Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kontrast-samsvarende vaskemiddel i liten vinkel Neutron spredning eksperimenter for membran Protein strukturell analyse og Ab Initio modellering

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/57901
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan å få en lav oppløsning ab initio modell og strukturelle detaljer i et vaskemiddel-solubilized membran protein i løsning med liten vinkel neutron spredning med kontrast-matching av vaskemiddel.

Abstract

Biologiske liten vinkel neutron spredning apparatet med høy-Flux isotop reaktoren i Oak Ridge National Laboratory er dedikert til etterforskningen av biologisk materiale, biodrivstoff behandling og bio-inspirert materialer dekker nanometer til mikrometer lengde skalaer. Metodene presenteres her for å undersøke fysiske egenskaper (dvs. størrelse og form) av membran proteiner (her, MmIAP, en intramembrane aspartyl protease fra Methanoculleus marisnigri) i løsninger av micelle-forming vaskemidler er velegnet for liten vinkel neutron spredning instrumentet, blant andre. Andre Biofysiske karakterisering teknikker er hindret av deres manglende evne til å løse vaskemiddel bidragene i en protein-rengjøringsmiddel kompleks struktur. Dessuten gir tilgang til Bio-deuterasjon (deuterering) Lab unike muligheter for utarbeidelse store nærområdet og uttrykke deuterium-merket proteiner for forbedret spredning signalet fra protein. Mens denne teknikken gir ikke strukturelle detaljer i høy oppløsning, strukturelle kunnskapen hullet for membran proteiner inneholder mange adresserbare områder av forskning uten nær Atom løsning. For eksempel omfatter disse områdene fastsettelse av oligomeric stater, komplekse formasjon, conformational endringer under forstyrrelsene og folding/unfolding arrangementer. Disse undersøkelsene kan lett oppnås gjennom programmer av denne metoden.

Introduction

Membran proteiner er kodet av anslagsvis 30% av alle gener1 og representerer en sterk flertallet av mål for moderne medisinsk narkotika. 2 disse proteinene utfører en rekke viktige cellulære funksjoner,3 men til tross for sine overflod og betydning, representerer bare ca 1% av totale strukturer avsatt i forskning Collaboratory for strukturelle bioinformatikk (RCSB) Protein Data Bank. 4 deres delvis hydrofobe naturen strukturelle fastsettelse av membran-bundet proteiner har vært meget utfordrende. 5 , 6 , 7

Som mange Biofysiske teknikker krever monodisperse partikler i løsningen for måling, har isolere membran proteiner fra innfødte membraner og stabilisere disse proteinene i en løselig etterligne av innfødte membraner vært et aktivt område av forskning i siste tiår. 8 , 9 , 10 disse undersøkelsene har ført til utviklingen av mange romanen amphiphilic samlinger til solubilize membran proteiner, slik som nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 og amphipols. 16 , 17 men bruk av vaskemiddel micelles fortsatt en av de vanligste og enkel tilnærmingene for å oppnå løselighet kravene til et bestemt protein. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 dessverre ingen enkelt vaskemiddel magisk blanding av vaskemidler ikke finnes eller som tilfredsstiller alle membran proteiner; Dermed må disse forholdene bli empirisk vist for de unike kravene hver protein. 26 , 27

Vaskemidler montere selv i løsning over deres kritisk micelle konsentrasjon skjemaet samlede strukturer kalt micelles. Micelles består av mange vaskemiddel monomerer (vanligvis varierer fra 20-200) med hydrofobe alkyl kjeder danner en micelle kjerne og hydrofile hodet grupper ordnet i et micelle ytterlag overfor vandig løsemiddelet. Virkemåten til vaskemidler og micelle formasjon har blitt klassisk beskrevet av Charles Tanford The hydrofobe,28 og størrelser og former av micelles fra vanlige vaskemidler i membranen protein studier har vært preget med liten vinkel spredning. 29 , 30 vaskemiddel organisasjon om membran proteiner også har vært studert, og dannelsen av protein-rengjøringsmiddel komplekser (PDC) forventes med vaskemiddel molekyler rundt protein i en ordning som ligner pen vaskemiddel micelles. 31

En ekstra fordel i bruker rengjøringsmidler er at de resulterende micelle egenskapene kan manipuleres ved å innlemme andre vaskemidler. Mange vaskemidler utstilling ideell blanding, og velg egenskaper av blandet micelles selv kan forutsies fra komponenter og forholdet mellom miksing. 22 men tilstedeværelsen av vaskemiddel kan fortsatt presentere utfordringer for Biofysiske karakteristikkene ved å bidra til det totale signalet. For eksempel røntgen og lysspredning teknikker er signal fra vaskemiddel i PDCEN nesten utvisket fra protein. 32 undersøkelser med enkelt-partikkel cryo-elektronmikroskop (cryo-EM) vanligvis stole på fanget (frossen) partikler; strukturelle detaljer i protein er fremdeles skjult av visse vaskemidler eller en høy konsentrasjon av vaskemiddel som legger til bakgrunnen. 33 alternative tilnærminger mot tolke full PDC strukturen (inkludert vaskemiddel) er gjort gjennom beregningsorientert metoder som søker å rekonstruere smuss rundt et gitt membran protein. 34

For tilfelle av neutron spredning produserer core-shell ordningen av vaskemiddel i micelle en formfaktor som bidrar til den observerte spredningen. Heldigvis kan løsningskomponenter endres slik at de ikke bidrar til netto observert spredning. Denne "kontrast matchende" prosessen oppnås ved å erstatte deuterium for hydrogen for å oppnå en spredning lengde tetthet som samsvarer med bakgrunnen (buffer). Et fornuftig valg av vaskemiddel (med tilgjengelig deuterated kolleger) og deres forhold blanding må vurderes. For vaskemiddel micelles, kan denne erstatningen utføres bruk et vaskemiddel med samme leder gruppen, men har en deuterated alkyl kjede (d-halen i stedet for h-tail). Siden vaskemidler er godt blandet,35 sine aggregater vil ha en spredning lengde tetthet som er en føflekk-brøkdel vektet gjennomsnitt av de to komponentene (h haler og d haler). Når denne gjennomsnittlig kontrast er konsekvent med at gruppen leder, samsvarer uniform samlet strukturer fullt for å fjerne alle bidrag til observert spredning.

Vi presenterer her en protokoll for å manipulere neutron kontrasten vaskemiddel micelles ved å innlemme kjemisk identisk vaskemiddel molekyler med deuterium-merket alkyl kjeder. 19 , 36 , 37 Dette tillater samtidig kontrast matching av micelle kjernen og shell, som er en unik evne neutron spredningsprosent. 35 , 38 med denne betydelig raffinert detaljnivå, kontrast matchende kan aktivere ellers unfeasible studier membran proteinstrukturer. I tillegg kan denne kontrast som utvides til andre systemer som involverer vaskemiddel, som polymer exchange reaksjoner39 og olje-vann dispergeringsmidler,40 eller til andre solubilizing stoffer, som bicelles,41 nanodiscs,42 eller blokker copolymers. 43 A lignende tilnærming som beskrevet i dette manuskriptet, men ansette én vaskemiddel Art med delvis deuterium erstatninger for alkyl kjede og/eller leder gruppen, ble nylig publisert. 37 mens dette kan forventes å forbedre tilfeldig fordeling av hydrogen og deuterium gjennom smuss sammenlignet tilnærmingen som presenteres her, begrenset antall tilgjengelige plasseringer i vaskemiddel for substitusjon og to-trinns vaskemiddel syntese kreves positurer flere utfordringer for vurdering.

Trinn 1 og 2 av protokollen vises nedenfor ofte overlapper siden første eksperiment planlegging må gjøres for å sende inn en kvalitet forslag. Men forslaget innlevering regnes som første skritt for å understreke at denne prosessen skal startes forveien en neutron eksperiment. Det bør også bemerkes at en forutsetning, som bør bli demonstrert av forslaget, er å ha biokjemiske og fysiske karakterisering (inkludert renhet og stabilitet) av prøven støtte behovet for Nøytron studier. En generell diskusjon om liten vinkel neutron spredning (San) er utenfor omfanget av denne artikkelen. En kort, men grundig innføring er tilgjengelig i den referanse arbeidet Karakterisering av materialer av Kaufmann,44 og en omfattende lærebok fokusert på biologiske liten vinkel løsning spredning er nylig publisert. 45 ytterligere anbefalt lesing er gitt under diskusjon. Liten vinkel spredning bruker såkalte spredning vektoren Q som sentrale antallet som beskriver spredning. Denne artikkelen bruker allment akseptert definisjon Q = 4π synd (θ) / λ, der θ er halvparten vinkelen mellom innkommende og spredt stråle og λ er bølgelengdeområdet av neutron stråling i Ångstrøm. Andre definisjoner finnes at bruk forskjellige symboler som er "for spredning vektoren, og at avvike ved en faktor 2π eller nanometer i stedet for Angstrom (se diskusjon av Figur 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberede og sende en Neutron anlegget strålen tid og Instrument forslag

  1. Se elektroniske ressurser for å identifisere neutron spredning fasiliteter som gir generelt bruker neutron strålen tilgang, for eksempel Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Kart over neutron fasiliteter og informasjon om neutron forskning verdensomspennende er tilgjengelig online. 46 være oppmerksom på at disse anleggene vanligvis har vanlig utlysninger; Dette bestemmer når neste strålen gang vil være tilgjengelig. Nøytroner brukes for en rekke applikasjoner. søke for liten vinkel neutron spredning (San) instrumenter, spesielt de med muligheter for biologiske prøver.
  2. Bruk ressurser fra neutron fasiliteter til å navigere neutron strålen tid innlevering forslagsprosessen. Konsultere med en Neutron spredning vitenskapsmann (NSS) som er forbundet med instrumentet som skal utlignes. Se gjennom funksjonen neutron gjeldende informasjon om forslaget samtaler, tidsfrister og råd for materiale; for Oak Ridge er tilgjengelig online. 47 sende strålen tid forslaget etter alle retningslinjer for et vellykket innlevering.
  3. Hvis deuterated protein er nødvendig (se 2.2), støttes ofte neutron spredning fasiliteter av laboratorier og ekspertise dedikert til produksjon av deuterated materialer. For å be om tilgang til Bio-deuterasjon (deuterering) Lab (BDL) på ORNL, velger du BDL som andre maskinen i forslaget systemet. Mens SANS forslaget er gjennomgått for gjennomførbarhet og av en vitenskapelig granskningskomité, er BDL forespørsler bare vist for muligheten. For å hjelpe med BDL gjennomførbarhet gjennomgang, sender en fullført informasjon forespørsel skjema48 som beskriver protein uttrykk protokollen og beregnet avkastning (tilgjengelig online).
  4. Etter vellykket peer-gjennomgang av bjelke tid forslaget, bekrefte tildelt datoen strålen tid før eksperimentet. Kontroller at alle utvalg og buffer og formler er oppført riktig i forslaget for skikkelig gjennomgang. Endringer foreslått eksperimentelle planen, inkludert endringer i utvalg og buffer komposisjon, krever varsling av anlegget.
    Merk: Endringer bør diskuteres snarest med tildelte NSS.

2. Finn ut Neutron kontrast matchpoeng og nødvendig kontrast for Protein måling

  1. Samle informasjon (fra leverandørens produktinformasjon, online databaser, publiserte verdier, etc.) atomic komposisjoner og volumer for vaskemiddel systemkomponentene kontrast-samkjøres. Denne informasjonen brukes neutron spredning lengde tettheter (SLDer) og dermed kontrast matchpoeng (CMPs) i løsning, som er avgjørende for å oppnå kvalitet SANS data og strukturell informasjon for membran protein i sammenheng med en PDC. En tabell oppsummerer de fysiske egenskaper og kontrast match poengene for vaskemidler brukte i Biofysiske studier av membran proteiner er inkludert (tabell 1).
  2. Bestemme neutron SLDer bruker webprogrammet MULCh: moduler For analyse av kontrast variant Data49 (tilgjengelig online50 -gratis). En kobling til brukerhåndboken ligger på hjemmesiden. Tilgang til nettstedet og lese dokumentasjonen som følger. Figur 1 og figur 2 gir en oversikt over kontrast modul input og output to relaterte eksempler.
    Merk: Andre nettsteder for beregning av SLDer er tilgjengelig, slik som den opprettholdt av National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Nøytron forskning. 51
    1. Åpne modulen kontrast ved å klikke 'Contrast' ligger i navigasjonsruten til venstre. Angi tekst for en prosjekttittel og angi detaljene nedenfor for to komponenter (f.eks vaskemiddel Hovedgruppe og hale) som "delenhet 1' og ' delenhet 2.
    2. Angi den molekylære formelen for hver komponent i tekstboksen "Formel".
      Merk: alternativknappen er ' velges under "Stoff Type" Angi en molekylære formel. I tillegg bruk bokstaven "X" i formelen for å angi lett utskiftbare hydrogenatomer. Protein RNA og DNA-sekvenser kan angis hvis de tilsvarende 'P', 'R', eller hadde ' alternativknapper er valgt. Hvis det finnes flere kopier av en komponent i delenhet, kan verdien for 'Nmolecules' endres tilsvarende. Et praktisk eksempel her gjelder lipid-lignende vaskemidler som inneholder to identiske haler, slik at formelen for en hale angis med Nmolecules lik 2.
    3. Angi volum i kubikkmeter Ångstrøm for hver komponent i boksen under "Volum (Å3)". Bruker Tanfords formel28 for alkyl kjeder lengde n, Vhale = 27,4 + n * 26,9, beregne omtrentlig hale volum eller få molekylær volumer fra produktinformasjon gitt eller publisert verdier i litteraturen.
    4. Angi detaljer for bufferen komponenter. Endre det 'tall oppløst arter i løsemiddelet' bruke rullegardinmenyen legge til eller fjerne rader for hver buffer komponent. Ved micelle-forming vaskemidler, inkluderer gratis vaskemiddel monomerer som separate buffer komponenter på smusss kritiske micelle konsentrasjon (CMC).
    5. Klikk 'Send' for å utføre neutron kontrast beregningene og generere en resultatside som inneholder en tabell over spredning lengde tetthet og kontrast matchpoeng samt formler for å bestemme disse parameterne ved enhver gitt til D2O i bufferen. Gjennom parameterne spredning med spesiell oppmerksomhet til komponenten CMPs. Hvis kampen poeng ligner (innen 10% D2O) og gratis micelle konsentrasjonen er lav, så gjennomsnittlig CMP kan brukes for kontrast-samsvarende vaskemiddel bidrag. I de fleste tilfeller varierer CMP vaskemiddel Hovedgruppe og hale med mer enn 10-15%, produserer en kjerne-shell form factor SANS dataene som obfuscates direkte innsamling av spredning signalet fra protein alene.
  3. Vurdere kontrasten mellom vaskemiddel Hovedgruppe og hale. Når vaskemiddel leder gruppen og alkyl kjeden halen CMPs ikke godt matchet, kan tilgjengelighet og innlemmelse av en deuterium-substituert vaskemiddel tillate spredning lengde tettheter på valg av komponenter til å være manipulert. I de fleste tilfeller krever dette danner en blandet micelle gjennom inkorporering av en identisk vaskemiddel med deuterium-substituert alkyl kjeder. Tillegg av deuterium reiser spredning lengde tettheten av kjernen av alkyl kjeden haler. Ønsket sluttpunktet, i dette tilfellet er slik at Hovedgruppe skallet CMP og alkyl kjeden kjernen CMP har omtrent like verdier.
    1. Øke CMP av vaskemiddel micelle kjernen for å være omtrent lik CMP av Hovedgruppe shell ved å bestemme riktige forholdet mellom blanding mellom h haler og d haler som oppnår kontrast samsvarer med hodet gruppene. En forutsetning for dette forsøket er kunnskap om CMP for en deuterium-substituert alkyl kjeden hale. Et kommersielt tilgjengelig motstykke til n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) er tilgjengelig med alle alkyl kjeden hydrogen erstattet av deuterium (d25-DDM). Gjenta kontrast beregningene i trinn 2.1 for en hadde-tail "i stedet for"h-halen".
    2. Beregne muldvarp forholdet mellom h-tail d-halen kreves for kontrast samsvarer med hodet gruppen CMP. Følgende formel kan hjelpe med dette forsøket:
      CMPhodet = CMPh-tail * χh-tail + CMPd-tail * χd-tail
      der CMP er spredning lengde tetthet og χ er volum brøken for vaskemiddel hodet, h-hale, eller d-tail komponenten. Bufrede løsninger over DDM innlemmelse av 44% av vekten (43% av Molo) av den totale vaskemiddel som d25-DDM med deuterium-substituert alkyl kjeder produserer en enkelt CMP i 48,5% D2O for både hode og hale komponenter.
  4. Vurdere graden av deuterium substitusjon for membran protein. For å måle tilstrekkelig spredning signalet fra protein, bør CMP for protein være minst 15% D2O i løsning fra vaskemiddel CMP og måling forhold. Signalet øker med kvadratet av denne % forskjellen. Siden CMP en umerket protein oppstår vanligvis med ~ 42% D2O i løsning (en CMP ligner på mange vaskemiddel hodet grupper), er deuterium merking av protein nesten alltid en nødvendighet. 52

3. uttrykker og rense membran Protein rundt

  1. Forberede LB (lysogeny buljong) medium og vokse Escherichia coli (E. coli) celler skjuler en induserbart uttrykk vektor for målet protein forløp.
    1. Forberede minimal media. I H2O eller D2O, oppløse 7.0 finans (NH4)2så4, 5,25 finans Na2HPO4, 1.6 finans KH2PO4, 0,50 finans diammonium hydrogen citrate, 5.0 finans glyserol, 1,0 mL/L 20% w/v-MgSO 4·7H2O og 1,0 mL/L av Holme spor metaller (0,50 finans CaCl2·2H2O 0.098 finans CoCl2, 0.102 finans CuSO4, 16,7 finans FeCl3·6H2O, 0.114 finans MnSO4· H2O, 22.3 finans Na2EDTA·2H2O og 0.112 finans ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Forberede aktuelle antibiotika lager løsninger ved hjelp av H2O eller D2O.
    3. Forberede en isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside lagerløsning H2O eller D2O.
    4. Sterile-filter alle løsninger til tørr, sterile containere med plastflaske-top vakuum og sprøyte filtre 0.22 mikron pore størrelse.
  2. Tilpasse E. coli celler til deuterium-merket medium før skalere opp for overuttrykte en deuterated protein.
    1. Vaksinere 3 mL LB medium med en isolert koloni fra en Lysogeny kjøttkraft (LB) agar plate eller celler fra en frossen glyserol lager. Vokse cellene på 37 ° C i en risting inkubator på 250 RPM eller redusere temperaturen til 30 ° C eller under for å unngå overvekst av kultur når rugende over natten.
      Merk: Tilpasning prosedyren kan varieres. 55 , 56 , 57
    2. Når LB kulturen har vokst til en optisk tetthet på 600 nm (OD600) ~ 1, fortynne den 1:20 i 3 mL H2O minimal medium og vokse et OD600 ~ 1. Gjenta 1:20 fortynninger med minimal medium som inneholder 50, 75 og 100% D2O (eller til ønsket D2O prosentverdi).
      Merk: som D2O innhold er økt, vekstrater reduseres. Forholdet mellom D2O prosenten i vekst medier og deuterium substitusjon i protein er rapportert i litteraturen. 58 , 59 , 60
    3. Fortsette å vokse kulturen i en bioreactor å øke avkastningen av deuterated cellemasse (Figur 3).
      Merk: Trinnvise fremgangsmåter for bioreactor operasjonen har gjennomgått andre steder. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Høste og lyse E. coli celler for membran utvinning og protein rensing
    1. Pellets cellene med sentrifugering ~ 6000 x g for ~ 30-45 minutter til 4 ° C.
    2. Myke celle pellet av soaking i buffer på is ~ 30 min. Deretter forsiktig resuspend celle pellet i bufferen ved forsiktig pipettering med en serologisk Pipetter, eller milde rocking på en 2D rocker, til en siste konsentrasjon av ~ 1 g våt cellen masse/10 mL buffer.
      Merk: et eksempel er 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), pH 7.5 200 mM NaCl supplert med en protease hemmer tablett.
    3. Lyse resuspended celler med tre går gjennom en høytrykks homogenizer på 10.000 psi mens chilling strøm.
      Merk: Avhengig av skalaen kreves, kan andre lysis metoder være brukt (f.eks fransk trykk eller sonication).
    4. Pellet celle rusk med sentrifugering ~ 4000-5000 x g i 15 min på 4 ° C. Gjenta dette trinnet til nedbryting er avklart.
    5. Ultracentrifuge (~ 150 000 x g i 30-45 min) nedbryting fra tidligere trinn, som inneholder den vannløselige og membran fraksjoner. Pellet etter ultracentrifugation inneholder membran brøken.
    6. Resuspend membran pellet i en stor Dounce homogenizer og isolere membran brøken igjen ved ultracentrifugation (trinn 3.3.5). Gjenta dette trinnet minst én gang for å fjerne løst bundet proteiner.
    7. Solubilize membraner av milde rocking for ~ 30 minutter til 4 ° C i en buffer med vaskemiddel egnet for rensing. Solubilization er tydelig når suspensjon fra skyet til gjennomsiktig. Fjerne uløselig materiale ved ultracentrifugation (~ 150 000 x g i 30-45 min).
      Merk: Et eksempel er 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole og 4% (w/v) DDM for rensing av Ni2 + affinitet kromatografi.
  4. Rense protein etter en protokoll utviklet for protonerte skjemaer.
    Merk: Se Naing et al. for en eksempel rensing protokoll for en hexahistidine merket M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl protease (d-MmIAP). 65 siste avkastningen var ~ 1 mg deuterated fra 5 L deuterated celle kultur vekst, som ble brukt i SANS eksperimentet (Figur 4).
  5. Bytte renset protein inn i "siste Exchange Buffer" for kontrast som matchet.
    1. Forberede 200 mL "Siste Exchange Buffer" som inneholder riktig blanding kontrast matchende, f.eks20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl, og utgjør 0,05% total DDM (0.028% DDM og 0.022% d25-DDM) i 49% D2O.
    2. Equilibrate en størrelse utelukkelse kolonne med > 2 kolonne mengder (CV) "Siste Exchange Buffer" i 3.5.1 ved å bruke en Fast Protein flytende kromatografi (FPLC).
    3. Etter sprøytebruk prøven, kjøre kolonnen og isolere fraksjoner tilsvarer protein av interesse.
    4. Konsentrere protein til ønsket endelige konsentrasjonen (2-5 mg/mL).
      Merk: Et volum på ~ 300 μL må fylle 1 mm sylindriske kvarts søppel brukes for SANS.
    5. Reservere en aliquot matchet bufferen for SANS bakgrunn subtraksjon.
      Merk: Aliquot kan bli tatt direkte fra forberedt bufferen, eller ideelt fra en ren elueringsrør brøkdel på slutten av FPLC kjøre.

4. gjøre endelige forberedelser for strålen tid og samle SANS Data

  1. Når forslaget er godkjent og områdetilgang er godkjent, fullføre alle nødvendige trening før tildelte strålen tid. Dette inkluderer prearrival, webbasert opplæring samt stedets radiologisk, laboratorium og instrument-spesifikk trening.
    Merk: Opplæring krav kan diktere forhånd ankomst for førstegangsbrukere. Mer informasjon er tilgjengelig online. 66
  2. Last prøver og buffere for datainnsamling.
    Merk: En oversikt over biologiske liten vinkel neutron spredning (Bio-SANS) instrument miljø område er vist i figur 5.
    1. Legg prøver og buffere i kvarts celler. Kvarts celler er tilgjengelig fra instrument forsker eller anlegg. Bruk gel-lasting tips til trange åpningen av de fleste eksempel celler.
    2. Sikre at strålen lukkeren lukkes, nærmer et miljø område og plasserer kvarts cellene i eksemplet veksler. Registrere veksler prøveposisjon for hver eksempel celle.
    3. Når området og sikre banen bjelke uten hindringer, og la et miljø område og åpne strålen skodde.
      Merk: Nøye følge alle lokale regler og forskrifter, adlyde alle innlegg, og gi akt på råd fra den instrument forskeren. Prøver kan ikke fjernes fra strålen og manipulert etter eksponering av strålen uten følgende forsiktighetsregler. Konsultere med en radiologisk kontroll tekniker (RCT) før disse prosedyrene.
  3. Utføre tabellsøk for automatisk datainnsamling
    1. Bruk maskinen gjennom egendefinert kontroll LabVIEW-basert programvare, Spectrometer Instrument kontrollmiljø (krydder). Følg instruksjonene for instrumentet drift av Neutron spredning forskeren. En oversikt over tabellen skanning operasjon windows finnes i figur 6.
    2. Etter inn informasjon som kreves i aktuelle områder, kjøre tabellsøk og en automatisert datainnsamlingsprosessen vil begynne. Overvåke fremdriften via kategorien 'Tabell skanne Status'.

5. redusere SANS Data fra 2D-bilde til 1D Plot

  1. Identifisere hver prøve og buffer datafil fra innspilte skanning tallene. Hver måling tilordnes noen unike skanning. Denne informasjonen er nyttig under data reduksjon å identifisere hver tilsvarende eksempler og buffer par.
  2. Bruk MantidPlot programvare og Python-skript for reduksjon
    1. Nøytron spredning brukere får kontodetaljer tilgang til sine data i eksterne analyse klyngen. 67 Logg inn til ekstern analyse Cluster og kjøre "MantidPlot" fra kommandolinjen. Figur 7 og Figur 8 tilbys for å hjelpe disse trinnene.
    2. Få et reduksjon brukere fra Neutron spredning forskeren (dette vil vanligvis skje under eksperimentet); Dette skriptet er Python-basert og inneholder alle nødvendige kalibrering og skalering justeringer redusere 2D spredning bildet til en 1D tomt spredte intensiteter som en funksjon av spredning vinkel, I(Q).
    3. Åpner den angitte reduksjon for brukere i MantidPlot og plasser tilsvarende skanning tall eller identifikasjon for eksempel og buffer parene i riktig oversikt.
    4. Kjøre skriptet å generere redusert data som en tekstfil med fire kolonner (rekkefølge er Q, I(Q), I(Q) feil, Q feil) i den angitte plasseringen. Høyreklikk det aktuelle arbeidsområdet i MantidPlot og velg "Plott med feil..." for en første undersøkelse av spredning profiler.

6. analysere Data for strukturelle parametere av spredning partikkel

  1. Overføre redusert datafilen fra analyseserver på en lokal datamaskin bruker sikker FTP-filoverføring. Dette kan utføres med bruk av programvare som FileZilla eller CyberDuck. Instruksjoner og detaljer for å koble til analyse server filsystemet tilbys på påloggingssiden analysis.sns.gov.
  2. Dataoverføre det ATSAS programvare suite65,68 (hele ATSAS suite). 69 enkeltprogrammer70 er også tilgjengelig online for å analysere SANS dataene, nemlig å fastslå strukturelle parametere og ab initio modeller.
    Merk: Mange alternativer er tilgjengelige for SANS dataanalyse av biomacromolecules. 45
  3. Bruke PRIMUS71 for inntegning av dataene, buffer skalering og subtraksjon og Guinier analyse.
    1. Starte ATSAS 'SAS dataanalyse' program og laste redusert data filer for eksempel og buffer paret.
      1. Hvis du vil skalere bufferen riktig, Velg et dataområde på høy Q (Q > 0,5 Å-1) hvor begge profiler er like og flate, og klikk på "Skala" knappen under 'Operasjonene' kategorien. En skalaen faktoren brukes til bufferen slik at disse to flat regionene skal overlappe. Forsiktig: det bør være en sannsynlig fysiske grunn som rettferdiggjør skalering buffer intensiteten for å matche utvalget. Hvis avviket er stor, kan du se et instrument forsker for gyldig tilnærminger til bakgrunnen subtraksjon. 44 , 45 , 72
      2. Øke dataområdet for å vise alle punktene. Klikk trekk fra for å utføre denne operasjonen. Høyreklikk det buffer-trukket datafile i forklaringen og lagre denne filen for senere analyse. Figur 9 beskriver bruk av kategorien "Operations".
    2. Utføre en Guinier analyse av buffer-trukket eksempeldata ved hjelp av kategorien 'Analyse' programmet 'SAS dataanalyse'.
      1. Sørg for riktig filen er valgt i listen og klikk 'Radius av Gyration'. Automatisk forsøk på å utføre en Guinier passer gis ved å klikke på knappen 'Autorg'.
      2. Utvide omfanget av dataene brukes til å inkludere alle low-Q dataene og begynne trangere dataområdet ved å ta bort høy-Q poeng til Qmax * Rg grensen er under 1.3. Bruk handlingen i rest for å bekrefte at data er lineær i området passer. Guinier passer gir en omtrentlig Rg og jeg0 for spredning partikler.
      3. Foreta små justeringer regionen passform og overvåke følsomheten til disse verdiene til dataområdet i passer. Figur 10A demonstrerer bruken av verktøyet 'Radius av Gyration'.
  4. Få sannsynlighetsfordeling funksjon (P(r)) i GNOM. 73 utdatafilen generert her brukes som inndata for den ab initio modellering prosessen.
    1. Start veiviseren fra distribusjon i kategorien "Analysen" å få en god plass til dataene er avgjørende for å få en kvalitet modell. For mer informasjon om å få nøyaktig passer, se for gjennomgang74 av Putnam, et al.
      Merk: The GNOM programmet gir tilleggsinformasjon om passformen utover veiviseren fra distribusjon. Figur 10B viser riktig bruk av 'Avstand distribusjon' verktøyet, og Figur 11 illustrerer noen av de vanlige feilene oppstod.
    2. Bestemme Dmax, maksimal interatomic avstanden i molekylet.
      1. Beregne en verdi for Dmax ved å fjerne merket i boksen for å tvinge Rmax = 0 og angi en stor verdi for Dmax (150 Å, for eksempel). Første x-snappe i plottet av P(r) gir dette anslaget.
      2. Gjøre trinnvise endringer til Dmax verdien og dataområdet brukes eller antall poeng brukt i passe for å optimalisere GNOM passer til dataene og den resulterende P(r) kurven.
    3. Fortsette å avgrense GNOM Tilpass og lagre utdatafiler GNOM med god passform parametere for påfølgende ab initio modellering trinn.
  5. Simulere SANS profiler fra høy oppløsning PDB modeller bruker programmet CRYSON. 75
    1. Åpne programmet og velg alternativet '0'. Velg navnet på PDB i filleseren popup. Trykk enter for å godta standardinnstillingene, bortsett fra å angi kjeden deuterasjon (deuterering) brøker og brøkdel av D2O i løsemiddelet å oppnå parameterne riktig kontrast.
    2. Passe modellen til en eksperimentell datasett ved å angi "Y" velge datafilen i filleseren popup. Godta gjenværende standardverdiene, og filer vil bli skrevet i PDB filplasseringen. Filen '.fit' inneholder informasjon for anslått spredning profilen fra høyoppløselig 3D-modellen.

7. opprette Ab Initio modeller fra den SANS Data.

Merk: DAMMIF76 og DAMMIN77 i programvarepakke for ATSAS brukes til å rekonstruere dummy atom modeller (dammer) bruker en simulert annealing fra GNOM utgang, som inneholder P(r) data eller informasjon om sannsynligheten eller frekvens for interatomic avstander i spredning partikkel. Disse programmene kan kjøres i batch-modus eller på ATSAS-Online web-serveren.

  1. Starte veiviseren PRIMUS figur fra 'Dammif'-knappen i kategorien 'Analyse' av "SAS dataanalyse", og bruke en manuelt valg av parametere. Inndataene for veiviseren er illustrert i Figur 12.
    1. Definere Guinier fra passer (trinn 6.3.2) og videre til neste trinn ved hjelp av navigasjonsknappene. Definer passer verdier fra P(r) handlingen (trinn 6,4) og videre til neste trinn.
    2. Angi parametere for den ab initio modellering prosessen. Angi et prefiks for modell utdatafiler (f.eks SANSEnvelope), velge enten "rask" eller "sakte" modellering, angi en verdi for antall modeller (17 anbefales for statistisk betydning), velg fra tilgjengelige alternativene for partikkel symmetri, anisometry og kantete skala (hvis kjent). Kontroller at boksene kontrolleres gjennomsnittlig modeller med DAMAVER og avgrense den siste modellen med DAMMIN.
    3. Starte prosessen ved hjelp av knappen 'Send'. Når prosessen er fullført, vise og lagre arbeidsmappen.
      Merk: typisk modelleringsprosessen med et enkelt, lite protein kan ta opp til et par timer med en vanlig PC. Filene lagres i midlertidige mapper før lagret.
  2. Overlegg og sammenligne finalen SANS konvolutten med relaterte høyoppløselig modell med SUPCOMB i ATSAS. Plassere en kopi av den høyoppløselige PDB-modellen for å passe til SANS konvolutten i arbeidsmappen. Kjøre SUPCOMB fra kommandolinjen med PDB filnavnene som to argumenter med malen struktur vises først: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Merk: Andre filnavnet vises vil bli omskrevet til en ny fil med en "r" lagt til slutten og har nye koordinater for overliggende på mal-strukturen.
  3. Visualisere ab initio modell resultatene med PyMOL (pymol.org), et 3D molekylær grafikkprogram. Figur 13 gir en oversikt over PyMOL operasjoner.
    Merk: Det er publikasjonen retningslinjer for strukturell modellering av liten vinkel spredning data fra biomolecules i løsningen. 78
    1. Starte PyMOL og åpne .pdb tilsvarer 3D SANS konvolutt og SUPCOMB alliansefrie høyoppløselig strukturen skal vises.
    2. Visualisere SANS konvolutten som representerer denne modellen som en overflate. Klikk 's "knappen ved siden av modellen og velg" Vis: som: overflaten ".
    3. Visualisere høyoppløselig protein ryggraden strukturen som representerer denne modellen som en tegneserie. Velg 's "ved siden av denne modellen, og velg" Vis: som: tegneserie '. Vis kjeden som en regnbue fra N - til C-terminus ved å velge knappen 'C' og ' av kjeden: Chainbows'.
    4. Endre gjennomsiktigheten av overflaten representasjon for klarhet. "Innstilling" menylinjen, velg "åpenhet» overflaten» 40% '.
    5. Gjøre bakgrunn hvit og ikke-ugjennomsiktig. 'Display' menylinjen, velg "bakgrunn»" og velg "Ugjennomsiktig" for å endre dette alternativet og "Hvit" for å markere denne fargen for bakgrunnen.
      Merk: flere operasjoner og bruker for PyMOL kan finnes på PyMolWiki.org.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strålen tid og instrument forslag skal tydelig formidle all informasjon nødvendig til gjennomgangen komiteen slik at en gyldig vurdering av foreslåtte eksperimentet kan gjøres. Kommunikasjon med en NSS er svært foreslått for uerfarne brukere. NSS kan vurdere første gjennomførbarhet og guide forslag innlevering å understreke gjennomførbarhet, sikkerhet og potensialet for høy effekt vitenskap. Informasjonen i forslaget bør inkludere bakgrunnsinformasjon og kontekst for betydningen av forskning; kunnskap som forventes å oppnås og hvordan dette påvirker gjeldende forståelse i relaterte felt av vitenskap; en beskrivelse av arbeid, eksempler, metoder og prosedyrer som vil bli ansatt; og, om mulig, tidligere produktivitet av teamet på anlegget, inkludert relevante publikasjoner og resultater. Nyttige ressurser, for eksempel forslag maler og tips for å forberede forslaget, er tilgjengelige for brukere via Neutron Science Brukerportal (neutrons.ornl.gov/users).

Eksperiment planlegging er en dynamisk prosess som ofte begynner under den innledende stadiet av forslaget innlevering, men kan ikke være fullt unnfanget før like før eksperimentet. Imidlertid huske på at endringer som avviker betydelig fra beskrivelsen i forslaget (inkludert endringer buffer forhold eller prøve sammensetning) må godkjennes av anlegget før starten av eksperimentet.

Denne protokollen forutsetter at en metode for å uttrykke og rensende membran protein av interesse i vaskemiddel micelles i løsning har blitt vellykket demonstrert. I dette tilfellet er membran protein av interesse en intramembrane aspartyl protease (IAP), som har en etablert rensing protokoll og tidligere har blitt bestemt å være vannløselige og aktiv i bufferen som inneholder DDM micelles.

Her viser vi neutron kontrast beregninger ved hjelp av MULCh: kontrast modul for en løsning av IAP protein i kontrast-matchet blandet DDM / d25-DDM micelles. Strategi skissert her var å først fastslå graden av blanding mellom de to vaskemidler som er nødvendig for å oppnå en kontrast kamp av micelle. Sluttresultatet var å bestemme relative kontrasten i hver komponent og bakgrunnen (H2O/D2O ratio) nødvendig til kontrast-match spredning fra vaskemiddel for å observere bare protein spredning.

Figur 1 viser en riktig inngang for modulen MULCh kontrast og utdataene for kontrast beregninger av DDM vaskemiddel Hovedgruppe og hale som tenkes 1 og 2, henholdsvis. Formelen som brukes for gruppen hodet er C12H14X7O11 med en mengde 348 Å3og alkyl kjeden hale formelen er gitt som C12H25 med et volum på 350 Å3.

Det er tydelig fra kontrast modul utdataene at DDM hodet grupper og halen har forskjellige spredning lengde tettheter, og dermed kontrasten mellom de to komponentene vil bli observert. For DDM har leder gruppene en CMP i 49% D2O mens alkyl kjeden haler har en CMP i 2% D2O, med deres gjennomsnittlige CMP forekommer i 22% D2O. Derfor vil sikte på neste trinn være å utforme en blandet micelle som inkorporerer deuterium-substituert alkyl kjeder for å øke gjennomsnittlig CMP vaskemiddel hvoster å matche CMP leder gruppene. Kontrast beregningen ble gjentatt for en substituerte vaskemiddel, DDM med en fullt deuterated hale (d25-DDM), som tilsvarende resulterer i kontrast mellom Hovedgruppe og halen. Imidlertid kontrastere verdier av h-mynt d haler er signifikant forskjellig. Husker at vaskemiddel blandinger er kjent for å produsere godt blandet micelles i løsning,22 derfor en blanding av disse h og d-haler i micelle kjernen skal produsere en gjennomsnittlig SLD lik det leder gruppen skall, gir en micelle med enkelt CMP. Siden gruppen hodet er felles for både DDM og d25-DDM, er strategien å finne en blanding av disse vaskemidler som produserer en gjennomsnittlig kontrastverdi fra blandet haler som samsvarer med kontrasten i hodet gruppene.

Målet gjennomsnittet CMP for vaskemiddel haler er at maltoside hodet grupper eller 49% D2O. For å beregne forholdet mellom blande gjennomsnittlig CMP av hver t-hale og d-tail komponent må være kjent. Disse verdier for noen vanlige vaskemidler og kommersielt tilgjengelig deuterium merket kolleger er gitt i tabell 1. Bruke disse CMP verdiene for DDM og d25-DDM, mole brøkdel av h-haler og d haler som oppfyller ligningen i trinn 2.2 er χd haler = 0.43.

Figur 2 viser en mer avansert inngang til MULCh kontrast modulen som kan brukes til å bekrefte de siste blandet micelle kontrast kamp forholdene og fastslå graden av deuterasjon (deuterering) nødvendig på protein. Her gjelder delenhet 1 kontrast-matchet blandet micelle med 2 komponenter, DDM og d25-DDM, mens delenhet 2 refererer til det M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl protease (MmIAP) gitt av sin aminosyresekvens. SLD av protein er blitt opphøyet av uttrykk i deuterated vekst medier å gi en CMP for protein i bufferen som inneholder ~ 92% D2O. Grad av separasjon mellom protein's match point i 92% D2O og betingelsen måling (48,5% D2O) antyder tilstrekkelig spredning signalet skal hentes fra protein.

Produksjon av d-MmIAP ble utført med Rosetta 2 E. coli celler skjuler pET22b-MmIAP vektoren. Minimal medium med umerkede glyserol i 90% D2O ble valgt som vekstmediet. Etter tilpasning til 90% D2O minimal middels, kultur volumet ble skalert opp til 400 mL og brukes til å vaksinere 3.6 liters frisk 90% D2O minimal medium i en 5.5 L bioreactor fartøy.

Figur 3 inneholder spor av prosessen verdiene under matet-batch dyrking. Ved vaksinasjon, temperatur settpunkt var 30 ° C, oppløst oksygen (DO) sett poenget var 100%, agitasjon sett poenget var 200 rpm og flow rate av trykkluft var 4 L/min. PH ble holdt over et sett poenget med 6,9 bruker en 10% w/v oppløsning av natriumhydroksid i 90% D2O. Når den gjør pigg signaliserte uttømming av første 5 g/L glyserol, fôring (30% w/v glyserol, 0,2% MgSO4 i 90% D2O) ble startet, som fortsatte gjennom dyrking. Etter rundt 7 timer med fôring, kultur temperaturen ble redusert til 18 ° C og isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside ble lagt til en siste konsentrasjon av 1 mM. Etter høsting kulturen, ca 145 g våt vekt celle lim ble samlet inn via sentrifugering (6000 x g for 45 min)

Rensing av d-MmIAP fortsatte som protonerte enzymet bortsett fra at enzym kapasitet var betydelig lavere og endelige renhet var noe lavere enn vanlig. Fra 5 L, ~ 20 g av våt membraner ble isolert, som var solubilized i DDM for rensing og lastet opp på den første Ni2 + affinity kolonnen. For å maksimere rensing avkastning, var gjennomflytsenhet brøken utvannet og nytt kjører på Ni2 + affinitet kolonne. Prosedyren ble gjentatt en tredje gang før polering konsentrert d-MmIAP utvalget av størrelse utelukkelse kromatografi (Figur 4).

Figur 5 viser en kvarts eksempel celle og dens relaterte eksempeloppsett for veksler. Eksempel miljøer styres av Bio-SANS operasjonsgruppen og NSS. En rekke forskjellige miljøer kan arrangeres til å utføre målinger med temperatur, fuktighetskontroll, mekanisk risting, høy temperatur og vedvarende press, blant andre.

Figur 6 viser Bio-SANS operasjonene og gjennomføring av tabellen automatisk skanner. Tabellen skanningen er konfigurert intuitivt og brukervennlig. I den første kategorien (Last eksempler), er informasjonen om eksempel veksler og oppsett, for eksempel identifikasjon av eksempler på hver posisjon i eksemplet veksler, celle tykkelser og prøvetype (åpne strålen, utvalg, bakgrunn, osv). Flere metadata kan brukes her også. Neste kategorien (planlegge eksperimentet) er Instrumentkonfigurasjonen og eventuelle tilknyttede parametere (for eksempel temperaturkontroll) definert. Dette trinnet er arrangert av NSS i begynnelsen av eksperimentet. Brukeren må bare input måling tidspunktene for hvert utvalg (i sekunder). Siste kategorien (kjøre skanninger) gir et sammendrag av skanning tabelldataene og gir automatiske skanningen skal utføres.

Etter 2D spredning bildene registreres, må dataene bli redusert til en 1D tomt intensiteten versus Q - en funksjon av spredning vinkelen. Under data reduksjon brukes også bildekorrigeringsinnstillinger som pixel følsomhet masker og mørk bakgrunn subtractions. MantidPlot programvaren er utviklet til å tolke rå Bio-SANS instrumentdata. NSS vil vanligvis hjelpe å redusere og hente de endelige dataene på slutten av eksperimentet.

Figur 7 gir en oversikt av ekstern analyse cluster MantidPlot og vinduet skriptet brukes for feilreduksjon. Rå data er tilgjengelig på ekstern analyse klyngen (analysis.sns.gov) via UCAMS/XCAMS brukergodkjenning. Etter hogger tømmer i det eksterne skrivebordet, kan MantidPlot programvaren startes fra en terminal vindu ved å bare kjøre "MantidPlot" under baner. Åpne vinduet skript i MantidPlot og redigere brukeren reduksjon skriptet som anvist av NSS. Kjøre dette skriptet vil generere redusert data-filer, som deretter kan overføres til en lokal maskin for analyse ved hjelp av sikker FTP.

Figur 8 viser plotting og visning av data etter utfører bruker reduksjon scriptet redusert dataene vises i vinduet arbeidsområder. Som standard vil endelige flettede dataene har suffikset _f legges. Høyreklikk gjør Plot spektrum med feil velges og dataene som skal tegnes. Innstillingene er tilgjengelig ved å velge innstillinger på 'Vis'-menylinjen. Formatering av akser og plotte utvalg er lett tilgjengelig ved å dobbeltklikke aksene. Spredning profiler av buffere, som inneholder ingen spredning partikler av betydelig størrelse skal vises som en relativt flatt linje (intensitet). For prøver praktiseres intensitet i lavere spredning vinkler (Q) med eksponensiell decay til en flat usammenhengende bakgrunn.

Figur 9 gir en oversikt over riktig buffer subtraksjon med programvarepakken SAS dataanalyse (eller primusqt) etter data reduksjon. Ganske ofte er usammenhengende bakgrunnen (intensitet på høy-Q) litt umake populasjonsutvalg og buffer. For riktig subtraksjon, skal data i dette området overlappe. Skala korrigering gjelder en intensitet skalaen faktoren data som resulterer i overlappende data og subtraksjon kan utføres. Hvis skaleringsfaktoren resulterer i bufferen datapunkter med større intensitet enn tilsvarende poeng i utvalget, vil være disse punktene negativ og ikke gjengis i en logg plot. Hvis negative verdier i filen buffer-trukket er rikelig, gjør en liten reduksjon i bufferen skaleringsfaktoren og utføre subtraksjon igjen.

Figur 10 gir eksempelet bruksområder Primus Guinier og avstand distribusjon veiviserne. En Guinier analyse gir en foreløpig estimat av partikler radius gyration fra lav vinkel spredning data. Når data nærmer null, må en lineær region finnes i data. Montering av en linje i denne regionen kan Rg skal bestemmes fra skråningen og en I0 være extrapolated fra intensitet skjæringspunktet ved Q = 0. En oppadgående trend i dataene indikerer som Q nærmer seg null aggregering i utvalget, mens nedadgående trend er vanligvis tegn på interparticle repulsions. Disse trendene er mest tydelig når fordelingen av rest er ikke-Stokastisk. Øvre grense for Guinier passer for globular partikler er begrenset av Q * Rg < 1.3 ('s' brukes i stedet for Q i ATSAS programvare).

Rg bestemt for d-MmIAP fra denne Guinier plass var 15,4 ± 1.1 Å med anslagsvis jeg0 som 0.580 ± 0,001.

Veiviseren for avstand distribusjon kan systematisk endringer gjøres i parameterne for P(r) som passer. P(r) kurven er en indirekte Fourier-transformere kurve til eksperimentelle data. Derfor er det viktig å kontrollere at passformen i informasjonsvinduet gjenspeiler eksperimentelle data. For Tilpass vist i dette eksemplet, en Dmax i 46 Å ble fått.

Figur 11 illustrerer vanlige feil i Dmax utvalg. En Dmax som er kunstig store ofte forårsaker P(r) verdier å bli negativ som funksjonen P(r) oscillates om x-aksen. En Dmax som er kunstig liten fører til en avkortet P(r) kurve med en brå overgang til Rmax = 0.

De første trinnene i veiviseren for Primus figuren er identisk med Guinier og avstand distribusjon veivisere. Når denne informasjonen har blitt gitt til få god passer til eksperimentelle data, er ab initio modelloppsettet konfigurert.

Figur 12 illustrerer en riktig inngang for veiviseren for Primus-figuren. Her eksperimentelle SANS dataene for IAP ble levert med en skala i Ångstrøm, og forventet filen prefiks av "SANSEnvelope" ble gitt. Et sett med 17 første dummy atom modeller ble bedt om å være generert av "rask" modell modus med ingen symmetri (P1) brukt og ingen anisometry valgt. Settet med 17 modeller vil være justert gjennomsnitt og filtrert med DAMAVER, og gjennomsnittlig modell raffinert med DAMMIN. Inspeksjon av prefiks-damsel.log tekst dokumentet inneholder et sammendrag av utvalgskriterium og noen modeller forkastet fra settet. Den siste raffinerte modellen ble skrevet som SANSEnvelope-1.pdb.

Programmet SUPCOMB brukes til å utføre en overliggende SANS konvolutten modell med høy oppløsning modellen, med bare to PDB struktur filer som inndata. Som standard tilføyes "r" reorientert og lagt navnet.

Når SANS konvolutt og kodebasert struktur har blitt lagt, disse modellene kan visualiseres ved hjelp av molekylære grafikk viser programmet. Resultatene fra PyMOL er egnet for publikasjonen bildekvalitet og kan brukes til å fremheve Biofysiske resultater knyttet til strukturelle etterforskningen. Her viser vi noen grunnleggende PyMOL operasjoner brukes 3D fremstillinger og utsikt over de resulterende lagt strukturene.

Figur 13 gir en oversikt over PyMOL visualisering prosessen. Når PDB struktur filene har blitt åpnet i PyMOL, skal modellene vises i PyMOL Viewer-vinduet. Endre representasjoner av hver modell bruker 's "knappen ved siden av hvert filnavn. Bruke en overflate representasjon for SANS konvolutten og en tegneserie representasjon av protein ryggraden fra høyoppløselig modell. Velg en egnet fargevalg fra alternativer tilgjengelig under knappen 'C'. Proteinet kjeder gir en "chainbow" coloring en fargegradering fra N - til C-terminus å hjelpe tolkning. Gjennomsiktighet brukes til overflaten representasjon å tillate bedre visualisering av protein i konvolutten. Publisering bilder bør en hvit bakgrunn. Når disse visualisering køene er brukt, kan 3D strukturer undersøkes. Manipulering av perspektiv og molekyl rotasjon/oversettelsen kan utføres ved å klikke og dra strukturen.

Figure 1
Figur 1. Bruk av MULCh kontrast modulen viser hvilken kontrast parametere for komponenter av dodecyl maltoside (DDM). Inndataverdier vises i skjermbildet til venstre med påfølgende utdataene til høyre. Siden kontrast modul input er tilgjengelig ved å klikke 'Contrast' (grønn sirkel) fra navigasjonsmenyen på venstre side av hver skjerm. Innleveringsområder for Prosjekttittelen, buffer komponenter og underenheter 1 og 2 er merket som sådan. Utskrevne sidene inneholde viktig partikkel informasjon og kontrast egenskaper for beskrevet systemet. Relevante tabellene og beregnede matchpoeng har blitt innestengt i oransje for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Bruk av MULCh kontrast modulen viser hvilken kontrast parametere for komponenter av membran protein-rengjøringsmiddel komplekset. I dette tilfellet har input fått til å beskrive den samlede PDC-systemet i bufferløsning. Delenhet 1 beskriver kontrast-matchet blandet micelle består av DDM med 43% av Molo som d25-DDM. Delenhet 2 beskriver membran protein, aminosyre sekvens for MmIAP innspill som formelen. Deuterasjon (deuterering) nivået (grønn sirkel) beskriver protein's graden av deuterium substitusjon, og har en direkte innvirkning på SLD og beregnede matchball som vil anslås for protein. Resultater (oransje boks) indikerer at matchball for blandet vaskemiddel vil skje i 48,5% D2O, mens protein's kamp-punktet oppstår på ~ 90% D2O. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Eksempel forberedelse-Bioreactor spor. Prosessen verdiene er temperatur settpunkt (oransje linje), oppløst oksygen (DO) settpunkt (blå linjen), agitasjon settpunkt (rød linje) og trykkluft strømningshastighet (rosa linje). Pumpe 1 (grønn linje) ble brukt for pH-kontroll. Topp på 18:40 signaliserte uttømming av den første glyserol og ble brukt til å starte foring av glyserol løsning via pumpe 2 (svart linje). X-aksen angir timer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Prøve forberedelse-FPLC og SDS-side karakteristikk av prøven. Endelig størrelse utelukkelse chromatogram for d- MmIAP equilibrated med 20 mM HEPES, pH 7.5 250 mM NaCl, 48,5% D2O og 0,05% total DDM, som 44% (w/v) er halen-deuterated d25-DDM. Innfelt: SDS side analyse med Coomassie flekker. Grupperte fraksjoner merket A, B og C. Region "B" ble brukt i SANS eksperimentet. Kommenterte molekylvekt markøren er i kDa. Bilde gjengitt med tillatelse fra Naing et al. 65 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5. Datainnsamling – kvarts banjo prøve cellen og autosampler. (A) en tom kvarts banjo celle vises hviler mot autosampler blokken. Celler er fylt med eksempler og settes inn i en av de 15 tilgjengelige plasseringene. (B) prøve blokken er montert bak en aperture-valg (vises ikke) mellom strålen Tube Extender og silisium vindu ved inngangen til detektor tanken. Slanger kobler til et temperaturkontrollert vannbad og kanaler i hele prøven blokken gir temperaturregulering på prøveposisjoner. Pilen viser mot neutron strålen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Datainnsamling – oversikt over SPICE operasjoner og tabellskanning. Tabell skanning operasjonene er tilgjengelig fra knappen 'Tabell Scan' på venstre menyen av SPICE instrument kontroll programvare. Grønne pilene betegne den aktive kategorien på toppen av skjermen og oransje boksene fremheve områder i tabellen for aktiv bruker innganger. (A) den første kategorien av tabellen skanningen brukes til å gi informasjon om eksempel veksler og celle prøveposisjoner. Gi etiketter, prøve tykkelser og prøve typer kor brukt i eksemplet veksler. Merker "Søker", legges den tilsvarende raden til tabellen skanning køen. (B) i kategorien andre detaljer om instrument konfigurasjon og måling tiden for hvert utvalg (i sekunder) registreres. Instrumentet konfigurasjoner er forhåndskonfigurert av Neutron spredning forsker og gitt til brukere basert på opplysninger gitt i strålen tid og instrument forslaget. Tilleggsparametere kan legges til instrument kontrollen, for eksempel muligheten til å definere temperatur setpoints og ventetid, gjennom måling køen. (C) siste kategorien gir en oversikt over målingene gjøres for hver rad i tabellen. Hvis ingen endringer er nødvendig, startes automatisk skanningen ved å klikke Kjør skanner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Data reduksjon – oversikt over reduksjon script og MantidPlot operasjoner. MantidPlot programvare er tilgjengelig i analyse klyngen ved å skrive "mantidplot" i terminal ledeteksten for alle aktiv adresseliste (gul sirkel og pil er lagt på vekt). Når programvaren er åpen, åpner skriptvinduet (pinnen knappen merket i grønt) og åpne manuset leveres av Neutron spredning forskeren. Følg instruksjonene i skriptet som bør bare krever skanning tallene for hver utvalget og buffer til angis i en liste for automatisk reduksjon, i tillegg til å skanne tall for den tomme cellen for subtraksjon og tom bjelke for overføring og stråle Center-vilje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8. Dataanalyse-Plotting av data ved hjelp av MantidPlot. Data er referert til som "arbeidsområder' i MantidPlot. Arbeidsområdet området fylles med filnavn som produseres av skriptet bruker reduksjon. Arbeidsområdedata for 1D datasett kan tegnes ved å høyreklikke arbeidsområdet og velge "Plot spektrum med feil...". Flere data kan legges til gjeldende handlingen ved å dra og slippe arbeidsområder. Formatering av tomten vinduet (for eksempel for logge-Logg tomter) kan utføres ved å velge "Innstillinger" fra 'Vis' meny stang eller dobbeltklikke på akseetikettene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9. Dataanalyse-ATSAS programvare: grunnleggende operasjoner og buffer subtraksjon. Primusqt søknaden (SAS dataanalyse) skaffer visualisering for riktig bakgrunn (buffer) subtraksjon. Filen bufferen skal tilpasses for subtraksjon slik at data overlapper på høy-Q (der spredning er flat som følge av gjenværende signalet fra usammenhengende bakgrunn). Når denne høy-Q dataområdet er valgt, gjelder skala operasjonen en skalaen faktoren for lavere datafilen i tabellen som produserer overlapping i regionen definert. Etter skalering, kan filen buffer trekkes for å gi netto spredning profilen av partikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10. Dataanalyse-Guinier og P(r) (avstand distribusjon) besluttsomhet. (A) Primus Guinier veiviseren brukes til å utføre en Guinier analyse, gir et første anslag over jeg0 og Rg. Partikkel type og dataområdet å passe brukes til å definere passer. En tomt passform og tilsvarende rest vises til venstre, mens Guinier vilkår (jeg0 og Rg), Q * Rg grenser og kvalitet av lineær fit tilbys som utdata i området preget av den oransje boksen. (B) veiviseren for Primus fra-fordeling brukes til å utføre avstand distribusjon analysen, gir P(r) kurven som definerer sannsynligheten for interatomic avstander i spredning partikkel og inkluderer Dmax eller maksimalt interatomic avstand. Parametere angitt av den oransje boksen kan undersøkes systematisk for å finne en riktig avstand fordeling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11. Feil resultater fra avstand distribusjon analyse. En skikkelig valgt Dmax skal produsere en P(r) kurve som topper med en gradvis nedbrytning til null. DMax verdier som er for stort vil trolig produsere negative P(r) verdier eller svingninger i x-aksen på høye verdier av r. Dmax verdier som er kunstig små ofte resultere i P(r) kurver der øvre grense avkortet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12. Modellering- Ab initio modell installasjon ved hjelp av veiviseren for Primus figur. Ab initio modellering parametere finnes i en enkelt inndata-vinduet. Et prefiks leveres for produksjon filnavn med andre alternativer for behandling tilgjengelig. Avspenning prosedyren kan være rask (større perler med raskere kjøling) eller treg (mindre perler med tregere kjøling). Antall repetisjoner bør være tilstrekkelig store undersøke reproduserbarhet av modellen har. Partikkel symmetri og anisometry kan gis, hvis kjent. Kantete skala bør tilsvare enhetene målt data. DAMAVER gjennomsnitt vil justere og gjennomsnittlig alle attrapp atom modeller, og deretter bruke et utvalgskriterium som utelukker noen avvikende modeller. En kjerne av fast atomer fra gjennomsnitt modellen blir ytterligere forbedret med DAMMIN Hvis dette alternativet er valgt. Denne raffinerte modellen skal representere 3D lavoppløselig konvolutten av den eksperimentelle SANS profil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 13
Figur 13. Visualisering-eksperimentelle SANS konvolutt og overlegg med høyoppløselig modell bruker PyMOL. Etter åpning PDB struktur filene i PyMOL, vises modeller i PyMOL-visningen. Aktiv modeller er oppført i tabellen til høyre, sammen med handlingsknapper som kan brukes til å manipulere modellen og representasjonen. Operasjoner er gitt for å visualisere disse modellene som tillater regioner av avtalen (eller feil) mellom SANS konvolutten og høy oppløsning struktur identifiseres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1. Fysiske egenskaper vaskemidler brukt i membranen protein undersøkelser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Strukturell biologi forskere utnytte komplementære strukturelle teknikker som løsning spredning å hente biokjemiske og strukturelle detaljer (som størrelsen og form) fra biomolecules i løsningen. SANS er en spesielt attraktivt teknikk for å bestemme lav oppløsning strukturer av membran proteiner, en kjerne fokus på moderne strukturell biologi og biokjemi. SANS krever mengder renset proteiner sammenlignbare med krystallografisk forsøk (1 mg/sampling). Nylig voksende kommersielle tilgjengeligheten av høy renhetsgrad deuterated vaskemidler relevant for membran protein studier gjør tilgjengelig å manipulere denne hydrogen/deuterium innhold for SANS eksperimenter av membran protein-rengjøringsmiddel komplekser, slik at protein signalet skal registreres direkte. Når vellykket, kan en ab initio modell molekylær konvolutt beregnes fra data samlet inn over bare adskillige timene. Dermed kan membran protein Biokjemikere, biophysicists og strukturelle biologer lett dra nytte av uten å få tatt første 3D-modeller av membran proteiner i løsningen, strukturer i kompleks med bindende partnere eller underlag, og modeller innhentet av SANS kan brukes for innfasing Diffraksjon data. Rutinemessig bruk av SANS å karakterisere membran proteiner ville være transformative for feltet membran protein biokjemi og ringvirkninger fra basisstrukturen funksjonen til medisiner og utvikling. Den ekstra fordelen av neutron kontrast samsvarer med deuterium substitusjon gjør SANS en verdifull teknikk for å studere protein-protein, protein-DNA eller andre biomolecular kompleksene, som lett kan manipuleres i hydrogen/deuterium innholdet.

For ytterligere informasjon om liten vinkel spredning instrument design og teori, anbefales følgende vurderinger: Bio-SANS instrumentet ved høy Flux isotop reaktoren i Oak Ridge National Laboratory,79 liten vinkel spredning for strukturell biologi-utvide grensen mens unngå fallgruver,72 og liten vinkel spredning studier av biologisk makromolekyler i løsningen. 80 the Neutron spredning Scientist kan også diskutere aktuelle instrument konfigurasjoner og optimale parametere for et system. For eksempel er data på lavere Q (som er en funksjon av spredning vinkel og neutron bølgelengden) generelt ønsket for større systemer. Den vanligste Instrumentkonfigurasjonen på Bio-SANS gir Qmin av 0.003 Å-1 og er egnet for større protein komplekser opp til hundrevis av kDa. En løsning som inneholder ~ 3 mg mL-1 membran protein av omtrentlig størrelsen på 30 kDa (monomer) i kontrast-matchet micelles med 48,5% D2O i løsningen krever typisk måling tid rundt 8 timer hver for eksempel, buffer og tom celle (24 timer = 1 dag totalt). Instrumentet måling ganger på en gitt kontrast tilstand kan skaleres ca ifølge produktet av spredning partikkel molekylær masse og konsentrasjon. Imidlertid må spredning partikler måles under ikke-samspill betingelser, inkludert eventuelle ikke-spesifikk protein aggregering, som plasserer en praktisk øvre grense på konsentrasjonen av prøven. Timelange målinger legger begrensninger på stabiliteten av visse proteiner. Heldigvis SANS målinger gjøres rutinemessig ved nedkjølt temperaturer å forbedre protein levetid og næringsdrivende stråle av lavenergi nøytroner forårsaker ikke stråling skader under målingen.

En oversikt over denne prosessen og fastsetting av mange viktige faktorer mot vellykket innspillingen av neutron spredning fra et utvalg målt ved kontrast match poenget med vaskemiddel presenteres i dette manuskriptet. Dette inkluderer de viktige skrittet mot å få en komplett kamp av den samlede vaskemiddel ved å utforme en vaskemiddel blanding med en ensartet neutron kontrast mellom vaskemiddel Hovedgruppe og alkyl kjeden komponenter. Målinger på dette enkelt vaskemiddel matchball gir en spredning profil tilskrevet bare membran protein av interesse og tillatt en ab initio konvolutt som representerer membran protein kan rekonstrueres fra dataene. Dataanalyse og ab initio modellering protokoller også vise potensielle innhentet informasjon fra slike undersøkelser, som kunne rettet mot overordnede strukturen, conformational endringer, oligomeric stater, blant andre. En begrensning er at hittil bare svært få detergents er kommersielt tilgjengelig med deuterium erstatninger. 19

Mens perdeuteration ikke være nødvendig, målet i dette tilfellet bør være å oppnå et protein med > 65% deuterium merking i protein. Alternativt, hvis vaskemiddel med selektivt deuterated hodet grupper og haler er tilgjengelig, og CMP av vaskemiddel micelle oppstår i nærheten av 100% D2O, så nok kontrast fra protein kan oppnås uten behov for deuterium merking. Fastslå hvilket riktig deuterasjon (deuterering) av proteinet å oppnå tilstrekkelig spredning målt på kontrast-match poenget med vaskemiddel. Det er mange utfordringer forbundet med membran protein uttrykk og rensing,81 som er utenfor omfanget av denne artikkelen. Dessverre, høye nivåer av deuterasjon (deuterering) er ikke (ennå) mulig for eukaryote systemer. Mens vi innser at dette er en begrensning for noen eukaryote proteiner, har de fleste membran proteiner bakteriell orthologs som denne metoden er egnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss og Ryan C. Oliver er kontrakt med UT-Battelle med oss DOE å støtte Neutron Science brukerprogram og Bio-SANS instrumentet ved Oak Ridge National Laboratory brukes i denne artikkelen.

Dette manuskriptet har vært medforfatter av UT-Battelle, LLC, kontrakt DE-AC05-00OR22725 med oss Department of Energy (DOE). Den amerikanske regjeringen beholder og utgiveren, godtar artikkelen for publikasjonen, erkjenner at den amerikanske regjeringen beholder en ikke-eksklusiv, innbetalt, ugjenkallelig, verdensomspennende lisens til å publisere eller reprodusere publisert form av dette manuskriptet, eller tillate andre å gjøre det, for amerikanske regjeringen formål. DOE gir publikum tilgang til disse resultatene av føderalt sponset forskning i samsvar med DOE offentlig tilgang Plan. 82

Acknowledgments

Office av biologiske og miljøforskning støttes forskning på ORNL'S Center for strukturelle molekylærbiologi (CSMB) og Bio-SANS bruker fasiliteter støttes av vitenskapelige bruker fasiliteter divisjon, Office for energi basalfag, US Department energi. Strukturelle arbeidet på membran proteiner i Lieberman lab har blitt støttet av NIH (DK091357, GM095638) og NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735 (2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Tags

Biokjemi problemet 140 liten vinkel spredning neutron spredning biofysikk membran proteiner kontrast variasjon surfactant micelle intramembrane aspartyl protease presenilin signalet peptid peptidase
Kontrast-samsvarende vaskemiddel i liten vinkel Neutron spredning eksperimenter for membran Protein strukturell analyse og <em>Ab Initio</em> modellering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss,… More

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter