gjedde eller fuktig pensel.
    Merk: Justering bør gjøres i henhold til region av interesse (regionen rundt så nær som mulig til gjenkjenning målet).
  7. Bruke en diamant-merking, skjære et stykke av et glass lysbilde 10 x 20 x 1 mm3.
  8. Legge lim på den ene siden av kutt stykke, og la det tørke i 20 s.
  9. Snu det kutt stykket og plasserer den på linje med embryoer, å holde det på kanten av lysbildet.
  10. Installere dette preparatet i prøven holderen og sett den i cuvette. Figur 4 gir utsikt over cuvette i observasjon sammenheng.
  11. Sette cuvette på piezoelectric scenen.

6. fangst eksperiment i Vivo

  1. Overlapping av cellen kontaktene-svingninger (figur 5)
    1. Finne plasseringen av interesse i vevet.
      Merk: Bruke fluer cadherins er merket som kan være nyttig hvis man trenger å arbeide i flyet adherens veikryss.
    2. Flytt målet kryssets midtpunkt på felle posisjon (landemerke satt på trinn 4.1.14) bruke piezo scenen.
    3. Angi parameterne felle å oppnå svingninger vinkelrett kontaktledningsanlegget. Angi faser som null. Angi amplituder i X og Y-retningene å ha en bevegelse vinkelrett kontaktledningsanlegget. Amplituden skal vanligvis 0,1 V.
    4. Starte oppkjøpet (med en rask bildefrekvens, som 10 fps).
    5. Slå på optisk pinsett trykk "Generere!"-knapp.
    6. Når ferdig, slå av bildeopptak pinsetter og stopp. En film og en tekstfil med galvanometer spenninger under oppkjøpet skal nå vises i den angitte mappen.
    7. Overlapping av cellen kontaktene-pull-release (figur 6)
    8. Finne plasseringen av interesse i vevet.
    9. Flytte målet krysset med piezo scenen slik at midtpunktet er vanligvis 1 µm fra fellen plasseringen (landemerke satt på trinn 4.1.14).
    10. Angi amplituder 0 å ha en jevn felle.
    11. Starte bildeopptak (med en rask bildefrekvens, som 10 fps).
    12. Slå på optisk pinsett trykk "Generere!"-knapp.
    13. Etter tiden, slå av fellen og vente på hvile.
    14. Stopp bilde oppkjøpet. En film og en tekstfil med galvanometer spenninger under oppkjøpet skal nå vises i den angitte mappen.
  2. Halvautomatisk kymograph generasjon og oppdagelsen av grensesnittet posisjon.
    1. I vinduet Matlab laste interpolering kartet generert under kalibreringsprosedyren (4b): load('convertFct.mat'). Dette gir fx og fy variablene.
    2. I vinduet Matlab Kjør autokymo(fx,fy), i Matlab kode filene. Hensikten med denne funksjonen er å generere en kymograph langs laser banen og oppdage plasseringen av kontakten linjen med underpiksel oppløsning for hver ramme.
    3. Velg spørsmål tekst filbanen inneholdende spenning.
    4. Velg første og siste bildet numrene av filmen som skal analyseres.
    5. Velg tiff filmfilen. To nye tall vises: det første er et bilde av kymograph. Den andre er en graf av oppdagelsen av de kontakte linje og laser stillingene, kontra hvor bildet.
      Merk: Funksjonen sparer grafen representerer posisjonen til prøven og plasseringen av laser versus hvor bildet (matlab figur, jpg), kymograph (tiff-bilde) og kymograph med laser posisjon (tiff-bilde). For jevn felle eksperimenter har kymograph gjøres manuelt, for eksempel bruker ImageJ. Gjenkjenning av grensesnittet fra kymograph gjøres deretter med den samme algoritmen.

7. mekanisk mål

  1. Stivhet og spenning målinger
    1. Utføre et oscillation eksperiment (trinn 6.1) og tilsvarende analyse (trinn 6.3) av tid forfalle filmen.
    2. Plot grensesnitt stillingen Equation 1 som en funksjon av felle plasseringen Equation 3 bruker Matlab tomten funksjon eller data plotting programvare.
      Merk: Dette bør være ca lineær.
    3. Utføre en lineær form, bruker Matlab "ezfit" gratis verktøykassen eller programvare slik at passer. Inverse av den passer skråningen gir gjennomsnittlig forholdet Equation 5 .
    4. Utføre beregninger av tilsynelatende bøying stivhet av grensesnittet, som antar lite forvrengning og en kvadratisk potensielle overlapping er gitt av Equation 6 . Equation 7 er felle stivhet (se trinn 8 for felle stivhet kalibrering).
    5. Utføre beregninger av spenning, som kan defineres som23:
      Equation 8.
  2. Reologiske mål
    1. Utføre dra utgivelsen eksperimenter (trinn 6.2) og tilsvarende analyse (trinn 6.3)
    2. Passe resulterende kurven med egendefinerte reologiske modellen.

