Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kontrast-matche vaskemiddel i små-Angle Neutron Scattering eksperimenter for membran Protein strukturel analyse og Ab Initio modellering

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/57901
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Summary

Denne protokol demonstrerer hvordan man kan opnå en lav opløsning ab initio model og strukturelle detaljerne i et vaskemiddel-solubilized membran protein i løsning ved hjælp af små-angle neutron scattering med kontrast-matche vaskemiddel.

Abstract

Det biologiske small angle neutron scattering instrument på High-Flux isotop reaktor af Oak Ridge National Laboratory er dedikeret til undersøgelse af biologiske materialer, biobrændstof forarbejdning og bio-inspirerede materialer der dækker nanometer til mikrometer længdeskalaer. De metoder, der præsenteres her for undersøger fysiske egenskaber (dvs. størrelse og form) af membranproteiner (her, MmIAP, en intramembrane aspartyl protease fra Methanoculleus marisnigri) i løsninger af micelle-dannende rengøringsmidler er velegnet til denne lille-angle neutron scattering instrument, blandt andre. Andre biofysiske karakterisering teknikker er hæmmet af deres evne til at løse de vaskemiddel bidrag i en protein-vaskemiddel kompleks struktur. Derudover giver adgang til Bio-Deuteration Lab unikke muligheder for at forberede store udlæg til planteavl og udtrykker deuterium-mærket proteiner for øget spredning signal fra protein. Mens denne teknik giver ikke strukturelle detaljer i høj opløsning, den strukturelle videnskløften på Membranproteiner indeholder mange adresserbare områder af forskning uden at kræve nær atomic opløsning. For eksempel, omfatter disse områder bestemmelse af oligomere stater, kompleks dannelse, konformationelle ændringer under undertrykkelse af netbårne og folde/udfoldelsen begivenheder. Disse undersøgelser kan udføres let gennem anvendelser af denne metode.

Introduction

Membranproteiner er kodet med en anslået 30% af alle gener1 og udgør en stærk størstedelen af mål for moderne lægemidler. 2 disse proteiner udfører en bred vifte af vitale cellulære funktioner,3 men trods deres overflod og betydning — kun udgør omkring 1% af de samlede strukturer deponeret i forskning learningsmiljøer for strukturel Bioinformatik (RCSB) Protein Data Bank. 4 på grund af deres delvist hydrofob karakter, har Strukturbestemmelse af proteiner, membran-bundet været overordentlig udfordrende. 5 , 6 , 7

Da mange biofysiske teknikker kræver monodisperse partikler i løsning for måling, har isolerende Membranproteiner fra native membraner og stabilisere disse proteiner i en opløselig efterligner af indfødte membraner været et aktivt område for forskning i de seneste årtier. 8 , 9 , 10 disse undersøgelser har ført til udviklingen af mange nye amphiphilic forsamlinger til solubilize Membranproteiner, såsom nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 og amphipols. 16 , 17 dog brugen af vaskemiddel micelles stadig en af de mest almindelige og enkle metoder til at opfylde kravene Opløselighed af et bestemt protein. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 desværre ingen enkelt vaskemiddel eller magiske blanding af vaske-og rengøringsmidler i øjeblikket findes der opfylder alle Membranproteiner; således, disse betingelser skal screenes empirisk for de unikke krav af hvert protein. 26 , 27

Rengøringsmidler samle selv i løsning over deres kritiske micelle koncentration til at danne samlede strukturer kaldet micelles. Micelles er sammensat af mange vaskemiddel monomerer (typisk spænder fra 20-200) med hydrofobe alkyl kæder danner en micelle kerne og hydrofile hoved grupper arrangeret i en micelle shell lag vender den vandigt opløsningsmiddel. Funktionsmåden for vaske-og rengøringsmidler og micelle dannelse er blevet klassisk beskrevet af Charles Tanford i Den hydrofobe virkning,28 og størrelser og figurer af micelles fra almindeligt anvendte detergenter i membranen protein undersøgelser har været karakteriseret ved hjælp af små-vinkel spredning. 29 , 30 vaskemiddel organisation om Membranproteiner er også blevet undersøgt, og dannelsen af protein-vaskemiddel komplekser (fremdaterede) forventes med vaskemiddel molekyler omkring protein i et arrangement, der ligner den pæn vaskemiddel micelles. 31

En tilføjet fordel i ved hjælp af vaske-og rengøringsmidler er, at de resulterende micelle egenskaber kan manipuleres ved at indarbejde andre rengøringsmidler. Mange rengøringsmidler udstille ideelle blanding, og vælg egenskaber af blandede micelles kan endda forudsiges ud fra komponenter og forholdet mellem blanding. 22 men tilstedeværelsen af vaskemiddel kan stadig præsentere udfordringer for biofysiske beskrivelser ved at bidrage til den samlede signal. For eksempel, med røntgen og lysspredning teknikker er signal fra vaskemiddel i PDC næsten umulig at skelne fra protein. 32 undersøgelser med enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) typisk stole på fanget (frosne) partikler; strukturelle detaljer af protein er stadig skjult af visse rengøringsmidler eller en høj koncentration af vaskemiddel, som tilføjer til baggrunden. 33 alternative tilgange mod tolkning fuld PDC struktur (herunder vaskemiddel) har gjort gennem beregningsmetoder, som søger at rekonstruere vaskemiddel omkring en given membran protein. 34

I tilfælde af neutron scattering producerer core-shell arrangement af vaskemiddel i micelle en formfaktor, som bidrager til den observerede spredning. Heldigvis kan løsningskomponenter ændres således, at de ikke bidrager til den netto observerede spredning. Denne "kontrast matching" processen er opnået ved at erstatte deuterium for brint til at opnå en spredning længde tæthed, som svarer til baggrunden (buffer). Et fornuftigt valg af vaskemiddel (med tilgængelige deutereret modstykker) og deres forhold til blanding skal tages i betragtning. For vaskemiddel micelles, kan denne substitution udføres ved hjælp af et rengøringsmiddel med samme hoved gruppe men at have en deutereret alkyl kæde (d-hale i stedet for h-hale). Da vaske-og rengøringsmidler er godt blandet,35 deres aggregater har en spredning længde tæthed, der er den mole-brøkdel vægtet gennemsnit af de to komponenter (h-haler og d-haler). Når denne gennemsnitlige kontrast er i overensstemmelse med den hoved gruppe, kan de ensartede samlede strukturer matches fuldt ud for at fjerne alle bidrag til observerede spredning.

Vi præsenterer her en protokol for at manipulere neutron kontrasten af vaskemiddel micelles ved at indarbejde kemisk identiske vaskemiddel molekyler med deuterium-mærket alkyl kæder. 19 , 36 , 37 dette tillader komplet samtidige kontrast matchende micelle kerne og shell, som er en unik evne til neutron spredning. 35 , 38 med dette væsentligt raffinerede detaljer, kontrast matchende kan aktivere ellers umuligt at gennemføre undersøgelser af membran proteinstrukturer. Derudover kunne denne kontrast-matching tilgang udvides til andre systemer, der omfatter vaskemiddel, såsom polymer exchange reaktioner39 og olie-vand dispergeringsmidler,40 eller endog andre solubilizing stoffer, såsom bicelles,41 nanodiscs,42 eller blok copolymere. 43 A lignende tilgang som skitseret i dette manuskript, men beskæftiger en enkelt vaskemiddel arter med delvis deuterium erstatningsvarer med alkyl kæde og/eller hoved gruppe, blev for nylig offentliggjort. 37 mens dette kan forventes at forbedre den tilfældige fordeling af brint og deuterium hele vaskemiddel i forhold til den fremgangsmåde, der præsenteres her, det begrænsede antal ledige stillinger på vaskemiddel til substitution og to-trins vaskemiddel syntese kræves udgør yderligere udfordringer for at vurdere.

Trin 1 og 2 i protokollen detaljeret nedenfor ofte overlapper da indledende forsøg planlægning skal gøres for at forelægge et forslag til kvalitet. Dog forslag indsendelse betragtes her som det første skridt til at understrege, at denne proces bør indledes god tid en neutron eksperiment. Det bør også bemærkes, at en forudsætning skridt, som skal påvises ved forslaget, er at have biokemiske og fysiske karakterisering (herunder renhed og stabilitet) af prøven støtter behovet for neutron undersøgelser. En generel diskussion af små-angle neutron spredning (SANS) er uden for rammerne af denne artikel. En kort men grundig introduktion er tilgængelig i opslagsværk Karakterisering af materialer af Kaufmann,44 og en omfattende lærebog fokuseret på biologiske små-vinkel løsning spredning er for nylig blevet offentliggjort. 45 yderligere anbefalet læsning er givet i afsnittet diskussion. Lille vinkel spredning bruger den såkaldte spredning vektor Q som den centrale mængde, der beskriver spredning processen. I denne artikel bruges det bredt accepteret definition Q = 4π synd (θ) / λ, hvor θ er halv vinkel mellem indgående og spredt stråle og λ er bølgelængden af neutron stråling i oxidlag. Andre definitioner findes at bruge forskellige symboler som 's' for spredning vektor, og som kan variere med en faktor 2π eller ved hjælp af nanometer i stedet for Ångstrøm (Se også diskussion af figur 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberede og indsende en Neutron facilitet Beam tid og Instrument forslag

  1. Consult online ressourcer for at identificere neutron scattering faciliteter, der giver generelt brugeren neutron stråle tid adgang, såsom Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Et kort over neutron faciliteter og oplysninger om neutron forskningen på verdensplan er tilgængelig online. 46 være klar over, at disse faciliteter typisk har regelmæssig indkaldelser af forslag; Dette afgør, hvornår den næste stråle gang bliver tilgængelig. Neutroner der bruges til en lang række applikationer; søge efter små-angle neutron scattering (SANS) instrumenter, navnlig med kapaciteter for biologiske prøver.
  2. Bruge midler fra neutron faciliteter til at hjælpe navigere neutron stråle gang forslag indgivelse proces. Rådføre sig med en Neutron Scattering videnskabsmand (NSS), der er knyttet til det instrument, som du vil anvende. Anmeld neutron facilitetens aktuelle oplysninger om forslag opkald, deadlines og rådgivning for indgivelse; for Oak Ridge er dette tilgængelige online. 47 indsende stråle gang forslaget efter alle retningslinjer for en vellykket indgivelse.
  3. Hvis deutereret protein er påkrævet (Se 2.2), understøttes neutron scattering faciliteter ofte af laboratorier og ekspertise dedikeret til produktion af deutereret materialer. For at anmode om adgang til Bio-Deuteration Lab (BDL) på ORNL, Vælg BDL som det andet instrument i forslaget system. Mens SANS forslag er gennemgået for gennemførligheden og af et udvalg, videnskabelig anmeldelse, er BDL anmodninger kun screenet for gennemførlighed. For at hjælpe med BDL feasibility anmeldelse, indsende en udfyldt oplysninger anmodning form48 der beskriver protein udtryk protokol og forventede udbytte (tilgængelig online).
  4. Efter vellykket ekspertgennemgang af stråle gang forslag, bekræfte den tildelte dato beam tid forud for forsøget. Sikre, at alle prøve og buffer detaljer og formler er angivet korrekt i forslag til korrekt anmeldelse. Eventuelle ændringer af den foreslåede eksperimentelle plan, herunder ændringer i prøven og buffer sammensætning, kræver anmeldelse af anlægget.
    Bemærk: Ændringer bør drøftes hurtigst muligt med det tildelte NSS.

2. Bestem Neutron kontrast matchpoint og nødvendige kontrast til Protein måling

  1. Indsamle oplysninger (fra leverandørens produktinformation, online databaser, publicerede værdier, osv.) vedrørende atomare kompositioner og diskenheder for vaskemiddel systemkomponenterne til at være kontrast-matchede. Disse oplysninger bruges til at bestemme neutron scattering længde tætheder (SLD'er) og dermed kontrast match point (Kystforvaltningsplaner) i løsning, som er kritiske for at opnå kvalitet SANS data og strukturelle oplysninger for membran protein af interesse i forbindelse med en PDC. En tabel sammenfatter de fysiske egenskaber og kontrast matchpoint for vaske-og rengøringsmidler, der almindeligvis anvendes i Biofysisk undersøgelser af membranproteiner er inkluderet (tabel 1).
  2. Bestemme neutron SLD'er ved hjælp af webprogrammet barkflis: moduler For The analyse af kontrast Variation Data49 (tilgængelig online50 -gratis). Et link til brugervejledningen ligger på hjemmesiden. Få adgang til hjemmesiden og læse de medfølgende dokumentation. Figur 1 og figur 2 giver et overblik over kontrast modul input og output for to relaterede eksempler.
    Bemærk: Andre hjemmesider til beregning af SLD'er er tilgængelige, som vedligeholdes af National Institute for standarder og teknologi (NIST) Center for Neutron forskningen. 51
    1. Åbne modulet kontrast ved at klikke på 'Kontrast' placeret i den venstre navigationsrude. Leverer tekst for en projekttitel og indtast oplysninger nedenfor for to komponenter (f.eks. vaske-og rengøringsmidler hoved gruppe og hale) som ' subunit 1' og ' subunit 2'.
    2. Angiv den molekylære formel for hver komponent i tekstboksen 'Formel'.
      Bemærk: radioknappen er ' skal være markeret under 'Stof Type' til at angive en Molekylær formel. Derudover bruge bogstavet "X" i formlen til at angive let udskiftelige brintatomer. Proteiner, RNA eller DNA sekvenser kan angives, hvis den tilsvarende 'P', 'R', eller havde ' radio knapper er valgt. Hvis flere kopier af en komponent findes i underenheden, kan værdien for 'Nmolecules' ændres i overensstemmelse hermed. Et praktisk eksempel her vedrører lipid-lignende rengøringsmidler der indeholder to identiske haler, så formlen for en hale skal opføres med Nmolecules lig med 2.
    3. Angiv volumen i cubic oxidlag for hver komponent i feltet under 'Volumen (Å3)'. Bruge Tanfords formel28 for alkyl kæder af længde n, Vhale = 27,4 + n * 26,9, til at beregne omtrentlige hale volumen, eller hente molekylære diskenheder fra produktinformation videregives eller offentliggøres værdierne i litteratur.
    4. Angiv detaljer for buffer komponenter. Ændre 'nummer opløst arter i opløsningsmidlet' ved hjælp af dropdown-menu til at tilføje eller fjerne rækker for hver komponent, buffer. For så vidt angår micelle-dannende rengøringsmidler, omfatter de gratis vaskemiddel monomerer som separate buffer komponenter i det vaskemiddel kritiske micelle koncentration (CMC).
    5. Klik på 'Send' for at udføre neutron kontrast beregninger og generere en resultatside, der indeholder en tabel af spredning længde densitet og kontrast matchpoint samt formler til bestemmelse af disse parametre til en given procentdel af D2O i bufferen. Gennemgå parametrene spredning med særlig vægt på komponent Kystforvaltningsplaner. Hvis match point er ens (indenfor 10% D2O) og gratis micelle koncentrationen er lav, så gennemsnitlige CMP kan være anvendes til kontrast-matche vaskemiddel bidrag. I de fleste tilfælde vil CMP vaskemiddel hoved gruppe og hale afvige mere end 10-15%, producerer en core-shell skema faktor i SANS data, som slører direkte indsamling af spredning signalet fra protein alene.
  3. Vurdere kontrasten mellem vaskemiddel hoved gruppe og hale. Når vaskemiddel hoved gruppe og alkyl kæde halen Kystforvaltningsplaner ikke er godt matchede, kan tilgængelighed og inkorporering af en deuterium-substitueret vaskemiddel tillade spredning længde tætheder af udvalgte komponenter at blive manipuleret. I de fleste tilfælde vil dette kræve, danner en blandet micelle gennem indarbejdelse af en identisk vaskemiddel med deuterium-substituerede alkyl kæder. Tilsætning af deuterium rejser spredning længde tæthed af kernen dannet af alkyl kæde haler. Det ønskede slutpunkt, i dette tilfælde er sådan, at hovedet gruppe shell CMP og alkyl kæde core CMP har omtrent samme værdier.
    1. Hæve CMP vaskemiddel micelle kerne at være omtrent svarer til CMP af hoved gruppe shell ved at bestemme den passende forhold blanding mellem h-haler og d-haler, der opnår komplet kontrast matchende med hoved grupper. En forudsætning for denne bestemmelse er viden om CMP for en deuterium-substituerede alkyl kæde hale. Et kommercielt tilgængelige modstykke til n-Dodecyl β-D-maltoside (Bettinas) er tilgængelig med alle alkyl kæde brint erstattes af deuterium (d25-Bettinas). Gentag kontrast beregninger skitseret i trin 2.1 for en havde-hale "i stedet for"h-hale".
    2. Beregne muldvarp forholdet mellem h-hale til d-hale kræves for kontrast-matching med gruppen hoved CMP. Følgende formel kan hjælpe med denne bestemmelse:
      CMPhoved = CMPh-hale * χh-hale + CMPd-hale * χd-hale
      hvor CMP er spredning længde tæthed og χ er volumenfraktion for komponenten vaskemiddel hoved, h-hale eller d-hale. Bufferet løsninger af Bettinas, inkorporering af 44% efter vægt (43% af muldvarp) af den samlede vaskemiddel som d25-Bettinas med deuterium-substituerede alkyl kæder producerer en enkelt CMP i 48,5% D2O for både hoved og hale komponenter.
  4. Overveje graden af deuterium substitution for membran protein. For at måle tilstrækkelig spredning signal fra protein, skal CMP for protein være mindst 15% D2O i løsning fra vaskemiddel CMP og målebetingelser. Signalet stiger med kvadratet på denne % forskel. Da CMP en umærket protein opstår typisk med ~ 42% D2O i løsning (en CMP svarer til mange vaskemiddel hoved grupper), er deuterium mærkning af protein næsten altid en nødvendighed. 52

3. express og rense membran Protein af interesse

  1. Forberede LB (lysogeny bouillon) medium og vokse Escherichia coli (E. coli) celler husly en inducerbar udtryk vektor for target protein sekvens.
    1. Forberede minimal medier. I enten H2O eller D2O, opløse 7,0 g/L (NH4)2så4, 5.25 g/L Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, 0,50 g/L diammoniumphosphat brint citrat, 5,0 g/L glycerol, 1,0 mL/L 20% w/v MgSO 4·7H2O og 1,0 mL/L af Holme trace metaller (0,50 g/L CaCl2·2H2O, 0.098 g/L CoCl2, 0.102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0.114 g/L MnSO4· H2O, 22.3 g/L Na2EDTA·2H2O og 0.112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Udarbejde passende antibiotika stamopløsninger bruger H2O eller D2O.
    3. Forberede en isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside stamopløsning bruger H2O eller D2O.
    4. Sterilt-filter alle løsninger til tørre, sterile beholdere ved hjælp af flaske-top vakuum og sprøjten filtre med en 0,22 micron porestørrelse.
  2. Tilpasse E. coli celler til deuterium-mærket medium før skala-up for overekspression af en deutereret protein.
    1. Podes 3 mL af LB medium med en isoleret koloni fra en Lysogeny bouillon (LB) agar plade eller celler fra en frossen glycerol bestand. Vokser celler ved 37 ° C i en rystende inkubator ved 250 omdrejninger i MINUTTET eller reducere temperaturen til 30 ° C eller derunder for at undgå tilgroning af kulturen, når inkubering natten over.
      Bemærk: Tilpasning procedure kan varieres. 55 , 56 , 57
    2. Når LB kultur er vokset til en optisk tæthed på 600 nm (OD600) ~ 1, fortyndes 1:20 i 3 mL H2O minimal medium og vokse til en OD600 ~ 1. Gentag 1:20 fortyndinger bruger minimal medium indeholdende 50, 75 og 100% D2O (eller op til den ønskede D2O procentsats).
      Bemærk: som D2O indhold er forhøjet, vækstraterne vil falde. Forholdet mellem D2O procent i vækst medier og deuterium substitution i proteinet er blevet rapporteret i litteraturen. 58 , 59 , 60
    3. Fortsat stigende kultur i en bioreaktor at øge udbyttet af deutereret cellemasse (figur 3).
      Bemærk: Trinvise procedurer for bioreaktor operation er blevet behandlet andetsteds. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Høst og lyse E. coli celler for membran udvinding og protein oprensning
    1. Sammenpresse cellerne ved centrifugering ved ~ 6.000 x g for ~ 30-45 min. ved 4 ° C.
    2. Blødgøre celle pellet ved opblødning i buffer på isen for ~ 30 min. Derefter forsigtigt resuspenderes celle i buffer af forsigtigt pipettering med en serologisk pipette, eller blid vuggende på en 2D rocker, til en slutkoncentration på ~ 1 g våd celle masse/10 mL buffer.
      Bemærk: et eksempel buffer er 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre), pH 7,5, 200 mM NaCl suppleret med en protease hæmmer tablet.
    3. Lyse resuspenderet celler med tre passerer gennem en højtryks homogeniseringsapparat på 10.000 psi mens køling udstrømningen.
      Bemærk: Afhængigt af skalaen kræves, kan andre lysis metoder være brugt (f.eks. af franske presse eller ultralydbehandling).
    4. Pellet celle debris ved centrifugering ved ~ 4.000-5.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Gentag dette trin, indtil supernatanten er afklaret.
    5. Ultracentrifuge (~ 150.000 x g for 30-45 min) supernatanten fra de forudgående trin, der indeholder den oploeselige og membran fraktioner. Pellet efter ultracentrifugering indeholder membran brøkdel.
    6. Resuspenderes membran i en stor Dounce homogeniseringsapparat og isolere membran brøkdel igen af ultracentrifugering (trin 3.3.5). Gentag dette trin mindst én gang for at fjerne løst bundet proteiner.
    7. Solubilize membraner af blid vuggende for ~ 30 min. ved 4 ° C i en buffer, som indeholder vaskemiddel egnet til rensning. Oploesning er tilsyneladende når suspensionen vender sig fra skyet til gennemsigtige. Fjerne uopløselige materiale af ultracentrifugering (~ 150.000 x g for 30-45 min).
      Bemærk: En eksempel buffer er 50 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol og 4% (w/v) Bettinas til rensning af Ni2 + affinitet kromatografi.
  4. Rense protein efter en protokol, der tidligere udviklet for protonated former.
    Bemærk: Se Naing et al. for en eksempel rensning protokol for en hexahistidine markeret M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl protease (d-MmIAP). 65 det endelige udbytte var ~ 1 mg deutereret fra 5 L deutereret celle kultur vækst, som blev brugt i SANS eksperiment (figur 4).
  5. Udveksle den renset protein i den "endelige Exchange Buffer" for kontrast matchende.
    1. Forberede 200 mL "Endelige Exchange buffer", som indeholder den korrekte for kontrast matching, fx20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl og 0,05% total Bettinas (0,028% Bettinas og 0,022% d25-Bettinas) i 49% D2O.
    2. Blandingen henstår en størrelse udstødelse kolonne med > 2 kolonne bind (CV) "Endelige Exchange buffer" i 3.5.1 ved hjælp af en hurtig Protein Liquid Chromatography (FPLC).
    3. Efter indsprøjtning prøven, køre kolonnen og isolere fraktioner svarende til protein af interesse.
    4. Koncentrere protein til den ønskede slutkoncentration (2-5 mg/mL).
      Bemærk: Et volumen på ~ 300 μL er forpligtet til at udfylde en 1 mm cylindrisk kvarts kuvette bruges til SANS.
    5. Reservere en alikvot af matchede buffer for SANS baggrund subtraktion.
      Bemærk: Alikvot kan tages direkte fra den forberedte buffer, eller ideelt set fra en ren eluering brøkdel i slutningen af FPLC opstille.

4. gør sidste forberedelser til bom tid og indsamle SANS Data

  1. Efter forslaget er blevet accepteret og websted adgang er blevet godkendt, komplet alle nødvendige træning forud for tildelte beam tid. Dette omfatter prearrival, web-baseret uddannelse samt on-site radiologiske, laboratorium, og instrument-specifik træning.
    Bemærk: Uddannelse krav kan diktere advance ankomst for første gang brugere. Flere oplysninger er tilgængelige online. 66
  2. Indlæse prøver og buffere for dataindsamling.
    Bemærk: En oversigt over biologiske small angle neutron scattering (Bio-SANS) instrument eksempelområde miljø er vist i figur 5.
    1. Indlæse prøver og buffere i kvarts celler. Quartz celler er tilgængelige fra instrument videnskabsmand eller facilitet. Bruge gel-loading tips til at få adgang til den smalle åbning af de fleste prøve celler.
    2. Sikre at stråle lukkeren er lukket, derefter tilgang miljø eksempelområde og placere kvarts celler i stikprøven skifteren. Post prøve skifter holdning til hver prøve celle.
    3. Kontrollere området og sikre strålegangen er fri for obstruktion, og derefter forlade området prøve miljøet og åbne beam lukkeren.
      Bemærk: Nøje følge alle facilitet regler og forordninger, adlyde alle posteringer, og lytte til råd af instrumentet scientist. Prøver kan ikke fjernes fra bjælken og manipuleres efter eksponering nærlys uden følgende særlige forholdsregler. Rådføre sig med en radiologisk kontrol tekniker (RCT) før disse procedurer.
  3. Udføre tabel scanning for automatiseret dataindsamling
    1. Betjene instrument gennem brugerdefineret kontrolelement LabVIEW-baseret software, spektrometer Instrument kontrolmiljø (krydderi). Følg instruktionerne for instrument drift af Neutron Scattering videnskabsmand. En oversigt i tabel scan operation windows gives i figur 6.
    2. Efter indtastning af oplysninger, der kræves i de relevante områder, udføre tabel scanning og en automatiseret data indsamling proces vil begynde. Overvåge fremskridt via fanen 'Tabel Skan Status'.

5. reducere SANS Data fra 2D-billede til 1D Plot

  1. Identificere hver stikprøve og buffer datafil fra registrerede scan numre. Hver måling vil blive tildelt en unik scanning antallet. Disse oplysninger er nyttige under data reduktion til at identificere hver tilsvarende prøve og buffer par.
  2. Brug MantidPlot software og Python script for reduktion
    1. Neutron spredning brugere leveres med kontooplysninger til at få adgang til deres data på den eksterne analyse klynge. 67 log den eksterne analyse klynge og udføre "MantidPlot" fra kommandolinjen. Figur 7 og figur 8 leveres til at bistå disse trin.
    2. Få en bruger reduktion skrift fra Neutron Scattering videnskabsmand (dette vil normalt ske under eksperimentet); Dette script er Python-baseret og vil indeholde alle de nødvendige kalibrering og skalering justeringer at reducere 2D spredning billedet til et 1D plot af spredte intensiteter som en funktion af scattering vinkel, I(Q).
    3. Åbner den angivne bruger reduktion skrift i MantidPlot og Placer tilsvarende scan numre eller identifikation for de buffer og prøve par i den relevante liste.
    4. Udfør script til at generere reduceret data som en fire-kolonne tekstfil (kolonnerækkefølgen er Q, I(Q), I(Q) fejl, Q fejl) på den angivne placering. Højreklik på den relevante arbejdsområde i MantidPlot og vælg "Plot med fejl..." for en indledende undersøgelse af spredning profiler.

6. analysere Data for strukturelle parametrene for spredning partikel

  1. Overføre datafilen reduceret fra analyseserver på en lokal computer ved hjælp af sikker FTP fil henlægge. Dette kan udføres med brug af software som FileZilla eller CyberDuck. Yderligere instruktioner og oplysninger til at oprette forbindelse til analysis server-filsystemet leveres på analysis.sns.gov login side.
  2. Download ATSAS software suite65,68 (hele ATSAS suite). 69 individuelle programmer70 er også tilgængelige online til at analysere SANS data, nemlig fastlæggelse af strukturelle parametre og ab initio modeller.
    Bemærk: Der findes mange muligheder for SANS dataanalyse af biomacromolecules. 45
  3. Bruge PRIMUS71 for data plotte, buffer skalering og subtraktion og Guinier analyse.
    1. Lancere ATSAS 'SAS Data Analysis' ansøgning og belastning reduceret data filer svarende til prøve og buffer parret.
      1. Du kan skalere bufferen, der korrekt, skal du vælge et dataområde på high Q (Q > 0,5 Å-1) hvor begge profiler er lignende og flad, og klik på knappen 'Skala' under 'Handlinger' fanen. En skala faktor vil blive anvendt til bufferen, sådan, at disse to flade regioner skal overlappe hinanden. Forsigtig: der bør være en plausibel fysisk grund, der berettiger til skalering buffer intensiteten for at svarer til eksemplet. Hvis forskellen er stor, konsultere en instrumentet scientist for gyldig tilgange til baggrunden subtraktion. 44 , 45 , 72
      2. Øge dataområde for at se alle punkter. Klik på Subtraher for at udføre denne handling. Højreklik på den buffer-trækkes datafile i forklaringen og gemme denne fil til efterfølgende analyse. Figur 9 beskriver brugen af fanen 'Handlinger'.
    2. Udfør en Guinier analyse af buffer-trækkes eksempeldataene ved hjælp af fanen 'Analyse' af programmet 'SAS dataanalyse'.
      1. Sørg for den rigtige fil er markeret på listen og klikke på 'Radius af Gyration'. En automatiseret forsøg på at udføre en Guinier passer udleveres ved at klikke på knappen 'Autorg'.
      2. Udvide viften af data bruges til at omfatte alle lav-Q data og begynde at indsnævre dataområdet ved at tage væk high-Q point indtil Qmaks * Rg grænse ligger under 1,3. Brug af restprodukter til at kontrollere, at data er lineær i rækken fit. Guinier fit giver en omtrentlig Rg og jeg0 for spredning partikler.
      3. Foretage små justeringer til regionen fit og overvåge følsomheden af disse værdier til rækken af data, der bruges i pasformen. Figur 10A viser brugen af værktøjet 'Radius af Gyration'.
  4. Hente funktionen sandsynlighedsfordeling (P(r)) i Elementarånder. 73 outputfilen genereres her skal bruges som input til den ab initio modellering proces.
    1. Start guiden afstand fordeling inden for den 'Analyse' tab. at opnå en god pasform til data er afgørende for at opnå en kvalitet model. For mere information om at opnå nøjagtig passer, se venligst anmeldelse74 af Putnam, et al.
      Bemærk: The Elementarånder program giver yderligere oplysninger om pasform guiden afstand Distribution. Figur 10B viser korrekt brug af værktøjet «Afstand Distribution», og Figur 11 illustrerer nogle af de fælles fejl.
    2. Bestemme Dmax, den maksimale interatomare afstand i molekylet.
      1. Anslå en værdi for Dmax ved at fjerne markeringen i boksen for at tvinge Rmax = 0 og indtaste en stor værdi for Dmax (150 Å, for eksempel). Det første x-skæringspunktet i plot af P(r) udbytter dette skøn.
      2. Foretage trinvise ændringer til denne Dmax værdi og vifte af data, der anvendes eller antallet af punkter anvendes i fit til at optimere Elementarånder passer til dataene og den resulterende P(r) kurve.
    3. Fortsat Præciser Elementarånder pasform og gemme Elementarånder outputfiler med god pasform parametre for efterfølgende ab initio modellering trin.
  5. Simulere SANS profiler fra høj opløsning FBF modeller ved hjælp af programmet CRYSON. 75
    1. Åbne programmet og vælge indstillingen '0'. Vælg filnavn FBF i popup-Filbrowser. Tryk på enter for at acceptere standardindstillingerne, undtagen angiver kæde deuteration brøker og brøkdel af D2O i at opnå ordentlig kontrast parametre.
    2. Passe til model til en eksperimentelle datasæt ved at angive 'Y' og vælge datafil, der bruges i popup-Filbrowser. Acceptere de resterende standardværdier, og output-filer vil blive skrevet i FBF filplacering. Filen '.fit' indeholder oplysninger om den forventede spredning profil fra høj opløsning 3D-modellen.

7. Opret Ab Initio modeller fra den SANS Data.

Bemærk: DAMMIF76 og DAMMIN77 inden for ATSAS software suite er bruges til at rekonstruere dummy atom modeller (dæmninger) ved hjælp af en Simuleret udglødning proces fra Elementarånder output, som indeholder P(r) data eller oplysninger om sandsynligheden eller hyppigheden af interatomare afstande inden for spredning partikel. Disse programmer kan køres i batchtilstand eller på ATSAS-Online web-serveren.

  1. Start guiden PRIMUS figur fra knappen 'Dammif' under fanen 'Analyse' af 'SAS Data Analysis', og brug en manuel udvælgelse af parametre. Input til guiden er illustreret i figur 12.
    1. Definer Guinier interval fra fit (trin 6.3.2) og Fortsæt til næste trin ved hjælp af navigationsknapper. Definere fit værdier fra P(r) plot (trin 6.4) og Fortsæt til næste trin.
    2. Angive parametre for den ab initio modellering proces. Angiv et præfiks for model output filnavne (f.eks. SANSEnvelope), vælge enten 'hurtig' eller 'langsom' mode modellering, indtaste en værdi for antallet af modeller (17 anbefales for Statistisk signifikans), Vælg valgmuligheder for partikel symmetri, anisometry og kantede skala (hvis kendt). Sikre at boksene kontrolleres til gennemsnitlige modeller med DAMAVER og forfine den endelige model med DAMMIN.
    3. Indlede processen ved hjælp af knappen "Udfør". Når processen er fuldført, se og gemme arbejdsmappen.
      Bemærk: den typiske modelleringsprocessen for en enkelt, lille protein kan tage op til et par timer med en typisk personlig computer. Filer gemmes i midlertidige mapper indtil gemt.
  2. Overlay og oven på endelige SANS kuvert med relaterede høj opløsning model ved hjælp af SUPCOMB inden for ATSAS. Placer en kopi af den høje opløsning FBF model at være egnet til SANS konvolutten i arbejdsmappen. Udføre SUPCOMB fra kommandolinjen ved hjælp af FBF filnavne som to argumenter med strukturen skabelon vises først: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Bemærk: Anden filnavnet angivet vil blive omskrevet som en ny fil med et "r" er føjet til de ende og at have nye koordinater til overlejring på skabelon struktur.
  3. Visualisere de ab initio modelresultater ved brug af PyMOL (pymol.org), en set-program, 3D Molekylær grafik. Figur 13 giver et overblik over PyMOL operationer.
    Bemærk: Der er offentliggjort retningslinjer for strukturel modellering af små-vinkel spredning data fra biomolekyler i løsning. 78
    1. Starte programmet PyMOL og åbne filerne .pdb svarende til 3D SANS kuvert og SUPCOMB alliancefrie kodebaseret struktur skal ses.
    2. Visualisere SANS kuvert ved at repræsentere denne model som en overflade. Klik på 's ' knappen ved siden af den model og vælg ' Vis: som: overfladen '.
    3. Visualisere høj opløsning protein rygraden struktur ved at repræsentere denne model som en tegneserie. Vælg den ' knappen ved siden af denne model og vælg ' Vis: som: tegneserie '. Vise kæden som en regnbue fra N - til C-terminus ved at vælge knappen 'C' og ' af kæden: Chainbows'.
    4. Ændre gennemsigtigheden af den overflade repræsentation for klarhed. Menulinjen 'Indstilling' Vælg ' gennemsigtighed» overflade» 40% '.
    5. Gøre baggrunden hvid og ikke-uigennemsigtig. Vælg menulinjen 'Skærm'» baggrund»' og vælg 'Opaque' til at fjerne markeringen af denne indstilling og 'Hvid' for at markere denne farve til baggrunden.
      Bemærk: yderligere operationer og anvendelser for PyMOL kan findes på PyMolWiki.org.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En stråle tid og instrument forslag bør klart viderebringe alle oplysninger, der kræves til anmeldelse udvalget, så en gyldig vurdering af den foreslåede eksperiment kan foretages. Kommunikation med en NSS er meget foreslået for uerfarne brugere. NSS kan vurdere indledende feasibility og guide forslag forelægges understrege gennemførlighed, sikkerhed og potentialet for high-impact videnskab. Oplysningerne i forslaget bør omfatte baggrundsinformation og konteksten for betydningen af forskning; viden, der forventes at blive opnået og hvordan dette påvirker den aktuelle forståelse i det relaterede felt af videnskab; en beskrivelse af arbejde, prøver, metoder og procedurer, der vil blive ansat; og, hvis relevant, tidligere produktivitet af teamet på deponeringsanlægget, inklusive relevante publikationer og resultater. Nyttige ressourcer, som forslaget skabeloner og tip til forberedelse af forslag, er tilgængelige for brugere via Neutron videnskab User Portal (neutrons.ornl.gov/users).

Eksperiment planlægning er en dynamisk proces, der ofte begynder i de indledende faser af forslag indsendelse, men kan ikke fuldt udtænkt indtil lige før eksperimentet. Men husk på, at eventuelle ændringer, der afviger betydeligt fra beskrivelsen i forslaget (herunder ændringer buffer betingelser eller prøve sammensætning) skal godkendes af anlægget forud for starten af forsøget.

Denne protokol antager, at en metode til at udtrykke og rensende membran protein af interesse i vaske-og rengøringsmidler micelles i løsning er påvist med succes. I dette tilfælde er membran protein af interesse en intramembrane aspartyl protease (IAP), som har en etableret rensning protokol og har været tidligere fast besluttet på at blive opløseligt og aktive i buffer indeholdende Bettinas micelles.

Her, vi vise neutron kontrast beregninger ved hjælp af barkflis: kontrast modul for en løsning af IAP protein i kontrast-matchede blandet Bettinas / d25-Bettinas micelles. Den strategi, der skitseres heri skulle først bestemme graden af blanding mellem de to vaskemidler nødvendigt at opnå en fuldstændig kontrast kamp i micelle. Slutresultatet var at bestemme den relative kontrast af hver komponent og baggrunden (H2O/D2O ratio) nødvendigt at kontrast-match spredning fra vaskemiddel for at observere kun protein spredning.

Figur 1 viser et korrekt input til modulet barkflis kontrast og det resulterende output for kontrast beregninger af Bettinas vaskemiddel hoved gruppe og hale som underenheder 1 og 2, henholdsvis. Formlen bruges til gruppen hoved er C12H14X7O11 med et volumen på 348 Å3og alkyl kæde hale formel er givet som C12H25 med et volumen på 350 Å3.

Det fremgår af kontrast modul output, Bettinas hoved gruppe og hale har forskellige spredning længde tætheder, og dermed kontrast mellem de to komponenter vil blive observeret. For Bettinas har hoved grupper en CMP i 49% D2O mens alkyl kæde haler har en CMP i 2% D2O, med deres gennemsnitlige CMP forekommer i 22% D2O. Formålet med det næste skridt bliver derfor at designe en blandet micelle, der inkorporerer deuterium-substituerede alkyl kæder for at øge den gennemsnitlige CMP af vaskemiddel haler til at matche CMP hoved grupper. Kontrast beregningen blev gentaget for en substitueret vaskemiddel, Bettinas med en fuldt deutereret hale (d25-Bettinas), som ligeledes resulterer i modsætning mellem hoved gruppe og hale. Men til gengæld værdier af h-haler og d-haler er væsentligt anderledes. Recall, at vaskemiddel blandinger er kendt for at producere godt blandet micelles i løsning,22 således en blanding af disse h og d-haler i micelle core skal producere en gennemsnitlig SLD lig med hovedet gruppe shell, giver en micelle med enkelt CMP. Da gruppen hoved er fælles for både Bettinas og d25-Bettinas, er strategien at finde en blanding af disse rengøringsmidler, der producerer en gennemsnitlig kontrast værdi fra den blandede haler, der matcher kontrast af grupperne hoved.

Target gennemsnittet CMP vaskemiddel haler er maltoside hoved grupper eller 49% D2O. For at anslå forholdet mellem blande den gennemsnitlige CMP af hver h-hale og d-hale komponent skal være kendt. Disse værdier for nogle almindelige vaskemidler og kommercielt tilgængelige deuterium mærket modparter er givet i tabel 1. Brug disse CMP værdier for Bettinas og d25-Bettinas, muldvarp brøkdel af h-haler og d-haler, der opfylder ligningen i trin 2.2 er χd-haler = 0,43.

Figur 2 viser en mere avanceret input til modulet barkflis kontrast, der kan bruges til at bekræfte de endelige blandet micelle kontrast match betingelser og bestemme graden af deuteration nødvendige på protein. Her, refererer subunit 1 til den kontrast-matchede blandet micelle med 2 komponenter, Bettinas og d25-Bettinas, mens subunit 2 henviser til M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl protease (MmIAP) i betragtning af dens aminosyresekvens. SLD af protein er blevet forhøjet af udtryk i deutereret vækst medier til at give en CMP for protein i buffer indeholdende ~ 92% D2O. Graden af adskillelse mellem protein's matchbold i 92% D2O og måling tilstand (48,5% D2O) tyder på, at tilstrækkelig spredning signal vil være opnået fra protein.

Produktion af d-MmIAP blev udført med Rosetta 2 E. coli celler husly på pET22b MmIAP vektor. Minimal medium med umærkede glycerol i 90% D2O blev valgt som vækstmediet. Efter tilpasning til 90% D2O minimal medium, kultur volumen var skaleres op til 400 mL og bruges til podes 3.6 L af frisk 90% D2O minimal medium i en 5,5 L bioreaktor fartøj.

Figur 3 giver et spor af processen værdier under fed-batch dyrkning. På tidspunktet for podning, temperatur setpunkt var 30 ° C, opløst ilt () sætpunkt var 100%, agitation sætpunkt var 200 rpm og strømningshastigheden af komprimeret luft var 4 L/min. PH blev afholdt over et sæt punkt 6.9 ved hjælp af en 10% w/v opløsning af natriumhydroxid i 90% D2O. Når spike signaleres nedbrydningen af den oprindelige 5 g/L glycerol, fodring (30% w/v glycerol, 0,2% MgSO4 i 90% D2O) blev indledt, som fortsatte under hele dyrkning. Efter omkring 7 timer efter fodring, kultur temperatur blev reduceret til 18 ° C og isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside blev tilføjet til en endelig koncentration på 1 mM. Efter høst af kultur, var ca 145 g vådvægt celle pasta indsamlet via centrifugering (6.000 x g for 45 min)

Rensning af d-MmIAP fortsatte med hensyn til protonated enzymet, bortset fra at enzymet udbytte var betydeligt lavere og endelige renhed var noget lavere end typiske. Fra 5 L, ~ 20 g af våde membraner var isoleret, som alle var oploeses i Bettinas for rensning og læsset på første Ni2 + affinitet kolonne. For at maksimere rensning udbytte, blev gennemstrømnings-fraktion fortyndet og igen køre på Ni2 + affinitet kolonne. Proceduren blev gentaget en tredje gang før polering eksemplet koncentreret d-MmIAP af størrelse udstødelse kromatografi (figur 4).

Figur 5 viser et quartz prøve celle og dens relaterede eksempelopsætning changer. Prøven miljøer forvaltes af Bio-SANS operationer team og NSS. En række forskellige miljøer kan arrangeres at udføre målinger med temperaturkontrol, fugtstyring, mekanisk tumbling, høj temperatur og vedvarende pres, blandt andre.

Figur 6 viser Bio-SANS operationer og udførelse af tabellen automatiserede scanninger. Tabel scanningen er konfigureret til at være intuitiv og brugervenlig. På den første fane (belastning prøver), er oplysninger om prøven changer og opsætning, som identifikation af prøver på hver position i stikprøven changer, celle tykkelser og prøvetypen (åben stråle, prøve, baggrund, osv.). Ekstra metadata tags kan også blive anvendt her. På det næste faneblad (planlægger eksperiment), er instrument konfiguration og eventuelle tilknyttede parametre (f.eks. temperaturkontrol) defineret. Dette trin er arrangeret af NSS i begyndelsen af eksperimentet. Brugeren skal simpelthen input måling gange for hver prøve (i sekunder). Den endelige tab (udføre scanninger) indeholder en oversigt over scan tabeldata og giver mulighed for automatiseret scanning til at blive henrettet.

Efter 2D spredning billeder registreres, skal disse data reduceres til et 1D plot af intensitet versus Q - en funktion af scattering vinkel. Under data reduktion anvendes billede korrektioner som pixel følsomhed masker og mørk baggrund fradrag også. MantidPlot software var designet til at fortolke de rå Bio-SANS instrument data. NSS vil normalt hjælpe med at reducere og henter de endelige data i slutningen af forsøget.

Figur 7 indeholder en oversigt over den eksterne analyse klynge adgang til MantidPlot og vinduet skrift anvendes til reduktion af data. RAW-data er tilgængelige på remote analyse-klynge (analysis.sns.gov) via UCAMS/XCAMS brugergodkendelse. Efter journaliserer i den sen desktop, kan MantidPlot software startes fra en terminal rude af blot udfører 'MantidPlot' under nogen sti. Åbn vinduet Script i MantidPlot og redigere scriptet bruger reduktion som anvist af NSS. Udførelse af dette script vil generere de reducerede datafiler, som derefter kan overføres til en lokal maskine til analyse ved hjælp af secure FTP.

Figur 8 viser plotte og visning af data efter udførelse bruger Script. reduceres dataene vises i vinduet arbejdsområder. Som standard vil endelige flettede data har endelsen _f vedlagt. Højreklik vil tillade Plot spektrum med fejl skal udvælges og data, der skal afbildes. Display-indstillinger er tilgængelige ved at vælge indstillinger fra 'Se på' menu bar. Formatering af akser og plotning range er let tilgængelige ved at dobbeltklikke på akserne. Spredning profiler af buffere, som indeholder ingen spredning partikler af betydelig størrelse bør fremstå som en forholdsvis flad kurve (konstant intensitet). For prøver bemærkes intensitet på lavere spredning vinkler (Q) med eksponentiel henfald til en flad usammenhængende baggrund.

Figur 9 oversigt over korrekt buffer subtraktion ved hjælp af SAS dataanalyse (eller primusqt) softwarepakken efter data reduktion. Ganske ofte er usammenhængende baggrunden (intensitet på high-Q) lidt uoverensstemmelser mellem prøve og buffer. For korrekt subtraktion, bør data i denne region overlapper. Skala rettelse gælder en intensitet skala faktor for data, hvilket resulterer i overlappende data, og subtraktion kan udføres. Hvis skalafaktoren resulterer i buffer datapunkter med større intensitet end tilsvarende punkter i stikprøven, vil disse punkter være negative og ikke gengives i en log plot. Hvis negative værdier i filen buffer-trækkes er rigelige, gøre en mindre reduktion i buffer skala faktor og udføre subtraktion igen.

Figur 10 giver eksempel kutymer af Primus Guinier og afstand Distribution guider. En Guinier analyse giver et foreløbigt skøn over partikler radius af gyration fra lav-vinkel spredning data. Data nærmer nul, bør en lineær region være til stede i dataene. Montering af en linie i denne region giver Rg skal fastsættes fra hældningen og en0 til ekstrapoleres fra intensitet skæringspunkt på Q = 0. En opadgående tendens i data angiver som Q nærmer sig nul sammenlægning i stikprøven, mens nedadgående tendenser er normalt vejledende af interparticle frastødninger. Disse tendenser er tydeligst, når fordelingen af residualer er ikke-stokastiske. Den øvre grænse for Guinier egnet til kugleformede partikler er begrænset af Q * Rg < 1.3 ('s' bruges i stedet for Q i ATSAS software).

Rg bestemmes for d-MmIAP fra denne Guinier fit var 15,4 ± 1.1 Å med en anslået jeg0 givet som 0.580 ± 0,001.

Guiden afstand distribution giver mulighed for systematiske ændringer skal foretages parametre af P(r) passer. P(r) kurve er en indirekte Fouriertransformation af kurven passer til eksperimentelle data. Derfor er det vigtigt at kontrollere, at pasform i venstre panel præcist afspejler den eksperimentelle data. For det passer vist i dette eksempel, en Dmax 46 Å blev opnået.

Figur 11 viser almindelige fejl i Dmax udvalg. En Dmax, der er kunstigt store ofte forårsager P(r) værdier til at blive negativ, som funktionen P(r) svinger omkring x-aksen. En Dmax, der er kunstigt lille fører til en afkortet P(r) kurve med en brat overgang til Rmax = 0.

De første trin i guiden Primus form er identisk med Guinier og afstand Distribution guider. Når disse oplysninger er fremlagt til at opnå god passer til eksperimentelle data er ab initio model opsætningen konfigureret.

Figur 12 viser en ordentlig input til guiden Primus form. Her, eksperimentelle SANS data for IAP var forsynet med en skala i oxidlag, og præfikset forventede fil af "SANSEnvelope" blev givet. Et sæt af 17 indledende dummy atom modeller blev anmodet om at blive genereret ved hjælp af "hurtige" model tilstand med ingen symmetri (P1) anvendes og ingen anisometry valgt. Sæt af 17 modeller bliver justeret, gennemsnit og filtreret med DAMAVER, og den gennemsnitlige model raffineret ved hjælp af DAMMIN. Inspektion af præfiks-damsel.log tekstdokument indeholder en oversigt over udvælgelseskriterium og nogen modeller kasseret fra sættet. Den endelige raffinerede model blev skrevet som SANSEnvelope-1.pdb.

Programmet SUPCOMB bruges til at udføre en overlejring af SANS kuvert model med høj opløsning model, med kun de to FBF struktur filer som input. Som standard tilføjes "r" omlagt og overlejret filnavnet.

Endnu en SANS kuvert og høj opløsning struktur har været overlejret, disse modeller kan visualiseres ved hjælp af Molekylær grafik visning af program. Resultater fra PyMOL er egnet til offentliggørelse kvalitetsbilleder og kan bruges til at fremhæve biofysiske resultater vedrørende den strukturelle undersøgelse. Her viser vi et par grundlæggende PyMOL operationer bruges til at give 3D repræsentationer og udsigt over de resulterende overlejrede strukturer.

Figur 13 indeholder en oversigt over PyMOL visualisering proces. Når filerne FBF struktur har været åbnet i PyMOL, skal modellerne være synlig i PyMOL Fremviserens vindue. Ændre repræsentationer af hver model med 's ' knappen ved siden af hver filnavn. Bruge en overflade repræsentation for SANS kuvert og en tegneserie repræsentation af protein rygraden fra modellen med høj opløsning. Vælg en passende farve ordningen fra indstillingerne under knappen 'C'. For proteinkæder giver en "chainbow" farve et farveforløb fra N - til C-terminus støtte fortolkning. Gennemsigtighed er anvendt overflade repræsentation at tillade bedre visualisering af protein struktur inden for konvolutten. Publikation billeder anbefales en hvid baggrund. Når disse visualisering køer har været anvendt, kan de 3D strukturer undersøges. Manipulationer af perspektiv og molekyle rotation/oversættelse kan udføres ved at klikke på og trække strukturen.

Figure 1
Figur 1. Brug af modulet barkflis kontrast til at bestemme kontrast parametre for komponenter af dodecyl maltoside (Bettinas). Input værdier er vist i skærmbilledet til venstre med den efterfølgende output til højre. Kontrast modul input siden åbnes ved at klikke på 'Kontrast' (grøn cirkel) fra navigationsmenuen i venstre side på hver skærm. Indlagringsområder for projektets titel, buffer komponenter og underenheder 1 og 2 er mærket som sådan. Output sider indeholder vigtige partikel oplysninger og kontrast egenskaber for den beskrevne system. Relevante tabeller og beregnede matchpoint har været boxed i orange for klarhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Brug af modulet barkflis kontrast til at bestemme kontrast parametre for komponenter af membran protein-vaskemiddel kompleks. I dette tilfælde fået input til at beskrive den overordnede PDC system i bufferopløsning. Subunit 1 beskriver kontrast-matchede blandet micelle sammensat af Bettinas med 43% af muldvarp som d25-Bettinas. Subunit 2 beskriver membran proteiner med aminosyresekvens for MmIAP input som formlen. Deuteration niveau (grøn cirkel) beskriver det protein graden af deuterium substitution, og har en direkte indvirkning på den SLD og beregnede matchbold, der vil være anslået for protein. Resultater (orange boks) anføres at matchbold for blandet vaskemiddel vil forekomme i 48,5% D2O, mens det protein matchbold opstår på ~ 90% D2O. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Forberedelse af prøver – bioreaktor spor. Proces værdierne vises er temperatur setpunkt (orange linie), opløst ilt () sætpunkt (blå linje), agitation setpunkt (rød linje) og trykluft strømningshastighed (lyserøde linje). Pumpe 1 (grøn linje) blev brugt til pH kontrol. Spike på 18:40 signaleres nedbrydningen af den oprindelige glycerol og blev brugt til at indlede fodring af glycerol løsning via pumpe 2 (sort streg). X-aksen betegner timer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Prøve forberedelse – FPLC og SDS-PAGE karakterisering af prøven. Endelige størrelse udstødelse kromatogram til d- MmIAP ekvilibreres med 20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl, 48,5% D2O og 0,05% total Bettinas, hvoraf 44% (w/v) er hale-deutereret d25-Bettinas. Indsatser: SDS-PAGE analyse med Coomassie farvning. Poolede fraktioner er mærket A, B, og C. Region "B" blev brugt i SANS eksperiment. Kommenteret molekylvægt markør er i kDa. Billedet er gengivet med tilladelse fra Naing et al. 65 Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5. Dataindsamling-kvarts banjo prøve celle og autosampler setup. (A) en tom kvarts banjo celle er vist hvilende mod autosampler blok. Celler er fyldt med prøven og indsættes i en af de 15 tilgængelige positioner. (B) prøve blok er monteret bag en blænde selector (ikke vist) mellem bom Tube Extender og silicium vindue ved indgangen til detektor tank. Slanger tilsluttes en temperatur-kontrolleret vandbad og kanaler i hele prøven blok give temperaturregulering på prøve holdninger. Pilen angiver retningen af neutron stråle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Indsamling af data – oversigt over SPICE operationer og tabel scanning. Tabel scan operationer er tilgængelige fra knappen "Tabel Scan" på menuen længst til venstre af SPICE instrument kontrol software. Grønne pile betegne den aktive fane øverst på skærmen og orange kasser fremhæve områder i tabellen for aktiv bruger input. (A) den første fane i tabel scanning bruges til at give oplysninger om prøven changer og prøve celle positioner. Give etiketter, udsnit tykkelser og prøve former for hver position, der anvendes i prøven skifteren. Kontrol boksen 'Gøre Scan' vil tilføje den tilsvarende række til tabellen scan kø. (B) på fanen andet detaljer om instrument konfiguration og måling tid for hver prøve (i sekunder) er registreret. Instrument konfigurationer er forudkonfigureret af Neutron Scattering videnskabsmand og leveres til brugerne baseret på oplysninger i bom tid og instrument forslag. Yderligere parametre kan tilføjes instrument kontrol, såsom evnen til at definere temperatur sætpunkter og holde gange i hele måling køen. (C) den endelige tab giver et overblik over målinger skal foretages for hver række i tabellen. Hvis ingen ændringer er nødvendige, indledte den automatiske scanning ved at klikke på knappen 'Udføre scanner'. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Data reduktion – oversigt over reduktion af script og MantidPlot operationer. MantidPlot software er tilgængelig i analyse klyngen ved at skrive "mantidplot" i en terminal kommando prompt på enhver active directory (gul cirkel og pil er tilføjet for vægt). Når softwaren åbnes, få adgang til vinduet script (slås af knap markeret med grønt) og åbne script leveres af Neutron Scattering videnskabsmand. Følg vejledningen i det script, som bør kun kræve scan tallene for hver stikprøve og buffer opføres på en liste for automatiseret reduktion samt Skan numre for den tomme celle for subtraktion og tomme bom for transmission og stråle Center bestemmelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8. Dataanalyse – Plotting af data ved hjælp af MantidPlot. Data er refereres til som "Arbejdsområder" i MantidPlot. Området arbejdsområde vil befolket med filnavne, som produceres af scriptet bruger reduktion. Arbejdsområdedata for 1D-datasæt kan afbildes ved at højreklikke på arbejdsområdet og vælge "Plot spektrum med fejl...". Yderligere data kan føjes til den aktuelle plot ved blot at trække og slippe arbejdsområder. Formatering af plot vindue (f.eks. log-log parceller) kan udføres ved at vælge 'Indstillinger' fra 'Se på' menu bar, eller dobbeltklik på akseetiketterne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9. Dataanalyse – ATSAS softwaren: grundlæggende operationer og buffer subtraktion. Primusqt-programmet (SAS dataanalyse) indeholder visualisering for ordentlig baggrund (buffer) subtraktion. Buffer-filen skal skaleres for subtraktion således at data overlapper på high-Q, (hvor spredning er flad som et resultat af resterende signal fra usammenhængende baggrund). Når denne high-Q dataområde er markeret, gælder handlingen skala en skaleringsfaktor lavere datafilen i den tabel, der producerer overlapning i det definerede område. Efter skalering, kan filen buffer trækkes for at give profilen netto spredning af partiklen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10. Dataanalyse – Guinier og P(r) (afstand distribution) bestemmelse. (A) Primus Guinier guiden bruges til at udføre en analyse af Guinier, giver et første skøn over jeg0 og Rg. Partikel type og vifte af data til at passe bruges til at definere fit. Et plot af pasform og tilsvarende residualer er vist til venstre, mens Guinier vilkår (jeg0 og Rg), Q * Rg grænser, og kvaliteten af lineære fit leveres som output i området præget af den orange boks. (B) Primus afstand Distribution guiden er bruges til at udføre afstand distribution analyse, at give P(r) kurven, som definerer sandsynligheden for interatomare afstande inden for spredning partikel og omfatter Dmax eller maksimalt interatomare afstand. Parametrene angivet med den orange boks kan undersøges systematisk for at bestemme en passende afstand distribution funktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11. Forkert resultater fra afstand distribution analyse. En korrekt valgt Dmax skal producere en P(r) kurve, der topper med en gradvis forfald til nul. DMax-værdier, der er for stor vil sandsynligvis producere negative P(r) værdier eller svingninger i nærheden af x-aksen på høje værdier af r. Dmax værdier, der er kunstigt små ofte resultere i P(r) kurver, hvor den øvre grænse vises afkortet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12. Modellering – Ab initio model opsætning ved hjælp af guiden Primus figur. Ab initio modellering parametre findes i en enkelt indtastningsvinduet. Et præfiks er leveret til output filnavne med andre muligheder for behandling af tilgængelige. Udglødning procedure kan være fast (større perler med hurtigere køling) eller langsom (mindre perler med langsommere køling). Antallet af gentagelser skal være af tilstrækkelig størrelse til at undersøge reproducerbarhed af model funktioner. Partikel symmetri og anisometry kan være fastsat, hvis kendt. Kantede skala bør svare til enhederne, de målte data. DAMAVER gennemsnit vil justere og gennemsnitlig alle dummy atom modeller, og anvend derefter et udvælgelseskriterium, som udelukker enhver outlier modeller. En kerne af faste atomer fra den gennemsnit model vil blive yderligere raffineres ved hjælp af DAMMIN, hvis denne indstilling er valgt. Dette raffineret model bør repræsentere 3D lav opløsning kuvert af den eksperimentelle SANS profil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13. Visualisering – eksperimenterende SANS kuvert og overlay med høj opløsning model ved brug af PyMOL. Efter åbning af filerne med FBF struktur i PyMOL, vises modeller i PyMOL Viewer. Aktive modeller er angivet i tabellen til højre, sammen med handlingsknapperne, som kan bruges til at manipulere modellen og dens repræsentation. Grundlæggende operationer er fastsat til at visualisere disse modeller, som giver mulighed for regioner i aftalen (eller uoverensstemmelse) mellem SANS kuvert og høj opløsning struktur kan identificeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1. Fysiske egenskaber af vaske-og rengøringsmidler, der almindeligvis anvendes i membranen protein undersøgelser. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Strukturel biologi forskere drage fordel af supplerende strukturelle teknikker som løsning spredning til atkræve biomolekyler i løsning biokemiske og strukturelle detaljer (såsom samlede størrelse og form). SANS er et særligt attraktivt teknik til bestemmelse af lav opløsning strukturer af membranproteiner, en kerne fokus på moderne strukturel biologi og biokemi. SANS kræver mængder af rensede proteiner sammenlignes med krystallografiske forsøg (1 mg/prøve). Høj renhed deutereret rengøringsmidler relevante membran protein undersøgelser for nylig ekspanderende kommerciel tilgængelighed gør tilgængelige et middel til at manipulere denne brint/deuterium indhold for SANS eksperimenter af membran protein-vaskemiddel komplekser, så protein signalet registreres direkte. Når det lykkes, kan en ab initio model molekylære konvolut beregnes ud fra data indsamlet over bare flere timer. Således kan membran protein biokemikere, biophysicists og strukturelle biologer let drage fordel af SANS at opnå eftertragtede første 3D modeller af membranproteiner i opløsning, strukturer i kompleks med bindende partnere eller substrater og modeller opnået af SANS kan bruges til udfasning diffraktion data. Rutinemæssig brug af SANS at karakterisere Membranproteiner ville være transformative for feltet membran protein biokemi og have ripple effekter fra grundlæggende struktur funktion til narkotikamisbrug opdagelse og udvikling. Den ekstra fordel af neutron kontrast matchende med deuterium substitution gør SANS en værdifuld teknik til at studere protein-protein, protein-DNA eller andre Biomolekylær komplekser, som let kan manipuleres i deres brint/deuterium indhold.

For yderligere detaljer om lille-vinkel spredning instrument design og teori, følgende anmeldelser anbefales: Bio-SANS instrument ved høj Flux isotop reaktor af Oak Ridge National Laboratory,79 små-vinkel spredning til strukturel biologi – udvide grænsen samtidig undgå de faldgruber,72 og små-vinkel spredning studier af biologiske makromolekyler i løsning. 80 the Neutron Scattering videnskabsmand kan også drøfte aktuelle instrument konfigurationer og de optimale parametre for et givet system. Data på lavere Q, (som er en funktion af scattering vinkel og neutron bølgelængde) ønskes eksempelvis generelt til større systemer. Den mest almindelige instrument konfiguration på Bio-SANS giver en Qmin af 0,003 Å-1 og er velegnet til større proteinkomplekser op til hundredvis af kDa. En opløsning indeholdende ~ 3 mg mL-1 membran protein af omtrentlige størrelse af 30 kDa (monomer) i kontrast-matchede micelles med 48,5% D2O i løsning kræver en typisk måleperioden omkring 8 timer for prøven, buffer og tom celle (24 timer = 1 dag samlede). Instrument måling gange på en given kontrast tilstand kan skaleres ca ifølge produktet af spredning partikel molekylmasse og koncentration. Dog skal spredning partikler måles under ikke-interagere betingelser, herunder eventuelle ikke-specifik protein sammenlægning, som lægger en praktisk øvre grænse på koncentrationen af prøven. Timelange målinger sætte grænser for visse proteiner stabilitet. Heldigvis, SANS målinger kan gøres rutinemæssigt på nedkølet temperaturer til at forbedre protein livstid, og den erhvervsdrivende stråle af lav-energi neutroner forårsager ikke nogen strålingsskader under målingen.

En oversigt over denne proces og bestemmelse af mange vigtige faktorer mod succesfuld registrering af neutron spredning fra en stikprøve, målt på kontrast matchbold i selve rengoeringsmidlet præsenteres i dette håndskrift. Dette omfatter det afgørende skridt mod at opnå en komplet match den samlede vaskemiddel ved at designe et vaskemiddel blanding med en ensartet neutron kontrast mellem vaskemiddel hoved gruppe og alkyl kæde komponenter. Målingerne på denne enkelt vaskemiddel matchbold give en spredning profil tilskrives kun membran protein af interesse og tilladt en ab initio konvolut der repræsenterer membran protein skal genopbygges fra dataene. Dataanalyse og ab initio modellering protokoller også vise potentielle oplysningerne fra disse undersøgelser, som kunne sigter mod at løse overordnede struktur, konformationelle ændringer, oligomere stater, blandt andre. En begrænsning er, at til dato kun meget få rengøringsmidler er kommercielt tilgængelige med deuterium erstatningsvarer. 19

Mens perdeuteration ikke må være nødvendig, målet i dette tilfælde bør være at opnå et protein med > 65% deuterium mærkning i proteinet. Alternativt, hvis vaskemiddel med selektivt-deutereret hoved grupper og haler er tilgængelige, og CMP af vaskemiddel micelle opstår nær 100% D2O, så tilstrækkelig kontrast fra protein kan opnås uden brug af deuterium mærkning. Fastlægge passende deuteration af protein til at opnå tilstrækkelig spredning målt på kontrast-match punkt i vaskemiddel. Der er mange udfordringer forbundet med membran protein proteinekspression og -oprensning,81 , som forbliver uden for rammerne af denne artikel. Desværre, høje niveauer af deuteration er i øjeblikket ikke (endnu) muligt for eukaryote systemer. Mens vi indse dette er en begrænsning for nogle eukaryote proteiner, har de fleste Membranproteiner bakterielle orthologs, denne metode er egnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne Volker S. Urban, Sai Rasmus Pingali, Kevin L. Weiss og Ryan C. Oliver er indgået gennem UT-Battelle med os DOE støtte Neutron videnskab brugerprogrammet og Bio-SANS instrument på Oak Ridge National Laboratory anvendes i denne artikel.

Dette manuskript har været medforfatter af UT-Battelle, LLC, under kontrakt DE-AC05-00OR22725 med os afdeling af Energy (DOE). Den amerikanske regering bevarer og udgiveren, ved at acceptere artikel til offentliggørelse, erkender, at den amerikanske regering bevarer en ikke-eksklusiv, indbetalte, uigenkaldelig, verdensomspændende licens til at udgive eller reproducere den offentliggjorte form af dette manuskript, eller tillade andre til at gøre det, for USA 's regering formål. DOE vil give offentligheden adgang til disse resultater af føderalt sponsoreret forskning i overensstemmelse med DOE aktindsigt Plan. 82

Acknowledgments

Office af biologiske og miljømæssige forskning støttet forskning på ORNL'S Center for strukturelle Molekylærbiologi (CSMB) og Bio-SANS bruger faciliteter understøttet af videnskabelige bruger faciliteter Division, Office of grundlæggende energi Sciences, os afdeling af energi. Strukturelle arbejde på Membranproteiner i Lieberman lab er blevet støttet af NIH (DK091357, GM095638) og NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735 (2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Tags

Biokemi spørgsmål 140 lille vinkel spredning neutron scattering Biofysik membran protein kontrast variation overfladeaktivt stof micelle intramembrane aspartyl protease presenilin signal peptid peptidase
Kontrast-matche vaskemiddel i små-Angle Neutron Scattering eksperimenter for membran Protein strukturel analyse og <em>Ab Initio</em> modellering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss,… More

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter