Developmental Biology

Drosophila भ्रूण में मनका मुक्त ऑप्टिकल चिमटी के साथ सेल यांत्रिकी की जांच

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/57900

Claire Chardès*¹, Raphael Clement*¹, Olivier Blanc¹, Pierre-François Lenne¹

¹CNRS, Institut de Biologie du Développement de Marseille, Aix-Marseille Université

* These authors contributed equally

Summary

हम एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप करने के लिए युग्मित ऑप्टिकल चिमटी के एक सेटअप मौजूद है, और Drosophila भ्रूण में मोतियों के बिना सेल यांत्रिकी जांच करने के लिए इसके कार्यांवयन ।

Abstract

Morphogenesis आनुवंशिक पैटर्न और यांत्रिक बलों के बीच समंवय के लिए मजबूती से कोशिकाओं और ऊतकों को आकार की आवश्यकता है । इसलिए, एक चुनौती morphogenetic प्रक्रियाओं को समझने के लिए सीधे सेलुलर बलों और embryogenesis के दौरान vivo में यांत्रिक गुणों को मापने के लिए है । यहाँ, हम एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप करने के लिए मिलकर ऑप्टिकल चिमटी के एक सेटअप मौजूद है, जो सीधे सेल के जल्दी Drosophila भ्रूण के सेल संपर्कों पर बल लागू करने के लिए अनुमति देता है, जबकि प्रति सेकंड कई फ्रेम की गति से इमेजिंग. इस तकनीक का लाभ है कि यह भ्रूण में मोतियों की इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है, आमतौर पर मध्यवर्ती जांच जिस पर ऑप्टिकल बलों लागू कर रहे है के रूप में इस्तेमाल किया है । हम कदम के विस्तार से कदम सेटअप के कार्यांवयन, और उपकरणों का प्रस्ताव को प्रयोगों से यांत्रिक जानकारी निकालने के लिए । वास्तविक समय में सेल-सेल संपर्कों के विस्थापन की निगरानी करके, एक तनाव माप प्रदर्शन और सेल संपर्क ' rheology की जांच कर सकते हैं ।

Introduction

भ्रूण विकास एक अत्यधिक reproducible प्रक्रिया है जिसके दौरान कोशिकाओं और ऊतकों को भविष्य के जानवर को आकार ख़राब है । इस तरह के विकृति कोशिका स्तर¹^,²पर बलों की सक्रिय पीढ़ी की आवश्यकता के लिए दिखाया गया है । morphogenetic प्रक्रियाओं को समझने के लिए जिसके दौरान कोशिकाओं और ऊतकों को अपने आकार बदलने के लिए, यह इसलिए शामिल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए कुंजी है, और प्रक्रिया के दौरान ऊतक के भीतर बलों को मापने के लिए³^,⁴ . विशेष रूप से Drosophilaमें उपकला परतों, व्यापक रूप से उनके अर्ध 2d ज्यामिति के कारण और उनके आसान हेरफेर करने के लिए अध्ययन किया गया है.

तकनीक के एक नंबर इस प्रकार हमारे द्वारा विकसित किया गया है और दूसरों के विकास के दौरान vivo में उपकला यांत्रिकी का आकलन करने के लिए. हम उपकला ऊतकों में इस्तेमाल तीन मुख्य तकनीकों का एक त्वरित अवलोकन दे देंगे. लेजर पृथक, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि, सेल जंक्शनों पर स्थानीय यांत्रिक तनाव प्रकट करने के लिए अनुमति देता है⁵^,⁶^,⁷^,⁸ या बड़े पैमाने पर⁹^,¹⁰^,¹¹स्थानीय कटौती है कि लक्ष्य की यांत्रिक अखंडता को बाधित प्रदर्शन करके । कटौती के बाद खोलने की गतिशीलता दोनों तनाव पूर्व पृथक पर जानकारी प्रदान करता है, और ऊतक के rheology पर¹²^,¹³. लेजर पृथक की एक खामी यह है कि यह आक्रामक है, क्योंकि यह सेल प्रांतस्था के स्थानीय व्यवधान की आवश्यकता है । इसलिए, एक केवल ablations की एक सीमित संख्या में प्रदर्शन कर सकते है यदि एक ऊतक अखंडता को बचाना चाहता है । एक और खामी यह है कि ablations केवल सेल संपर्कों में तनाव के सापेक्ष अनुमान प्रदान करते हैं, क्योंकि खुलने का वेग चिपचिपा घर्षण पर निर्भर होता है, जो सामान्यतः ज्ञात नहीं होता है । चुंबकीय हेरफेर भी विकसित किया गया है और Drosophilaमें इस्तेमाल किया, या तो ferrofluids¹⁴ या ultramagnetic liposomes¹⁵के उपयोग को शामिल । वे निरपेक्ष माप¹⁶^,¹⁷प्रदान कर सकते हैं, लेकिन इस अर्थ में भी आक्रामक है कि वे वांछित स्थान पर जांच के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है । इस प्रणाली है, जो हमेशा सटीक इंजेक्शन के लिए उत्तरदाई नहीं है पर निर्भर करता है बहुत मुश्किल हो सकता है । एक तीसरी तकनीक, पूरी तरह से गैर इनवेसिव, बल अनुमान है¹⁸^,¹⁹^,²⁰। बल निष्कर्ष ट्रिपल अंक (tricellular जंक्शनों, या वर्टेक्स) में यांत्रिक संतुलन की धारणा पर निर्भर करता है, और सभी सेल में तनाव का अनुमान करने की अनुमति देता है सेल संपर्कों (और संभवतः, सभी कोशिकाओं में दबाव) एक व्युत्क्रम समस्या को हल करके । तनाव के लिए, प्रत्येक शीर्ष दो समीकरणों (एक्स और वाई) प्रदान करता है । इस पैदावार रैखिक समीकरणों की एक बड़ी प्रणाली है जो कुछ शर्तों के तहत औंधा किया जा सकता है सभी सेल संपर्कों में तनाव का आकलन । हालांकि यह विधि बहुत आकर्षक है, क्योंकि यह केवल एक विभाजित छवि और कोई अतिरिक्त प्रयोग या सेटअप की आवश्यकता है, इसकी सटीकता अभी तक निर्धारित करने के लिए है, और फिर यह केवल सापेक्ष मान प्रदान करता है, जब तक कि एक निरपेक्ष अंशांकन माप किया जाता है ।

इन सीमाओं में से कुछ को दूर करने के लिए, हम इस लेख ऑप्टिकल Drosophila melanogasterके भ्रूण उपकला में कोशिका पैमाने पर नियंत्रित बलों को लागू करने के लिए एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप करने के लिए मिलकर चिमटी का एक सेटअप में परिचय । ऑप्टिकल चिमटी एकल प्रोटीन पर माप और organelles और कोशिकाओं²¹के हेरफेर सहित कई जैविक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है । यहां, हम कुछ दर्जन pN है, जो छोटे अभी तक सेल संपर्कों के स्थानीय विकृतियों को प्रेरित और vivo मेंयांत्रिक माप प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है की सीमा में लागू बलों की रिपोर्ट । आमतौर पर, हम सेल संपर्कों के सीधा विक्षेपन का उपयोग करें, kymographs के विश्लेषण के माध्यम से निगरानी, विरूपण के लिए बल संबंधित है । महत्वपूर्ण बात, हमारे सेटअप के ऊतकों में वांछित स्थान पर मोतियों की इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है, के रूप में ऑप्टिकल चिमटी सीधे सेल सेल संपर्कों पर बलों को लागू करने में सक्षम हैं । एक हल्की चादर माइक्रोस्कोप करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी के युग्मन एक रैपिड इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है (प्रति सेकंड कई फ्रेम), जो कम समय तराजू पर एक यांत्रिक विश्लेषण के लिए बहुत प्रशंसनीय है, और कम phototoxicity के साथ, के रोशन के बाद से नमूना इमेजिंग²²के विमान तक ही सीमित है ।

कुल मिलाकर, ऑप्टिकल चिमटी एक गैर इनवेसिव तरीका Drosophila भ्रूण में vivo में सेल संपर्कों पर नियंत्रण बलों को लागू कर रहे हैं, और इस तरह के सेल संपर्क²³, rheological गुण^{में कठोरता और तनाव के रूप में यांत्रिक जानकारी निकालने के लिए 24}, और ढाल या तनाव के anisotropy²³।

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Protocol

1. सेट अप प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप

पिछले प्रकाशन²⁵में सेटअप का वर्णन करने के लिए देखें ।
नोट: सेटअप एक ईमानदार माइक्रोस्कोप मंच और क्षैतिज विमान में एक प्रकाश चादर का निर्माण एक प्रकाश शीट मॉड्यूल से बना है । एक 10x उत्तेजना उद्देश्य लेंस एक गिलास cuvette (चित्रा 4) में प्रकाश चादर निर्देशन । पता लगाने के उद्देश्य लेंस एक उच्च एनए (१.१) है, जो कुशल tweezing के लिए आवश्यक है (नीचे देखें) ।

2. सेटिंग-अप ऑप्टिकल चिमटी पथ

नोट: चित्रा 1 ऑप्टिकल सेटअप की एक सामान्य योजना देता है.

१०७० एनएम लेजर यूनिट प्लेस और एक वी-क्लैंप माउंट के साथ ऑप्टिकल टेबल पर फाइबर ठीक । सुनिश्चित करें कि फाइबर संधानक ऑप्टिकल तालिका के समानांतर है (इसलिए, क्षैतिज) और यह कि ऊंचाई यहां चयनित सभी ऑप्टिकल ऑप्टिकल मेज पर गठबंधन घटकों के लिए ऊंचाई हो जाएगा ।
नोट: १०० mm इस ऊंचाई के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है ।
अवरक्त लेज़र इकाई की कुंजी को चालू करें और संरेखण सूचक को चालू करने के लिए "Select" बटन दबाएं । प्रकाश फाइबर की क्षैतिज जावक होना है ।
ऑप्टिकल पथ में शटर प्लेस, और यह ऑप्टिकल टेबल को ठीक है, ताकि अवरक्त लेजर बीम शटर के एपर्चर के माध्यम से गुजरता है । सुनिश्चित करें कि ऑप्टिकल तालिका और शटर के एपर्चर के केंद्र के बीच की दूरी चरण २.१ में चुना ऊंचाई है ।
शटर नियंत्रक की कुंजी बारी, तीर के साथ मैनुअल मोड का चयन करें और शटर खोलने के लिए "सक्षम" बटन दबाएँ.
पहले गैल्वेनोमीटर मिरर को लगाएं, संरेखित करें और ठीक करें ।
नोट: दो गैल्वेनोमीटर दर्पण का पता लगाने के उद्देश्य के पीछे एपर्चर करने के लिए संयुग्मित होना चाहिए, ताकि जब दर्पण में से एक घूर्णन है, लेजर बीम उद्देश्य के पीछे एपर्चर के बाहर जाना नहीं है । ध्यान दें कि उद्देश्य के पहले गैल्वेनोमीटर और वापस एपर्चर के बीच की दूरी के उद्देश्य के संबंध में इस गैल्वेनोमीटर की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए गणना की जानी है (f1 + f1 + f2 + f2 + f3 + f3 + f4 + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = १५५० मिमी; fi = लेंस n ° i के फोकल लंबाई) ।
गैल्वेनोमीटर बिजली की आपूर्ति चालू करें । सुनिश्चित करें कि galvanometers संरेखण प्रोटोकॉल के आराम के लिए संचालित कर रहे हैं ।
(NIMAX या ऑप्टिकल नोचना सॉफ्टवेयर के साथ शून्य विक्षेपन के लिए galvanometers सेट-गैल्वेनोमीटर कनेक्शन के लिए चरण 3 देखें).
प्लेस, संरेखित करें और रिले दूरबीन 30 मिमी की एक फोकल लंबाई के साथ दो लेंस से बना तय ।
जगह, संरेखित करें और दूसरा गैल्वेनोमीटर मिरर को ठीक करें । ध्यान दें कि दो galvanometers के बीच की दूरी 4f = 4 x 30 mm = १२० mm (f = फोकल लंबाई) है ।
दूरबीन को लगाएं और ठीक करें ।
नोट: दूरबीन दो लेंस से बना है कि एक चौड़ाई के लिए बीम का विस्तार कम उद्देश्य लेंस के वापस एपर्चर के व्यास के बराबर है । सबसे छोटी फोकल लंबाई के साथ लेंस पहले आना चाहिए ।
प्लेस, संरेखित करें और ऊपर की ओर लाने के पेरिस्कोप को ठीक करने के लिए dichroic मिरर रेल के प्रवेश द्वार के करीब ऑप्टिकल पथ ।
रेल में गर्म दर्पण को ठीक करें, रेल को माइक्रोस्कोप में रखें । सुनिश्चित करें कि रेल दाईं ओर स्वेड है अवरक्त लेजर के प्रवेश द्वार की अनुमति (चित्रा 2) ।
जांच करें कि लेजर प्रकाश माइक्रोस्कोप से बाहर जा रहा है, पहले उद्देश्य के बिना तो उद्देश्य के साथ । पेरिस्कोप के नीचे दर्पण के साथ उद्देश्य से पहले लेजर की स्थिति को सही । पेरिस्कोप के शीर्ष दर्पण के साथ उद्देश्य के बाद लेजर की स्थिति को सही ।
ग्लास cuvette में ५०० एनएम फ्लोरोसेंट मोतियों की 1 µ एल रखो और आसुत जल के 10 मिलीलीटर जोड़ें । cuvette धारक में उद्देश्य के तहत cuvette रखो और उद्देश्य (जेड स्थिति) का ध्यान समायोजित करें ताकि उद्देश्य पानी की सतह को छूता है ।
AOTF, कैमरा और piezoelectric स्टेज को नियंत्रित करने के अधिग्रहण घर का बना सॉफ्टवेयर शुरू करो । micromanager जैसे एक फ्री सॉफ्टवेयर का भी इस्तेमाल किया जा सकता है । "लाइव" पुश-बटन दबाकर लाइव अधिग्रहण मोड चालू करें.
1 डब्ल्यू करने के लिए IR लेजर पावर समायोजित करें ।
चश्मे पर रखो (और प्रयोग के अंत से पहले इसे दूर नहीं) और लेजर पर स्विच । एक मनका लेजर ध्यान में फंस जाना चाहिए ।
1. यदि कोई मनका लेजर ध्यान में फंस गया है, जांच अगर लाल लेजर सूचक (जो IR लेजर के साथ collinear है) उद्देश्य से बाहर आ रहा है । यदि नहीं, तो विशेष चरण २.१३ में, फिर से संरेखण चरण प्रारंभ करें । या, IR लेजर शक्ति बढ़ाएं ।
2. यदि मनका ध्यान से बाहर (इमेजिंग विमान के) फंस गया है, धीरे पिछले दूरबीन के पिछले लेंस की स्थिति को स्थानांतरित ( चित्रा 1में L4) ऑप्टिकल धुरी के साथ इमेजिंग विमान के साथ ध्यान में मनका लाने के लिए । यदि पर्याप्त नहीं है, तो पिछले दूरबीन का पहला लेंस ले जाएं ( चित्रा 1में L3) ऑप्टिकल धुरी के साथ ।
3. यदि फंस मनका छवि में केंद्रित नहीं है, 2 पेरिस्कोप का उपयोग करने के लिए जाल की स्थिति को समायोजित दर्पण । यदि मनका की स्थिति को पहले दर्पण के कोण में बदलकर बदल दिया जाए, तो भी दूसरे दर्पण के इसी कोण को बदलकर किरण की दिशा की भरपाई करें. सही एक्स स्थिति केवल (प्रत्येक दर्पण के लिए 1 पेंच), तो सही Y स्थिति (प्रत्येक दर्पण के लिए 1 पेंच) ।
यदि आवश्यक हो, ध्यान में मनका निरीक्षण करने के लिए 2^{एन डी} दूरबीन लेंस की स्थिति को समायोजित करें ।
यदि आवश्यक हो, पेरिस्कोप के कोण को समायोजित करने के लिए छवि में केंद्रित मनका है दर्पण ।

3. साधन का सामना करना पड़

नोट: चित्रा 3 राष्ट्रीय इंस्ट्रूमेंट्स (एनआई) कार्ड कनेक्शन की एक सामान्य योजना देता है.

चेसिस (cDAQ-९१७८) के पहले स्लॉट में आउटपुट कार्ड (NI-९२६३) डालें. ध्यान दें कि कम से 2 एनालॉग outputs और 3 अनुरूप आदानों के साथ एनआई कार्ड के अन्य मॉडलों का इस्तेमाल किया जा सकता है.
चेसिस के दूसरे स्लॉट में इनपुट कार्ड (NI-९२१५) डालें.
एनालॉग आउटपुट AO0 और BNC केबल्स के साथ एनालॉग इनपुट AI0 करने के लिए पहले गैल्वेनोमीटर कनेक्ट करें । ध्यान दें कि एक टी अनुकूलक एक के लिए 2 BNC केबल कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । गैल्वेनोमीटर चालक बोर्ड पर पिन स्थानीयकरण करने के लिए गैल्वेनोमीटर मैनुअल का संदर्भ लें ।
इसी तरह से दूसरी गैल्वेनोमीटर को AO1 और AI1 से कनेक्ट करें ।
PFI1 (नियंत्रक के पीछे) शटर के ट्रिगर करने के लिए कनेक्ट ।
कैमरे की आग के लिए और AI2 करने के लिए PFI0 कनेक्ट ।
AI3 (नियंत्रक के पीछे) शटर से बाहर ट्रिगर करने के लिए कनेक्ट ।
शटर नियंत्रक की सेटिंग्स समायोजित करें । तीर का प्रयोग करें पैरामीटर मूल्यों को बदलने के लिए और विकल्प को मांय और अगले पैरामीटर के पास करने के लिए "चुनें" बटन धक्का । ०००.००० करने के लिए "समय खुला सेकंड पैरामीटर" रखो, "समय बंद सेकंड" ०००.००० करने के लिए, "मोड" करने के लिए एकल, और "ट्रिगर" करने के लिए EXT. "सक्षम करें" बटन को धकेलने से शटर के नियंत्रण की अनुमति दें ।
ओपन QtCreator (https://www.qt.io/, नि: शुल्क संस्करण से डाउनलोड) ।
नोट: QtCreator एकीकृत विकास वातावरण C++ ऑप्टिकल चिमटी सॉफ्टवेयर में विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया है । क्यूटी पुस्तकालय विगेट्स बनाने के लिए यहाँ प्रयोग किया जाता है.
OT.pro फ़ाइल खोलें (क्यूटी कोड फ़ाइलों में प्रदान की गई) । इस कार्रवाई से प्रोजेक्ट खुलेगा । उपयोग किए गए नी कार्ड (ओं) के अनुसार AOGenerator. cpp फ़ाइल में इनपुट और आउटपुट का नाम बदलें ।
संकलित करें और OT सॉफ़्टवेयर चलाएँ ।

4. मोतियों के साथ ऑप्टिकल ट्रैप स्थिति का अंशांकन

एक अंशांकन फिल्म की रिकॉर्डिंग
1. ग्लास cuvette में ५०० एनएम लाल फ्लोरोसेंट मोतियों की 1 µ एल रखो, तो आसुत पानी की 10 मिलीलीटर के साथ cuvette भरें । चित्रा 4 अवलोकन संदर्भ में cuvette के एक दृश्य देता है ।
2. piezoelectric मंच पर cuvette को ठीक करें ।
3. cuvette की जेड स्थिति को समायोजित करें ताकि पता लगाने के उद्देश्य पानी में डुबकी ।
4. इंफ्रारेड लेजर पर मुड़ें और 1 डब्ल्यू करने के लिए बिजली सेट
5. छवि प्राप्ति सॉफ़्टवेयर चालू करें ।
6. समय चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए, जोखिम समय का चयन करें, लाभ, दो छवियों के बीच का समय, छवियों की संख्या का अधिग्रहण किया जा करने के लिए, और लेजर शक्ति. ध्यान दें कि मोतियों के साथ ऑप्टिकल नोचना अंशांकन के लिए, दीप्ति लेजर (५६१ एनएम) की आवश्यकता नहीं है । अवरक्त लेजर द्वारा प्रेरित 2-फोटॉन प्रभाव एक फंस मनका के प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त है ।
7. ऑप्टिकल चिमटी घर का बना सॉफ्टवेयर शुरू करो ।
8. किसी वृत्त का पता लगाने के लिए ऑप्टिकल चिमटी पैरामीटर्स सेट करें । सेट SamplingRate के रूप में २५० samp/१००० के रूप में bufferSize, Waveform1 पैरामीटर (galvo 1) के रूप में Sinusoidal, nbPeriod 1, आयाम ०.५ v, चरण ०.० रेड, ऑफसेट ०.० v, तरंग 2 पैरामीटर (galvo 2) के रूप में Sinusoidal, nbPeriod 1, आयाम ०.५ v, चरण १.५७ रेड, ऑफ़सेट ०.० v.
9. "एअर इंडिया पैरामीटर" बॉक्स की जाँच करें, और "इसके लिए रुको"... बॉक्स.
10. छवि अधिग्रहण (५०० या १००० छवियों एक उच्च फ्रेम दर, जैसे 10 एफपीएस) के साथ शुरू करो ।
11. "सृजन!" पुश बटन दबाकर ऑप्टिकल चिमटी पर स्विच करें ।
12. फंस मनका की अनुमति देने के लिए पूरी तरह से दो पूर्ण हलकों को पूरा करने और संयुक्त राष्ट्र द्वारा ऑप्टिकल चिमटी रोक "सृजन!" बटन ।
13. छवि अधिग्रहण बंद करो । नोट करें कि कोई tiff चलचित्र और पाठ फ़ाइल गैल्वेनोमीटर वोल्टेज के साथ डिफ़ॉल्ट में बनाए जाते हैं "C:/TEMP/" फ़ोल्डर (जब तक कि कोई कस्टम स्थान निर्दिष्ट किया गया है) । ध्यान दें कि संबद्ध डेटा फ़ाइलों के साथ कई अंशांकन फिल्मों यदि आवश्यक बनाया जा सकता है ।
  1. अगर चक्र पूरा नहीं है, मनका चक्र पथ के दौरान खो दिया है । शायद गति बहुत अधिक है । OT सॉफ्टवेयर में नमूना दर कम करके इसे कम. या, अवरक्त लेजर के लाल लेजर सूचक का उपयोग कर, जांच अगर लेजर उद्देश्य से बाहर पूरे सर्कल पथ के दौरान आ रहा है । यदि नहीं, तो गैल्वेनोमीटर दर्पण उद्देश्य लेंस के पीछे फोकल विमान के साथ संयुग्मित नहीं किया जा सकता है । उद्देश्य के पीछे फोकल विमान के संबंध में galvanometers की स्थिति सही है, फिर से २.५ कदम से संरेखण कदम शुरू ।
14. आयाम शून्य करने के लिए सेट और लेजर पर स्विच करने के लिए एक तय स्थिति में एक मनका जाल. ट्रैप स्थान पर एक मील का पत्थर रखें ।
छवि विश्लेषण के साथ स्थिति प्रक्षेप
1. Matlab खोलें, अंशांकन फ़ोल्डर पर जाएँ, और "position2tension" स्क्रिप्ट चलाएँ (Matlab कोड फ़ाइलों में प्रदान की गई) । इस स्क्रिप्ट के लिए ऑप्टिकल ट्रैप की स्थिति में गैल्वेनोमीटर वोल्टेज अनुवाद प्रक्षेपण समारोह की गणना करता है ।
2. अंशांकन फिल्मों की संख्या का चयन किया जाएगा । कई फिल्में अलग पथ के साथ चुना जा सकता है, इस तरह के दो सीधा दीर्घवृत्त के रूप में. आम तौर पर, एक परिपत्र पथ के साथ एक एकल अंशांकन फिल्म पर्याप्त है ।
3. संवाद बॉक्स (प्रति फिल्म एक संवाद बॉक्स), शोर अनुपात करने के लिए एक स्पष्ट पथ और अच्छा संकेत के साथ दृश्यों में पहली और अंतिम छवि संख्या प्रदान करें ।
4. प्रत्येक फिल्म के लिए अधिग्रहण के दौरान वोल्टेज युक्त पाठ फ़ाइल का पथ प्रदान करें । नोट करें कि स्क्रिप्ट फ़ाइल पढ़ता है और प्रत्येक छवि के लिए दो galvanometers का माध्य वोल्टेज की गणना करता है ।
5. इसी अंशांकन फिल्म का पथ प्रदान करें ।
  नोट: स्क्रिप्ट के मनका एक 2d गाऊसी फिटिंग द्वारा एक उपपिक्सेल संकल्प के साथ प्रत्येक फ्रेम के लिए मनका का पता लगाता है, कस्टम कार्य और²⁶MTT से निकाले कार्यों का उपयोग कर । यह एक मनका पथ दिखा ग्राफ प्रदर्शित करता है ।
6. इसे क्लिक करके किसी भी खराब पता लगाया बिंदु (outliers) को हटा दें ।
7. जांच करें कि एक्स और वाई लेजर पदों के लिए इंटरपोल नक्शा गणना और स्क्रिप्ट द्वारा प्रदर्शित, पूरा हो गया है । अगर वहाँ के एक बहुत कुछ है लापता मूल्यों (मानचित्र में सफेद क्षेत्रों), एक नया अंशांकन फिल्म के साथ आपरेशन दोहराने, शोर अनुपात करने के लिए एक बेहतर संकेत के साथ, या/और galvanometers की एक धीमी गति के साथ.
  नोट: इन छवियों और प्रक्षेपण मान स्वचालित रूप से एक ही फ़ोल्डर में छवि के रूप में, नाम convertFct. mat के साथ सहेजा जाता है ।

5. बढ़ते Drosophila भ्रूण²⁷

एक पिंजरे से Drosophila भ्रूण ले लीजिए, 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
खमीर निकालें, एक चलनी के माध्यम से थाली सामग्री गुजर (ताकना आकार १०० µm के बारे में होना चाहिए) ।
१००% ब्लीच के साथ भ्रूण धो (२.६% सोडियम हाइपोक्लोराइट) ४५ एस के लिए चोरियों को दूर करने के लिए ।
2 मिनट के लिए पानी के साथ भ्रूण धो लो ।
एक ब्रश के साथ एक आगर पैड पर भ्रूण रखो ।
चुनें के बारे में 10 वांछित चरण के अनुसार भ्रूण और एक पाइक या एक नम ब्रश के साथ भ्रूण संरेखित करें ।
नोट: संरेखण हित के क्षेत्र (खोज उद्देश्य के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में ब्याज के क्षेत्र) के अनुसार किया जाना चाहिए ।
एक हीरे की निशानी कलम का प्रयोग, 10 x 20 x 1 मिमी³के एक गिलास स्लाइड का एक टुकड़ा काट ।
कट टुकड़ा के एक तरफ गोंद जोड़ें, और यह 20 एस के लिए सूखी ।
पर काट टुकड़ा बारी और यह भ्रूण की लाइन पर जगह है, यह स्लाइड के किनारे पर रहना ।
नमूना धारक में यह तैयारी स्थापित करें और इसे cuvette में रखें । चित्रा 4 अवलोकन संदर्भ में cuvette के एक दृश्य देता है ।
cuvette को piezoelectric मंच पर रखें ।

6. Vivo में ट्रैपिंग प्रयोग

सेल संपर्कों के फँसाना — दोलनों (चित्रा 5)
1. ऊतक में रुचि के स्थान का पता लगाएं ।
  नोट: एक adherens जंक्शनों के विमान में काम करने की जरूरत है, तो जो cadherins में लेबल कर रहे हैं प्रयोग किया जाता है मक्खियों का उपयोग करना ।
2. जाल की स्थिति पर लक्ष्य जंक्शन के मध्यबिंदु ले जाएं (मील का पत्थर पर सेट 4.1.14) पीजो चरण का उपयोग कर ।
3. संपर्क लाइन के लिए सीधा दोलनों को प्राप्त करने के लिए जाल मापदंडों सेट करें । चरणों को शूंय के रूप में सेट करें । X और Y दिशाओं में आयाम सेट करने के लिए संपर्क लाइन के लिए एक सीधा आंदोलन है । आयाम आमतौर पर ०.१ V होना चाहिए ।
4. अधिग्रहण (जैसे 10 एफपीएस के रूप में एक तेजी से फ्रेम दर, के साथ) शुरू करो ।
5. ऑप्टिकल चिमटी "सृजन!" पुश बटन दबाने पर स्विच करें ।
6. जब किया, चिमटी बंद स्विच और छवि अधिग्रहण बंद करो । एक फिल्म और एक पाठ फ़ाइल अधिग्रहण के दौरान गैल्वेनोमीटर वोल्टेज युक्त अब निर्दिष्ट फ़ोल्डर में प्रकट होना चाहिए ।
7. सेल संपर्कों के फँसाना-pull-रिलीज (चित्रा 6)
8. ऊतक में रुचि के स्थान का पता लगाएं ।
9. पीजो चरण का उपयोग कर लक्ष्य जंक्शन ले जाएं ताकि इसके मध्यबिंदु को आम तौर पर 1 µm से दूर जाल की स्थिति (कदम 4.1.14 पर मील का पत्थर सेट) ।
10. 0 के लिए आयाम सेट करने के लिए एक स्थिर जाल है ।
11. (10 एफपीएस के रूप में एक तेजी से फ्रेम दर, के साथ) छवि अधिग्रहण शुरू करो ।
12. ऑप्टिकल चिमटी "सृजन!" पुश बटन दबाने पर स्विच करें ।
13. वांछित समय के बाद, जाल बंद और होने के लिए छूट के लिए प्रतीक्षा करें ।
14. छवि अधिग्रहण बंद करो । एक फिल्म और एक पाठ फ़ाइल अधिग्रहण के दौरान गैल्वेनोमीटर वोल्टेज युक्त अब निर्दिष्ट फ़ोल्डर में प्रकट होना चाहिए ।
अर्द्ध स्वचालित kymograph पीढ़ी और इंटरफेस की स्थिति का पता लगाने ।
1. Matlab आदेश विंडो में, अंशांकन प्रक्रिया (4b): लोड (' convertFct. mat ') के दौरान जनरेट किया गया प्रक्षेपित नक्शा लोड करें । यह fx और वित्तीय वर्ष चर प्रदान करता है ।
2. Matlab आदेश विंडो में, autokymo (fx, वित्तीय), Matlab कोड फ़ाइलों में उपलब्ध कराए गए चलाएँ । इस समारोह का उद्देश्य लेजर पथ के साथ एक kymograph उत्पन्न करने के लिए है, और प्रत्येक फ्रेम के लिए उपपिक्सेल संकल्प के साथ संपर्क लाइन की स्थिति का पता लगाने के लिए.
3. संकेत पाठ फ़ाइल वोल्टेज मान युक्त पथ का चयन करें ।
4. विश्लेषण करने के लिए चलचित्र के पहले और अंतिम फ़्रेम संख्याओं का चयन करें ।
5. tiff चलचित्र फ़ाइल का चयन करें । दो नए आंकड़े प्रदर्शित किया जाएगा: पहले एक kymograph की एक छवि है । दूसरा एक संपर्क लाइन और लेजर पदों का पता लगाने का एक ग्राफ है, बनाम छवि संख्या ।
  नोट: समारोह के नमूने की स्थिति का प्रतिनिधित्व करने ग्राफ बचाता है और लेजर की स्थिति बनाम छवि संख्या (matlab चित्रा, jpg), kymograph (झगड़ा छवि) और लेजर स्थिति (झगड़ा छवि) के साथ kymograph । स्थिर जाल प्रयोगों के लिए, kymograph के लिए मैन्युअल रूप से किया जाना है, उदाहरण के लिए ImageJ का उपयोग. kymograph से अंतरफलक का पता लगाने के बाद एक ही एल्गोरिथ्म का उपयोग किया जा सकता है ।

7. यांत्रिक माप

कठोरता और तनाव मापन
1. एक दोलन प्रयोग (चरण ६.१) और इसी विश्लेषण (चरण ६.३) समय चूक फिल्म का प्रदर्शन ।
2. साजिश Matlab भूखंड समारोह या किसी भी सॉफ्टवेयर साजिश रचने डेटा का उपयोग कर जाल की स्थिति के एक समारोह के रूप में इंटरफेस की स्थिति ।
  नोट: यह लगभग रेखीय होना चाहिए ।
3. एक रैखिक फिट प्रदर्शन, Matlab "ezfit" नि: शुल्क toolbox या किसी भी सॉफ्टवेयर फिट की अनुमति का उपयोग कर । फिट की ढलान का व्युत्क्रम औसत अनुपात प्रदान करता है ।
4. इंटरफेस है, जो, छोटे विकृति और फंसाने के लिए एक द्विघात क्षमता संभालने के स्पष्ट झुकने कठोरता का अनुमान प्रदर्शन, द्वारा दिया जाता है । जाल कठोरता है (जाल कठोरता अंशांकन के लिए कदम 8 देखें) ।
5. तनाव का अनुमान है, जो²³के रूप में परिभाषित किया जा सकता है प्रदर्शन:
  .
Rheological मापन
1. pull रिलीज़ प्रयोगों (चरण ६.२) और संबंधित विश्लेषण (चरण ६.३) निष्पादित करें
2. परिणामी वक्र कस्टम rheological मॉडल के साथ फ़िट ।

8. जाल कठोरता के अंशांकन

नोट: निरपेक्ष बलों के निर्धारण इंटरफेस पर जाल कठोरता के ज्ञान की आवश्यकता है । यह एक दो कदम प्रक्रिया के माध्यम से मोतियों का उपयोग कर पहुँचा जा सकता है ।

cytosol चिपचिपापन का निर्धारण
1. halocarbon तेल में भ्रूण प्लेस और उंहें फ्लोरोसेंट polystyrene मोती (1:1000 शेयर कमजोर पड़ने, ०.४६ µm व्यास)²³^,²⁷के साथ एक microinjection सेटअप का उपयोग कर सुई ।
2. माइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्शन भ्रूण प्लेस ।
3. cytosol में पाया एकल मोतियों की आवाजाही को ट्रैक. मोती का मतलब वर्ग विस्थापन निकालें (पथ की एक बड़ी संख्या > १०० मोतियों का उपयोग करें) । मतलब वर्ग विस्थापन की ढलान से मनका प्रसार निरंतर निर्धारित करते हैं । स्टोक्स-आइंस्टीन के समीकरण द्वारा चिपचिपाहट को निरंतर प्रसार से संबंधित, cytosol के प्रभावी चिपचिपापन deduce । प्रारंभिक भ्रूण में, लगभग ३.५ Pa. s की चिपचिपापन²³की सूचना है ।
मोतियों पर जाल कठोरता का संकल्प
1. ऑप्टिकल चिमटी के साथ cytosol में ट्रैप एकल मोती ।
2. दो जाल पदों के बीच एक stepwise फैशन में मनका हटो ०.५ µm द्वारा अलग
3. मोती पर जाल कठोरता का निर्धारण, खींचें गुणांक और मनका विश्राम के बीच अनुपात एक जाल की स्थिति से दूसरे के लिए समय के रूप में ।
  नोट: खींचें गुणांक है , जहां चिपचिपापन में निर्धारित (८.१) और मनका त्रिज्या है । विश्राम का समय Matlab या किसी भी सॉफ्टवेयर फिट बैठता है की अनुमति का उपयोग, मनका स्थिति की घातीय फिट बैठता है से प्राप्त की है । जाल कठोरता के विशिष्ट मूल्यों १२० ± ५० pN. µm^-1२०० मेगावाट लेजर उत्तेजना पर हैं ।
सेल इंटरफेस पर ट्रैप कठोरता का निर्धारण
1. एक संपर्क लाइन पर लेजर ध्यान केंद्रित है, और यह (के रूप में 6 कदम में विस्तृत) को मोड़ना । विरूपण आयाम को मापने । यह एक प्रतिनिधि औसत प्राप्त करने के लिए कई संपर्क लाइनों पर दोहराया जाना चाहिए ।
2. कि संपर्क लाइनों के खिलाफ धक्का दिया मोतियों से प्रेरित के साथ उत्पादित विकृति की तुलना करें । के बाद से विरूपण के लिए जाल कठोरता के व्युत्क्रम आनुपातिक है, deduce सेल संपर्कों पर जाल कठोरता ।
  नोट: सेल संपर्कों पर जाल कठोरता आम तौर पर पाया गया था 2-से 3-मोतियों की तुलना में छोटे गुना (०.४६ µm व्यास) ।

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Representative Results

चित्रा 5 के जाल के लिए एक sinusoidal आंदोलन थोप द्वारा प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा से पता चलता है. जाल इंटरफ़ेस का विक्षेपन पैदा करता है, के रूप में 3 स्नैपशॉट 3 क्रमिक इंटरफेस पदों (आंकड़ा 5)²³दिखा द्वारा उदाहरण । दर्ज की गई फिल्मों के लिए एक kymograph (चित्रा 5B) उत्पंन किया जाता है और आगे के लिए उपपिक्सेल संकल्प के साथ इंटरफेस की स्थिति का निर्धारण, प्रत्येक फ्रेम के लिए एक्स दिशा के साथ एक गाऊसी फिट का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । छोटे विकृति के शासन में, जाल और इंटरफेस पदों आनुपातिक (चित्रा 5C) कर रहे हैं । जाल (चित्रा 5d) के सापेक्ष इंटरफेस विक्षेपन के आयाम अंतरफलक तनाव या कठोरता (७.१ कदम देखें) के लिए पहुंच देता है ।

चित्रा 6 खींच जारी प्रयोगों प्रदर्शन द्वारा प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा से पता चलता है. ऑप्टिकल ट्रैप लगभग 1 µm दो कोशिकाओं के बीच अंतरफलक के मध्यबिंदु से दूर पर बंद है, जो इंटरफेस के लिए जाल की स्थिति (चित्रा 6A)²⁴की ओर मोड़ना का कारण बनता है । जाल तो समय की वांछित राशि के बाद बंद है । इंटरफेस (फिगर घमण्ड) की स्थिति xm kymographs (चित्रा 6C) से प्राप्त की है, फिर से गाऊसी प्रत्येक फ्रेम के लिए एक्स दिशा के साथ फिट बैठता है का उपयोग कर । जिसके परिणामस्वरूप ग्राफ की कल्पना की गई rheological मॉडलों की तुलना में किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक मैक्सवेल मॉडल (चित्रा 6D) ।

चित्रा 1: प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप के साथ संयुक्त ऑप्टिकल चिमटी (लाल पथ) सेटअप की योजनाबद्ध । यह आंकड़ा Bambardekar, के. एट अल से संशोधित किया गया है । ²³. प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप, दीप्ति इकाई और पता लगाने इकाई द्वारा रचित, पहले²⁵वर्णित है । ऑप्टिकल चिमटी योजना के लाल भाग के अनुरूप: अवरक्त लेजर एक ऑप्टिकल शटर और 2 galvanometers जो नमूना में जाल की स्थिति को नियंत्रित करने के माध्यम से गुजरता है । इन दोनों के बीच विकार रखने के लिए 2 galvanometers के बीच 1 गुना टेलीस्कोप रखा गया है । फिर, एक दूरबीन २.५-गुना द्वारा बीम के आकार को बढ़ाता है और पेरिस्कोप यह माइक्रोस्कोप की ऊंचाई पर लाता है । अवरक्त लेजर एक dichroic दर्पण के लिए माइक्रोस्कोप धंयवाद का पता लगाने के उद्देश्य में प्रवेश करती है । ऑप्टिकल तत्वों के बीच महत्वपूर्ण दूरी सीधे आंकड़ा में दिया जाता है । पिछले लेंस के बीच दूरी (फोकल लंबाई ५०० मिमी) और उद्देश्य के पीछे एपर्चर ५०० mm है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: घर का बना संशोधित रेल dichroic दर्पण और गर्म दर्पण पकड़े । खुर्दबीन की dichroic मिरर रेल को बाईं ओर से काटकर अवरक्त लेसर के प्रवेश द्वार की अनुमति दी गई है. dichroic दर्पण अवरक्त प्रकाश को दर्शाता है और दृश्यमान प्रकाश (प्रतिदीप्ति) पहुंचाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 3: नी कार्ड के लिए उपकरणों का कनेक्शन । ए ओ: एनालॉग आउटपुट, एअर इंडिया: एनालॉग इनपुट, AO0 और AI0 galvo1 से जुड़े हैं, AO1 और AI1 galvo2 से जुड़े हैं, PFI0 कैमरा की आग से जुड़ा है, AI2 करने के लिए और PFI1 शटर के ट्रिगर से जुड़ा है और AI3 शटर से बाहर ट्रिगर करने के लिए जुड़ा हुआ है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 4: अवलोकन संदर्भ में नमूना धारक । यह आंकड़ा Chardès, सी, एट अलसे संशोधित किया गया है । ²⁵. भ्रूण को ग् coverslip पर मैटीरियल कर रहे हैं । स्लाइड नमूना धारक द्वारा आयोजित किया जाता है । नमूना धारक ग्लास cuvette, piezoelectric चरण के लिए तय धारक द्वारा आयोजित में डाला जाता है । हल्की चादर क्षैतिज होती है और बगल से भ्रूण को रोशन करती है । जांच उद्देश्य लेंस ऊर्ध्वाधर, नमूना ऊपर है, और cuvette में डुबकी ।

चित्रा 5: जाल के sinusoidal आंदोलन द्वारा लगाया इंटरफेस विक्षेपन. यह आंकड़ा Bambardekar, के. एट अल²³से संशोधित किया गया है । (क) जाल अंतरफलक के लिए sinusoidally सीधा ले जाया जाता है । जाल और इंटरफेस पदों xt और xm, क्रमशः कर रहे हैं । सही पैनलों विभिंन पदों पर इंटरफेस के तीन चित्र दिखाते हैं । लेजर ट्रैप की स्थिति पीले arrowhead द्वारा चिह्नित है । इंटरफेस एक झिल्ली मार्कर के साथ लेबल कर रहे हैं (GAP43:: mcherry). (ख) जाल आंदोलन की दिशा द्वारा परिभाषित अक्ष के साथ Kymograph (सीधा अंतरफलक के लिए) (अवधि = 5 एस) । (ग) दोनों जाल (लाल ठोस लाइन) और इंटरफेस पदों (काले ठोस लाइन) दिखा समय बनाम विक्षेपन की प्रतिनिधि साजिश । (घ) लेजर दोलन के कुछ चक्रों के दौरान ट्रैप की स्थिति के एक समारोह के रूप में इंटरफेस की स्थिति (आयाम = ०.५ µm, अवधि = 2 एस). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 6: पुल रिलीज प्रयोगों में इंटरफेस विक्षेपन । यह आंकड़ा Serge, ए, एट अलसे संशोधित किया गया है । ²⁴. (क) जाल अंतरफलक के मध्यबिंदु से एक दूरी पर बंद है, तो फिर से स्विच । (ख) जाल और इंटरफेस पदों क्रमशः xt और xm हैं । Kymographs एक्स दिशा के साथ उत्पंन कर रहे हैं, सीधा संपर्क लाइन के मध्यबिंदु के लिए । (ग) एक पुल रिलीज प्रयोग की Kymograph । कक्ष संपर्क Utrophin:: GFP के साथ लेबल किए गए हैं । (घ) दोनों जाल (बिंदीदार लाल/हरी लाइनों) और इंटरफेस की स्थिति (काले ठोस लाइन) दिखा समय बनाम विक्षेपन की प्रतिनिधि साजिश । ठोस लाल रेखा से पता चलता है एक फिट एक मैक्सवेल का उपयोग कर प्राप्त rheological मॉडल²⁴की तरह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक मूवी 1: Tweezing प्रयोग. पिक्सेल आकार = १९४ एनएम, 10 एफपीएस, ट्रैप दोलन अवधि = 2 एस, लेबलिंग: Gap43:: mCherry । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

ऑप्टिकल चिमटी एक गैर इनवेसिव तरीके से विकासशील भ्रूण उपकला में सीधे पूर्ण यांत्रिक माप प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं । उस अर्थ में, यह ऐसे लेजर पृथक, जो आक्रामक है और रिश्तेदार माप, चुंबकीय बलों, जो इंजेक्शन, या बल निष्कर्ष है, जो मजबूत मांयताओं पर निर्भर करता है और भी रिश्तेदार प्रदान की आवश्यकता के रूप में अंय तरीकों से अधिक लाभ प्रस्तुत माप.

प्रोटोकॉल कुछ महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है । सबसे पहले, के रूप में उद्देश्य लेंस रंगीन वाकया दिखा सकते है और यह है कि लेजर ट्रैप वस्तु धक्का "" बहाव, यह महत्वपूर्ण है कि जांच करने के लिए कि IR लेजर इमेजिंग विमान में मनका, और अंततः इसके लिए सही (२.१८ कदम) । दूसरा, विधि सेल ' संपर्कों की स्थिति की माप पर निर्भर करता है । यह इस प्रकार के लिए एक उच्च विपरीत फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग महत्वपूर्ण है ।

उद्देश्य लेंस की गुणवत्ता और लेजर बीम प्रभावी फंसाने के लिए महत्वपूर्ण हैं । उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर १.० से अधिक होना चाहिए । यदि फँसाना अप्रभावी है, सुनिश्चित करें कि लेजर बीम उद्देश्य लेंस के रियर एपर्चर भरता है ।

हमारी विधि कई सीमाओं के साथ आता है । सबसे पहले, यह स्पष्ट नहीं है कि वास्तव में ऑप्टिकल ट्रैपिंग के लिए समर्थन प्रदान करता है । हालांकि अपवर्तन सूचकांक का एक बेमेल का पता चला है, इसका मूल निर्धारित किया जाना है । दूसरा, अंशांकन प्रक्रिया, अगर एक निरपेक्ष माप में रुचि है, थोड़ा थकाऊ हो सकता है, क्योंकि यह निष्क्रिय microrheology प्रयोगों की आवश्यकता है, और मोतियों पर जाल कठोरता के अंशांकन । यह पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोशिका संपर्कों पर कठोरता के अंशांकन प्रयोगात्मक अनिश्चितता के अधीन है: यह मोतियों पर जाल कठोरता की माप पर निर्भर करता है, जो केवल cytosol में मापा जा सकता है, लेकिन सेल संपर्कों के पास नहीं. तीसरा, यह स्पष्ट नहीं है कैसे बहुमुखी ऑप्टिकल चिमटी हो सकता है । हालांकि वे Drosophila भ्रूण में कोशिकाओं ख़राब करने में सक्षम हैं, अन्य ऊतकों उच्च तनाव या अधिक कठिन पहुँच मौजूद हो सकता है (जैसे एक छल्ली के माध्यम से जा रहा है) और इसलिए कम ऑप्टिकल tweezing के लिए उत्तरदायी हो.

ऑप्टिकल बलों छोटे है (< कुछ दसियों के pN) और इस प्रकार ख़राब कड़ा या अत्यधिक दसियों संरचनाओं के लिए अपर्याप्त हो सकता है । बड़े कणों पर चुंबकीय चिमटी शायद इस मामले में अधिक प्रभावी होगा ।

हम यहां एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप के लिए ऑप्टिकल चिमटी के युग्मन वर्णित है, लेकिन ऑप्टिकल चिमटी इस तरह के एक epifluorescence या एक फोकल कताई डिस्क माइक्रोस्कोप के रूप में, सूक्ष्मदर्शी के अंय प्रकार के लिए युग्मित किया जा सकता है । माइक्रोस्कोप में आईआर फँसाने लेजर की शुरूआत माइक्रोस्कोप विन्यास पर निर्भर करता है. यह मुख्य रूप से एक dichroic के लिए इमेजिंग और ऑप्टिकल हेरफेर के लिए पथ गठबंधन दर्पण जोड़ने की संभावना की आवश्यकता है । सबसे सूक्ष्म कंपनियों मॉड्यूलर रोशनी प्रणालियों का प्रस्ताव, एक दो परत मॉड्यूल है, जो इस संयोजन की अनुमति के साथ ।

कई दिशाओं में सुधार या तकनीक का उंनयन मौजूद हैं । एक संभावना कई पदों के बीच लेजर निवास समय विभाजित करने के लिए या अधिक उन्नत होलोग्राम तकनीक का उपयोग करने के लिए, कई जाल का उत्पादन करने के लिए है । यह लक्ष्य कक्षों या कक्ष संपर्कों पर अधिक जटिल बल प्रतिमान बनाने की अनुमति दे सकता है । एक और सुधार के लिए झुकाव की वजह से और जाल की स्थिति के बीच एक वास्तविक समय प्रतिक्रिया डिजाइन हो सकता है । यह उचित रेंगना प्रयोग है जिसमें लागू बल प्रयोग भर में निरंतर बनाए रखा है अनुमति सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम एक FRM लैस ग्रांट FRM DEQ20130326509, Agence राष्ट्रीयकृत डे ला सभ्य ANR-ब्लैंक ग्रांट, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (टू पी.-F.L.) द्वारा समर्थित किया गया । हम फ्रांस-इमेजिंग फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (ANR-10-INBS-04-01, «भविष्य» के लिए निवेश) द्वारा समर्थित बुनियादी ढांचा स्वीकार करते हैं । हम तकनीकी सहायता के लिए PICSL-एफबीआई के बुनियादी ढांचे से ब्राईस Detailleur और क्लाउड Moretti का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW	IPG Laser	YLM-10-LP-SC	including collimator LP: beam D = 1.6 mm and red guide laser
Ø1/2" Optical Beam Shutter	Thorlabs	SH05
Small Beam Diameter Galvanometer Systems	Thorlabs	GVS001	1 for X displacement, 1 for Y displacement
1D or 2D Galvo System Linear Power Supply	Thorlabs	GPS011	galvanometers power supply
2 lenses f = 30 mm	Thorlabs	LB1757-B	relay telescope between 2 galva
Lens f = 200 mm	Thorlabs	LB1945-B	2.5X telescope
Lens f = 500 mm	Thorlabs	LB1869-B	2.5X telescope
Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes	Thorlabs	KCB1E	Periscope
Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style	Thorlabs	LG1
45° AOI, 50.0 mm Diameter, Hot Mirror	Edmund Optics	#64-470
Multiphoton-Emitter HC 750/S	AHF	HC 750/SP
CompactDAQ Chassis	National Instruments	cDAQ-9178
C Series Voltage Output Module	National Instruments	NI-9263	Analog output module
C Series Voltage Input Module	National Instruments	NI-9215	Analog input module
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids	ThermoFisher Scientific	F8812	calibration beads
C++ (Qt) home made optical tweezers software			developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview

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References

Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).
Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).

Developmental Biology

Drosophila भ्रूण में मनका मुक्त ऑप्टिकल चिमटी के साथ सेल यांत्रिकी की जांच

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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