8. kalibrering av felle stivhet

Merk: Bestemmelse av absolutt styrker krever kunnskap om felle stivhet på grensesnitt. Dette kan nås med perler gjennom to trinn.

  1. Fastsettelse av stoffer viskositeten
    1. Plasser embryoene i halocarbon olje og injisere dem med en microinjection oppsett med fluorescerende polystyren perler (1:1, 000 lager fortynning, 0,46 µm diameter)23,27.
    2. Plass de injiserte embryoene under mikroskopet.
    3. Spore enkelt perler funnet i stoffer. Ekstra betyr kvadratisk forskyvning av perler (bruker et stort antall baner > 100 perler). Bestemme perle diffusjon konstant fra bakken betyr kvadratisk forskyvningsverdien. Om spredning konstant viskositet av Stokes-Einstein ligningen, utlede effektiv viskositeten av stoffer. I tidlig embryo er en viskositet på ca 3,5 Pa.s rapportert23.
  2. Fastsettelse av felle stivhet på perler
    1. Overlappe enkelt perler i stoffer med optisk pinsett.
    2. Flytt perlen i en gradvis mote mellom to felle posisjoner med 0,5 µm
    3. Bestemme felle stivhet på perler, som forholdet mellom dra koeffisient og perle avslapning tid fra en trap posisjon til den andre.
      Merk: Dra koeffisient er Equation 9 , der Equation 10 er viskositeten i (8.1) og Equation 13 perle radius. Avslapning tid hentes fra eksponentiell anfall av perle stillingen, bruker Matlab eller programvare slik at passer. Verdiene i fellen stivhet er 120 ±50 pN.µm-1 på 200 mW laser eksitasjon.
  3. Fastsettelse av felle stivhet på cellen grensesnitt
    1. Fokusere laseren på en kontakt, og avlede det (som beskrevet i trinn 6). Måle deformasjon amplituden. Dette skal gjentas på flere kontakt linjer å få en representant gjennomsnitt.
    2. Sammenligne produsert deformasjon med som indusert av perler presset mot kontakt linjer. Siden deformasjon er omvendt proporsjonal med felle stivhet, utlede felle stivhet på cellen kontakter.
      Merk: Felle stivhet på cellen kontakter Vanligvis finner 2 - til 3 ganger mindre enn på perler (0,46 µm diameter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 viser eksperimentelle data ved å pålegge en sinusformet bevegelse til fellen. Fellen produserer en avbøyning av grensesnittet, som eksemplifisert ved 3 øyeblikksbilder viser 3 påfølgende grensesnitt posisjoner (figur 5A)23. Innspilte filmer brukes til å generere en kymograph (figur 5B) og analyseres videre for å finne plasseringen av grensesnittet med underpiksel oppløsning, bruker en Gaussian passer langs x-retningen for hver ramme. I regimet av små deformasjoner, felle og grensesnitt stillingene er proporsjonal (figur 5C). Amplituden til grensesnittet nedbøyning i forhold til fellen (figur 5 d) gir tilgang til grensesnittet spenning eller stivhet (se trinn 7.1).

Figur 6 viser eksperimentelle data hentes ved å trekke ut eksperimenter. Optisk fellen er slått på ca 1 µm fra midtpunktet i grensesnittet mellom to celler, noe som fører til grensesnittet til avlede mot felle posisjon (figur 6A)24. Fellen er deretter slått av etter det ønsket tid. Posisjon xm av grensesnitt (figur 6B) er Hentet fra kymographs (figur 6C), igjen med Gaussian passer x retning for hver ramme. Den resulterende grafen som kan sammenlignes med hypotetiske reologiske modeller, for eksempel en Maxwell modell (figur 6D).

Figure 1
Figur 1: skjematisk for optisk pinsett (rød sti) kombinert med lys ark mikroskopet. Dette tallet har blitt endret fra Bambardekar, K. et al. 23. Lys ark mikroskopet, belysning enheten og enheten, er beskrevet tidligere25. Optisk pinsett tilsvarer den røde delen av ordningen: infrarød laser passerer gjennom en optisk nedleggelse og 2 galvanometers som kontrollerer posisjonen til fellen i utvalget. 1-fold teleskop er plassert mellom de 2 galvanometers å holde Bøyning mellom dem. Deretter et teleskop øker størrelsen på bjelken av 2.5-fold og periscope bringer det til høyden på mikroskopet. Infrarød laser inn oppdagelsen målet av mikroskopet takket være en dichroic speil. Viktig avstander mellom optiske elementer gis direkte i figuren. Avstanden mellom siste lens (brennvidde 500 mm) og tilbake blenderåpning for målsettingen er 500 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: hjemmelaget endret rail holder det dichroic speilet og varme speilet. Dichroic speil skinnen av mikroskopet har blitt kuttet til venstre slik at inngangen til infrarød laser. Det dichroic speilet reflekterer den infrarødt lys og overfører synlig lys (fluorescens). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: tilkobling av instrumenter til NI kort. AO: analoge AI: analog inngang, AO0 og AI0 er koblet til galvo1, AO1 og AI1 er koblet til galvo2, PFI0 er koblet til brannen i kameraet, AI2 og PFI1 er koblet til utløseren av nedleggelse og AI3 er koblet til avtrekkeren av lukkeren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel holderen i observasjon sammenheng. Dette tallet er endret fra Chardès, C., et al. 25. embryoene er immobilized på glass dekkglassvæske. Lysbildet blir holdt av prøven abonnenten. Eksempel abonnenten settes i glass cuvette, holdt av abonnenten fast til piezoelectric scenen. Den lette vannrett og lyser embryoer fra siden. Den oppdagelsen linsen loddrett, over utvalget, og fall i cuvette.

Figure 5
Figur 5: grensesnitt nedbøyning pålagt av sinusformet bevegelighet for trap. Dette tallet er endret fra Bambardekar, K. et al23. (A) fellen flyttes sinusoidally vinkelrett på grensesnittet. Trap og grensesnitt stillingene er xt og xm, henholdsvis. Høyre panelene viser tre bilder av grensesnittet til forskjellige posisjoner. Laser felle posisjonen er markert med et gult pilhode. Grensesnittet er merket med en membran markør (GAP43::mcherry). (B) Kymograph langs aksen definert av felle bevegelsesretning (vinkelrett grensesnittet) (periode = 5 s). (C) representant tomt nedbøyning versus tid viser både felle (rød heltrukket linje) og grensesnittet posisjoner (svart heltrukket linje). (D) grensesnitt plass som en funksjon av felle posisjon under noen sykluser av laser oscillasjonen (Amplitude = 0,5 µm, periode = 2 s). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: grensesnitt nedbøyning i trekk-release eksperimenter. Dette tallet er endret fra Serge, A., et al. 24. (A) fellen er slått på på avstand fra midtpunktet av grensesnittet, så slått av. (B) felle og grensesnitt stillingene er xt og xm, henholdsvis. Kymographs genereres x retning, vinkelrett kontaktledningsanleggets midtpunkt. (C) Kymograph av en pull-release eksperimentet. Cellen kontakter er merket med Utrophin::GFP. (D) representant tomt nedbøyning versus tid viser både felle (prikket rød/grønn linje) og grensesnittet posisjon (svart heltrukket linje). Den solide røde linjen viser en plass får en Maxwell-lignende reologiske modell24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sekvenser komplementære filmen 1: Tweezing eksperimentet. Pikselstørrelsen = 194 nm, 10 fps, Trap oscillation periode = 2 s, opplysningsarbeid: Gap43::mCherry. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optisk pinsett kan utføre absolutt mekanisk mål direkte i utviklingsland embryonale epitel i en ikke-invasiv måte. På den måten presenterer det fordeler over andre metoder som laser ablasjon, som er invasiv og gi relative mål, magnetiske styrker, som krever injeksjoner, eller tvinge slutning, som bruker sterk forutsetninger og også gi relativ målinger.

Protokollen inneholder noen viktige skritt. Først som linsen kan vise kromatisk aberrasjon og at laser fellen presser objektet "nedstrøms", er det viktig å sjekke at IR laser feller perlen i tenkelig flyet, og til slutt riktig for det (trinn 2,18). Andre bruker metoden målinger av cellen kontaktenes posisjon. Det er dermed viktig å bruke en høy kontrast fluorescerende markør.

Kvaliteten på linsen og laserstrålen er kritiske til effektiv overlapping. Den numeriske blenderåpningen på objektivet målet bør overstige 1.0. Hvis overlapping er ineffektivt, kontrollerer du at laserstrålen fyller den bakre blenderåpningen på objektivet mål.

Vår metode kommer med flere begrensninger. Først, det er ikke klart hva akkurat gir støtte for optisk overlapping. Selv om mellom brytningsindeks oppdages, gjenstår sin opprinnelse for å fastsettes. Andre kan kalibreringsprosessen, hvis man er interessert i absolutte målinger, være litt kjedelig, fordi den krever passiv microrheology eksperimenter, og kalibrering av felle stivhet på perler. Det er viktig å erkjenne at kalibrering av stivhet på cellen kontakter er underlagt eksperimentelle usikkerhet: det er avhengig av målinger av felle stivhet på perler, noe som kan måles i stoffer, men ikke nær cellen kontakter. Tredje det er uklart hvordan allsidig optisk pinsett kan være. Selv om de er kjøpedyktig deformere cellene i Drosophila fosteret, kan andre vev presentere høyere spenning eller vanskeligere tilgang (for eksempel går gjennom en cuticle) og derfor mindre mottakelig for optisk tweezing.

Optisk styrker er liten (< titalls pN) og kan dermed ikke nok å deformeres stiv eller svært spent strukturer. Magnetisk pinsett på store partikler ville trolig være mer effektiv i dette tilfellet.

Vi beskrevet her koblingen av optisk pinsett for å lette ark mikroskop, men optisk pinsetter kan kobles til andre typer mikroskoper, for eksempel en epifluorescence eller en AC confocal spinning disk mikroskop. Innføring av IR overlapping laser i mikroskopet avhenger av mikroskopet konfigurasjonen. Hovedsakelig krever muligheten til å legge til dichroic speil for å kombinere banene for bildebehandling og optisk manipulasjon. De fleste mikroskopi selskapene foreslår tilpasningsvennlig belysning systemer, med en to-lags modul, som tillater denne kombinasjonen.

Det finnes flere retninger å forbedre eller oppgradere teknikken. En mulighet er å dele laser botid blant flere stillinger eller å bruke mer avanserte holografiske teknikker, for å produsere flere feller. Dette kan tillate for å opprette mer komplekse force mønstre på målcellene eller cellen kontakter. En annen forbedring kunne utforme en tilbakemelding mellom nedbøyning forårsaket og plasseringen av fellen. Dette kan gi riktig krype eksperimenter der kraften blir opprettholdt konstant gjennom hele eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (til P.-F.L.). Vi erkjenner Frankrike-BioImaging infrastruktur støttes av franske National Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringer for fremtiden»). Vi takker Brice Detailleur og Claude Moretti fra PICSL-FBI infrastrukturen for teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW IPG Laser YLM-10-LP-SC including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser
Ø1/2" Optical Beam Shutter Thorlabs SH05
Small Beam Diameter Galvanometer Systems Thorlabs GVS001 1 for X displacement, 1 for Y displacement
1D or 2D Galvo System Linear Power Supply Thorlabs GPS011 galvanometers power supply
2 lenses f = 30 mm Thorlabs LB1757-B relay telescope between 2 galva
Lens f = 200 mm Thorlabs LB1945-B 2.5X telescope
Lens f = 500 mm Thorlabs LB1869-B 2.5X telescope
Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes Thorlabs KCB1E Periscope
Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style Thorlabs LG1
45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror Edmund Optics #64-470
Multiphoton-Emitter HC 750/S AHF HC 750/SP
CompactDAQ Chassis National Instruments cDAQ-9178
C Series Voltage Output Module National Instruments NI-9263 Analog output module
C Series Voltage Input Module National Instruments NI-9215 Analog input module
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids ThermoFisher Scientific F8812 calibration beads
C++ (Qt) home made optical tweezers software developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
  2. Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  3. Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).
  4. Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
  5. Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
  6. Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
  7. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  8. Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
  9. Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  10. Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
  11. Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
  12. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
  13. Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
  14. Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
  15. Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
  16. Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
  17. Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
  18. Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
  19. Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
  20. Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
  21. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
  22. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  23. Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  24. Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
  25. Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
  26. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  27. Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 141: lys ark mikroskopi optisk pinsetter tvinge målinger celle mekanikk i vivo bildebehandling Drosophila embryo
Prøvende celle mekanikk med perle-fri optisk pinsett i <em>Drosophila</em> Embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chardès, C., Clement, R.,… More

Chardès, C., Clement, R., Blanc, O., Lenne, P. F. Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (141), e57900, doi:10.3791/57900 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter