Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/57901
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Summary

Bu iletişim kuralı, düşük çözünürlüklü ab initio manken ve yapısal bir deterjan çözündürüldükten membran proteini küçük açı Nötron saçılma kontrast-eşleştirme ile deterjan kullanarak çözümde detaylarını elde etmek gösterilmiştir.

Abstract

Biyolojik küçük açı Nötron saçılma enstrüman High-Flux izotop reaktör, Oak Ridge National Laboratory, biyolojik malzemeler, işleme biyoyakıt ve biyo-ilham malzemeler için nanometre kapsayan soruşturma adanmış mikrometre uzunluğunda ölçekler. Burada fiziksel özelliklerini (Örneğin, boyut ve şekil) membran proteinlerinin soruşturma için sunulan yöntemleri (burada, MmIAP, Methanoculleus marisnigrigelen bir intramembrane aspartyl proteaz) micelle kurma çözümlerinde deterjanlar vardır diğerleri arasında bu küçük açı Nötron saçılma araç için oldukça uygundur. Diğer biyofiziksel karakterizasyonu teknikleri bir protein-deterjan karmaşık yapıda deterjan katkıları gidermek için kendi yetersizlik tarafından engellemiştir. Ayrıca, biyo-Deuteration laboratuvar erişim büyük ölçekli arazisi hazırlama ve protein gelişmiş saçılma sinyal proteinleri döteryum etiketli ifade için benzersiz yetenekleri sağlar. Bu süre tekniği yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi sağlamaz, membran proteinlerinin yapısal bilgi boşluğu yakınındaki atomik çözünürlük gerek kalmadan birçok adresli alanda araştırma içerir. Örneğin, bu alanlarda oligomeric Birleşik, karmaşık oluşumu, konformasyon değişiklikleri belirlenmesi sırasında pertürbasyon ve katlama/unfolding olayları içerir. Bu araştırmalar yoluyla bu yöntemin uygulamaları kolayca gerçekleştirilebilir.

Introduction

Membran proteinlerinin tüm genler1 yaklaşık %30 tarafından kodlanmış ve hedefler modern tıbbi ilaçlar için güçlü bir çoğunluğu temsil. 2 bu proteinler hayati hücresel fonksiyonların3 ama onların bereket ve önem rağmen geniş bir dizi gerçekleştirmek — yalnızca toplam yapıları içinde araştırma Collaboratory Yapısal Biyoinformatik (RCSB) Protein için yatırılan yaklaşık % 1'i temsil Veri Bankası. 4 kısmen hidrofobik kendi doğası nedeniyle membran bağlı proteinler yapısal belirlenmesi son derece zorlu olmuştur. 5 , 6 , 7

Birçok biyofiziksel teknikleri ölçüm için çözüm monodisperse parçacıklar gerektiği, membran proteinlerinin yerli membranlar üzerinden yalıtma ve yerel membranlar çözünür bir taklit bu proteinler sabitleme bir etkin alan araştırma son olmuştur on yıl. 8 , 9 , 10 bu soruşturmalar birçok roman amfifilik derlemeler geliştirme için zar proteinleri, nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 gibi solubilize yol açmıştır ve amphipols. 16 , 17 ancak, deterjan micelles kullanımı belirli bir protein çözünürlük gereksinimlerinin karşılanması için en yaygın ve basit yaklaşımların türlerindendir. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 ne yazık ki, hiçbir tek deterjan veya deterjanlar sihirli karışımı tüm membran proteinlerinin karşılayan şimdilik; Böylece, bu koşullar her protein benzersiz gereksinimleri için ampirik olarak taranması gerekir. 26 , 27

Deterjanlar kendi kritik micelle konsantrasyon yukarıda çözümünde micelles denilen formu toplu yapıların için kendini topla. Micelles (genellikle 20-200 çeşitli) birçok deterjan monomerleri micelle çekirdek ve sulu solvent bakan bir micelle kabuk katmanda düzenlenmiş hidrofilik baş grupları oluşturan hidrofobik alkil zincirleri ile oluşur. Deterjanlar ve micelle oluşumu davranışını klasik Charles Tanford Hidrofobik etkisi,28 ve boyutları tarafından tarif edilmiştir ve micelles membran protein çalışmalarda yaygın olarak kullanılan deterjanlar gelen şekiller olmuştur küçük açı saçılma kullanarak karakterize. 29 , 30 deterjan örgüt membran proteinlerinin hakkında da eğitim gördü ve protein-deterjan kompleksleri (PDC) oluşumu ile deterjan molekülleri protein düzgün deterjan benzer bir düzenleme çevreleyen bekleniyor micelles. 31

Bir avantaj deterjanlar kullanarak elde edilen micelle özellikleri diğer deterjanlar dahil ederek manipüle eklenir. İdeal karıştırma birçok deterjanlar sergi ve karışık micelles seçme özellikleri bile bileşenleri ve karıştırma oranı tahmin. 22 ancak, deterjan varlığı hala sorunlar biyofiziksel karakterizasyonu için genel sinyal katkıda bulunarak mevcut. Örneğin, x-ışını ve ışık saçılım teknikleri ile deterjan PDC içinde sinyal protein neredeyse ayırt edilemez. 32 tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) ile araştırmalar genellikle kapana kısılmış (donmuş) parçacıkları üzerinde itimat; yapısal protein ayrıntılarını hala bazı deterjanlar veya arka planına ekler deterjan yüksek konsantrasyon tarafından gizlenmiş. 33 (deterjan da dahil olmak üzere) tam PDC yapısını yorumlama doğru alternatif yaklaşımlar deterjan verilen membran protein çevresinde yeniden inşa etmeye hesaplama yöntemleri ile yapılmıştır. 34

Nötron saçılma durum için deterjan micelle içinde çekirdek-kabuk düzenlenmesi için gözlenen saçılma katkıda bir form faktörü üretir. Neyse ki, öyle ki onlar için net gözlenen saçılma katılmazlar çözüm bileşenlerini değiştirilebilir. Bu "eşleşen kontrast" işlem döteryum için arka plan (arabellek) uygun bir saçılma uzunluğu yoğunluğu sağlamak hidrojen yerine kullanarak elde edilir. Deterjan (kullanılabilir deuterated meslektaşları ile) akıllıca bir seçim ve karıştırma onların oranı dikkate alınmalıdır. Deterjan micelles için bu ikame deuterated alkil zinciri (h-kuyruk yerine d-kuyruk) sahip ama aynı kafa grubu ile bir deterjan kullanarak gerçekleştirilir. Deterjanlar iyi karışık olduğundan,35 ağırlıklı köstebek-kesir bir saçılma uzunluğu yoğunluğu onların toplamları verir ortalama iki bileşenleri (h-kuyrukları ve d-kuyrukları). Bu ortalama kontrast baş grup ile tutarlı olduğunda, tek tip toplu yapıları tam olarak gözlenen saçılma tüm katkılar kaldırmak için eşleştirilir.

Burada döteryum etiketli alkil zincirlerle kimyasal olarak özdeş deterjan molekülleri içeren ile deterjan micelles nötron karşıtlığını değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. 19 , 36 , 37 bu micelle çekirdek ve Nötron saçılma benzersiz bir yetenektir kabuk tam eşzamanlı aksine eşleşen izin verir. 35 , 38 önemli ölçüde rafine bu ayrıntı düzeyiyle, kontrast eşleşen etkinleştirebilirsiniz membran protein yapıları Aksi takdirde olanaksız çalışmalar. Ayrıca, bu karşıtlık eşleştirme yaklaşım için diğer sistemleri polimer Satım reaksiyonlar39 ve yağ-su dispersant,40 veya bicelles,41 gibi solubilizing bile diğer ajanlar gibi deterjan içeren uzun olabilir nanodiscs,42 ya da blok kopolimerler. 43 A benzer yaklaşım bu el yazması, ancak kısmi döteryum kısaltmaları alkil zinciri ve/veya kafa grubu ile tek bir deterjan tür istihdam Seviyelendirilmiş olarak son zamanlarda yayınlandı. Bu hidrojen ve döteryum deterjan boyunca rasgele dağıtımını geliştirmek için beklenen süre 37 burada anlatılan yaklaşım ikame ve iki adım için deterjan kullanılabilir pozisyonlar sınırlı sayıda karşılaştırıldığında. deterjan sentez pozlar ek zorluklar dikkate için gerekli.

İlk deneme planlama bir kalite teklif için yapılması gereken bu yana adım 1 ve 2 kez aşağıda ayrıntılı Protokolü'nün üst üste. Ancak, öneri gönderme olarak kabul edilir bu işlemin de nötron deney öncesinde başlayan olduğunu vurgulamak için ilk adım olarak. Ayrıca göre teklif gösterdi, bir önkoşul adım nötron çalışmaları ihtiyacını destekleyen örnek (saflık ve istikrar dahil) fiziksel ve biyokimyasal karakterizasyonu sahip olmaktır dikkat edilmelidir. Küçük açı Nötron saçılma (San) genel bir tartışma Bu makalenin kapsamı dışında olduğunu. Kısa ama kapsamlı giriş Malzeme karakterizasyonu Kaufmann,44 ve saçılma kapsamlı bir ders kitabı üzerinde duruldu biyolojik küçük açı çözüm tarafından son yayınlanan başvuru eser bulunmaktadır kullanılabilir. 45 daha fazla tartışma bölümünde önerilen okuma verilir. Küçük açı saçılma sözde saçılma vektör Q dağıtma işlemini açıklar merkezi miktarı olarak kullanır. Bu makalede yaygın olarak kabul gören tanım Q kullanılmaktadır = 4π sin (θ) / λ, θ gelen ve dağınık kiriş ve λ arasında yarım açı nerede dalga boyu Angström nötron radyasyonu. Diğer tanımları farklı kullanım 's gibi semboller var ' saçılma vektör ve bu faktör 2π veya nanometre Angstrom yerine kullanarak farklı olabilir için (Ayrıca bkz: Şekil 10tartışılması).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırla ve bir nötron tesis ışın zaman ve enstrüman teklifi gönder

  1. Genel Kullanıcı nötron ışın zaman erişim, gibi Oak Ridge National Laboratory (ORNL) sağlamak Nötron saçılma özellikleri belirlemek için online kaynaklarına başvurun. Nötron imkanları ve nötron araştırma dünya çapında hakkında bilgi çevrimiçi kullanılabilir. 46 bu tesisler genellikle normal görüşmeleri için teklif var unutmayın; Bu ne zaman sonraki ışın sırasında kullanılabilir belirler. Nötron çeşitli uygulamalar için kullanılır; küçük açı Nötron saçılma (San) aletleri, özellikle de biyolojik örnekleri için yetenekleri ile arayın.
  2. Nötron imkanları tarafından sağlanan kaynaklar nötron ışın zaman teklif gönderme işlemini gezinmek için kullanın. İle bir Nötron saçılma bilim adamı (kendisi için geçerli olacaktır araç ile ilişkili NSS) başvurun. Nötron tesisin teklif çağrıları, son başvuru tarihleri ve tavsiye için başvuru ile ilgili geçerli bilgileri gözden geçirin; Oak Ridge için bu çevrimiçi kullanılabilir. 47 başarılı bir gönderme için tüm yönergeleri izleyerek ışın zaman teklif gönderin.
  3. Deuterated protein gerekli (bkz: 2.2) ise, Nötron saçılma imkanları kez laboratuvarları ve uzmanlık deuterated malzemelerin üretim adanmış tarafından desteklenir. Erişim için Bio-Deuteration Lab (BDL) adlı ORNL istiyorsanız, BDL ikinci araç olarak öneri sistemi seçin. SANS önerisi için fizibilite ve bilimsel inceleme Komitesi tarafından gözden iken, BDL istekleri sadece için fizibilite ekranlı. BDL fizibilite incelemeleri ile yardımcı olmak için tahmini verim ve protein ifade protokolü açıklar tamamlanan bilgi istek formu48 gönderin (kullanılabilir çevrimiçi).
  4. Başarılı-akran sonra ışın zaman önerisi, ışın zaman deneme öncesinde ödül tarih onaylamak. Tüm örnek ve arabellek bilgileri ve formüller doğru düzgün İnceleme için teklifinde listelendiğinden emin olun. Örnek ve tampon bileşiminde değişiklikler dahil olmak üzere önerilen deneysel planın herhangi bir değişiklik bildirim tesisin gerektirir.
    Not: Değişiklikleri en kısa zamanda atanan NSS ile görüşülmelidir.

2. Protein ölçümü için nötron kontrast maç puanı ve gerekli kontrast belirleyin

  1. Bilgi toplamak (tedarikçi firmanın ürün bilgileri, online veritabanları, yayımlanmış değerleri, vb) atomik besteleri ve birimler için kontrast uyumlu deterjan sistem bileşenleri ile ilgili. Bu bilgiler bağlamında ilgi membran protein için veri ve yapısal bilgi SANS kalite elde etmek için önemlidir çözümde Nötron saçılma uzunluğu yoğunlukları (SLD) belirlemek ve böylece maç puanı (CMPs) kontrast için kullanılır bir PDC. Fiziksel özellikler ve kontrast maç puanı membran proteinlerinin biyofiziksel çalışmalarda yaygın olarak kullanılan deterjanlar için olduğunu özetleyen bir tablo (Tablo 1) dahil.
  2. Malç web uygulamasını kullanarak nötron SLD'ler belirlemek: modüller için analiz, kontrast varyasyon veri49 (elde edilebilir online50 ücretsiz-of-charge). Kullanım Kılavuzu için bir bağlantı giriş sayfasında yer alır. Web sitesine erişmek ve eşlik eden belgeleri okuyun. Şekil 1 ve Şekil 2 kontrast modülü giriş ve çıkış genel bir bakış için iki ilgili örnekler sağlar.
    Not: SLD'ler hesaplamak için diğer Web sitelerine are elde edilebilir, National Institute of Standards ve Technology (NIST) Merkezi tarafından nötron araştırma için tutulan biri gibi. 51
    1. Kontrast modülü 'sol Gezinti Bölmesi'nde yer alan kontrast' ı tıklatarak açın. Proje başlığı için metin sağlamak ve olarak iki bileşeni (Örneğin, deterjan grubu baş ve kuyruk) aşağıda ayrıntıları girin ' alt birim 1' ve ' alt birim 2'.
    2. Moleküler formülü her bileşen 'Formül' metin kutusuna girin.
      Not: radyo düğmesini değilim ' 'Madde türü'nün altında bir moleküler formülü girmek için seçilmiş olması gerekir. Ayrıca, formül 'X' harfi kolayca değiştirilebilir hidrojen atomları belirtmek için kullanın. Eğer protein, RNA veya DNA dizileri girilebilir karşılık gelen 'P', 'R', ya da vardı ' radyo düğmesi seçilir. Bir bileşenin birden çok kopya içinde alt birimi varsa, 'Nmolecules' değeri buna göre değiştirilebilir. Pratik bir örnek 2'ye eşit Nmolecules ile girilecek bir kuyruk için formül sağlayan iki özdeş kuyrukları içeren lipid benzeri deterjanlar ile ilgilidir.
    3. Birimin kübik Angström her bileşen 'Cilt (Å3)' aşağıdaki kutuya girin. Tanford'ın formül28 uzunluk n, Vkuyruk alkil zincirler için kullanın = 27,4 + n * 26,9 yaklaşık kuyruk birim hesaplamak veya moleküler birimleri ürün bilgileri elde etmek için sağlanan veya değerleri yayınlandı Edebiyat.
    4. Ayrıntılar için arabellek bileşenleri girin. 'Numarası tür solvent içinde çözünmüş' değiştirmek için her arabellek bileşen satırları eklemek veya kaldırmak için aşağı açılan menüsünü kullanarak. Micelle oluşturmayan durumunda deterjanlar, deterjan'ın kritik micelle konsantrasyonu (CMC), ayrı arabellek bileşenleri olarak ücretsiz deterjan monomerleri içerir.
    5. 'Gönder' nötron kontrast hesaplamalar ve saçılma uzunluğu yoğunluğu ve kontrastı maç puanı yanı sıra D2O içinde verilen herhangi bir yüzdesi, bu parametrelerin belirlenmesi için formüller tablosu sağlar bir sonuçlar sayfası oluşturmak için tıklatın arabellek. Saçılma parametreleri bileşen CMPs özel önem ile gözden geçirin. Maç puanı (%10 D2içinde O) benzer ve ücretsiz micelle konsantrasyonu düşük sonra ortalama CMP olabilir kontrast eşleştirmek için kullanılan deterjan katkıları. Çoğu durumda, CMP deterjan grubu baş ve kuyruk bir çekirdek-kabuk form faktörü doğrudan yalnız protein saçılma sinyalini topluluğu obfuscates SANS veri üreten daha fazla 10-15 oranında farklılık gösterir.
  3. Deterjan baş grup ve kuyruk arasındaki kontrast değerlendirmek. Deterjan baş grubu ve alkil zinciri kuyruk CMPs olmadığın zaman uyumlu kullanılabilirlik ve döteryum yerine deterjan birleşmesiyle değiştirilmesine bile■enleri uzunluğu yoğunlukları saçılma izin verebilir. Çoğu durumda, bu karışık micelle döteryum yerine alkil zincirleri ile özdeş bir deterjan Incorporation aracılığıyla oluşturan gerektirir. Döteryum ilavesi alkil zinciri kuyrukları tarafından kurulan çekirdek saçılma uzunluğu yoğunluğu yükseltir. Baş grubu kabuğunu CMP ve alkil zinciri çekirdek CMP yaklaşık olarak eşit değerler böyle istediğiniz son nokta, bu durumda olduğunu.
    1. H-kuyrukları ve tam aksine baş gruplarla eşleşen elde d-uçlar arasında karıştırma uygun oranını belirleyerek baş grubu kabuğunu CMP için yaklaşık olarak eşit olmak CMP deterjan micelle çekirdek yükseltmek. Döteryum yerine alkil zinciri kuyruk için CMP bilgisine Bu tayini için bir önkoşuldur. N-Lauryl β-D-maltoside (demir) için piyasada bulunan bir meslektaşı ile tüm alkil zinciri hidrojen döteryum (d25-DDM) tarafından yerine kullanılabilir. 2.1. adımda vardı kuyruk özetlenen kontrast hesaplamalar tekrar ' yerine 'h-kuyruğu'.
    2. H-d-kuyruk baş grup CMP ile kontrast eşleştirmek için gerekli kuyruğuna köstebek oranını hesaplamak. Aşağıdaki formül bu tespiti ile size yardımcı olabilir:
      Cumhuriyetçi millet partisiBaşkanı Cumhuriyetçi millet partisih-kuyruk = * χh-kuyruk + CMPd-kuyruk * χd kuyruk
      CMP saçılma uzunluğu yoğunluğu ve χ birim kesir deterjan kafa, h-kuyruk ya da d-kuyruk bileşeni için orada. DDM tamponlu çözümleri d25-DDM döteryum yerine alkil zincirlerle olarak toplam deterjan (köstebek tarafından % 43) ağırlıkça % 44 birleşmesiyle %48.5 D2O baş ve kuyruk bileşenleri için tek bir CMP üretir.
  4. Döteryum ikame membran protein için derecesi göz önünde bulundurun. Protein yeterli saçılma sinyalini ölçmek için CMP protein için en az %15 D2O çözüm deterjan CMP uzak ve ölçüm koşulları olmalıdır. Sinyal bu % fark Meydanı ile artar. CMP etiketlenmemiş bir proteinin genellikle ~ %42 D2O çözüm (CMP birçok deterjan baş gruplarına benzer) ile ortaya çıkar, döteryum protein etiketleme hemen hemen her zaman bir zorunluluk olduğunu. 52

3. hızlı ve membran Protein ilgi arındırmak

  1. LB (lysogeny et suyu) orta hazırlamak ve Escherichia coli büyümek (E. coli) hücreleri hedef protein sırası için bir indüklenebilir ifade vektör yataklık.
    1. En az ortam hazırlamak. 7.0 g/L (NH4)2H2O veya D2O, yani dağıtılması4, 5,25 g/L Na2HPO4, 1.6 g/L KH2PO4, 0.50 g/L diammonium hidrojen sitrat, 5.0 g/L gliserol, 1.0 mL/L % 20 w/v MgSO 4·7H2O ve 1.0 mL/L Holme izleme metaller (0.50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/M CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22.3 g/L Na2EDTA·2H2O ve 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Uygun antibiyotik hisse senedi çözümler H2O veya D2O. kullanmaya hazırlamak
    3. H2O veya D2O. kullanarak izopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside hisse senedi çözümünü hazırlamak
    4. Tüm çözümler içine kuru, Steril konteyner şişe üstü Vakum kullanma ve 0,22 mikronluk gözenek boyutu filtreleriyle şırınga steril-filtre.
  2. E. coli hücrelerine ölçek-up için bir deuterated protein overexpression döteryum etiketli orta öncesinde uyum.
    1. 3 mL LB orta Lysogeny suyu (LB) agar plaka izole bir kolonisi veya dondurulmuş gliserol hisse senedi hücrelerden aşılamak. Titreyen bir kuluçka 250 RPM'de 37 ° C'de hücrelerin büyümesine veya sıcaklığı 30 ° c veya daha düşük büyüme kültür gecede kuluçka önlemek için azaltmak.
      Not: Adaptasyon yordamı çeşitli olabilir. 55 , 56 , 57
    2. Bir kez LB kültür 600 optik bir yoğunluk büyümüştür nm (OD600) ~ 1, 1:20 H2O en az orta 3 ml seyreltik ve bir OD600 ~ 1 için büyür. 1:20 tekrar 50, 75 ve %100 D2O (kadar veya istenilen D2O yüzde) içeren en az orta kullanarak dilutions.
      Not: olarak D2O içeriği artar, büyüme oranları azalacak. D2O yüzde olarak büyüme medya ve döteryum ikame protein arasındaki ilişkiyi literatürde bildirilmiştir. 58 , 59 , 60
    3. Deuterated hücre kütlesi (Şekil 3) verimini artırmak için bir biyoreaktör kültüründe büyümeye devam.
      Not: Adım adım yordamlar biyoreaktör işlemi için başka bir yerde inceledik. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Hasat ve E. coli hücre membran çıkarma ve protein arıtma için koşullar
    1. Hücreleri tarafından Santrifüjü ~ 6.000 x g ~ 30-45 için de cips min 4 ° C'de
    2. Hücre Pelet ~ 30 dakika buzda arabellekte ıslatarak yumuşatmak. Sonra yavaşça hücre Pelet arabellekte yavaşça serolojik damlalıklı veya yumuşak ~ 1 g ıslak hücre kütlesi/10 mL arabellek son bir konsantrasyon için 2D bir rocker üzerinde sallanan pipetting tarafından resuspend.
      Not: bir örnek arabellek 50 mm'dir HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit), pH 7.5, 200 mM NaCl bir proteaz inhibitörü tablet ile desteklenmiştir.
    3. Resuspended hücreleri ile 10.000 PSI, yüksek basınçlı homogenizer üzerinden üç geçer çıkış soğutma parçalayıcı.
      Not: Gerekli ölçek bağlı olarak, diğer lizis yöntemleri kullanılan (Örneğin, Fransız basın veya sonication) olabilir.
    4. Pelet hücre artıkları Santrifüjü ~ 4000-5000 x g 4 ° C'de 15 dakika at tarafından Süpernatant açıklık kadar bu adımı yineleyin.
    5. Ultracentrifuge (30-45 dk ~ 150.000 x g) süpernatant çözünen içeren önceki adım ve membran kesirler. Pelet ultrasantrifüj sonra membran kesir içerir.
    6. Membran Pelet içinde büyük bir Dounce homogenizer resuspend ve membran kesir tekrar ultrasantrifüj tarafından (adım 3.3.5) yalıtır. Gevşek ilişkili proteinler kaldırmak için en az bir kez bu adımı yineleyin.
    7. Membranlar ~ 30 dk içinde deterjan arıtma için uygun içeren bir tampon 4 ° C'de yumuşak Rock yaparak solubilize. Süspansiyon bulutlu saydam olarak döner solubilization belirgindir. Çözünmez malzeme ultrasantrifüj (30-45 dk ~ 150.000 x g) çıkarın.
      Not: Bir örnek arabellek 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole ve % 4 (w/v) DDM Ni2 + benzeşme Kromatografi tarafından arıtma olduğunu.
  4. Daha önce protonated formları için geliştirilen bir protokol sonrası protein arındırmak.
    Not: Naing ve ark. öğesini hexahistidine M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl proteaz (d-MmIAP) için bir örnek arıtma iletişim kuralı için bkz. 65 son verim oldu ~ 1 mg deuterated tüm bunların kullanıldı 5 L deuterated hücre kültür büyüme SANS deneyinde (Şekil 4).
  5. Saf protein "Son Exchange arabellek" kontrast eşleştirmek için değiştirin.
    1. 250 mM NaCl ve % %0.05 49 D2' O. DDM (%0,028 DDM ve %0.022 d25-DDM) Toplam 200 mL "Son Exchange eşleştirme, Örneğin,20 mM HEPES, pH 7.5 kontrast için doğru karışımı içeren arabellek" hazırlamak,
    2. Bir boyut dışlama sütunla equilibrate > 2 sütun cilt (CV) "Son Exchange arabelleği" olarak hızlı Protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemini kullanarak 3.5.1.
    3. Örnek enjekte sonra sütun çalıştırın ve faiz protein karşılık gelen kesirler yalıtmak.
    4. İstenen son konsantrasyonu (2-5 mg/mL) protein konsantre.
      Not: ~ 300 μL hacmi SANS için kullanılan 1 mm silindirik kuvars küvet doldurmak için gereklidir.
    5. Bir aliquot arka plan çıkarma SANS için eşleşen tamponunun saklıdır.
      Not: Aliquot doğrudan hazır arabellek veya ideal temiz elüsyon kesir FPLC Çalıştır sonunda alınabilir.

4. ışın zaman ve SANS veri toplamak için son hazırlıklarını yapmak

  1. Teklifi kabul etti ve site erişimi kabul gördü sonra atanan ışın saat öncesinde gerekli tüm eğitim tamamlayın. Bu prearrival, web tabanlı eğitim yerinde radyolojik, laboratuvar ve enstrüman özel eğitim yanı sıra içerir.
    Not: Eğitim gereksinimlerini önceden varış ilk kez kullananlar için dikte verebilir. Daha fazla bilgi çevrimiçi kullanılabilir. 66
  2. Örnekleri ve arabellekleri veri toplama için yükleyin.
    Not: Biyolojik küçük açı Nötron saçılma genel bir bakış (Bio-SANS) enstrüman örnek çevre alanı Şekil 5' te gösterilen.
    1. Örnekleri ve arabellekleri kuvars hücrelere yükleyin. Kuvars hücreleri enstrüman bilim adamı veya tesis mevcuttur. Jel-yükleme ipuçları çoğu örnek hücre dar açılış erişmek için kullanın.
    2. Işını çekim kapalı olduğundan emin olun, sonra örnek çevre bölgesi yaklaşım ve kuvars hücreleri örnek değiştirici yerleştirin. Örnek değiştirici pozisyon her örnek hücre için kaydedin.
    3. Kontrol..... .et ve ışın yolu tıkanıklığı ücretsiz olduğundan emin olun o zaman örnek çevre bölgesi bırakın ve ışın çekim açın.
      Not: Dikkatle tüm tesis kural ve yönetmelikleri takip, tüm ilanları itaat ve enstrüman bilim adamının öğüdünü tut. Örnekler kiriş kaldırıldı ve uzun süre maruz kiriş aşağıdaki özel önlemler olmadan manipüle. İle bir radyolojik kontrol teknisyeni (RCT) önce bu yordamları bakın.
  3. Tablo tarama otomatik veri toplama için yürütmek
    1. Araç özel denetim LabVIEW-esaslı bilgisayar yazılımı, spektrometre enstrüman denetim ortamı (baharat) aracılığıyla faaliyet. Araç operasyon Nötron saçılma bilim adamı tarafından sağlanan yönergeleri izleyin. Tablo tarama işlemi windows genel bakış Şekil 6' da verilmiştir.
    2. Uygun yerlerde gerekli bilgileri girdikten sonra tablo taraması yürütmek ve bir otomatik veri toplama işlemi başlayacak. 'Tablo tarama durumu' sekmesinden ilerlemesini izlemek.

5. 1 D arsa için 2B görüntü veri azaltmak

  1. Her örnek ve arabellek veri dosyasından kaydedilmiş Tarama numaraları tanımlayın. Her ölçüm benzersiz tarama numarası atanır. Bu bilgiler veri azaltma sırasında her karşılık gelen örnek ve tampon çifti belirlemek için yararlıdır.
  2. MantidPlot yazılım ve Python komut azaltma için kullanın
    1. Nötron saçılma kullanıcıları uzak analiz kümede onların verilerine erişmek için rapor tafsilât ile sağlanır. 67 uzaktan analizi küme oturum açın ve "MantidPlot" komut satırından çalıştırın. Şekil 7 ve Şekil 8 adımları yardımcı olmak için sağlanmıştır.
    2. Nötron saçılma (Bu genellikle deneme sırasında olacak) bilim adamı ile bir Kullanıcı azaltma komut dosyası alın; Bu betik Python tabanlı ve tüm gerekli kalibrasyon ve 2D saçılma dağınık yoğunluklarda 1 D komplo içine saçılma açı, I(Q) bir fonksiyonu olarak küçültme için ölçekleme ayarlamalar içerir.
    3. MantidPlot içinde sağlanan Kullanıcı azaltma komut dosyasını açın ve karşılık gelen tarama numaraları veya kimlik örnek ve tampon çiftleri için uygun listesinde yer.
    4. Dört sütunlu metin dosyası olarak azaltılmış verileri oluşturmak için komut dosyasını yürütün (sütun sıradır Q, I(Q), I(Q) hatası, Q hatası) belirtilen konumda. Uygun çalışma alanında MantidPlot sağ tıklatıp "hataları ile ilk saçılma profilleri incelenmesi için... çıkart" i seçin.

6. saçılma parçacık yapısal parametreleri için verileri analiz

  1. Azaltılmış veri dosyasını çözümleme sunucusundan güvenli FTP dosya aktarımı kullanarak yerel bir bilgisayara aktarın. Bu FileZilla veya CyberDuck gibi yazılım kullanımı ile yapılabilir. Analysis.sns.gov giriş sayfasında ilgili ek talimatlar vermesi ve analiz sunucu dosya sistemine bağlanmak için ayrıntılar sağlanmaktadır.
  2. ATSAS yazılım Süiti65,68 (tüm ATSAS suite) yükleyin. 69 tek program70 kullanılabilir ayrıca durumda yani yapısal parametreleri ve ab initio modelleri belirleme SANS verileri analiz etmek için.
    Not: Birçok seçenek SANS biomacromolecules veri analizi için kullanılabilir. 45
  3. PRIMUS71 verileri çizmek için kullanmak, ölçekleme ve çıkarma ve Guinier analiz arabellek.
    1. ATSAS 'SAS veri analizi' başlatmak uygulama ve yük azaltılmış veri dosyaları örnek ve tampon çiftine karşılık gelen.
      1. Arabellek düzgün ölçeklemek için yüksek Q adlı bir veri aralığı seçin (Q > 0,5-1Å) nerede her iki profilleri benzer ve düz ve 'Operasyon' altında bulunan 'Ölçek' düğmesini tıklatın. Bu iki düz bölgeleri üst üste öyle ki bir ölçek faktörü arabelleğe uygulanır. Dikkatli olun: örnekle eşleşmesi için arabellek yoğunluğu ölçekleme haklı makul fiziksel bir nedeni olmalı. Tutarsızlık büyükse, bir enstrüman bilim adamı arka plan çıkarma geçerli yaklaşımlar başvurun. 44 , 45 , 72
      2. Tüm noktalarını görüntülemek için veri aralığını artırın. Bu işlemi gerçekleştirmek için ' çıkar' tıklatın. Göstergedeki arabellek düşülen datafile sağ tıklayın ve daha sonraki analiz için bu dosyayı kaydedin. Şekil 9 'Operasyon' sekmesini kullanımı özetlenmektedir.
    2. Bir Guinier 'SAS veri analizi' uygulama 'Analiz' sekmesini kullanarak arabellek düşülen örnek veri analizi gerçekleştirin.
      1. Uygun dosya listede seçili olduğundan emin olun ve 'Eylemsizlik yarıçapı' tıklatın. Uygun bir Guinier gerçekleştirmek için otomatik bir girişim 'Autorg' butonuna basarak sağlanacaktır.
      2. Tüm düşük-Q veri içerir ve veri aralığı uzağa kadar Qmax Yüksek-Q puan alarak daralma başlamak için kullanılan veri aralığını genişletin * Rg sınırıdır 1.3. Kalanlar Arsa veri uygun aralığında doğrusal doğrulamak için kullanın. Uygun Guinier verimleri yaklaşık bir Rg ve0 saçılma parçacıklar için.
      3. Uygun bölge ufak değişiklikler yapmak ve bu değerler için uyum içinde kullanılan veri aralığını duyarlılığını izlemek. Şekil 10A 'Eylemsizlik yarıçapı' araç kullanımını gösterir.
  4. Olasılık dağılım fonksiyonu (P(r)) GNOM. elde 73 burada oluşturulan çıktı dosyası süreç modelleme ab initio için giriş olarak kullanılacak.
    1. Başlangıç uzaklığı Dağıtım Sihirbazı'nı veri için iyi bir uyum elde etme 'Analiz' sekmesini içinde bir kalite modeli elde etmek için esastır. Doğru uygun elde etme hakkında daha fazla bilgi için lütfen Putnam, et al. tarafından İnceleme74 bakın
      Not: GNOM programı uygun mesafe dağıtım Sihirbazı'nı ötesinde hakkında ek bilgi sağlar. Şekil 10B 'Mesafe dağıtım' aracı uygun kullanımını gösterir ve Şekil 11 yaygın hataların bazıları gösterilmektedir.
    2. VSEÇMAK molekül içinde en fazla Soygazlar mesafeyi belirlemek.
      1. Rmax zorlamak için kutusunu genişletmeyi VSEÇMAK için tahmini bir değeri = 0 ve Dmax için büyük bir değer girdikten (150 Å, örneğin). İlk x-kesme noktası P(r) arsa içinde bu tahmin verir.
      2. Bu VSEÇMAK değer ve kullanılan veri aralığını veya hastalık nöbeti içinde veri ve elde edilen P(r) eğrisi uygun GNOM optimize etmek için kullanılan puan artımlı değişiklikler yapmak.
    3. GNOM uyum rafine ve modelleme adımları izleyen ab initio için iyi uygun parametrelerle GNOM çıktı dosyalarını kaydetmek devam edin.
  5. CRYSON programını kullanarak yüksek çözünürlüklü PDB modelleri profillerden SANS simülasyonu. 75
    1. Program ve Seç seçeneğini '0' açın. PDB dosya adı açılır menüsü dosya tarayıcısı seçin. Zincir deuteration kesirler ve D2O kısmını çözücü uygun kontrast parametreleri elde etmek için belirtme dışında varsayılan ayarları kabul etmek için enter tuşuna basın.
    2. 'Y' girme ve veri dosyası açılır menüsü Dosya tarayıcısında seçerek model deneysel bir veri kümesi için uygun. Geri kalan varsayılan değerleri kabul edin ve çıkış dosyalarının PDB dosya konumunda yazılır. 'Vasileri' dosya için yüksek çözünürlüklü 3D modeli tahmin edilen saçılma profil bilgilerini içerir.

7. Ab Initio modellerden oluşturma veri SANS.

Not: DAMMIF76 ve77 ATSAS bilgisayar yazılımı maiyet içinde DAMMIN kukla atom modelleri (baraj) çıkışı, hangi P(r) veri veya olasılık hakkında bilgi içeren GNOM Benzetimli Tavlama işleminden kullanarak yeniden oluşturmak için kullanılan veya Soygazlar mesafeler saçılma parçacık içinde sıklığı. Bu programlar toplu modunda veya ATSAS-Online web sunucusunda çalışabilir.

  1. 'Analiz' sekmesinde 'SAS veri analizi', 'Dammif' düğmesinden PRIMUS şekil Sihirbazı başlatın ve bir el ile seçim parametreleri kullanın. Sihirbazın giriş Şekil 12' gösterilmektedir.
    1. Uyum (adım 6.3.2) Guinier aralığından tanımlamak ve gezinti düğmelerini kullanarak sonraki adıma geçin. P(r) Arsa (adım 6.4) uygun değerleri tanımlamak ve sonraki adıma geçin.
    2. Süreç modelleme ab initio için parametreleri sağlar. Modeli çıktı için dosya adları (Örneğin, SANSEnvelope) bir önek girin, her iki 'hızlı' ya da 'yavaş' tarz modelleme seçin, modelleri (istatistiksel anlamlılık için önerilen 17) sayısı için bir değer girin, parçacık simetri için kullanılabilen seçeneklerini seçin, anisometry ve açısal ölçeği (biliniyorsa). Kutuları DAMAVER ile ortalama modelleri için denetlenir ve DAMMIN ile son model iyileştirmek emin olun.
    3. 'Kayıt' düğmesini kullanarak işlemini başlatmak. İşlem tamamlandıktan sonra görüntüleme ve kaydetme çalışma dizini.
      Not: tipik modelleme işleminin tek bir küçük protein olarak tipik bir kişisel bilgisayar ile birkaç saat sürebilir. Dosyaları kaydettiğiniz kadar geçici dizinlerde saklanır.
  2. Yerleşimi ve final üst üste zarf içinde ATSAS SUPCOMB kullanarak ilgili yüksek çözünürlüklü modeli ile SANS. Çalışma dizini SANS zarfta uyacak yüksek çözünürlüklü PDB modeli bir kopyasını yerleştirin. Komut satırından SUPCOMB çalıştırın ilk listelenen şablon yapısı ile iki bağımsız değişken olarak PDB dosya adları kullanarak: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Not: Listelenen ikinci dosya adı superimposition şablon yapısı üzerinde son ve sahip yeni koordinatlarını eklenen bir "r" ile yeni bir dosya olarak yeniden.
  3. Ab initio modeli sonuçlar PyMOL (pymol.org), bir 3D Moleküler grafik görüntüleme programı kullanarak görselleştirmek. Şekil 13 PyMOL işlemleri genel bakış sağlar.
    Not: Biomolecules çözüm küçük açı saçılma veri yapısal modelleme için yayın kurallar vardır. 78
    1. PyMOL uygulamasını başlatmak ve görüntülenecek zarf ve SUPCOMB uyumlu yüksek çözünürlüklü yapısı SANS 3D için karşılık gelen .pdb dosyaları açın.
    2. Bu model bir yüzey olarak temsil eden SANS zarf görselleştirin. Tıklayın ' ın ' düğmesini seçin ve model ' göster: olarak: yüzey '.
    3. Yüksek çözünürlüklü protein omurga yapısı bu model bir çizgi film olarak temsil eden görselleştirin. Seçin ' ın ' düğmesinin yanındaki bu model ve seçin ' göster: olarak: çizgi film '. 'C' düğmesini seçerek bir gökkuşağı üzerinden N - için C-terminus zinciri görüntülemek ve ' tarafından Zinciri: Chainbows'.
    4. Netlik için yüzey gösterimi saydamlığını değiştirmek. 'Ayar' menü çubuğundan seçin ' şeffaflık» yüzey» %40 '.
    5. Arka plan beyaz ve opak olun. 'Görünen' menü çubuğundan seçin ' arka plan»' ve 'Bu seçeneği 'Beyaz' arka planı için bu renk işaretlemek için uncheck ve opak' seçin.
      Not: ek işlemleri ve anlamları için PyMOL-ebilmek bulunmak PyMolWiki.org.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir ışın zaman ve enstrüman öneri açıkça böylece önerilen deney geçerli bir değerlendirme yapılan değerlendirme Komitesi için gereken tüm bilgileri iletmek. Bir NSS ile iletişim çok deneyimsiz kullanıcılar için önerilir. NSS ilk fizibilite ve fizibilite, emniyet ve çok etkili bilim potansiyelini vurgulamak için kılavuz öneri gönderme değerlendirebilirsiniz. Teklife bilgiler arka plan bilgileri ve araştırma önemini bağlamının içermelidir; elde edilebilir için beklenen bilgi ve nasıl bu bilimin ilgili bir alanda şimdiki anlayış etkiler; iş, örnekler, yöntemleri ve istihdam edilecektir yordamlar açıklaması; ve varsa, ilgili yayınları ve sonuçları da dahil olmak üzere tesis, takımının önceki verimlilik. Teklif şablonları ve teklif hazırlama ipuçları gibi yararlı kaynaklar nötron bilim Kullanıcı Portalı (neutrons.ornl.gov/users) aracılığıyla kullanıcılara kullanılabilir.

Deneme planlama kez öneri gönderme ilk aşamalarında başlar, ama tam olarak hemen önce deneme kadar gebe değil dinamik bir süreçtir. Ancak, önemli ölçüde sapma (arabellek koşulları veya örnek kompozisyon değişiklikleri de dahil olmak üzere) teklif açıklamasında herhangi bir değişiklik tesisin deneme başlangıcı önce tarafından onaylanması gerekir unutmayın.

Bu iletişim kuralı ifade ve çözüm içinde deterjan micelles içine ilgi membran protein arındırıcı bir yöntem başarıyla göstermiş olduğu varsayılır. Bu durumda, membran ilgi bir kurulan arıtma Protokolü ve daha önce çözünür ve DDM micelles içeren arabellekte aktif olmak için kararlı bir intramembrane aspartyl proteaz (IAP), proteindir.

Burada, biz malç kullanarak nötron kontrast hesaplamalar göstermek: kontrast eşlemeli IAP proteinin bir çözüm için kontrast modülü karışık DDM / d25-demir micelles. Burada özetlenen strateji ilk micelle bir tam aksine maç elde etmek için gerekli iki deterjanlar arasında karıştırma belirlerken oldu. Sonuçta her bileşen ve arka plan (H2o/d2O oranı) kontrast-saçılma deterjan üzerinden maç sadece protein saçılma incelemek için'gerekli göreli karşıtlığını belirlemek için oldu.

Şekil 1 malç kontrast modülü için uygun bir giriş ve sonuç çıktısı DDM deterjan baş grubu ve kuyruk kontrast hesaplamalar için alt birimleri 1 ve 2, sırasıyla gösterir. Baş grubu için kullanılan C12H14X7O11 Å3ve alkil zinciri kuyruk formül3Å 350 hacmi ile H25 C12olarak verilir 348 hacmi ile formülüdür.

DDM baş grup ve kuyruk farklı saçılma uzunluğu yoğunlukları var ve böylece iki bileşenler arasındaki kontrast tespit edilecektir kontrast modülü çıktısı görülmektedir. Alkil zinciri kuyrukları % 22 D2' O. meydana gelen onların ortalama CMP ile % 2 D2içinde O, bir Cumhuriyetçi millet partisi varken DDM için kafa grupları bir Cumhuriyetçi millet partisi % 49 D2içinde O var Bu nedenle, bir sonraki adım amacı kafa grupları CMP eşleştirmek için Ortalama CMP deterjan kuyrukları, artırmak için döteryum yerine alkil zincirleri içerir bir karışık micelle tasarlamak için olacak. Kontrast hesaplama DDM neden olan benzer şekilde buna ek olarak baş grup ve kuyruk arasında bir tam deuterated kuyruk (d25-demir), değiştirilen bir deterjan için tekrarlandı. Ancak, kontrast değerleri h-kuyrukları ve d-kuyrukları önemli ölçüde farklıdır. Karışımlar iyi karışık micelles çözümünde, böylece bir karışım, bu h ve d-tails micelle çekirdek başı olan için Ortalama bir SLD eşit üretmek gerekir22 üretmek bilinmektedir deterjan grubu kabuk bir micelle tek CMP ile verimli, hatırlama. Baş grup DDM ve d25-DDM için ortak olduğu için kafa grupları karşıtlığını maçlar karışık kuyrukları bir ortalama kontrast değeri üretir bu deterjan karışımı bulmak için stratejisidir.

Hedef CMP deterjan kuyrukları için maltoside kafa grupları veya %49 D2O. ortalamasıdır H-kuyruk ve d-kuyruk her bileşeninin ortalama CMP karıştırma oranı tahmin etmek için bilinmesi gerekir. Bunlar değerleri için bazı ortak deterjanlar ve piyasada bulunan döteryum karşıtları etiketli Tablo 1' de verilmektedir. Bu CMP değerleri DDM ve d25-DDM için kullanarak, köstebek h-kuyrukları ve 2.2 adımda sağlanan denklem tatmin d-kuyrukları χd-kuyrukları bir bölümüdür 0,43 =.

Şekil 2 son karışık micelle kontrast maç koşulları onaylamak ve deuteration protein üzerinde gerekli derecesini belirlemek için kullanılan malç kontrast modülü için daha gelişmiş bir girişi gösterir. Burada, onun amino asit dizisi tarafından verilen M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl proteaz (MmIAP) alt birim 2 başvurduğu süre alt birim 1 2 bileşenleri, demir ve d25-demir, kontrast eşlemeli karışık micelle için ifade eder. SLD protein ifade protein içeren ~ %92 D2O. arabelleği için bir Cumhuriyetçi millet partisi vermeye deuterated büyüme medya tarafından yükseltilmiş olan Protein'ın maç sayısı %92 D2O ile Ölçüm koşulu (%48.5 D2O) arasındaki mesafeyi derecesini yeterli saçılma sinyal protein elde edilir öneriyor.

D-MmIAP üretim pET22b-MmIAP vektör yataklık Rosetta 2 E. coli hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. En az orta % 90 D2O etiketlenmemiş gliserol ile büyüme aracı olarak seçildi. %90 D2O en az orta adaptasyon sonra kültür birim oldu ilâ 400 mL ölçekli ve taze %90 D2O en az orta 5.5 L biyoreaktör gemi içinde 3,6 L aşılamak için kullanılır.

Şekil 3 beslenen-toplu işleme sırasında izleme işlemi değerleri sağlar. Aşı zamanda, 30 ° C sıcaklık ayar noktası oldu, çözünmüş oksijen () ayar noktası % 100 olarak, ajitasyon ayar noktası 200 d/d, ve basınçlı hava debisi 4 L/dk oldu. PH 6,9 sodyum hidroksit % 10 w/v çözeltisi % 90 D2' O. kullanarak bir set noktası yukarıda gerçekleştirildi Bir kez spike (% 30 w/v gliserol, %0,2 MgSO%4 90 D2O) besleme ilk 5 g/L gliserol tükenmesi başlatılan, hangi ekimi devam sinyalini verdi. Beslenme yaklaşık 7 saat sonra kültür sıcaklık 18 ° C'ye düşürüldü ve izopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside 1 mM son bir konsantrasyon için eklendi. Kültür hasat üzerine yaklaşık 145 g ıslak ağırlığını hücre Yapıştır Santrifüjü (6.000 x g için 45 dk) yoluyla toplanmıştır

D-MmIAP arınma enzim verim daha düşük, ve son saflık tipik daha biraz daha düşük protonated enzim gelince devam etti. 5 L, ~ 20 g ıslak zarı izole edildi, tüm bunların içinde DDM arıtma için çözündürüldükten ve ilk Ni2 + benzeşme sütun yüklendi. Arıtma verimi en üst düzeye çıkarmak için akışı sayesinde kesir seyreltilmiş ve Ni2 + benzeşme sütun yeniden yeniden çalıştırın. Yordamı boyutu dışlama Kromatografi (Şekil 4) tarafından konsantre d-MmIAP örnek parlatma önce üçüncü kez tekrarlandı.

Şekil 5 bir kuvars örnek hücre ve onun ilgili örnek changer kurulum gösteriyor. Örnek ortamlar Bio tarafından yönetilir-operasyon ekibi ve NSS SANS. Farklı ortamlarda çeşitli ölçümler sıcaklık kontrolü, nem kontrolü, mekanik eskitme, yüksek sıcaklık ve diğerleri arasında sürekli baskı ile gerçekleştirmek için yardımcı olabilir.

Şekil 6 gösterir biyo-işlemleri ve otomatik tablo yürütülmesi tarar. Tablo tarama sezgisel ve kullanımı kolay olacak şekilde yapılandırıldı. İlk sekme (yük örnekleri), örnek değiştirici ve örnekleri örnek değiştirici, hücre kalınlıkları ve örnek türü (açık kiriş, örnek, arka plan, vb) her pozisyonda tanımlaması gibi kurulumu hakkında bilgi sağlanır. Ek meta veri etiketleri burada da uygulanabilir. Sonraki sekmeye (deneme planı), enstrüman yapılandırma ve ilişkili parametreleri (örneğin, sıcaklık kontrolü) tanımlanır. Bu adımı denemenin başlangıcında NSS göre düzenlenmiş. Kullanıcı sade bir şekilde her örnek için ölçüm kez (saniye cinsinden) giriş gerekir. Son sekme (yürütmek inceden inceye gözden geçirmek) tablo tarama verisini bir özetini sunar ve yürütülmek üzere otomatik tarama sağlar.

2D saçılma görüntüleri kaydedilir sonra bu verileri 1 D Arsa Q - bir işlev saçılma açının karşı yoğunluğunun azaltılmalıdır. Veri azaltma sırasında görüntü düzeltmeleri piksel hassasiyeti maskeleri ve koyu arka plan subtractions gibi de uygulanır. MantidPlot yazılım ham Bio yorumlamak için tasarlanmıştır-enstrüman veri SANS. NSS genellikle azaltılması ve deneme sonunda son veri almak yardımcı olacaktır.

Şekil 7 MantidPlot ve komut dosyası penceresinde veri azaltılması için kullanılan uzaktan analizi küme erişiminin genel bir bakış sağlar. Ham veri uzaktan analizi küme (analysis.sns.gov) UCAMS/XCAMS Kullanıcı kimlik doğrulaması üzerinden de erişilebilir. Herhangi bir yol altında 'MantidPlot' yürüterek içine uzak okul sırası oturum açtıktan sonra MantidPlot yazılım terminal penceresinden başlatılabilir. MantidPlot içinde komut dosyası penceresini açın ve Kullanıcı azaltma komut dosyası tarafından NSS yönetmen olarak düzenleyin. Bu komut dosyası yürütme sonra Güvenli FTP kullanarak analiz için yerel bir makine için transfer edilebilir azaltılmış veri dosyaları oluşturur.

Şekil 8 komplo ve Kullanıcı azaltma yollarsam azaltılmış veri yürütme çalışma alanları penceresinde görünecektir sonra verileri görüntüleme gösterir. Varsayılan olarak, son birleştirilmiş verilerin eklenen sonek _f gerekir. Sağ tıklatma hataları seçilecek ve çizilmek üzere veri ile arsa spektrum sağlayacaktır. Görüntüleme tercihlerini Tercihler 'Görüş' menü çubuğundan seçerek erişilir. Eksenlerini biçimlendirme ve Aralık komplo eksenleri çift tıklatarak kolayca ulaşılabilir. Saçılma profilleri önemli boyutu yok saçılma parçacıkları içeren arabellekleri nispeten düz bir çizgi (Sabit yoğunluğu) görünmesi gerekir. Örnekler için yoğunluğu düşük saçılma açılarda (Q) düz tutarsız bir arka planda üstel çürüme ile dikkat edilmelidir.

Şekil 9 uygun arabellek çıkarma veri azaltma takip SAS veri analizi (veya primusqt) yazılım paketi kullanarak genel bir bakış sağlar. Sık sık tutarsız arka plan (Yüksek-Q yoğunlukta) örnek ve tampon arasında biraz uyumsuz. Uygun çıkarma için bu bölümdeki verilere örtüşmesi. Ölçek düzeltme neden olan örtüşen verilerde veri bir yoğunluk ölçek faktörü uygulandığı ve çıkarma gerçekleştirilebilir. Ölçek çarpanı arabellek veri noktaları olarak örnek ilgili noktaları daha büyük yoğunluğu ile sonuçlanırsa, bu noktaları negatif ve bir günlük komplo değil işlenmiş olacaktır. Arabellek düşülen dosyasındaki negatif değerler bol ise küçük bir azalma arabellek ölçek faktörü içinde yapmak ve çıkarma yeniden gerçekleştirin.

Şekil 10 örnek kullanımları Primus Guinier ve mesafe dağıtım sihirbazları sağlar. Bir Guinier analiz eylemsizlik aşağılardan saçılma verilerden parçacıklar yarıçap ön tahmin sağlar. Veri sıfır yaklaşırken, doğrusal bir bölge verileri mevcut olmalıdır. Bu bölgede bir hattı provası yamaç ve bir ben kararlı olmak Rg Q = 0, yoğunluk kesme noktası üzerinden yaygınlaştırılması0 verir. Q sıfır yaklaşırken aşağıya eğilimleri interparticle repulsions genellikle gösterge olmakla birlikte bir artış eğilimi veri toplama örnek gösterir. Kalanlar dağıtımını Stokastik sigara olduğunda bu eğilimleri en belirgin olduğu. Küresel parçacıklar için uygun Guinier üst sınırı kısıtlı Q * Rg < 1.3 montaj tarafından ' Q yerine ATSAS yazılımında kullanılır).

D-MmIAP--dan bu Guinier uygun olduğu için 15,4 ± 1.1 Å tahmini ile belirlenen Rg ben verilen 0,580 ± 0.0010 .

Mesafe dağıtım Sihirbazı'nı sistematik değişiklik uygun P(r) parametreleri için yapılmasına izin verir. P(r) eğri dolaylı bir Fourier dönüşümü eğrinin deneysel verilere uygun olduğunu. Bu nedenle, sol bölmedeki uygun doğru deneysel veri yansıtan doğrulamak için esastır. Bu örnekte, bir VSEÇMAK 46 gösterilen sığması için Å elde edildi.

Şekil 11 VSEÇMAK seçimi sık karşılaşılan hatalar gösterir. Kez yapay olarak büyük bir VSEÇMAK P(r) işlevi x ekseni hakkında olsun gibi negatif olmak P(r) değerler neden olur. Yapay olarak küçük bir VSEÇMAK kesilmiş P(r) eğriye ani geçişe Rmax önde = 0.

Primus şekil Sihirbazı'ndaki ilk adımları Guinier ve mesafe dağıtım sihirbazlar için aynıdır. Bu bilgiler iyi uyar deneysel verilere elde etmek için sağlanan sonra ab initio modeli Kur yapılandırılır.

Şekil 12 Primus şekil Sihirbazı için uygun bir girişi gösterir. Burada, deneysel veri IAP için SANS Angström ölçeğinde ile sağlanan ve "SANSEnvelope" beklenen dosya öneki verildi. 17 ilk kukla atom modelleri bir dizi "hızlı" modeli moduyla uygulanan hiçbir simetri (P1) ve seçili yok anisometry kullanarak oluşturulacak talep. 17 modelleri dizi Hizala, ortalama ve DAMAVER ve DAMMIN kullanarak rafine ortalama modeli ile filtre. Önekincelenmesi-damsel.log metin belgesi seçim kriteri ve herhangi bir model kümesinden atılan bir özetini sağlar. Son rafine model SANSEnvelope-1.pdb yazılmıştır.

SUPCOMB SANS zarf superimposition gerçekleştirmek için kullanılan program ile yalnızca iki PDB yapısı dosya giriş olarak yüksek çözünürlüklü modeliyle modeli. Varsayılan olarak, "r" Woody ve üst üste dosya adına eklenir.

Bir kere SANS zarf ve yüksek çözünürlüklü yapısı üst üste, bu modeller program ile ilgilenen herhangi bir moleküler grafikler kullanılarak görüntülenir. PyMOL sonuçlarından yayın kaliteli görüntüler için uygundur ve biyofiziksel sonuçları yapısal soruşturmayla ilgili vurgulamak için kullanılır. Burada, 3D temsilcilikleri ve elde edilen üst üste yapıların sayısı sağlamak için kullanılan birkaç temel PyMOL işlemlerini gösterir.

Şekil 13 PyMOL görselleştirme işlemine genel bakış sağlar. PDB yapısı dosyaları PyMOL açılmış olan, modelleri PyMOL Görüntüleyicisi penceresinde görünür olmalıdır. Her modeli kullanarak temsilcilikleri değiştirmek 's ' her dosya adının yanındaki düğme. Bir yüzey temsil SANS zarf ve yüksek çözünürlüklü modelinden protein omurga çizgi film gösterimi için kullanın. 'C' düğme altında kullanılabilir seçenekleri uygun bir renk düzeni seçin. Protein zincirler için bir "chainbow" boyama renk degradesi üzerinden N - için C-terminus yorumu yardımcı olmak için sağlar. Şeffaflık protein yapısının daha iyi görselleştirme zarf içinde izin vermek için yüzey gösterimi uygulanır. Beyaz bir arka plan yayın görüntüler için önerilir. Bu görselleştirme sıralar uyguladıktan sonra 3D yapılar incelenebilir. Perspektif ve molekül döndürme/çeviri manipülasyonlar tıklatıp sürükleyerek yapısı gerçekleştirilebilir.

Figure 1
Şekil 1. Kullanım Lauryl maltoside (demir) bileşenleri için kontrast parametreleri belirlemek için malç kontrast modülünün. Giriş değerleri sonraki çıkışı ile soldan sağa doğru ekranda gösterilir. Karşıtlık modülü giriş sayfası 'Karşıtlık' (yeşil daire) tıklatarak her ekranın sol tarafında navigasyon menüsünden erişilir. Proje başlığı, arabellek bileşenleri ve alt birimleri 1 ve 2 için giriş alanları gibi etiketli. Çıkış sayfaları açıklanan sistem için önemli parçacık bilgi ve kontrast özellikleri içerir. İlgili tablo ve hesaplanan maç puanı turuncu netlik için kutulu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Membran protein-deterjan karmaşık bileşenleri için kontrast parametreleri belirlemek için malç kontrast modülü kullanımı. Bu durumda, giriş arabelleğe alınmış çözüm genel PDC sisteminde tanımlamak için verilmiştir. Alt birim 1 kontrast eşlemeli DDM köstebek olarak d25-demir ile % 43 bestelediği micelle karışık açıklar. Alt birim 2 membran protein MmIAP giriş için amino asit dizisi formülüyle ile açıklar. Deuteration düzeyi (yeşil daire) döteryum ikame protein derecesini tanımlar ve SLD ve protein için tahmin edilebilir hesaplanan match point üzerinde doğrudan bir etkisi vardır. Sonuçlar (turuncu kutu) gösterir o maç sayısı sırasında protein'ın maç sayısı ~ %90 D2O. oluşur karışık deterjan %48.5 D2içinde O, ortaya çıkar için Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Numune hazırlama-biyoreaktör izleme. Görüntülenen işlemi sıcaklık ayar noktası (turuncu hat), çözünmüş oksijen () ayar noktası (mavi çizgi), ajitasyon ayar noktası (kırmızı çizgi) ve sıkıştırılmış hava akış hızı (Pembe hat) değerlerdir. Pompa 1 (yeşil hat) pH kontrolü için kullanıldı. 18:40 spike intial gliserol tükenmesi sinyal ve gliserol çözüm yolu ile pompa 2 (siyah çizgi) besleme başlatmak için kullanılır. X ekseni saat gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Örnek hazırlama-örnek FPLC ve SDS-sayfa karakterizasyonu. Son boyutu dışlama kromatografik d- MmIAP 20 mM, HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl, equilibrated %48.5 D2O ve %0,05 Toplam %44 (w/v) kuyruk deuterated d25-DDM olduğu DDM. İç metin: SDS-sayfa analizi Coomassie boyama ile. Havuza alınan kesirler A, B, etiketlenir ve C. bölge "B" kullanıldı SANS denemede. Ek açıklama eklenen molekül ağırlığı kDa içinde olur. Görüntü Naing ve ark. izniyle çoğaltılamaz 65 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 5
Şekil 5. Veri toplama-kuvars banjo örnek hücre ve Otomatik Örnekleyici Kur. (A) bir boş kuvars banjo hücre Otomatik Örnekleyici blok karşı istirahat gösterilir. Hücreleri örnek ile dolu ve 15 mevcut pozisyonlar birine eklenir. (B) örnek blok ışın tüpü Extender silikon penceresi dedektörü tank girişinde arasında (gösterilmez) bir diyafram seçici monte edilmiştir. Bağlanma ısı kontrollü su banyosu ve kanalları örnek blok boyunca hortumlar örnek pozisyonlarda sıcaklık regülasyonu sağlar. Ok nötron ışın yönünü gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Veri toplama-tablo taraması ve baharat işlemleri genel bakış. Tablo tarama işlemleri baharat araç kontrol yazılımı çok sol menüsünde 'Tablo tarama' düğmesi aracılığıyla erişilebilir. Yeşil oklar etkin sekme başta-in belgili tanımlık perde göstermek ve turuncu kutu için etkin Kullanıcı Girişi tablosundaki alanları vurgulamak. (A) ilk sekmesinin tablo tarama örnek değiştirici ve örnek hücre konumları hakkında bilgi sağlamak için kullanılır. Örnek değişmek içinde kullanılan her pozisyon için etiketleri, örnek kalınlıkları ve örnek türleri sağlar. 'Tara yapmak' kutusunu kontrol karşılık gelen satır tablo tarama kuyruğuna eklemek olacaktır. (B) ikinci sekmesinde araç yapılandırma ve ölçüm zamanı her örnek için (saniye cinsinden) hakkında ayrıntılı bilgi kaydedilir. Araç yapılandırmaları Nötron saçılma bilim adamı tarafından önceden yapılandırılmış ve bilgilerini ışın zaman ve enstrüman teklife dayalı olarak kullanıcılara verilmektedir. Ek parametreler sıcaklık ayarları tanımlamak ve ölçüm sıra boyunca kez tutun yeteneği gibi enstrüman denetimine eklenir. (C) son sekmesi tablo içindeki her satırı için yapılması için ölçümleri genel bir bakış sunar. Herhangi bir değişiklik gerekiyorsa, otomatik tarama 'tarar idam' düğmesini tıklatarak başlatılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7. Veri azaltma-azaltma komut dosyası ve MantidPlot işlemleri genel bakış. MantidPlot yazılım analiz küme üzerinde erişilebilir "mantidplot" (sarı daire ve ok vurgu için eklenir) herhangi bir active directory terminal komut istemine yazarak. Yazılım açıldıktan sonra (yeşil renkle işaretli düğme tarafından toggled) komut dosyası penceresine erişmek ve Nötron saçılma bilim adamı tarafından sağlanan komut dosyasını açın. Sadece yanı sıra bir listede otomatik azaltma için girilmesi çıkarma için boş hücre ve iletim ve ışın için boş ışın için numaraları inceden inceye gözden geçirmek her örnek ve arabellek için tarama numaraları gerektirmelidir komut dosyasında sağlanan yönergeleri izleyin Merkezi belirlenmesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8. Veri Analizi-Plotting MantidPlot kullanarak veri. Veri MantidPlot 'çalışma' olarak başvuruda bulunulan. Var olan workspace alan ile dosya adlarını Kullanıcı azaltma kod tarafından üretilen olarak doldurulur. Çalışma alanı verilerini 1D veri kümeleri için çalışma alanını sağ tıklatıp "Hataları ile spektrum... çizmek" seçerek çizilebilir. Ek veriler için geçerli Arsa basitçe sürükleyip bırakarak çalışma alanları eklenebilir. Çizim penceresinin (günlük günlük araziler gelince gibi) biçimlendirme 'Tercihler' 'Görünüm' menü çubuğundan seçerek veya eksen etiketleri çift tıklatarak gerçekleştirilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9. Veri Analizi-ATSAS yazılım: temel işlemler ve arabellek çıkarma. Primusqt uygulama (SAS veri analizi) uygun arka plan (arabellek) çıkarma için görselleştirme sağlar. Öyle ki veri yüksek-Q üst üste arabellek dosya çıkarma için (burada saçılma sonucu olarak kalan sinyal tutarsız arka plan düz adıdır) ölçekli olmalıdır. Veri bu yüksek-Q aralığı seçildiğinde, ölçek işlemi tanımlanmış bölge birbiri üzerine çakışması oluşturur tablo alt veri dosyasında bir ölçek faktörü uygulanır. Sonra ölçekleme, arabellek dosyası parçacık net saçılma profili vermeye düşülen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10. Veri Analizi-Guinier ve P(r) (mesafe dağıtım) belirlenmesi. (A) Primus Guinier Sihirbazı'nı ben ilk tahmini sağlayan0 ve RgGuinier çözümlemesi için kullanılır. Parçacık türü ve veri sığdırmak için uygun tanımlamak için kullanılır. Uyum ve karşılık gelen fazlalıklar bir arsa Guinier şartları sola, gösterilir (ben0 ile Rg), Q * Rg sınırları ve doğrusal uygun kalite turuncu kutu tarafından işaretlenmiş alan çıktı olarak sunulmaktadır. (B) Primus mesafe dağıtım Sihirbazı'nı mesafe dağıtım çözümlemeyi gerçekleştirmek için hangi saçılma parçacık içinde Soygazlar mesafeler olasılığını tanımlar ve Dmax veya maksimum içerir P(r) eğrisi sağlayan kullanılır Soygazlar mesafe. Turuncu kutu tarafından belirtildiği parametreleri sistematik olarak uygun mesafe dağıtım işlevini belirlemek için soruşturma olması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 11
Şekil 11. Yanlış mesafe dağıtım analiz sonuçlarından. Düzgün seçili VSEÇMAK sıfıra kademeli bir çürüme ile doruklarına P(r) eğrisi üretmek gerekir. Çok büyük olan VSEÇMAK değerleri büyük olasılıkla negatif P(r) değerler üretecektir veya üst sınır kesilmiş göründüğü P(r) eğrileri içinde çoğu kez yapay küçük r. VSEÇMAK değerlerden yüksek değerleri, x ekseni yakınındaki titreşimler neden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 12
Şekil 12. Modelleme- Ab initio Primus şekil Sihirbazı'nı kullanarak modeli Kur. AB initio modelleme parametreleri tek bir giriş penceresinde sağlanır. Bir önek çıkış dosya adları için kullanılabilir işleme için diğer seçenekleri ile sağlanır. Yordam tavlama hızlı (daha hızlı soğutma ile daha büyük boncuk) veya (daha yavaş soğutma ile yavaş daha küçük boncuklar) olabilir. Tekrarlamaların sayısını tekrarlanabilirlik modeli özellikleri incelemek için yeterli boyutu olmalıdır. Parçacık simetri ve anisometry, biliniyorsa sağlanabilir. Açısal ölçek ölçülen veri birimleri için karşılık gelmelidir. DAMAVER ortalama hizalayın ve tüm kukla atom modelleri ortalama ve sonra herhangi bir aykırı modelleri hariç bir seçim ölçütü uygulayabilirsiniz. Ortalama modeli sabit atomların çekirdek daha fazla olacaktır bu seçeneği işaretlediyseniz DAMMIN kullanarak rafine. Bu rafine model deneysel profil SANS 3D düşük çözünürlüklü zarf temsil etmelidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 13
Şekil 13. Görselleştirme-deneysel SANS zarf ve PyMOL kullanarak yüksek çözünürlüklü modeli kaplamasıyla. PyMOL içinde PDB yapısı dosyaları açtıktan sonra modelleri PyMOL görüntüleyicide görünür. Etkin modelleri modeli ve anlayışına işlemek için kullanılabilecek komut düğmeleri ile birlikte Sağdaki tabloda listelenmiştir. Temel işlemleri tespit edilmesi Sözleşmesi (veya uyuşmazlığı) arasında SANS zarf ve yüksek çözünürlüklü yapılara sahip bölge sağlayan bu modeller görüntülenmesi için sağlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1. Fiziksel özellikleri membran protein araştırmalarda yaygın olarak kullanılan deterjanlar. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yapısal biyoloji araştırmacılar biomolecules çözümünde biyokimyasal ve yapısal ayrıntılarını (örneğin, toplam boyut ve şekil) edinmek için çözüm saçılma gibi tamamlayıcı yapısal teknikleri yararlanmak. SANS belirlenmesi membran proteinlerinin düşük çözünürlüklü yapıları, modern yapısal biyoloji ve biyokimya bir çekirdek odak için özellikle çekici bir tekniktir. SANS saf protein crystallographic denemeler (1 mg/örnek) karşılaştırılabilir miktarda gerektirir. Yüksek saflıkta deuterated deterjanlar membran protein çalışmalara ilgili son zamanlarda genişleyen ticari durumu bu hidrojen/döteryum membran protein-deterjan kompleksleri deneyler için içerik işlemek için bir yol erişilebilir yapar, protein sinyal doğrudan kaydedilmesini sağlar. Başarılı olduğunda, bir ab initio modeli moleküler zarf sadece birkaç saat içinde toplanan verilerden hesaplanan olamaz. Böylece, membran protein biyokimyacılar, biophysicists ve yapısal biyologlar kolayca SANS coveted ilk 3D modelleri membran proteinlerinin çözümde, ortaklar veya yüzeylerde ve elde edilen modelleri binding ile karmaşık yapıları elde etmek için yararlanabilirsiniz SANS tarafından kırınım veri dönüşümü için kullanılabilir. SANS membran proteinlerinin karakterize etmek için rutin kullanımı membran protein Biyokimya alanı için dönüştürücü olacağını ve ilaç bulma ve geliştirme temel yapısı işlevden dalgalanma etkileri var. Protein-protein, protein-DNA veya hidrojen/döteryum içerikleri kolayca manipüle edilebilir diğer biyomoleküler kompleksleri için değerli bir yüntem SANS nötron kontrast döteryum ikame ile eşleşen ek fayda sağlar.

Küçük açı saçılma tasarım ve teorisi hakkında ek ayrıntılar için aşağıdaki değerlendirmeleri tavsiye edilir: Bio-enstrüman yüksek akı izotop reaktör, Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı, SANS79 küçük açı saçılma için yapısal biyoloji-tuzaklar,72 ve küçük açı saçılma çalışmaları çözümde biyolojik oluştururlar kaçınırken sınır genişletme. 80 Nötron saçılma bilim adamı de geçerli araç yapılandırmaları ve belirli bir sistem için en uygun parametreler tartışabilirsiniz. Örneğin, (açı ve Nötron saçılma dalga boyu bir fonksiyonu olan) daha düşük Q veri genellikle daha büyük sistemler için arzu edilir. Bio en yaygın araç konfigürasyonunu-SANS bir Qmin -1 Å 0,003 sağlar ve kDa yüzlerce kadar büyük protein kompleksleri için uygundur. Örnek, arabellek ve boş hücre (24 için tipik ölçüm süresi yaklaşık 8 saat ~ 3 mg mL-1 30 kDa (monomer) kontrast eşlemeli micelles %48.5 D2O çözüm ile yaklaşık boyutu membran protein içeren bir çözüm gerektirir Saat 1 gün toplam =). Enstrüman ölçümü zamanlarda verilen kontrast koşulu yaklaşık saçılma parçacığın molekül ağırlığı ve konsantrasyon ürün göre ölçeklenebilir. Ancak, saçılma parçacıklar örnek konsantrasyon pratik bir üst sınır yerler herhangi bir non-spesifik protein toplama dahil olmak üzere, etkileşim olmayan koşullar altında ölçülen gerekir. Saat süren ölçümleri sınırlar belirli proteinlerin istikrarı üzerinde yer. Neyse ki, ölçümleri rutin olarak protein yaşam süresi geliştirmek için buzdolabında sıcaklıklarda yapılabilir ve düşük enerjili nötronlar istihdam demeti ölçüm sırasında herhangi bir radyasyon hasarı neden olmaz.

Bu işlemine genel bakış ve birçok önemli faktörler Nötron saçılma deterjan kontrast maç noktada ölçülen bir örnekten başarılı kayıt doğru belirlenmesi bu el yazması sunulmaktadır. Bu bir deterjan karışımı ile bir üniforma nötron kontrast alkil zinciri bileşenleri ve deterjan baş grup arasında tasarlayarak toplu deterjan komple bir maç alma kritik bir adım içerir. Bu tek deterjan maç sayısı ölçülerde bir saçılma profil sadece ilgi membran protein atfedilen ve verileri yeniden olabilir için membran protein temsil eden ab initio zarf izin sağlar. Veri analizi ve iletişim kuralları da modelleme ab initio genel yapısı, konformasyon değişiklikleri, diğerleri arasında oligomeric Birleşik adrese amacı bu tür araştırmalar, elde edilen potansiyel bilgi göstermek. Bir sınırlama yalnızca çok bugüne kadar kaç deterjanlar döteryum oyuncu değişikliği ile ticari olarak kullanılabilir olmasıdır. 19

Perdeuteration gerekli olmayabilir iken, amaç bir protein ile elde etmek için bu durumda olmalıdır > % 65 döteryum protein etiketleme. Alternatif olarak, deterjan ile seçici-deuterated Eğer kafa grupları ve kuyrukları elde edilebilir ve %100 D2O deterjan micelle CMP oluşur, sonra protein üzerinden yeterli kontrast döteryum etiketleme gerek kalmadan elde edilebilir. Deterjan kontrast-maç sayısı ölçülen zaman yeterli saçılma ulaşmak için protein uygun deuteration düzeyini belirleyin. Membran protein ifade ve arıtma, bu makalenin kapsamı dışında kalan81 ile ilgili birçok sorun vardır. Ne yazık ki, yüksek düzeyleri deuteration Şu anda (henüz) ökaryotik sistemleri için mümkün değildir. Ökaryotik bazı proteinler için bir sınırlama olduğunun farkında, çoğu membran proteinlerinin bakteriyel orthologs bu yöntem uygun olması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss ve Ryan C. Oliver ile UT-Battelle bize nötron bilim Kullanıcı programı ve biyografi desteklemek için DOE ile sözleşmeli-enstrüman Oak Ridge National Laboratory Bu makalede kullanılan, SANS.

Bu el yazması UT-Battelle, LLC, sözleşmeli DE-AC05-00OR22725 ile bize departmanı, enerji (DOE) co-yazar. ABD hükümeti korur ve Yayımcı, yayın, makale kabul ederek ABD hükümeti yayımlamak veya bu makale yayımlanmış form çoğaltmak veya izin vermek için münhasır olmayan, dünya çapında geri dönülmez Odenmis lisans korur onaylar diğerleri ABD hükümeti amaçlı bunun için. DOE DOE kamu erişim planı uyarınca araştırma federal projeleri bu sonuçlar kamu erişim sağlayacak. 82

Acknowledgments

Office biyolojik ve çevresel araştırma desteklenen araştırma ORNL'ın merkezi yapısal Moleküler Biyoloji (CSMB) ve biyografi-bilimsel Kullanıcı imkanları bölüm, temel enerji Bilimler Office, ABD Bakanlığı tarafından desteklenen özellikleri kullanarak SANS Enerji. Membran proteinlerinin Lieberman laboratuarında yapısal çalışmalarına NIH (DK091357, GM095638) tarafından desteklenen ve NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735 (2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Tags

Biyokimya sayı: 140 küçük açı saçılma Nötron saçılma Biyofizik membran protein kontrast varyasyon yüzey aktif micelle intramembrane aspartyl proteaz presenilin sinyal peptid peptidaz
Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve <em>Ab Initio</em> modelleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss,… More

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter