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Biochemistry

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/57901
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Summary

Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

Abstract

O instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo biológico no alto fluxo Isotope Reactor de Oak Ridge National Laboratory dedica-se à investigação de materiais biológicos, processamento de biocombustíveis e materiais bio-inspirado cobrindo nanômetros para escalas de comprimento do micrômetro. Os métodos apresentados aqui para investigar propriedades físicas (ou seja, o tamanho e forma) de proteínas de membrana (aqui, MmIAP, um intramembrane aspartil protease de Methanoculleus marisnigri) em soluções de formação de micela detergentes são well-suited para este instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo, entre outros. Outras técnicas de caracterização biofísica são prejudicadas por sua incapacidade de abordar as contribuições de detergente em uma estrutura complexa de proteína-detergente. Além disso, o acesso ao laboratório de Bio-Deuteration fornece recursos exclusivos para a preparação de cultivos em grande escala e expressando proteínas deutério-labeled pelo sinal de maior dispersão da proteína. Enquanto esta técnica não fornece detalhes estruturais em alta resolução, a lacuna de conhecimento estrutural para proteínas de membrana contém muitas áreas endereçáveis de pesquisa sem a necessidade de resolução atômica perto. Por exemplo, estas áreas incluem a determinação dos Estados oligoméricos, a formação do complexo, a mudanças conformacionais durante a perturbação e eventos de dobradura/revelação. Estas investigações podem ser facilmente realizadas através de aplicações deste método.

Introduction

Proteínas da membrana são codificadas por um estimado de 30% de todos os genes1 e representam uma forte maioria de alvos para drogas medicinais modernos. 2 estas proteínas executam uma grande variedade de funções celulares vitais,3 mas apesar da sua abundância e importância — representam apenas cerca de 1% do totais estruturas depositados na organização da pesquisa para proteína de Bioinformática estrutural (RCSB) Banco de dados. 4 devido à sua natureza parcialmente hidrofóbica, determinação estrutural de proteínas de membrana-limite tem sido extremamente desafiador. 5 , 6 , 7

Como muitas técnicas biofísicas exigem monodisperso partículas em solução para medição, isolando as proteínas de membrana de membranas nativas e estabilizar estas proteínas em um mímico solúvel das membranas nativas tem sido uma área ativa de pesquisa em recentes décadas. 8 , 9 , 10 estas investigações levaram ao desenvolvimento de muitos conjuntos de romance anfifílica para solubilizar as proteínas de membrana, tais como nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 e amphipols. 16 , 17 no entanto, o uso de detergentes micelas continua a ser uma das abordagens mais comuns e simples para satisfazer os requisitos de solubilidade de uma determinada proteína. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 -infelizmente, nenhum único detergente ou mistura mágica de detergentes existe atualmente que satisfaça todas as proteínas de membrana; assim, estas condições devem ser empiricamente selecionadas para os requisitos exclusivos de cada proteína. 26 , 27

Detergentes auto-montagem na solução acima da concentração crítica micelle para formar estruturas agregadas chamadas micelas. Micelas são compostas de muitos monômeros detergentes (normalmente variando de 20-200) com cadeias alquila hidrofóbicas, formando um núcleo micelle e grupos cabeça hidrofílicos, dispostos em uma camada de casca micelle enfrentando o solvente aquoso. O comportamento de detergentes e formação micela foi classicamente descrito por Charles Tanford em O efeito hidrofóbico,28 e tamanhos e formas das micelas de detergentes usados em estudos de proteínas de membrana têm sido caracteriza-se usando o pequeno ângulo espalhamento. 29 , 30 organização de detergente sobre as proteínas de membrana também tem sido estudada, e a formação de complexos proteína-detergente (PDCs) é esperada com moléculas de detergente em torno da proteína em um arranjo que se assemelha o detergente puro micelas. 31

Um adicionado a vantagem em usar detergentes é que as propriedades de micela resultante podem ser manipuladas, incorporando outros detergentes. Muitos detergentes exibem uma mistura ideal, e selecione Propriedades de micelas mistas nem podem ser previstas a partir os componentes e a proporção de mistura. 22 no entanto, a presença de detergente pode ainda apresentar desafios para caracterizações biofísicos, contribuindo para o sinal global. Por exemplo, com raio-x e técnicas de espalhamento de luz, sinal de detergente no PDC é praticamente indistinguível da proteína. 32 investigações com single-particle cryo-microscopia (cryo-EM) normalmente contam com partículas (congeladas) presas; detalhes estruturais da proteína ainda são obscurecidos por determinados detergentes ou uma alta concentração de detergente, que acrescenta ao fundo. 33 abordagens alternativas para interpretar a estrutura completa do PDC (incluindo o detergente) foram feitas através de métodos computacionais que visam reconstruir o detergente em torno de uma proteína de membrana determinado. 34

Para o caso de dispersão de nêutrons, o arranjo de núcleo-casca de detergente no micelle produz um fator de forma que contribui para a dispersão observada. Felizmente, componentes de solução podem ser alterados, tal que eles não contribuem para a dispersão líquida observada. Este processo de "correspondência de contraste" é conseguido pela substituição de deutério de hidrogênio obter uma densidade de comprimento de dispersão que corresponde do fundo (tampão). Uma escolha criteriosa de detergente (com contrapartes deuterados disponíveis) e sua proporção de mistura devem ser considerados. Para detergentes micelas, essa substituição pode ser realizada usando um detergente com o mesmo grupo de cabeça mas tendo uma cadeia deuterado (d-cauda em vez de h-cauda). Uma vez que os detergentes são bem misturados,35 seus agregados terá uma densidade de comprimento de dispersão que é a fração molar-ponderada média dos dois componentes (h-caudas e d-caudas). Quando este contraste médio é consistente com a do grupo principal, as estruturas de agregação uniformes podem ser correspondidas totalmente para remover todas as contribuições para dispersão observada.

Apresentamos aqui um protocolo para manipular o contraste de nêutrons de micelas detergentes pela incorporação de moléculas de detergente quimicamente idênticas com cadeias alquila deutério-rotulados. 19 , 36 , 37 isto permite completo contraste simultâneo de correspondência do micelle núcleo e casca, que é um recurso exclusivo de dispersão de nêutrons. 35 , 38 com este significativamente refinado nível de detalhe, correspondência de contraste pode habilitar caso contrário inviáveis estudos de estruturas de proteínas de membrana. Além disso, esta abordagem de correspondência de contraste pode ser estendida para outros sistemas que envolvem detergente, como polímero troca reações dispersantes óleo-água e39 ,40 ou até mesmo outros agentes solubilizante, tais como bicelles,41 nanodiscs,42 ou bloco de copolímeros. 43 A abordagem semelhante como descrito neste manuscrito, mas empregando uma única espécie de detergente com substituições de deutério parcial sobre o grupo alquila de cadeia e/ou cabeça, foi recentemente publicada. 37 enquanto isso pode ser esperado para melhorar a distribuição aleatória de hidrogênio e deutério em todo o detergente em comparação com a abordagem apresentada aqui, o número limitado de posições disponíveis sobre o detergente para substituição e em duas etapas síntese de detergente necessário coloca desafios adicionais para a consideração.

As etapas 1 e 2 do Protocolo detalhado abaixo muitas vezes sobrepõem-se desde o planejamento do experimento inicial deve ser feito para apresentar uma proposta de qualidade. No entanto, a apresentação de proposta é considerada aqui como o primeiro passo para enfatizar que esse processo deve ser iniciado bem antes de um experimento de nêutrons. Também deve ser notado que um passo pré-requisito, que deve ser demonstrado pela proposta, é a caracterização bioquímica e física (incluindo pureza e estabilidade) da amostra apoiando a necessidade de estudos de nêutrons. Uma discussão geral do ângulo pequeno neutrão espalhamento (SANS) está além do escopo deste artigo. Uma introdução breve, mas completa está disponível na obra de referência, Caracterização de materiais por Kaufmann,44 e uma abrangente livro focado em pequeno ângulo solução biológica dispersando recentemente tem sido publicado. 45 -mais leitura recomendada é dado na seção de discussão. Dispersão de ângulo pequeno usa o vetor de dispersão chamado Q como a quantidade de central que descreve o processo de espalhamento. Este artigo usa a definição amplamente aceita Q = 4π sin (θ) / λ, onde θ é meio o ângulo entre o feixe de entrada e dispersado e λ é o comprimento de onda da radiação de nêutron em Angstroms. Outras definições existem que uso diferentes símbolos tais como está ' para o vetor de dispersão e que podem diferir por um fator 2 π ou usando nanômetros no lugar de Angstrom (Veja também a discussão da Figura 10).

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Protocol

1. preparar e apresentar um nêutron instalação feixe tempo e proposta de instrumento

  1. Consulte os recursos online para identificar instalações de dispersão de nêutrons que fornecem acessar de tempo de feixe de nêutrons usuário geral, como Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mapa de nêutrons facilidades e informações sobre pesquisa de nêutrons em todo o mundo está disponível online. 46 estar ciente de que estas instalações têm tipicamente regulares convites à apresentação de propostas; Isto determina quando a próxima viga estará disponível. Nêutrons são usados para uma variedade de aplicações; Pesquisar por instrumentos de espalhamento (SANS) ângulo pequeno neutrão, particularmente aqueles com capacidades para amostras biológicas.
  2. Use os recursos fornecidos pelas instalações de nêutrons para ajudar a navegar o processo de submissão de proposta de tempo feixe nêutrons. Consulte com um cientista de dispersão de nêutrons (NSS) que está associado com o instrumento para o qual você irá aplicar. Rever as informações atuais da facilidade nêutrons sobre chamadas de proposta, prazos e conselhos para apresentação; Oak Ridge está disponível on-line. 47 apresente a proposta de tempo de feixe seguindo todas as orientações para uma apresentação bem sucedida.
  3. Se deuterado proteína é requerido (ver 2.2), instalações de dispersão de nêutrons são suportadas frequentemente pelos laboratórios e experiência dedicada à produção de materiais deuterados. Para solicitar acesso ao laboratório da Bio-Deuteration (BDL) em ORNL, selecione o BDL como o segundo instrumento no sistema de proposta. Enquanto a proposta de SANS é revista para viabilidade e por um Comitê de revisão científica, BDL solicitações somente são selecionadas para viabilidade. Para ajudar com a análise de viabilidade BDL, apresentar uma informação preenchido pedido formulário48 que descreve o protocolo de expressão de proteínas e rendimento estimado (disponível on-line).
  4. Após a bem sucedida revisão da proposta de altura da viga, confirme a data premiada do tempo de feixe com antecedência o experimento. Certifique-se de que todos os detalhes de amostra e buffer e fórmulas são listadas corretamente na proposta de revisão adequada. Quaisquer alterações para o plano experimental proposto, incluindo alterações na composição da amostra e buffer, exigem notificação da instalação.
    Nota: As alterações devem ser discutidas tão logo quanto possível com o NSS atribuído.

2. determinar o Neutron contraste Match Points e contraste necessário para a medição da proteína

  1. Reunir informações (a partir de bases de dados online informações sobre o produto do fornecedor, valores publicados, etc.) relativas às composições atômicas e volumes para os componentes do sistema de detergente a ser correspondido por contraste. Esta informação é usada para determinar densidades de comprimento de dispersão de nêutrons (SLDs) e contraste, portanto, pontos de partida (CMPs) em solução, que é fundamental para obter qualidade SANS informações dados e estrutural para a proteína de membrana de interesse no contexto de uma PDC. Uma tabela Resumindo os pontos de partida de propriedades e contraste físicos para detergentes usados em estudos biofísicos de proteínas de membrana é incluído (tabela 1).
  2. Determinar o neutron SLDs usando o aplicativo web MULCh: módulos para análise a de contraste variação dados49 (disponível on-line50 livre-de-carga). Um link para o manual do utilizador está localizado na página inicial. Acessar o site e ler a documentação que o acompanha. Figura 1 e Figura 2 fornecem uma visão geral de contraste módulo de entrada e saída para dois exemplos relacionados.
    Nota: Outros sites de cálculo SLDs estão disponíveis, como o mantido pelo Instituto Nacional de padrões e tecnologia (NIST) centro de investigação de nêutrons. 51
    1. Abra o módulo de contraste clicando em 'Contraste' localizado no painel de navegação esquerdo. Fornecer um texto para um título do projeto e inserir os dados abaixo para dois componentes (por exemplo, detergente grupo cabeça e cauda) como ' subunidade 1' e ' subunidade 2'.
    2. Insira a fórmula molecular para cada componente na caixa de texto 'Fórmula'.
      Nota: O botão de rádio estou ' deve ser selecionada em 'Tipo de substância' para inserir uma fórmula molecular. Além disso, use a letra 'X' na fórmula para indicar os átomos de hidrogênio prontamente trocáveis. Sequências de DNA, RNA ou proteína podem ser inseridas se a correspondente 'P', 'R', ou tinha ' botões de rádio são selecionados. Se várias cópias de um componente existem dentro da subunidade, o valor para 'Nmolecules' pode ser alterado em conformidade. Um exemplo prático aqui refere-se aos lipídios, como detergentes contendo duas caudas idênticas, permitindo a fórmula para uma cauda ser inserida com Nmolecules igual a 2.
    3. Insira o volume em Angstroms cúbicos para cada componente na caixa abaixo o 'Volume (Å3)'. Uso fórmula28 do Heberle para cadeias alquila de comprimento n, V-cauda = 27,4 + n * 26,9, para calcular o volume aproximado de cauda, ou obter volumes moleculares de informações sobre o produto fornecido ou publicados valores em a literatura.
    4. Inserir os dados para componentes de reserva. Alterar o número dissolvido espécies no solvente usando o menu suspenso para adicionar ou remover linhas para cada componente de reserva. No caso de formação de micela detergentes, incluem os monómeros detergentes livre como componentes de reserva separada na concentração de micelle crítico do detergente (CMC).
    5. Clique em 'Enviar' para executar os cálculos de contraste de nêutrons e gerar uma página de resultados que fornece uma tabela de dispersão comprimento densidade e contraste pontos de partida, bem como fórmulas para a determinação desses parâmetros em qualquer determinado percentual de D2O em o buffer. Rever os parâmetros de dispersão com especial atenção para os componente CMPs. Se os pontos de partida são semelhantes (dentro de 10% D2O) e a concentração livre micelle é baixa e, em seguida, a média CMP pode ser utilizados para correspondência de contraste as contribuições de detergente. Na maioria dos casos, o CMP do detergente grupo cabeça e cauda serão diferentes em mais de 10-15%, produzindo um fator de forma de núcleo-casca nos dados de SANS que ofusca a recolha directa do sinal do espalhamento da proteína sozinho.
  3. Avalie o contraste entre o detergente grupo cabeça e cauda. Quando o detergente principal grupo e alquil cadeia cauda CMPs não são bem-acompanhado, a disponibilidade e a incorporação de um detergente de deutério-substituídos podem permitir dispersando as densidades de comprimento de selecionar os componentes a ser manipulado. Na maioria dos casos, isso exigirá formando uma micela mista através da incorporação de um detergente idêntico com cadeias alquila deutério-substituídos. A adição de deutério aumenta a densidade de comprimento de dispersão do núcleo formado pelas caudas de cadeia alquila. O ponto de extremidade desejado, neste caso, é tal que a cabeça do grupo shell CMP e núcleo de cadeia alquil CMP tem valores aproximadamente iguais.
    1. Levante o CMP do núcleo micelle detergente para ser aproximadamente igual da CMP de shell do grupo cabeça, determinando a relação apropriada de mistura entre h-caudas e d-caudas que atinge o completo contraste correspondência com os grupos de cabeça. Um pré-requisito para esta determinação é conhecimento da CMP para uma cauda de cadeia alquil deutério-substituídos. Uma contrapartida comercialmente disponíveis para n-dodecil-β-D-maltoside (DDM) está disponível com hidrogênio de cadeia alquil todo substituído por deutério (d25-DDM). Repita os cálculos de contraste descritos no passo 2.1 para uma cauda tinha ' no lugar 'h-cauda'.
    2. Calcule a relação de mole de h-cauda a cauda d necessária para correspondência de contraste com o grupo cabeça CMP. A fórmula a seguir pode ajudar com esta determinação:
      CMPcabeça = CMPh-cauda * χh-cauda + CMPd-cauda * χd-cauda
      onde a CMP é a densidade de comprimento de espalhamento e χ é a fração de volume para o componente de detergente cabeça, cauda-h, ou d-cauda. Para soluções em buffer da DDM, incorporação de 44% em peso (43% por mole) do detergente total como d25-DDM com cadeias alquila deutério-substituídos produz um único CMP em 48,5% D2O para componentes de cabeça e caudos.
  4. Considere o grau de substituição de deutério para a proteína de membrana. Para medir o suficiente sinal de dispersão da proteína, a CMP para a proteína deve ser de pelo menos 15% D2O em solução longe do detergente CMP e condições de medição. O sinal aumenta com o quadrado desta diferença de %. Desde que o CMP de uma proteína sem rótulo normalmente ocorre com ~ 42% D2O em solução (semelhante a muitos grupos de cabeça detergentes um CMP), deutério rotulagem da proteína é quase sempre uma necessidade. 52

3. express e purificar a proteína de membrana de interesse

  1. Preparar meio LB (caldo lisogenia) e crescer Escherichia coli (e. coli) células abrigando um vetor de expressão inducible da sequência da proteína alvo.
    1. Prepare a mídia mínima. H2O ou D2O, dissolver 7,0 g/L (NH4)2então4, 5,25 g/L, Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, citrato de hidrogênio diamónio 0,50 g/L, glicerol 5,0 g/L, 1,0 mL/L de 20% w/v MgSO 4·7H2O e 1,0 mL/L de metais de traço Holme (0,50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/L de CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22,3 g/L at2EDTA·2H,2O e 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Preparar soluções adequadas de estoque de antibióticas, usando H2O ou D2O.
    3. Prepare uma solução stock de isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside usando H2O ou D2O.
    4. Estéril-filtro todas as soluções em secam, recipientes esterilizados usando vácuo garrafa-top e seringa de filtros com um tamanho de poros de 0,22 micron.
  2. Adaptar-se as células de Escherichia coli deutério-rotulado médio anteriores ao aumentar para superexpressão de uma proteína deuterada.
    1. Inocule 3 mL de meio LB com uma colônia isolada de uma placa de ágar caldo lisogenia (LB) ou células de um estoque de glicerol congelado. Desenvolvem-se células a 37 ° C numa incubadora de agitação a 250 RPM ou reduzir a temperatura de 30 ° C ou abaixo para evitar o crescimento excessivo da cultura quando incubando durante a noite.
      Nota: O procedimento de adaptação pode ser variado. 55 , 56 , 57
    2. Uma vez que a cultura LB tem crescido a uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1, diluí-lo 01:20 em 3 mL de meio mínimo de H2O e crescem a um OD600 ~ 1. Repita as 01:20 diluições com meio mínimo contendo 50, 75 e 100% D2Ó (ou até a porcentagem desejada de2O D).
      Nota: como o D2O teor é aumentou, taxas de crescimento irão diminuir. A relação entre a porcentagem de2O D na substituição de mídia e deutério crescimento da proteína tem sido relatada na literatura. 58 , 59 , 60
    3. Continue a crescer a cultura em um biorreator para aumentar o rendimento de massa celular deuterado (Figura 3).
      Nota: Procedimentos passo a passo para a operação do biorreator foram revistos em outro lugar. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Colheita e lyse pilhas de Escherichia coli para purificação de extração e proteínas de membrana
    1. As células de pelotas por centrifugação a ~ 6.000 x g durante 30-45 min a 4 ° C.
    2. Suavizar o centrifugado por imersão em buffer no gelo para ~ 30 min. Então, suavemente resuspenda o pellet de células no buffer pipetando suavemente com uma pipeta sorológica, ou suave balançar sobre um roqueiro 2D, para uma concentração final de 1 ~ g celulares molhado massa/10 mL de tampão.
      Nota: um buffer de exemplo é 50 mM HEPES (ácido 4 de-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic), pH 7,5, 200 mM NaCl suplementado com um comprimido de inibidor de protease.
    3. Lyse pilhas ressuspensa com três passagens através de um homogeneizador de alta pressão de 10.000 psi enquanto o fluxo de refrigeração.
      Nota: Dependendo da escala necessária, outros métodos de Lise podem ser usado (por exemplo, pela imprensa francesa ou sonication).
    4. Detritos de célula da pelota por centrifugação a ~ 4.000-5.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Repita este passo até que o sobrenadante é esclarecido.
    5. Se (~ 150.000 x g durante 30-45 min) o sobrenadante da etapa anterior, que contém o solúvel e fracções de membrana. O sedimento após ultracentrifugação contém a fração de membrana.
    6. Resuspenda o pellet de membrana em um grande homogenizacao homogenizador e isolar a fração de membrana novamente por ultracentrifugação (etapa 3.3.5). Repita este passo pelo menos uma vez para remover proteínas frouxamente ligadas.
    7. Solubilize membranas tocando rock suave para ~ 30 min a 4 ° C em um buffer contendo detergente adequado para a purificação. Solubilização é aparente quando a suspensão gira de nublado para transparente. Remova o material insolúvel por ultracentrifugação (~ 150.000 x g durante 30-45 min).
      Nota: Um buffer de exemplo é 50 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM de NaCl, imidazol 20mm e 4% (p/v) DDM para purificação por cromatografia de afinidade do Ni2 + .
  4. Purifica a proteína seguindo um protocolo previamente desenvolvido para formas protonadas.
    Nota: Ver neto et al . para um protocolo de depuração de exemplo para um hexahistidine com a tag M. marisnigri JR1 intramembrane aspartil protease (d-MmIAP). 65 o rendimento final era ~ 1 mg de deuterado de crescimento de cultura de células deuterado 5 L, que foi usado no experimento de SANS (Figura 4).
  5. Troca a proteína purificada para o Buffer de troca"Final" para a correspondência de contraste.
    1. Preparar 200 mL de "Buffer de câmbio Final" contendo a mistura correta para contraste de correspondência, por exemplo,20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM de NaCl e 0,05% total DDM (0,028% DDM e 0,022% d25-DDM) em 49% D2O.
    2. Equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho com > 2 volumes de coluna (CV) de "Buffer de câmbio Final" em 3.5.1 usando um sistema rápido proteína líquida cromatografia (FPLC).
    3. Após a injeção da amostra, executar a coluna e isolar frações correspondente à proteína de interesse.
    4. Concentre a proteína para a concentração final desejada (2-5 mg/mL).
      Nota: Um volume de ~ 300 μL é exigido para preencher uma cubeta de quartzo cilíndrica 1 mm usada para SANS.
    5. Reserve uma parte alíquota do buffer correspondente para SANS subtração de fundo.
      Nota: A alíquota pode ser tomada diretamente do buffer preparado, ou idealmente de uma fração de eluição limpo no final da execução de FPLC.

4. fazer os preparativos finais para tempo de feixe e coletar sem dados

  1. Depois que a proposta foi aceite e acesso ao site tenha sido aprovado, complete a formação necessária com antecedência o tempo atribuído feixe. Isso inclui prearrival, bem como laboratório radiológico, no local e formação de instrumento específico de treinamento baseado na web.
    Nota: Requisitos de formação pode ditar a chegada antecipada para usuários iniciantes. Mais informações estão disponíveis online. 66
  2. Carregar amostras e buffers para coleta de dados.
    Nota: Uma visão geral sobre a dispersão de nêutrons de pequeno ângulo biológico (Bio-SANS) área de ambiente de amostra instrumento é mostrada na Figura 5.
    1. Carregar amostras e buffers em células de quartzo. Células de quartzo estão disponíveis a partir do cientista de instrumento ou instalação. Use gel de carregamento dicas para acessar a estreita abertura da maioria das amostras de células.
    2. Certifique-se de que o obturador do feixe está fechado, então abordar a área de meio ambiente de amostra e coloque as células de quartzo no cambiador da amostra. Grave a posição do cambiador de amostra para cada célula de amostra.
    3. Verifique a área e garantir que o caminho do feixe é livre de obstrução, em seguida, deixar a área de meio ambiente de amostra e abrir o obturador de feixe.
      Nota: Cuidadosamente siga os regulamentos e as regras de instalação, obedecer a todos os comentários e ouvir conselhos do cientista instrumento. Amostras não podem ser removidas do feixe e manipuladas após a exposição ao feixe sem seguintes precauções especiais. Consulte com um técnico de controle radiológico (RCT) antes destes procedimentos.
  3. Executar a varredura da tabela, para coleta de dados automatizado
    1. Opere o aparelho através do controle personalizado software baseado em LabVIEW, ambiente de controle de instrumento espectrômetro (SpICE). Siga as instruções para operação do instrumento fornecido pelo cientista Neutron Scattering. Uma visão geral das janelas de operação de varredura de tabela é fornecida na Figura 6.
    2. Depois de inserir as informações necessárias nas áreas apropriadas, executar a varredura da tabela, e começará um processo de coleta de dados automatizada. Monitorar o progresso através da guia 'Table Scan Status'.

5. reduzir sem dados de imagem 2D para lote 1D

  1. Identifica cada arquivo de dados de amostra e reserva dos números gravados de varredura. Cada medição será atribuída um número exclusivo de varredura. Esta informação é útil durante a redução de dados para identificar cada amostra correspondente e um par de reserva.
  2. Usar o software MantidPlot e script Python para redução
    1. Usuários de dispersão de nêutrons são fornecidos com os dados de conta para acessar seus dados no Cluster de análise remota. 67 logar ao Cluster de análise remota e executar "MantidPlot" na linha de comando. Figura 7 e Figura 8 são fornecidas para auxiliar estes passos.
    2. Obter um certificado de redução do usuário do cientista de dispersão de nêutrons (isso normalmente irá acontecer durante o experimento); Este script é baseado em Python e conterá todos os necessária calibração e ajustes de dimensionamento para reduzir a imagem de dispersão 2D em um terreno de 1D de intensidades espalhadas em função do ângulo de dispersão, I(Q).
    3. Abra o Script de redução de usuário fornecido no MantidPlot e coloque os números correspondentes de varredura ou identificação para os pares de amostra e reserva em lista apropriada.
    4. Execute o script para gerar redução de dados como um arquivo de texto de quatro colunas (ordem de coluna é Q, I(Q), I(Q) erro, erro de Q) no local especificado. O espaço de trabalho adequado em MantidPlot com o botão direito e selecione "Enredo com erros..." para um exame inicial dos perfis de dispersão.

6. analisar os dados para os parâmetros estruturais da partícula da dispersão

  1. Transferi o arquivo de redução de dados do servidor de análise para um computador local usando a transferência de arquivos FTP segura. Isso pode ser realizada com o uso de software como o FileZilla ou CyberDuck. Instruções adicionais e detalhes para se conectar ao sistema de arquivos do servidor de análise são fornecidas na página de login do analysis.sns.gov.
  2. Baixe o ATSAS software suite65,68 (suíte ATSAS toda). 69 programas individuais70 também estão disponíveis online para analisar os dados SANS, ou seja, determinar os parâmetros estruturais e modelos ab initio .
    Nota: Muitas opções estão disponíveis para SANS análise de dados de macromoléculas. 45
  3. Use PRIMUS71 para plotagem de dados, dimensionamento e subtração e Guinier análise de buffer.
    1. Lançar o ATSAS 'Análise de dados SAS' aplicativo e carga reduzidas dados arquivos correspondente ao par de amostra e buffer.
      1. Para dimensionar corretamente o buffer, selecione um intervalo de dados em alta Q (Q > 0,5 Å-1) onde ambos os perfis são semelhantes e plana e clique no botão de 'Escala', localizado sob as 'operações' guia. Um fator de escala será aplicado para o buffer de tal que estas duas regiões planas devem se sobrepor. Cuidado: deve haver uma razão física plausível que justifique a escala da intensidade de tampão para coincidir com a amostra. Se a discrepância é grande, consulte uma cientista de instrumento para abordagens válidas para subtração de fundo. 44 , 45 , 72
      2. Aumente o intervalo de dados para exibir todos os pontos. Clique em 'Subtrair' para executar esta operação. Botão direito do mouse o datafile reserva-subtraído na legenda e salvar este arquivo para análise posterior. Figura 9 descreve o uso da guia 'Operações'.
    2. Realizar uma análise de Guinier os subtraído de buffer de dados de exemplo usando a aba 'Análise' do aplicativo 'Análise de dados SAS'.
      1. Certifique-se de que o arquivo apropriado é selecionado na lista e clique em 'Raio de giração'. Será fornecida uma tentativa automatizada para executar um Guinier caber clicando no botão 'Autorg'.
      2. Expandir o intervalo de dados usados para incluir todos os dados de baixo-Q e começam a restringir o intervalo de dados, tira pontos de alta-Q até o Qmax * Rg limite é abaixo de 1,3. Use o enredo dos resíduos para verificar que os dados são lineares na faixa de ajuste. O Guinier caber produz uma aproximada Rg e0 para as partículas de dispersão.
      3. Fazer pequenos ajustes para a região de ajuste e monitorar a sensibilidade destes valores para o intervalo de dados usados no ajuste. Figura 10A demonstra o uso da ferramenta 'Raio de giração'.
  4. Obter a função de distribuição de probabilidade (P(r)) em GNOM. 73 o arquivo de saída gerado aqui irá ser usado como uma entrada para o ab initio processo de modelagem.
    1. Iniciar o assistente de distribuição de distância dentro da Tab. 'Análise' obtendo um bom ajuste aos dados é essencial para a obtenção de um modelo de qualidade. Para obter mais informações sobre como obter ajustes precisos, por favor, consulte o revisão de74 por Putnam, et al
      Nota: O GNOM programa fornece informações adicionais sobre o ajuste além do assistente de distribuição de distância. Figura 10B demonstra uso adequado da ferramenta 'Distribuição de distância', e a Figura 11 ilustra alguns dos erros comuns encontrados.
    2. Determine Dmax, a máxima distância interatômicas dentro da molécula.
      1. Estimar um valor para Dmax, desmarcando a caixa para forçar Rmax = 0 e inserindo um valor grande para Dmax (150 Å, por exemplo). O primeiro x-intercept na trama de reacionamento produz esta estimativa.
      2. Fazer alterações incrementais a esse valor Dmax e intervalo de dados usados ou número de pontos utilizados no ajuste para otimizar o GNOM apto para os dados e a curva resultante de reacionamento.
    3. Continue a aperfeiçoar o ajuste GNOM e salvar os arquivos de saída GNOM com boas ajuste parâmetros para posterior ab initio etapas de modelagem.
  5. Simule SANS perfis de modelos de alta resolução PDB usando o programa CRYSON. 75
    1. Abra o programa e selecione a opção '0'. Selecione o nome do arquivo PDB no navegador de arquivos de pop-up. Pressione enter para aceitar as configurações padrão, exceto para especificar a cadeia deuteration frações e a fração de D2O no solvente para alcançar os parâmetros de contraste adequado.
    2. Ajuste o modelo a um conjunto de dados experimental inserindo 'Y' e selecionar o arquivo de dados no navegador de arquivos de pop-up. Aceite os valores padrão restantes, e arquivos de saída serão gravados no local do arquivo PDB. Arquivo de 'Fit' contém informações para o perfil de dispersão previsto partir do modelo 3D de alta resolução.

7. criar modelos Ab Initio da sem dados.

Nota: DAMMIF76 e77 dentro da suite de software ATSAS de DAMMIN é usado para reconstruir modelos de átomo fictício (barragens) usando um processo de recozimento simulado de saída, que contém dados de reacionamento, ou obter informações sobre a probabilidade o GNOM ou frequência de distâncias interatômicas dentro da partícula de dispersão. Esses programas podem ser executados no modo em lotes ou no servidor web ATSAS-Online.

  1. Iniciar o assistente de forma PRIMUS do botão 'Dammif' na guia 'Análise' ' SAS da análise de dados' e usar uma seleção manual dos parâmetros. A entrada para o assistente é ilustrada na Figura 12.
    1. Definir o intervalo de Guinier de ajuste (etapa 6.3.2) e prossiga para a próxima etapa usando os botões de navegação. Definir valores de ajuste do terreno de reacionamento (etapa 6.4) e prossiga para a próxima etapa.
    2. Fornece parâmetros para o ab initio processo de modelagem. Digite um prefixo para os nomes de saída do modelo (por exemplo, SANSEnvelope), escolher a modelagem de qualquer modo 'rápido' ou 'lento', digite um valor para o número de modelos (17 recomendado para significância estatística), selecione uma das opções disponíveis para a simetria das partículas, anisometry e escala angular (se conhecido). Certifique-se que as caixas são verificadas para modelos médios com DAMAVER e refinam o modelo final com DAMMIN.
    3. Inicie o processo usando o botão de 'confirmação'. Uma vez que o processo estiver concluído, exibir e salvar o diretório de trabalho.
      Nota: O processo de modelagem típico para uma única, pequena proteína pode demorar até algumas horas com um computador pessoal típico. Arquivos são armazenados em diretórios temporários até que salvou.
  2. Sobreposição e sobrepor a final SANS envelope com um modelo de alta resolução relacionado usando SUPCOMB dentro ATSAS. Coloque uma cópia do modelo PDB de alta resolução para estar apto para o envelope SANS no diretório de trabalho. Executar SUPCOMB na linha de comando usando os nomes de arquivos PDB como dois argumentos com a estrutura de modelo listado primeiro: supcomb $ HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Nota: O nome do segundo ficheiro listado será reescrito como um novo arquivo com um "r" anexado ao final e ter novas coordenadas para sobreposição sobre a estrutura do modelo.
  3. Visualize os resultados ab initio modelo usando PyMOL (pymol.org), um programa de visualização de gráficos 3D molecular. Figura 13 fornece uma visão geral das operações PyMOL.
    Nota: Existem diretrizes de publicação para a modelagem estrutural de dados pequeno ângulo de dispersão de biomoléculas em solução. 78
    1. Iniciar o aplicativo PyMOL e abrir os arquivos. pdb correspondente para o 3D SANS envelope e a estrutura de alta resolução SUPCOMB-alinhados para ser visualizado.
    2. Visualize o envelope SANS representando este modelo como uma superfície. Clique do ' botão ao lado do modelo e selecione ' Mostrar: como: superfície '.
    3. Visualize a estrutura da espinha dorsal da proteína de alta resolução por que representa este modelo como um desenho animado. Selecione do ' botão ao lado deste modelo e selecione ' Mostrar: como: Cartoon'. Exibir a cadeia como um arco-íris de N - a C-terminal, selecionando o botão 'C' e ' pela cadeia: 'Chainbows.
    4. Modifica a transparência da representação da superfície para maior clareza. Barra de menu de 'Configuração', selecione ' transparência» superfície» 40% '.
    5. Fazer o fundo branco e não-opaco. Barra de menu 'Exibir', selecione ' fundo»' e selecione 'Opaco' para desmarcar essa opção e 'Branco' para marcar essa cor para o fundo.
      Nota: as operações adicionais e usos para PyMOL podem ser encontrados em PyMolWiki.org.

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Representative Results

Uma proposta de tempo e instrumento de feixe claramente deve transmitir todas as informações necessárias para o Comitê de revisão para que uma avaliação válida do experimento proposto pode ser feita. Comunicação com um NSS é altamente recomendada para usuários inexperientes. O NSS podem avaliar a viabilidade inicial e apresentação de proposta de guia para enfatizar o potencial para a ciência de alto impacto, segurança e viabilidade. As informações fornecidas na proposta devem incluir informação de fundo e o contexto para a importância da pesquisa; conhecimento que é esperado para ser adquirida e como isso afeta o entendimento atual no campo relacionado da ciência; uma descrição do trabalho, amostras, métodos e procedimentos que serão empregados; e, se aplicável, produtividade anterior da equipe na instalação, incluindo publicações relevantes e resultados. Recursos úteis, como modelos de proposta e dicas para preparar a proposta, estão disponíveis para os usuários através do Portal de usuário ciência nêutrons (neutrons.ornl.gov/users).

Experiência de planejamento é um processo dinâmico que frequentemente começa durante as fases iniciais da apresentação da proposta, mas não pode ser totalmente concebido até pouco antes do experimento. No entanto, tenha em mente que quaisquer alterações que desviam significativamente a descrição da proposta (incluindo as alterações para as condições de reserva ou a composição da amostra) devem ser aprovadas pela facilidade antes do início do experimento.

Este protocolo assume que um método para expressar e purificação da proteína de membrana de interesse em micelas detergentes em solução foi demonstrado com sucesso. Neste caso, a proteína de membrana de interesse é um intramembrane aspartil protease (IAP), que tem um protocolo de purificação estabelecida e foi previamente determinada a ser solúvel e ativo em tampão contendo micelas DDM.

Aqui, demonstramos os cálculos de contraste de nêutrons usando o MULCh: módulo de contraste para uma solução de proteína IAP em contraste-combinadas misturado DDM / micelas d25-DDM. A estratégia apresentada neste documento foi primeiro determinar o grau de mistura entre os dois detergentes necessários para conseguir um jogo completo contraste da micela. O resultado final foi determinar o contraste relativo de cada componente e o plano de fundo (proporção de2O2o/d H) necessário contraste combinem o espalhamento de detergente para observar apenas a dispersão de proteína.

A Figura 1 demonstra uma entrada apropriada para o módulo de MULCh contraste e a saída resultante para cálculos de contraste do DDM detergente grupo cabeça e cauda como subunidades 1 e 2, respectivamente. A fórmula usada para o grupo principal é C12H14X7O11 com um volume de 348 Å3e a fórmula de cauda de cadeia alquila é dado como C12H25 com um volume de 350 Å3.

É aparente a partir da saída do módulo de contraste que o grupo cabeça DDM e cauda têm densidade de comprimento diferente de dispersão, e, portanto, será observado o contraste entre os dois componentes. Para DDM, os grupos de cabeça têm um CMP em 49% D2O enquanto as caudas de cadeia alquila têm um CMP em 2% D2O, com seu CMP média ocorrendo em 22% D2O. Portanto, o objectivo do próximo passo será projetar uma micela mista que incorpora cadeias alquila deutério-substituído para aumentar o CMP médio de caudas as detergentes para coincidir com a CMP dos grupos de cabeça. O cálculo de contraste foi repetido para um detergente substituído, DDM com uma cauda totalmente deuterado (d25-DDM), que da mesma forma, resulta em contraste entre o grupo de cabeça e a cauda. No entanto, valores das h-caudas de contraste e d-caudas são significativamente diferentes. Lembre-se que o detergente misturas são conhecidas para produzir micelas bem misturadas na solução,22 , portanto, uma mistura destes h-d-caudas e no núcleo micelle deve produzir SLD médio igual ao chefe de grupo shell, rendendo uma micela com CMP único. Desde que o grupo principal é comum a ambos DDM e d25-DDM, a estratégia é encontrar uma mistura destes detergentes que produz um valor de contraste médio do rabo misto que coincide com o contraste dos grupos de cabeça.

A média de alvo CMP para as caudas detergentes é do grupos de cabeça maltoside, ou 49% D2O. Para estimar a proporção de mistura o CMP médio de cada componente h-cauda e d-cauda deve ser conhecido. Estes valores para alguns detergentes comuns e comercialmente disponíveis deutério rotulados homólogos são fornecidas na tabela 1. Usando esses valores CMP para DDM e d25-DDM, a fração molar de h-caudas e d-caudas que satisfazem a equação fornecida na etapa 2.2 é χd-caudas = 0,43.

A Figura 2 demonstra uma entrada mais avançada para o módulo de MULCh contraste que pode ser usado para confirmar as condições de partida final misturado-micelle contraste e determinar o grau de deuteration necessário na proteína. Aqui, o subunit 1 refere-se a micela mista contraste-combinadas com 2 componentes, DDM e d25-DDM, enquanto subunidade 2 refere-se a M. marisnigri JR1 intramembrane aspartil protease (MmIAP) dada por sua sequência de aminoácidos. O SLD da proteína tem sido elevado pela expressão na mídia de crescimento deuterado ceder um CMP para a proteína em tampão contendo ~ 92% D2O. O grau de separação entre match point a proteína em 92% D2O e a condição de medição (48,5% D2O) sugere que esse sinal suficiente de dispersão será obtido da proteína.

Produção de d-MmIAP foi realizada com células de Rosetta 2 Escherichia coli , abrigando o vetor de pET22b-MmIAP. Meio mínimo com glicerol sem rótulo, em 90% D2O foi selecionado como o meio de crescimento. Depois da adaptação ao meio mínimo de 90% D2O, o volume de cultura foi escalado até 400 mL e utilizado para inocular 3,6 L de 90% D2O mínimo meio fresco em um navio de biorreator de 5,5 L.

A Figura 3 fornece um rastreamento dos valores de processo durante o cultivo alimentados em lotes. No momento da inoculação, o ponto de ajuste de temperatura era de 30 ° C, o oxigênio dissolvido (DO) set point foi 100%, o ponto de ajuste de agitação era 200 rpm, sendo a taxa de fluxo de ar comprimido 4 L/min. Realizou-se o pH acima de um ponto definido de 6,9 usando uma solução a 10% w/v de hidróxido de sódio em 90% D2O. Uma vez a tocha sinalizado depleção de glicerol a inicial de 5 g/L, alimentação (30% p/v glicerol, 0,2% MgSO4 em 90% D2O) foi iniciada, que continuou ao longo do cultivo. Após cerca de 7 horas de alimentação, a temperatura de cultura foi reduzida para 18 ° C e isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside foi adicionado a uma concentração final de 1 mM. Após a colheita da cultura, aproximadamente de 145 g de peso molhado de célula colar foi coletado através de centrifugação (6.000 x g durante 45 min)

Purificação de d-MmIAP procedeu quanto a enzima protonados, exceto que o rendimento da enzima foi significativamente menor e pureza final foi um pouco menor do que o típico. De 5 L, ~ 20 g de membranas molhadas foi isolado, todos os quais foi solubilizado na DDM para purificação e carregado para a primeiro Ni2 + coluna de afinidade. Para maximizar o rendimento de purificação, a fração de escoamento foi diluída e re-execute novamente na coluna do Ni2 + afinidade. O procedimento foi repetido uma terceira vez antes de polir a amostra concentrada d-MmIAP por cromatografia de exclusão (Figura 4).

Figura 5 mostra uma célula de amostra de quartzo e sua configuração de trocador de amostras relacionadas. Ambientes de amostra são gerenciados pelo Bio-SANS equipe de operações e NSS. Uma variedade de ambientes diferentes pode ser organizada para realizar medições com controle de temperatura, controle de umidade, caindo mecânico, alta temperatura e pressão sustentada, entre outros.

A Figura 6 demonstra Bio-SANS operações e execução da tabela automatizada faz a varredura. A varredura da tabela é configurada para ser intuitivo e fácil de usar. Na primeira guia (amostras de carga), são fornecidas informações sobre a amostra changer e instalação, tais como identificação de amostras em cada posição no trocador de amostra, espessuras de célula e tipo de amostra (feixe aberto, amostra, fundo, etc.). Tags de metadados adicionais podem ser aplicadas aqui também. Na guia seguinte (plano experimento), a configuração do instrumento e quaisquer parâmetros associados (como controle de temperatura) são definidos. Esta etapa é organizada pelo NSS no início do experimento. O usuário deve simplesmente de entrada os tempos de medição para cada amostra (em segundos). A guia final (executar Scans) fornece um resumo dos dados de varredura da tabela e permite a verificação automatizada ser executado.

Depois que as imagens 2D de dispersão são registradas, estes dados devem ser reduzidos para uma trama de 1D da intensidade versus Q - uma função do ângulo de espalhamento. Durante a redução de dados, correções de imagem, tais como máscaras de sensibilidade de pixel e subtrações de fundo escuro também são aplicadas. MantidPlot software foi projetado para interpretar o cru Bio-SANS dados do instrumento. O NSS geralmente ajudarão na redução e recuperando os dados finais ao final do experimento.

Figura 7 fornece uma visão geral do acesso remoto análise cluster para MantidPlot e a janela de Script usado para redução de dados. Dados brutos são acessíveis no cluster análise remota (analysis.sns.gov) por meio de autenticação de usuário UCAMS/XCAMS. Após iniciar sessão na área de trabalho remota, o software de MantidPlot pode ser lançado de uma janela de terminal executando simplesmente 'MantidPlot' sob qualquer caminho. Abra a janela de Script em MantidPlot e editar o Script de redução do usuário conforme indicado pelo NSS. Executar este script irá gerar os arquivos de dados reduzida, que podem então ser transferidos para uma máquina local para análise utilizando FTP seguro.

Figura 8 demonstra a plotagem e exibindo os dados depois de executar o script de redução de usuário reduzida data aparecerá na janela de espaços de trabalho. Por padrão, os dados mesclados finais terá o sufixo _f acrescentado. Botão direito do mouse permitirá traçar o espectro com erros a ser selecionado e dados para plotagem. Preferências de exibição são acessadas selecionando preferências da barra de menu 'Ver'. Formatação dos eixos e escala de plotagem são facilmente acessível clicando duas vezes os eixos. Perfis de espalhamento de buffers, que contêm não dispersão de partículas de tamanho significativo devem aparecer como uma linha relativamente plana (intensidade constante). Para amostras, intensidade deve ser observada em ângulos de dispersão inferiores (Q) com decaimento exponencial para um fundo liso incoerente.

Figura 9 fornece uma visão geral de subtração de tampão apropriado usando o pacote de software de análise de dados do SAS (ou primusqt) sequência de redução de dados. Muitas vezes o fundo incoerente (intensidade em alta-Q) é ligeiramente incompatível entre a amostra e o tampão. Para subtração apropriada, devem sobrepor dados nesta região. A correção de escala aplica-se um fator de escala de intensidade para os dados que resulta em dados sobrepostos, e a subtração pode ser executada. Se o fator de escala resulta em pontos de dados de reserva, com maior intensidade do que pontos correspondentes na amostra, estes pontos serão negativos e não processado em uma trama de log. Se valores negativos no arquivo subtraído de reserva são abundantes, fazer uma menor redução no fator de escala de reserva e realizar a subtração novamente.

Figura 10 fornece usos de exemplo do Primus Guinier e assistentes de distribuição de distância. Uma análise de Guinier fornece uma estimativa preliminar do raio de rotação a partir dos dados de baixo ângulo de dispersão de partículas. Como dados abordagem zero, uma região linear deve ser presente nos dados. Montagem de uma linha nesta região permite a Rg a ser determinada de encosta e um0 ser extrapolados da interceptação de intensidade em Q = 0. Uma tendência ascendente nos dados como Q se aproxima de zero indica agregação na amostra, enquanto tendências decrescentes são geralmente indicativas de repulsões interpartícula. Estas tendências são mais aparentes quando a distribuição dos resíduos é não-estocástica. Limite superior da Guinier apto para partículas globulares é restrito por Q * Rg < 1.3 ('s' é usado no lugar de Q no software ATSAS).

O Rg determinado para d-MmIAP deste ajuste de Guinier foi 15,4 ± 1,1 Å com um número estimado0 dado como 0.580 ± 0,001.

O assistente de distribuição de distância permite sistemáticas alterações a serem feitas aos parâmetros do reacionamento caber. A curva de reacionamento é uma indireta de Fourier da curva de ajuste aos dados experimentais. Portanto, é essencial para verificar que o ajuste no painel da esquerda reflete com precisão os dados experimentais. Para o ajuste mostrado neste exemplo, um Dmax de 46 Å foi obtido.

A Figura 11 ilustra erros comuns na seleção de Dmax. Um Dmax que artificialmente grande muitas vezes faz com que valores de reacionamento tornar-se negativo como a função de reacionamento oscila sobre o eixo x. Um Dmax artificialmente pequeno leva a uma curva de reacionamento truncada com uma transição abrupta para Rmax = 0.

Os primeiros passos no assistente de forma a Primus são idênticos para os assistentes de distribuição de distância e Guinier. Uma vez que esta informação foi fornecida para obter boa adapta-se aos dados experimentais, a configuração do modelo ab initio está configurada.

A Figura 12 ilustra uma entrada apropriada para o assistente de forma Primus. Aqui, experimental SANS dados para o IAP foi fornecido com uma escala em Angstroms, e foi dado o prefixo de arquivo esperada de "SANSEnvelope". Um conjunto de 17 modelos de átomo fictício inicial foram solicitados a ser gerado usando o modo de modelo "rápido" com nenhuma simetria (P1) aplicado e não anisometry selecionado. O conjunto de 17 modelos será alinhado, em média e filtrado com DAMAVER e o modelo médio refinado usando DAMMIN. Inspeção do prefixo-damsel.log documento de texto fornece um resumo de qualquer modelos descartados do conjunto e o critério de seleção. O modelo final refinado foi escrito como SANSEnvelope-1.pdb.

O programa SUPCOMB é usado para executar uma sobreposição do envelope SANS modelo com o modelo de alta resolução, com apenas os dois estrutura arquivos PDB como entrada. Por padrão, "r" é acrescentado ao nome do arquivo reorientados e sobrepostos.

Uma vez o SANS envelope e estrutura de alta resolução tem sido sobrepostas, estes modelos podem ser visualizados usando qualquer molecular graphics programa de visualização. Os resultados do PyMOL são adequados para imagens de qualidade de publicação e podem ser usados para enfatizar resultados biofísicos relacionados com a investigação estrutural. Aqui, demonstramos algumas operações básicas do PyMOL costumávamos fornecer representações 3D e pontos de vista das estruturas sobrepostas resultantes.

Figura 13 fornece uma visão geral do processo de visualização PyMOL. Uma vez que os arquivos de estrutura PDB foram abertos em PyMOL, os modelos devem estar visíveis na janela do visualizador PyMOL. Alterar as representações de cada modelo usando do ' botão ao lado de cada nome de arquivo. Use uma superfície representação para o envelope SANS e uma representação dos desenhos animados da espinha dorsal da proteína do modelo de alta resolução. Selecione um esquema de cores apropriado das opções disponíveis no botão 'C'. Para as cadeias de proteínas, uma coloração de "chainbow" fornece um gradiente de cor de N - a C-terminal para auxiliar a interpretação. Transparência é aplicada à superfície representação para permitir a melhor visualização da estrutura da proteína dentro do envelope. Para imagens de publicação, recomenda-se um fundo branco. Uma vez que essas filas de visualização foram aplicadas, as estruturas 3D podem ser examinadas. Manipulações da perspectiva e molécula rotação/tradução podem ser realizadas clicando e arrastando a estrutura.

Figure 1
Figura 1. Uso do módulo MULCh contraste para determinar parâmetros de contraste para componentes de dodecil maltoside (DDM). Valores de entrada são mostrados na tela à esquerda, com a subsequente saída à direita. A página de entrada de módulo de contraste é acessada clicando 'Contraste' (círculo verde) no menu de navegação do lado esquerdo de cada tela. Áreas de entrada para o título do projeto, componentes de reserva e subunidades 1 e 2 são rotuladas como tal. Páginas de saída contém propriedades de partícula importantes informações e contraste para o sistema. Tabelas relevantes e pontos de partida calculados ter sido embalados em laranja para maior clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Uso do módulo MULCh contraste para determinar parâmetros de contraste para componentes do complexo proteína-detergente membrana. Nesta instância, foi dada entrada para descrever o sistema global de PDC em solução tamponada. Subunidade 1 descreve o contraste combinados misturados micelle composto de DDM com 43% por mole como d25-DDM. Subunidade 2 descreve a proteína de membrana, com a sequência de aminoácidos para a entrada de MmIAP como a fórmula. O nível de deuteration (círculo verde) descreve o grau da proteína de substituição de deutério e tem um impacto direto sobre o SLD e ponto de partida calculado que será estimado para a proteína. Resultados (caixa laranja) indicaram esse ponto de partida para o detergente misturado ocorrerá em 48,5% D2O, enquanto ponto de partida da proteína ocorre no ~ 90% D2O. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Preparação da amostra-rastreamento de biorreator. Os valores de processo exibidos são o ponto de ajuste de temperatura (linha laranja), oxigênio dissolvido (DO) ponto de ajuste (linha azul), ponto de ajuste de agitação (linha vermelha) e taxa de fluxo de ar comprimido (linha rosa). Bomba 1 (linha verde) foi usada para controle do pH. O pico às 18:40 sinalizado depleção do glicerol inicial e foi usado para iniciar a alimentação de solução de glicerol através de bomba 2 (linha preta). Eixo x denota horas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Preparação – da amostra FPLC e SDS-PAGE a caracterização da amostra. Cromatograma de exclusão tamanho final para d- MmIAP equilibrada com 20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl, 48,5% D2O e 0,05% total DDM, dos quais 44% (p/v) é a cauda-deuterado d25-DDM. Baixo-relevo: Análise de SDS-PAGE com coloração Coomassie. Frações em pool são rotuladas A, B, e C. região "B" foi usado no experimento de SANS. Marcador de anotado peso molecular é em kDa. Imagem reproduzida com a permissão do neto et al 65 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 5
Figura 5. Coleta de dados – banjo de quartzo amostra instalação celular e mostruário. (A) uma célula de banjo de quartzo vazio é mostrada descansando contra o bloco de mostruário. As células são cheios de amostra e inseridas em uma das 15 posições disponíveis. (B) o bloco de amostra é montado atrás de um selector de abertura (não mostrado) entre o feixe tubo extensor e janela de silício na entrada para o tanque do detector. Mangueiras de conexão para um banho de água com temperatura controlada e canais em todo o bloco de amostra fornecem regulamento de temperatura nas posições de amostra. A seta indica a direção do feixe de nêutrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Coleta de dados – visão geral das operações de especiaria e varredura da tabela. As operações de verificação de tabela são acessíveis a partir do botão 'Table Scan' no menu mais à esquerda do software de controle de instrumento SPICE. Setas verdes indicam a guia ativa no topo da tela e caixas de laranja destacam áreas na tabela para entradas de usuário ativo. (A) a primeira guia da varredura da tabela é usada para fornecer informações sobre a amostra changer e posições de célula de amostra. Fornece rótulos, espessuras de amostra e tipos de amostra para cada posição usada no cambiador da amostra. Marcando a caixa de 'Fazer Scan' irá adicionar a linha correspondente à fila de verificação de tabela. (B) na segundo guia, são registrados detalhes sobre o tempo de configuração e medição de instrumento para cada amostra (em segundos). Configurações do instrumento são pré-configurados do cientista de dispersão de nêutrons e fornecidas aos usuários com base em dados fornecidos na proposta de tempo e o instrumento da viga. Parâmetros adicionais podem ser adicionados para o controle do instrumento, tais como a capacidade de definir temperatura setpoints e mantenha vezes, ao longo da fila de medição. (C) a guia final fornece uma visão geral das medições a efectuar para cada linha na tabela. Se nenhuma alteração é necessária, a verificação automática é iniciada clicando no botão 'Executar Scans'. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7. Redução de dados – visão geral do script de redução e MantidPlot operações. MantidPlot software é acessível no cluster de análise, digitando "mantidplot" em um prompt de comando terminal em qualquer diretório ativo (o círculo amarelo e seta são adicionados para dar ênfase). Uma vez que o software é aberto, acessar a janela de script (alternada por botão marcado em verde) e abra o script fornecido pelo cientista Neutron Scattering. Siga as instruções fornecidas no script, que só requer os números de verificação para cada amostra e buffer ser inserido em uma lista para redução automática, bem como números de célula vazia para subtração e feixe vazio para transmissão e feixe de varredura determinação do centro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8. Análise de dados – Plotting de dados usando o MantidPlot. Dados são referenciados como áreas de 'trabalho' em MantidPlot. A área de trabalho será preenchida com nomes de arquivo como produzido pelo script de redução do usuário. Dados de espaço de trabalho para conjuntos de dados 1D podem ser plotados o espaço de trabalho botão direito do mouse e selecionando "Plot Spectrum com erros.... Dados adicionais podem ser adicionados ao enredo atual simplesmente arrastando e soltando os espaços de trabalho. Formatação da janela do enredo (tal como parcelas de log-log) pode ser executada selecionando 'Preferências' 'Ver' na barra de menus, ou clicar duas vezes em rótulos de eixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9. Análise de dados – software de ATSAS: operações básicas e subtração reserva. a aplicação de primusqt (análise de dados SAS) proporciona visualização para subtração de fundo adequado (tampão). O arquivo de reserva deve ser dimensionado para subtração tal que dados se sobrepõem em alta-Q (onde a dispersão é plana como resultado de sinal restante de fundo incoerente). Quando esta gama alta-Q de dados é selecionada, a operação de escala aplicará um fator de escala para o arquivo de dados inferior da tabela que produz sobreposição na região definida. Após o dimensionamento, o arquivo de reserva pode ser subtraído para render o perfil de dispersão líquida da partícula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10. Análise de dados – determinação de Guinier e reacionamento (distribuição de distância). (A) o Primus Guinier assistente é usado para executar uma análise de Guinier, fornecendo uma estimativa inicial de I0 e Rg. O tipo de partícula e o intervalo de dados para caber são usados para definir o ajuste. Uma parcela do ajuste e resíduos correspondentes são mostrados à esquerda, enquanto termos Guinier (eu0 e Rg), Q * Rg limites e qualidade de ajuste linear são fornecidos como saída na área marcada por caixa de laranja. (B) o assistente de distribuição de distância de Primus é usado para realizar a análise de distribuição de distância, fornecendo a curva de reacionamento que define a probabilidade de distâncias interatômicas dentro da partícula de espalhamento e inclui o Dmax ou máximo distância interatômicas. Parâmetros indicados pela caixa de laranja podem ser investigados sistematicamente para determinar uma função de distribuição de distância apropriada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11. Impróprios resultados a partir da análise de distribuição distância. Um Dmax corretamente selecionado deve produzir uma curva de reacionamento picos com uma deterioração gradual para zero. DMAX valores muito grandes, provavelmente produzirá valores negativos de reacionamento ou oscilações perto do eixo x em altos valores de r. Dmax valores artificialmente pequenos muitas vezes resultam em curvas de reacionamento onde o limite superior aparece truncado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12. Modelagem – Ab initio modelo instalação usando o assistente de forma Primus. Ab initio , modelagem de parâmetros são fornecidos em uma única janela de entrada. Um prefixo é fornecido para nomes de arquivo de saída com outras opções de tratamento disponíveis. Processo de recozimento pode ser rápido (grânulos maiores com resfriamento mais rápido) ou lentos (grânulos menores com resfriamento mais lento). Número de repetições deve ser de tamanho suficiente para examinar a reprodutibilidade das características do modelo. Anisometry e simetria das partículas podem ser fornecidos, se conhecido. Escala angular deve corresponder às unidades dos dados medidos. Uma média de DAMAVER irá alinhar média de todos os modelos de átomo fictício e em seguida, aplicar um critério de seleção que exclui qualquer modelos de outlier. Um núcleo de átomos fixos do modelo em média será mais refinado usando DAMMIN se esta opção for selecionada. Este modelo refinado deve representar o envelope de baixa resolução 3D de SANS perfil experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 13
Figura 13. Visualização – envelope SANS Experimental e sobreposição com modelo de alta resolução usando PyMOL. Depois de abrir os arquivos de estrutura PDB em PyMOL, modelos aparecem no visualizador PyMOL. Os modelos ativos estão listados na tabela para a direita, juntamente com botões de ação que podem ser usados para manipular o modelo e sua representação. Operações básicas são fornecidas para visualizar esses modelos que permitem que as regiões de estrutura de acordo (ou incompatibilidade) entre o envelope SANS e de alta resolução para ser identificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Propriedades físicas dos detergentes, comumente usados em investigações de proteínas de membrana. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Pesquisadores de biologia estrutural aproveitam técnicas estruturais complementares como espalhamento da solução para obter detalhes bioquímicos e estruturais (como forma e tamanho total) de biomoléculas em solução. SANS é uma técnica particularmente atraente para a determinação de estruturas de baixa resolução de proteínas de membrana, um foco central de Bioquímica e biologia estrutural moderna. SANS requer quantidades de proteínas purified comparáveis dos ensaios cristalográficos (1 mg/amostra). A disponibilidade comercial recentemente em expansão de alta pureza deuterados detergentes relevantes para estudos de proteínas de membrana torna acessível um meio de manipular esse conteúdo para SANS experimentos de complexos de proteínas-detergente de membrana, hidrogênio/deutério permitindo que o sinal de proteína a ser registados directamente. Quando bem sucedido, um envelope ab initio modelo molecular pode ser calculado a partir de dados recolhidos ao longo de apenas algumas horas. Assim, os bioquímicos proteína de membrana, biophysicists e biólogos estruturais podem prontamente aproveitar SANS para obter o cobiçado iniciais modelos 3D de proteínas de membrana em solução, estruturas em complexo com parceiros ou substratos, e os modelos obtidos por SANS pode ser usado para dados de difração de fase. Uso rotineiro de SANS para caracterizar as proteínas de membrana seria transformadora para o campo de bioquímica de proteínas de membrana e tem efeitos em cascata de função de estrutura básica para a descoberta de medicamentos e desenvolvimento. A vantagem adicional de contraste de nêutrons correspondência com substituição de deutério faz SANS uma técnica valiosa para o estudo da proteína-proteína, proteína-ADN ou outros complexos biomolecular, que podem ser facilmente manipulados em seu conteúdo de hidrogênio/deutério.

Para obter detalhes adicionais sobre o projeto de instrumento de pequeno ângulo de espalhamento e teoria, são recomendadas as seguintes avaliações: O Bio-SANS instrumento no alto fluxo isótopo reator de Oak Ridge National Laboratory,79 pequeno ângulo de espalhamento para biologia estrutural – expandindo a fronteira, evitando as armadilhas,72 e estudos de dispersão de pequeno ângulo de macromoléculas biológicas em solução. 80 o cientista de dispersão de nêutrons também pode discutir configurações atuais do instrumento e os parâmetros ideais para um dado sistema. Por exemplo, dados em Q inferior (que é uma função de onda de ângulo e nêutrons a dispersão) é geralmente desejados para sistemas maiores. A configuração mais comum do instrumento em Bio-SANS fornece um Qmin de 0,003 Å-1 e é adequado para grandes complexos de proteínas até centenas de kDa. Uma solução contendo ~ 3 mg mL-1 de proteínas de membrana de tamanho aproximado de 30 kDa (monômero) em micelas de contraste-combinadas com 48,5% D2O em solução requer um tempo típico de medição em torno de 8 horas cada, por exemplo, buffer e célula vazia (24 horas = 1 dia de total). Tempos de medição do instrumento em uma condição determinada contraste podem ser aproximadamente dimensionados de acordo com o produto da massa molecular da partícula dispersão e concentração. No entanto, partículas de dispersão devem ser medidas em condições não-interagindo, incluindo qualquer agregação de proteínas não específicas, que coloca um limite prático sobre a concentração da amostra. Uma hora de duração medições colocar limites sobre a estabilidade de certas proteínas. Felizmente, SANS medições pode ser feito rotineiramente a temperatura refrigerada para melhorar o tempo de vida de proteína, e o trabalhador assalariado feixe de nêutrons de baixa energia não causa danos de radiação durante a medição.

Uma visão geral deste processo e a determinação de muitos fatores-chave para a gravação bem sucedida do espalhamento de nêutrons de uma amostra medida no ponto de partida contraste do detergente são apresentados neste manuscrito. Isso inclui o passo crítico para obtenção de uma partida completa do detergente agregado através da concepção de uma mistura de detergente com um contraste de nêutrons uniforme entre o grupo de cabeça detergente e componentes de cadeia alquil. Medições nesse único ponto de partida de detergente fornecem um perfil de dispersão atribuída somente à proteína de membrana de interesse e permitiu um envelope ab initio , representando a proteína de membrana para ser reconstruído a partir dos dados. A análise de dados e ab initio modelagem protocolos também demonstram potenciais informações obtidas a partir dessas investigações, que poderiam visam abordar a estrutura geral, mudanças conformacionais, Estados oligoméricos, entre outros. Uma limitação é que, até à data apenas muito alguns detergentes são comercialmente disponíveis com substituições de deutério. 19

Enquanto perdeuteration não seja necessário, o objectivo neste caso deve ser conseguir uma proteína com > 65% deutério rotulagem na proteína. Alternativamente, se detergente com seletivamente-deuterado caudas e grupos cabeça está disponível, o CMP do detergente micelle ocorre perto de 100% D2O e contraste suficiente da proteína pode ser alcançado sem a necessidade de rotulagem de deutério. Determine o nível apropriado do deuteration da proteína para alcançar a dispersão suficiente quando medido no ponto de partida de contraste do detergente. Existem inúmeros desafios associados com a expressão de proteínas de membrana e purificação,81 , que permanecem além do escopo deste artigo. Infelizmente, altos níveis de deuteration atualmente não são (ainda) possíveis para sistemas eukaryotic. Quando percebemos que esta é uma limitação para algumas proteínas eukaryotic, a maioria das proteínas de membrana têm orthologs bacteriana para que este método é apropriado.

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Disclosures

Os autores Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss e Ryan C. Oliver são contratados através de UT-Battelle nos DOE para apoiar o programa de usuário ciência nêutrons e Bio-SANS instrumento no Oak Ridge National Laboratory usado neste artigo.

Este manuscrito tem sido co-autoria de UT-Battelle, LLC, sob contrato DE-AC05-00OR22725 com nos departamento de energia (DOE). O governo dos EUA mantém e Publicador, aceitando o artigo para publicação, reconhece que o governo dos EUA mantém uma licença não exclusiva, integralizada, irrevogável, mundial, para publicar ou reproduzir o formulário publicado este manuscrito ou permitir que outros a fazê-lo, para fins de governo dos Estados Unidos. DOE fornecerá acesso público a esses resultados de pesquisa patrocinado pelo governo federal, em conformidade com o plano de acesso público do DOE. 82

Acknowledgments

O escritório de biológica e investigação ambiental apoiaram pesquisa do ORNL centro de Biologia Molecular estrutural (CSMB) e Bio-SANS usando recursos suportados pela divisão de instalações científicas usuário, escritório de ciências básicas de energia, departamento dos EUA de energia. O trabalho estrutural em proteínas de membrana no laboratório de Lieberman foi apoiado pelo NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

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Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do <em>Ab Initio</em>
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