Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kontrast-matchande tvättmedel i liten vinkel Neutron Scattering experiment för membran Protein strukturell analys och Ab Initio modellering

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/57901
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Summary

Detta protokoll visar hur du skaffar en lågupplöst rättsverkan modell och strukturella Detaljer för ett tvättmedel-solubilized membranprotein i lösningen med liten vinkel neutronspridning med kontrast-matchning av tvättmedel.

Abstract

Det biologiska small-angle neutron scattering instrumentet på High-Flux isotopen reaktorn av Oak Ridge National Laboratory är tillägnad utredningen av biologiska material, biobränsle bearbetning och bio-inspirerade material som täcker nanometer till mikrometer längdskalor. De metoder som presenteras här för att utreda fysiska egenskaper (dvs., storlek och form) av membranproteiner (här, MmIAP, en intermembrana aspartyl proteashämmare från Methanoculleus marisnigri) i lösningar av micelle-bilda rengöringsmedel är väl lämpad för detta liten vinkel neutron scattering instrument, bland annat. Andra biofysiska karakterisering tekniker hindras av deras oförmåga att ta itu med tvättmedel bidragen i en protein-tvättmedel komplex struktur. Dessutom ger tillgång till Bio-Deuteration Lab unika möjligheter för att förbereda storskaliga odlingar och uttrycker deuterium-märkt proteiner för förbättrad spridning signal från proteinet. Medan detta teknik ger inte strukturella Detaljer på högupplösta, strukturella kunskapsluckorna för membranproteiner innehåller många adresserbara områden av forskning utan nära-atomär upplösning. Dessa områden omfattar exempelvis bestämning av Oligomera stater, komplexa bildande, konfirmerande förändringar under störning och vikning/utspelas händelser. Dessa undersökningar kan lätt åstadkommas genom tillämpningar av denna metod.

Introduction

Membranproteiner är kodade med uppskattningsvis 30% av alla gener1 och utgör en stark majoritet av mål för moderna läkemedel. 2 dessa proteiner utför ett brett spektrum av vitala cellulära funktioner,3 men trots deras överflöd och betydelse — endast utgör cirka 1 procent av totala strukturer deponeras i forsknings Collaboratory struktur Bioinformatik (RCSB) protein Data banken. 4 på grund av deras delvis hydrofoba karaktären, strukturella bestämning av membran-bundna proteiner har varit oerhört utmanande. 5 , 6 , 7

Eftersom många biofysiska tekniker kräver monodisperse partiklar i lösningen för mätning, har isolera membranproteiner från infödda membran och stabilisera dessa proteiner i en löslig härma av infödda membran varit ett aktivt område av forskning under de senaste årtiondena. 8 , 9 , 10 det undersökningarna har lett till utvecklingen av många roman amfifila församlingar till solubilize membranproteiner, såsom nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 och amphipols. 16 , 17 , användning av rengöringsmedel miceller förblir dock en av de vanligaste och enkla metoderna för att tillfredsställa löslighet kraven i ett visst protein. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 tyvärr ingen enda tvättmedel eller magiska blandning av rengöringsmedel för närvarande finns som uppfyller alla membranproteiner; Således måste dessa villkor undersökas empiriskt för de unika kraven i varje protein. 26 , 27

Rengöringsmedel montera själv i lösning över deras kritiska micelle koncentration att bilda sammanlagda strukturer kallas miceller. Miceller består av många tvättmedel monomerer (vanligtvis mellan 20-200) med hydrofoba alkyl kedjor bildar en micelle kärna och hydrofil huvud grupper ordnade i ett micelle skallager inför det vattenbaserade lösningsmedlet. Uppförandet av tvättmedel och micelle bildning klassiskt har beskrivits av Charles Tanford i Det hydrofoba effekten,28 och storlekar och former av miceller från vanliga tvättmedel i membran protein studier har varit kännetecknas med liten vinkel spridning. 29 , 30 tvättmedel organisation om membranproteiner har också undersökts, och bildandet av protein-tvättmedel komplex (PDC) förväntas med tvättmedel molekyler kring proteinet i ett arrangemang som liknar den snyggt diskmedel miceller. 31

En tillsatt fördelen i att använda rengöringsmedel är att de resulterande micelle egenskaperna kan manipuleras genom att införliva andra rengöringsmedel. Många rengöringsmedel uppvisar perfekt blandning, och välj egenskaper av blandade miceller kan även förutsägas från komponenter och förhållandet mellan blandning. 22 men förekomsten av rengöringsmedel kan fortfarande presenterar utmaningar för biofysiska karakteriseringar genom att bidra till den övergripande signalen. Exempelvis med röntgen och ljusspridning tekniker är signalen från tvättmedel i PDC praktiskt taget omöjlig att skilja från protein. 32 utredningar med singel-particle kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) normalt förlitar sig på instängd (fryst) partiklar; strukturella Detaljer av proteinet är fortfarande skyms av vissa tvättmedel eller en hög koncentration av tvättmedel som läggs till i bakgrunden. 33 alternativa metoder mot tolka full PDC-strukturen (inklusive tvättmedel) har gjorts genom beräkningsmetoder som syftar till att rekonstruera tvättmedel runt en given membranprotein. 34

För fallet av neutronspridning producerar core-shell arrangemanget av tvättmedel i micelle en formfaktor som bidrar till den observerade spridningen. Lyckligtvis kan komponenter ändras så att de inte bidrar till netto observerade spridningen. ”Kontrast matchande” processen uppnås genom att ersätta deuterium för vätgas att uppnå en scattering längd täthet som matchar bakgrunden (buffert). Ett klokt val av tvättmedel (med tillgängliga deutererade motsvarigheter) och deras förhållande av blandning måste beaktas. För tvättmedel miceller, kan denna substitution utföras med ett rengöringsmedel med samma huvud grupp men har en deutererade alkyl kedja (d-svans i stället för h-tail). Eftersom tvätt är väl blandade,35 deras aggregat har en spridning längd täthet som är den mole-fraktionen vägt genomsnitt av de två komponenterna (h-svansar och d-tails). När denna genomsnittliga kontrast är konsistent med gruppen huvud, kan de enhetliga sammanlagda strukturerna matchas helt för att ta bort alla bidrag till observerade spridning.

Vi presenterar här ett protokoll för att manipulera tvättmedel miceller neutron kontrast genom att införliva kemiskt identiska tvättmedel molekyler med deuterium-märkt alkyl kedjor. 19 , 36 , 37 Detta möjliggör komplett samtidig kontrast matchning av micelle kärna och skal, som är en unik funktion av neutronspridning. 35 , 38 med denna betydligt raffinerade detaljnivå, kontrast matchande kan aktivera annars omöjligt studier av protein membranstrukturer. Dessutom skulle denna kontrast-matchande strategi kunna utvidgas till andra system med rengöringsmedel, såsom polymer exchange reaktioner39 och olja-vatten dispergeringsmedel,40 eller även andra solubilizing medel, såsom bicelles,41 nanodiscs,42 eller block sampolymerer. 43 A liknande tillvägagångssätt som beskrivs i detta manuskript, men sysselsätter en enda tvättmedel art med partiell deuterium substitutioner på alkyl kedja eller huvud grupp, publicerades nyligen. 37 även om detta kan förväntas förbättra den slumpmässiga fördelningen av väte och deuterium i hela tvättmedel jämfört med den strategi som presenteras här, det begränsade antalet tillgängliga positioner på tvättmedel för substitution och tvåstegsverifiering rengöringsmedel syntes krävs poser ytterligare utmaningar för bedömningen.

Steg 1 och 2 i protokollet beskrivs nedan ofta överlappar varandra eftersom första försöket planering måste göras för att lägga fram ett förslag om kvalitet. Förslaget inlämning anses dock här som det första steget att betona att denna process bör inledas i god tid före en neutron experiment. Det bör också noteras att ett nödvändigt steg, som ska styrkas med förslaget, är att ha biokemiska och fysikaliska karakterisering (inklusive renhet och stabilitet) av provet stödja behovet av neutron studier. En allmän diskussion av små-vinkel neutron scattering (SANS) är utanför ramen för denna artikel. En kort men grundlig introduktion finns i referensunderlag Karakterisering av material av Kaufmann,44 och en heltäckande lärobok fokuserade på biologiska small-angle lösning spridning har nyligen publicerats. 45 vidare Rekommenderad läsning ges i avsnittet diskussion. Liten vinkel scattering använder så kallade scattering vektorn Q som den centrala kvantitet som beskriver spridningen. Denna artikel använder allmänt accepterade definitionen Q = 4π synd (θ) / λ, där θ är halva vinkeln mellan inkommande och spridda balk och λ är våglängden av neutronstrålning i Ångström. Andra definitioner finns att använda olika symboler såsom 's' för spridning vektorn, och att skilja med en faktor 2π eller nanometer i stället för Ångström (se också diskussionen av figur 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. förbereda och lämna in en Neutron anläggning Beam tid och Instrument förslag

  1. Konsultera online-resurser för att identifiera neutron scattering faciliteter som tillhandahåller allmänna neutron beam tid användaråtkomst, såsom Oak Ridge National Laboratory (ORNL). En karta över neutron faciliteter och information om neutron forskning över hela världen är tillgänglig online. 46 vara medveten om att dessa anläggningar normalt har regelbunden förslagsinfordringar. Detta avgör när nästa balk tiden kommer att finnas. Neutroner används för en mängd applikationer; Sök efter små-vinkel neutron scattering (SANS) instrument, särskilt de med kapacitet för biologiska prover.
  2. Använda resurser som tillhandahålls av neutron faciliteterna för att navigera neutron beam tid förslag budgivningen. Rådgör med en Neutron Scattering vetenskapsman (NSS) som är associerad med instrumentet som du kommer att använda. Granska neutron anläggningens nuvarande information angående förslaget samtal, tidsfrister och råd för inlämnande; för Oak Ridge är tillgängliga online. 47 skicka beam tid förslaget följer alla riktlinjer för en lyckad inlämning.
  3. Om deutererade protein är nödvändig (se 2.2), stöds neutron scattering faciliteter ofta av laboratorier och expertis tillägnad produktion av deutererade material. För att begära tillgång till de Bio-Deuteration Lab (BDL) vid ORNL, Välj BDL som det andra instrumentet i systemet förslag. Medan SANS förslaget granskas för genomförbarhet och av en kommittén för vetenskaplig granskning, screenas endast BDL begäranden för genomförbarhet. För att hjälpa till med översynen BDL genomförbarhet, skicka en färdig information begäran form48 som beskriver protein uttryck protokoll och beräknad avkastning (tillgänglig online).
  4. Efter framgångsrika peer-review förslagets tid beam, bekräfta tilldelade datum beam tid i förväg om experimentet. Se till att alla prov och buffert detaljer och formler visas korrekt i förslaget till ordentlig översyn. Eventuella ändringar av den föreslagna experimentella planen, inklusive ändringar i provet och buffert sammansättning, kräver anmälan av anläggningen.
    Obs: Förändringar bör diskuteras så snart som möjligt med tilldelade NSS.

2. Bestäm Neutron kontrast Match Points och nödvändiga kontrast för Protein mätning

  1. Samla in information (från leverantörens produktinformation, online-databaser, publicerade värden, etc.) avser Atom kompositioner och volymer för tvättmedel systemkomponenter kontrast-matchas. Denna information används för att bestämma neutron scattering längd tätheter (SLDs) och således kontrast match points (CMPs) i lösning, vilket är avgörande för att få kvalitet SANS data och strukturell information för membranprotein av intresse i samband med en PDC. En tabell som sammanfattar på fysiska egenskaper och kontrast match Points för rengöringsmedel som vanligen används i biofysiska studier av membranproteiner ingår (tabell 1).
  2. Bestämma neutron SLDs hjälp av webbprogrammet marktäckning: moduler för analys av kontrast Variation Data49 (tillgängliga online50 -kostnadsfria). En länk till användarhandboken ligger på startsidan. Åtkomst till webbplatsen och Läs den medföljande dokumentationen. Figur 1 och figur 2 ger en översikt över kontrast modul ingång och utgång för två närliggande exempel.
    Obs: Andra webbplatser för att beräkna SLDs finns tillgängliga, som upprätthålls av National Institute of Standards och Technology (NIST) Center för Neutron forskning. 51
    1. Öppna modulen kontrast genom att klicka på 'Kontrast' ligger i det vänstra navigeringsfönstret. Ge text för ett projektnamn och ange detaljer nedan för två komponenter (t.ex. tvättmedel huvud grupp och svans) som ' delenhet 1' och ' subenhet 2'.
    2. Ange formeln för varje komponent i textrutan 'Formel'.
      Obs: knappen är ' måste väljas under 'Ämne typ' ange en molekylformel. Dessutom använda bokstaven 'X' i formeln anger lätt utbytbara väteatomer. Protein, RNA eller DNA-sekvenser kan anges om de motsvarande 'P', 'R', eller hade ' alternativknappar är markerade. Om flera kopior av en komponent finns inom subuniten kan värdet för 'Nmolecules' ändras i enlighet därmed. Ett praktiskt exempel här avser lipid-liknande rengöringsmedel som innehåller två identiska svansar, så att formeln för en svans ska anges med Nmolecules lika med 2.
    3. Ange volymen i cubic nanometer för varje komponent i rutan nedanför 'Volym (Å3)'. Använda Tanfords formel28 för alkyl kedjor av längden n, Vsvans = 27,4 + n * 26,9, att beräkna ungefärlig svans volym eller erhålla molekylära volymer från produktinformationen som tillhandahålls eller publicerade värden i litteraturen.
    4. Ange Detaljer för buffert komponenter. Ändra den 'nummer upplöst arter i lösningsmedlet' använda menyn Lägg till eller ta bort rader för varje buffert komponent. När det gäller micelle-bilda rengöringsmedel, inkluderar gratis tvättmedel monomerer som separata buffert komponenter vid tvättmedels kritiska micelle koncentration (CMC).
    5. Klicka på 'Skicka' för att utföra beräkningarna av neutron-kontrast och generera en resultatsida som innehåller en tabell av scattering längd densitet och kontrast match points samt formler för att fastställa dessa parametrar vid någon viss procentandel D2O i bufferten. Granska scattering parametrarna med särskild uppmärksamhet på de komponent CMPs. Om match pekar är liknande (inom 10% D2O) och gratis micelle koncentrationen är låg, då Genomsnittligt CMP kan vara används för kontrast-matchande tvättmedel bidragen. I de flesta fall CMP av tvättmedel huvud grupp och stjärten skiljer sig med mer än 10-15%, producerar en core-shell formfaktor i SANS data som förvirrar direkta insamling av scattering signalen från proteinet ensam.
  3. Bedöma kontrasten mellan tvättmedel huvud grupp och svans. När rengöringsmedlet huvud grupp och alkyl kedja svansen CMPs inte är väl matchade, kan tillgänglighet och införlivandet av en deuterium-substituerade tvättmedel tillåta spridning längd tätheter av Välj komponenter att manipuleras. I de flesta fall kräver detta bildar en blandad micelle genom införlivandet av en identisk rengöringsmedel med deuterium-substituerade alkyl kedjor. Tillägg av deuterium väcker scattering längd tätheten av kärnan bildas av alkyl kedja svansar. Önskad slutpunkten, i detta fall är sådan att huvud grupp shell CMP och alkyl kedja core CMP har ungefär samma värden.
    1. Höja CMP tvättmedel micelle kärna för att vara ungefär lika med CMP huvud grupp skalet genom att fastställa lämpliga förhållandet av blandning mellan h-svansar och d-svansar som uppnår fullständig kontrast matchning med huvudet grupperna. En förutsättning för denna bestämning är kunskap om CMP för en deuterium-substituerade alkyl kedja svans. En kommersiellt tillgänglig motsvarighet till n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) är tillgänglig med alla alkyl kedja väte ersättas av deuterium (d25-DDM). Upprepa de kontrast beräkningar som beskrivs i steg 2.1 för en hade svans ' istället för 'h-svansen'.
    2. Beräkna förhållandet mullvad h-tail till d-svans krävs för kontrast-matchning med gruppen head CMP. Följande formel kan hjälpa till med denna bestämning:
      CMPhuvud = CMPh-tail * χh-tail + CMPd-tail * χd-tail
      där CMP är scattering längd täthet och χ är volymfraktionen för komponenten tvättmedel huvud, h-tail, eller d-svans. Buffrade lösningar av DDM, införlivandet av 44 viktprocent (43% av mullvad) av det totala tvättmedlet som d25-DDM med deuterium-substituerade alkyl kedjor producerar en enda CMP i 48,5% D2O för både huvud och svans komponenter.
  4. Överväga att graden av deuterium substitution för membranprotein. För att mäta tillräcklig spridning signal från proteinet, bör CMP för protein vara minst 15% D2O i lösning från tvättmedel CMP och mätförhållanden. Signalen ökar med kvadraten på denna % skillnad. Eftersom CMP en omärkt protein sker vanligtvis med ~ 42% D2O i lösning (en CMP liknar många tvättmedel huvud grupper), är deuterium märkning av protein nästan alltid en nödvändighet. 52

3. express och rena membranprotein av intresse

  1. Förbereda LB (lysogeny buljong) medium och växa Escherichia coli (E. coli) celler hysa en inducerbara uttryck vektor för sekvensen mål protein.
    1. Förbered minimal. H2O eller D2O och upplösa 7,0 g/L (NH4)2så4, 5,25 g/L Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, 0.50 HB diammoniumcitrat väte, 5.0 HB glycerol, 1,0 mL/L av 20% w/v MgSO 4·7H2O och 1,0 mL/L av Holme spårmetaller (0.50 HB CaCl2·2H2O, 0,098 HB CoCl2, 0.102 HB CuSO4, 16,7 HB FeCl3·6H2O, 0.114 HB MnSO4· H2O, 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O och 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Förbereda lämpliga antibiotika stamlösningar använder H2O eller D2O.
    3. Förbereda en isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside stamlösning använder H2O eller D2O.
    4. Steril-filter alla lösningar till torr, steril behållare med flaska-top dammsugare och spruta filter med porstorlek 0,22 mikrometer.
  2. Anpassa E. coli celler till deuterium-märkt medelstora före skala upp för överuttryck av ett deutererade protein.
    1. Inokulera 3 mL LB medium med en isolerad koloni från en Lysogeny buljong (LB) agarplatta eller celler från en fryst glycerol lager. Odla cellerna vid 37 ° C i en skakande inkubator vid 250 RPM eller sänka temperaturen till 30 ° C eller lägre för att undvika överväxt av kulturen när ruvar över natten.
      Obs: Förfarandet för anpassning kan varieras. 55 , 56 , 57
    2. När LB kulturen har vuxit till en optisk densitet på 600 nm (OD600) ~ 1, späd det 1:20 3 ml H2O minimalmedium och växa till en OD600 ~ 1. Upprepa 1:20 utspädningar med minimal medium innehållande 50, 75 och 100% D2O (eller upp till den önska D2O procentsatsen).
      Obs: som the D2O innehåll är ökad, tillväxten kommer att minska. Förhållandet mellan procentandelen D2O i tillväxt medier och deuterium substitution i proteinet har rapporterats i litteraturen. 58 , 59 , 60
    3. Fortsätta växa kulturen i en bioreaktor att öka avkastningen av deutererade cellmassan (figur 3).
      Obs: Stegvisa procedurer för bioreaktor drift har granskats någon annanstans. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Skörda och lysera E. coli celler för membran utvinning och protein rening
    1. Pellet cellerna genom centrifugering vid ~ 6 000 x g för ~ 30-45 min vid 4 ° C.
    2. Mjuka cellpelleten genom blötläggning i buffert på is för ~ 30 min. Sedan försiktigt Återsuspendera cellpelleten i buffert av försiktigt pipettering med en serologisk Pipettera, eller mild gunga på en 2D rocker, till en slutlig koncentration på ~ 1 g våt cell massan/10 mL buffert.
      Obs: en exempel buffert är 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra), pH 7.5, 200 mM NaCl kompletteras med en proteas hämmare tablett.
    3. Lysera återsuspenderade celler med tre passerar genom en högtrycks Homogenisatorer vid 10.000 psi medan kylning utflödet.
      Obs: Beroende på den omfattning som krävs, kanske andra lysis metoder används (t.ex. genom fransk press eller ultraljudsbehandling).
    4. Pellet cellfragment genom centrifugering vid ~ 4.000-5.000 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Upprepa detta steg tills supernatanten klargöras.
    5. Ultracentrifugen (~ 150 000 x g för 30-45 min) supernatanten från föregående steg, som innehåller den lösliga och membran fraktioner. Pelleten efter ultracentrifugering innehåller den membran-fraktionen.
    6. Återsuspendera pelleten membran i en stor Dounce Homogenisatorer och isolera den membran-fraktionen igen genom ultracentrifugering (steg 3.3.5). Upprepa detta minst en gång för att ta bort löst bundna proteiner.
    7. Solubilize membran av mild gunga för ~ 30 minuter vid 4 ° C i en buffert som innehåller rengöringsmedel passande för rening. Lösbarhet framgår när fjädringen blir från molnigt till transparent. Ta bort olösligt material genom ultracentrifugering (~ 150 000 x g för 30-45 min).
      Obs: En exempel-buffert är 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol och 4% (w/v) DDM för rening av Ni2 + affinitetskromatografi.
  4. Rena proteinet efter ett protokoll som tidigare utvecklats för protonerade former.
    Obs: Se Naing et al. för ett exempel rening protokoll för en hexahistidine taggade M. marisnigri JR1 intermembrana aspartyl proteashämmare (d-MmIAP). 65 den slutliga avkastningen var ~ 1 mg deutererat från 5 L deutererat kultur celltillväxt, som användes i SANS experimentet (figur 4).
  5. Utbyta det renat proteinet in i ”sista Exchange bufferten” för kontrast matchning.
    1. Förbereda 200 mL ”slutliga Exchange Buffer” som innehåller den korrekta blandningen för kontrast matchning, exempelvis20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl och 0,05% totalt DDM (0,028% DDM och 0,022% d25-DDM) i 49% D2O.
    2. Temperera en utslagning i kolumnen storlek med > 2 kolumn volymer (CV) av ”slutliga Exchange Buffer” i 3.5.1 med ett snabbt Protein Liquid Chromatography (FPLC) system.
    3. Efter injektion provet, kör kolumnen och isolera fraktioner motsvarar proteinet av intresse.
    4. Koncentrera sig proteinet till önskad slutliga koncentration (2-5 mg/mL).
      Obs: En volym av ~ 300 μL krävs för att fylla en 1 mm cylindrisk kvarts kyvetten används för SANS.
    5. Reservera en alikvot av matchade buffert för SANS bakgrund subtraktion.
      Obs: Alikvoten kan tas direkt från beredda bufferten, eller helst en ren eluering bråkdel i slutet av FPLC kör.

4. gör sista förberedelserna för Beam tid och samla SANS Data

  1. När förslaget har godtagits och tillgång till webbplatsen har godkänts, slutföra alla obligatoriska utbildning i förväg tilldelade beam. Detta inkluderar prearrival, webbaserad utbildning liksom Hotellets radiologisk, laboratorium och instrumentspecifika utbildning.
    Obs: Utbildning krav kan diktera advance ankomst för förstagångsanvändare. Mer information finns online. 66
  2. Läsa in prover och buffertar för datainsamling.
    Obs: En översikt över den biologiska small-angle neutronspridning (Bio-SANS) instrumentet prov miljöområdet visas i figur 5.
    1. Läsa in prover och buffertar i kvarts celler. Quartz celler finns tillgängliga från instrumentet scientist eller anläggning. Använd gel-lastning tips för att komma åt den smala öppningen av de flesta prov celler.
    2. Se till att balken slutaren är stängd, sedan närma sig området prov miljö och placera kvarts cellerna i provväxlare. Spela in sample changer positionen för varje prov cell.
    3. Kontrollera området och se till att balken sökvägen är fria från hinder, och sedan lämna prov miljöområdet och öppna beam slutaren.
      Obs: Noggrant följa alla anläggning regler och förordningar, lyda alla bokföringar och lyssna råd av instrumentet forskare. Prover kan inte tas bort från balken och manipulerade efter exponering för balken utan följande särskilda försiktighetsåtgärder. Rådgör med en radiologisk kontroll tekniker (RCT) innan dessa förfaranden.
  3. Exekvera tabellen scan för automatiserad datainsamling
    1. Fungera instrumentet med anpassad kontroll LabVIEW-baserad programvara, spektrometer Instrument kontrollmiljö (krydda). Följ instruktionerna för instrument som tillhandahålls av Neutron Scattering vetenskapsmannen. En översikt av tabell skanningen operationen windows finns i figur 6.
    2. När du har angett den information som krävs i de aktuella områdena, utföra en registergenomsökning och en automatiserad data insamlingen börjar. Följa utvecklingen via fliken 'Tabell Skanna Status'.

5. minska SANS Data från 2D-bild till 1D tomt

  1. Identifiera varje prov och buffert datafil från inspelade scan nummer. Varje mätning kommer att tilldelas en unik genomsökning nummer. Denna information är användbar under data minskning att identifiera varje motsvarande prov och buffert par.
  2. Använda MantidPlot programvara och Python-skript för att minska
    1. Neutron Scattering användare förses med kontouppgifter åtkomst till sina data på fjärrklustret analys. 67 logga in Remote analys klustret och köra ”MantidPlot” från kommandoraden. Figur 7 och figur 8 finns för att bistå dessa steg.
    2. Skaffa ett användarskript minskning från Neutron Scattering vetenskapsmannen (detta sker vanligtvis under experimentet); Detta skript är Python-baserad och kommer att innehålla alla nödvändiga kalibrering och skalning justeringar att minska 2D scattering bilden till en 1D tomt spridda stödnivåer som en funktion av scattering vinkel, I(Q).
    3. Öppna den befintliga användaren minskning skriptet i MantidPlot och placera motsvarande scan nummer eller identifiering för prov och buffert paren i lämplig lista.
    4. Köra skriptet för att generera reducerad data som en fyra kolumner textfil (kolumnordning är Q, I(Q), I(Q) fel, Q fel) på den angivna platsen. Högerklicka på arbetsytan lämplig i MantidPlot och välj ”tomt med fel...” för en första undersökning av scattering profilerna.

6. analysera Data för strukturella parametrar av Scattering partikel

  1. Överföra reducerad datafilen från analysservern till en lokal dator med hjälp av säker FTP-filöverföring. Detta kan utföras med användning av program som FileZilla eller CyberDuck. Ytterligare instruktioner och information för att ansluta till filsystemet analys server finns på sidan för inloggning i analysis.sns.gov.
  2. Ladda ner den ATSAS programvara suite65,68 (hela ATSAS suite). 69 enskilda program70 är också tillgängliga online för att analysera SANS data, nämligen att fastställa strukturella parametrar och rättsverkan modeller.
    Obs: Många alternativ finns för SANS dataanalys av biomakromolekyler. 45
  3. Använd PRIMUS71 för data plottning, buffert skalning och subtraktion och Guinier analys.
    1. Starta ATSAS 'SAS dataanalys' ansökan och belastningen minskade data filer motsvarande prov och buffert paret.
      1. Om du vill skala bufferten ordentligt, Välj ett dataområde på hög Q (Q > 0,5 Å-1) där båda profilerna är liknande och platta, och klicka på knappen 'Skala' under 'Verksamhet' fliken. En skalfaktor kommer att tillämpas till bufferten så att dessa två platta regioner ska överlappa. Var försiktig: det bör finnas en rimlig fysiska skäl som motiverar skalning buffert intensiteten för att matcha provet. Om skillnaden är stor, konsultera en instrumentet scientist för giltig förhållningssätt till bakgrunden subtraktion. 44 , 45 , 72
      2. Öka dataintervallet för att visa alla punkter. Klicka på 'Subtrahera' för att utföra den här åtgärden. Högerklicka på den buffer-subtraheras datafile i förklaringen och spara filen för senare analys. Figur 9 beskriver användningen av fliken 'Åtgärder'.
    2. Utföra en Guinier analys av buffert-subtraheras exempeldata med hjälp av fliken 'Analys' av 'SAS dataanalys' ansökan.
      1. Kontrollera rätt fil är markerad i listan och klicka på 'Radie av Gyration'. Ett automatiserat försök att utföra en Guinier passar kommer att tillhandahållas genom att klicka på knappen 'Autorg'.
      2. Öka utbudet av data som används för att inkludera alla låg-Q data och påbörja förträngning dataområdet genom att ta bort high-Q punkter tills Qmax * Rg gräns ligger under 1.3. Använda tomten av residualer för att verifiera att data är linjär i intervallet passform. Den Guinier passform ger en ungefärlig Rg och jag0 för spridning partiklarna.
      3. Göra små justeringar i regionen passform och övervaka känsligheten hos dessa värden till dataområdet används i passformen. Figur 10A visar användningen av verktyget 'Radie av Gyration'.
  4. Få funktionen sannolikhetsfördelningen (P(r)) i GNOM. 73 utdatafilen genereras här kommer att användas som indata för den rättsverkan modellering process.
    1. Starta guiden avstånd Distribution inom fliken 'Analys' att få en bra passform till data är avgörande för att få en kvalitet modell. För mer information om att erhålla korrekt passar, vänligen se den granskning74 av Putnam, o.a.
      Obs: The GNOM program ger ytterligare information om passform utöver guiden avstånd Distribution. Figur 10B visar korrekt användning av verktyget 'Avstånd Distribution', och figur 11 illustrerar några av de vanliga fel som uppstått.
    2. Bestämma Dmax, INTRAATOMISK maxavståndet inom molekylen.
      1. Beräkna ett värde för Dmax genom att avmarkera kryssrutan för att tvinga Rmax = 0 och ange ett stort värde för Dmax (150 Å, till exempel). Den första x-axeln i handlingen i P(r) ger denna uppskattning.
      2. Göra inkrementella ändringar Dmax värdet och dataområdet används eller antal poäng används i fit för att optimera den GNOM passar till informationen och resulterande P(r) kurvan.
    3. Fortsätta att förfina GNOM passformen och spara GNOM utdatafiler med bra passform parametrar för efterföljande rättsverkan modellering steg.
  5. Simulera SANS profiler från högupplösta PDB modeller med hjälp av programmet CRYSON. 75
    1. Öppna programmet och välj alternativet '0'. Välj PDB filnamnet i den popup-fil. Tryck enter för att acceptera standardinställningarna, förutom att ange kedja deuteration fraktioner och fraktionen av D2O i spädningsvätskan uppnå ordentlig kontrast parametrarna.
    2. Passa modellen till en experimentell uppsättning data genom att ange 'Y' och välja filen i filläsaren popup. Acceptera de återstående standardvärdena och utdatafiler skrivs på PDB fil plats. '.Fit' filen innehåller information för förväntad spridning profilen från högupplösta 3D-modellen.

7. skapa Ab Initio modeller från den SANS Data.

Obs: DAMMIF76 och DAMMIN77 inom ATSAS mjukvaran sviten används för att rekonstruera overksam Atomen modellerar (dammar) använder en simulerad glödgning processen från den GNOM utgång, som innehåller P(r) data eller information om sannolikheten eller frekvensen av INTRAATOMISK avstånd inom scattering partikeln. Dessa program kan köras i batchläge eller på ATSAS-Online webbservern.

  1. Starta guiden PRIMUS form från knappen 'Dammif' på fliken 'Analys' av 'SAS dataanalys', och använda ett manuellt val av parametrar. Ingång för guiden illustreras i figur 12.
    1. Definierar intervallet Guinier från passformen (steg 6.3.2) och fortsätt till nästa steg med hjälp av navigeringsknapparna. Definiera fit värden från P(r) tomten (steg 6,4) och fortsätt till nästa steg.
    2. Ange parametrar för den rättsverkan modellering process. Ange ett prefix för den modell utgång filnamnen (t.ex. SANSEnvelope), Välj antingen 'snabb' eller 'långsam' mode modellering, ange ett värde för antalet modeller (17 rekommenderas för statistisk signifikans), Välj från tillgängliga alternativ för partikel symmetri, anisometry och kantiga skala (om känt). Kontrollera att rutorna kontrolleras att genomsnittliga modeller med DAMAVER och förfina den slutliga modellen med DAMMIN.
    3. Inleda processen med knappen 'begå'. När processen är klar, Visa och spara arbetskatalogen.
      Obs: den typiska modellering processen för ett enda, litet protein kan ta upp till några timmar med en typisk persondator. Filerna lagras i temporära kataloger tills sparats.
  2. Overlay och överlagra finalen SANS kuvert med en relaterade Högupplösningsmodell med SUPCOMB inom ATSAS. Placera en kopia av den högupplösta PDB-modellen att vara vältränad på SANS kuvertet i arbetskatalogen. Kör SUPCOMB från kommandoraden med PDB filnamnen som två argument med mallen struktur visas först: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Obs: Andra filnamnet som anges kommer att skrivas om som en ny fil med ett ”r” läggs till slutet och med nya koordinater för överlagring på mallen struktur.
  3. Visualisera rättsverkan modell resultaten med PyMOL (pymol.org), en 3D molekylär grafik visning program. Figur 13 ger en översikt över PyMOL verksamheten.
    Obs: Det finns publikationen riktlinjer för strukturella modellering av små-vinkel scattering data från biomolekyler i lösning. 78
    1. Starta programmet PyMOL och öppna de .pdb filer som motsvarar 3D SANS kuvert och SUPCOMB-anpassade högupplösta strukturen att ses.
    2. Visualisera SANS kuvertet genom att representera denna modell som en yta. Klicka på 's ' knappen bredvid den modell och välj ' Visa: som: ytan '.
    3. Visualisera den högupplösta proteinstrukturen ryggraden genom att representera denna modell som en tecknad serie. Välj s ' bredvid denna modell och välj ' Visa: som: tecknad '. Visa kedjan som en regnbåge från N - till C-terminus genom att välja knappen 'C' och ' av kedja: Chainbows'.
    4. Ändra insyn i den ytan representationen för tydlighet. Från menyraden 'Inställning' Välj ' öppenhet» ytan» 40% '.
    5. Gör bakgrunden vit och icke-ogenomskinlig. Från menyraden 'Display' Välj ' bakgrund»' och välj 'Opaque' avmarkera det här alternativet och 'Vit' för att markera denna färg för bakgrunden.
      Obs: ytterligare operationer och användningsområden för PyMOL kan hittas på PyMolWiki.org.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beam tid och instrumentet förslag bör tydligt förmedla all information som behövs till utskottet för granskning så att en giltig bedömning av det föreslagna experimentet kan göras. Kommunikation med en NSS är bäst för oerfarna användare. NSS kan bedöma inledande genomförbarhet och guide förslag inlämning att betona genomförbarhet, säkerhet och risken för stor genomslagskraft vetenskap. Informationen i förslaget bör omfatta bakgrundsinformation och sammanhang för betydelsen av forskningen; kunskap som förväntas uppnås och hur detta påverkar aktuell kunskap i det relaterade fältet vetenskap; en beskrivning av det arbete, prover, metoder och förfaranden som kommer att vara anställd; och, i tillämpliga fall, tidigare produktivitet av teamet på anläggningen, inklusive relevanta publikationer och forskningsresultat. Användbara resurser, såsom förslag mallar och tips för att förbereda förslaget, är tillgängliga för användare via portalen Neutron vetenskap användaren (neutrons.ornl.gov/users).

Experimentet planering är en dynamisk process som ofta börjar under de inledande skedena av förslaget inlämning, men kan inte utformas helt tills strax före experimentet. Men tänk på att eventuella ändringar som avviker markant från beskrivningen i förslaget (inklusive ändringar buffert villkor eller provets sammansättning) måste godkännas av anläggningen före starten av experimentet.

Protokollet förutsätter att en metod för att uttrycka och renande proteinet membran av intresse i tvättmedel miceller i lösning har visats framgångsrikt. I det här fallet är membranprotein av intresse en intermembrana aspartyl proteas (IAP), som har ett etablerat rening protokoll och tidigare har fastställts vara lösliga och aktiva i buffert innehållande DDM miceller.

Här visar vi neutron kontrast beräkningar med kompost: kontrast-modul för en lösning av IAP protein i kontrast-matchade blandat DDM / d25-DDM miceller. Den strategi som beskrivs häri var att först bestämma graden av blandning mellan de två rengöringsmedel som är nödvändigt för att uppnå en fullständig kontrast match av micelle. Slutresultatet var att fastställa den relativa kontrasten av varje komponent och bakgrunden (H2ö/v2O ratio) nödvändigt att kontrast-match spridningen från tvättmedel för att observera endast protein spridningen.

Figur 1 visar en korrekt ingång för modulen MULCh kontrast och resulterande utdata för kontrast beräkningar av DDM tvättmedel huvud grupp och stjärten som subenheter 1 och 2, respektive. Den formel som används för gruppen huvud är C12H14X7O11 med en volym av 348 Å3och alkyl kedja svans formeln ges som C12H25 med en volym på 350 Å3.

Det framgår av kontrast modul utdata att det DDM huvud grupp och svans har olika scattering längd tätheter och därmed kontrasten mellan de två komponenterna kommer att observeras. För DDM har huvudet grupperna en CMP i 49% D2O medan alkyl kedja svansar har en CMP i 2% D2O, med deras genomsnittliga CMP som förekommer i 22% D2O. Syftet med nästa steg kommer därför att utforma en blandad micelle som innehåller deuterium-substituerade alkyl kedjor för att öka den genomsnittliga CMP av tvättmedel svansar för att matcha CMP huvud grupper. Beräkningen av kontrasten upprepades för ett substituerade rengöringsmedel, DDM med fullt deutererat svans (d25-DDM), vilket på motsvarande sätt resulterar i kontrast mellan huvud grupp och svans. Dock kontrast värden av h-svansar och d-svansar skiljer sig avsevärt. Minns att tvättmedel blandningar är kända för att producera välblandade miceller i lösning,22 således en blandning av dessa h och d-svansar i micelle kärnan bör producera ett genomsnittligt SLD motsvarar som huvudet grupp skal, ger en micelle med enda CMP. Eftersom gruppen huvud är gemensamma för både DDM och d25-DDM, är strategin att hitta en blandning av dessa rengöringsmedel som producerar ett genomsnittligt kontrast värde från blandade svansar som matchar kontrasten i grupperna huvud.

Mål genomsnittet CMP för tvättmedel svansar är att av maltoside huvud grupper eller 49% D2O. För att uppskatta förhållandet mellan blandning genomsnittliga CMP av varje h-svans och d-tail komponent måste vara känd. Dessa värden för några vanliga tvättmedel och kommersiellt tillgängliga deuterium märkt motsvarigheter finns i tabell 1. Med dessa CMP värden för DDM och d25-DDM, molbråket för h-svansar och d-svansar som uppfyller ekvationen i steg 2.2 är χd-svansar = 0,43.

Figur 2 visar en mer avancerade indata till marktäckning kontrast modul som kan användas för att bekräfta de slutliga blanda-micelle kontrast match villkor och avgöra graden av deuteration krävs på proteinet. Här, refererar delenhet 1 till den kontrast-matchade blandade micelle med 2 komponenter, DDM och d25-DDM, medan subenhet 2 refererar till den M. marisnigri JR1 intermembrana aspartyl proteashämmare (MmIAP) ges av dess aminosyrasekvens. SLD av protein har upphöjts uttrycket i dehydrerade odlingsmedier ge en CMP för protein i buffert innehållande ~ 92% D2O. Graden av separation mellan proteinets matchboll i 92% D2O och villkoret mätning (48,5% D2O) föreslår att tillräcklig spridning signalen kommer att erhållas från proteinet.

Produktionen av d-MmIAP genomfördes med Rosetta 2 E. coli celler hysa pET22b-MmIAP vektorn. Minimalmedium med omärkt glycerol i 90% D2O valdes som odlingsmedium. Efter anpassning till 90% D2O minimalmedium, kultur volymen var skalas upp till 400 mL och brukade Inokulera 3.6 L färska 90% D2O minimal medium i 5,5 L bioreaktor kärl.

Figur 3 ger en trace av processen värdena under fed-batch odling. På tiden av inympningen, börvärdet för temperatur var 30 ° C, löst syre (DO) börvärdet var 100%, agitation börvärdet var 200 rpm och flödet klassar av tryckluft var 4 L/min. PH hade hållits över ett börvärde på 6,9 med en 10% w/v lösning av natriumhydroxid i 90% D2O. En gång den spike signalerade utarmning av inledande 5 g/L glycerol, utfodring (30% w/v glycerol, 0,2% MgSO4 i 90% D2O) inleddes, som fortsatte under hela odlingen. Efter ca 7 timmar av utfodring, kultur temperaturen sänktes till 18 ° C och isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside lades till en slutlig koncentration på 1 mM. Vid skörd kulturen, samlades cirka 145 g våtvikt cell pasta via centrifugering (6 000 x g för 45 min)

Rening av d-MmIAP fortsatte när det gäller enzymet protonerade förutom att enzym kapacitet var betydligt lägre och slutliga renhet var något lägre än normalt. Från 5 L, ~ 20 g av våta membran isolerades, varav alla var solubilized i DDM för rening och lastas den första Ni2 + affinity kolumnen. För att maximera rening avkastning, var andelen genomflöde utspädd och åter kör på Ni2 + affinitet kolumn. Förfarandet upprepades en tredje tid innan polering koncentrerad d-MmIAP provet genom storlek utslagning kromatografi (figur 4).

Figur 5 illustrerar en kvarts sample cell och dess relaterade sample changer setup. Prov-miljöer hanteras av Bio-SANS driftgruppen och NSS. En mängd olika miljöer kan ordnas att utföra mätningar med temperaturkontroll, fuktstyrning, mekaniska tumlande, hög temperatur och ihållande tryck, bland andra.

Figur 6 visar Bio-SANS verksamhet och verkställandet av tabellen automatiserade File. Tabell genomsökningen är konfigurerad för att vara intuitiv och användarvänlig. På den första fliken (Load prover) uppgifter om provväxlare och setup, såsom identifiering av prover på varje position i provväxlare, cell tjocklekar och Provtyp (öppen beam, prov, bakgrund, etc.). Ytterligare metadatataggar kan appliceras här också. På nästa flik (planera Experiment) definieras instrumentet konfigurationen och eventuella associerade parametrar (såsom temperaturkontroll). Detta steg arrangeras av NSS i början av experimentet. Användaren måste helt enkelt ange mätning tider för varje prov (i sekunder). Fliken slutliga (Execute File) ger en sammanfattning av genomsökningen tabelldata och automatiska sökningen ska utföras.

Efter 2D scattering bilderna bokförs, måste dessa data minskas till en 1D tomt på intensiteten jämfört med Q - en funktion av scattering vinkel. Under data minskning tillämpas även bildkorrigeringar såsom pixel känslighet masker och mörk bakgrund subtraktioner. MantidPlot programvara har utformats för att tolka den råa Bio-SANS instrumentdata. NSS hjälper generellt minska och hämta de slutliga uppgifterna i slutet av experimentet.

Figur 7 ger en översikt av fjärranalys kluster tillgång till MantidPlot och skriptrutan används för reducering av data. RAW-data finns tillgängliga på fjärranalys klustret (analysis.sns.gov) via UCAMS/XCAMS användarautentisering. Efter logga in remote desktop, kan MantidPlot programvaran startas från ett terminalfönster genom att helt enkelt köra 'MantidPlot' under någon sökväg. Öppna fönstret manus i MantidPlot och redigera skriptet användaren minskning som regisserad av NSS. Köra detta skript kommer att generera de reducerade datafiler, som sedan kan överföras till en lokal maskin för analys med hjälp av secure FTP.

Figur 8 visar plottning och visa data efter verkställande användaren minskning Script. minskas data visas i fönstret arbetsytor. Som standard har sista sammanslagna data de suffix _f bifogas. Högerklick gör att Plot Spectrum med fel väljas och data som ska ritas upp. Visningsinställningar nås genom att välja inställningar på 'Visa'-menyraden. Formatering av yxor och plottning range är lättillgängligt genom att dubbelklicka på axlarna. Scattering profiler av buffertar, som innehåller inga scattering partiklar av betydande storlek bör visas som en relativt platt linje (konstant intensitet). För prover, bör intensitet observeras vid lägre spridning vinklar (Q) med exponentiell förfalla till en platt osammanhängande bakgrund.

Figur 9 ger en översikt av ordentlig buffert subtraktion med hjälp av programpaketet SAS dataanalys (eller primusqt) efter data förminskning. Ganska ofta är osammanhängande bakgrunden (intensitet på high-Q) något avvikande mellan prov och buffert. För korrekt subtraktion, ska data i denna region överlappa. Skala korrigering gäller en intensitet skalfaktorn för de data som resulterar i överlappande data och subtraktionen kan utföras. Om skalfaktorn resulterar i buffert datapunkter med större intensitet än motsvarande punkter i provet, då blir dessa punkter negativ och inte återgivna i en logg tomt. Om negativa värden i filen buffert-subtraheras är riklig, göra en smärre minskning i buffert skalfaktorn och utföra subtraktionen igen.

Figur 10 ger exempel användningar av Primus Guinier och avstånd fördelning guider. En Guinier analys ger en preliminär uppskattning av partiklar radien tröghetsradie från låg vinkel scattering data. Som data närma sig noll, bör en linjär region vara närvarande i data. Montering av en linje i denna region tillåter den Rg avgöras från lutningen och ett I0 till extrapoleras från skärningspunkt med intensitet vid Q = 0. En uppåtgående trend i data visar som Q närmar sig noll aggregation i provet, medan nedåtgående trender är ett vanligt tecken på interparticle repulsions. Dessa trender är tydligast när fördelningen av residualer är icke-stokastiska. Den övre gränsen för den Guinier passar för klotformiga partiklar begränsas av Q * Rg < 1.3 ('s' används i stället för Q i programvaran ATSAS).

Rg bestäms för d-MmIAP från denna Guinier fit var 15,4 ± 1,1 Å med uppskattningsvis jag0 ges som 0.580 ± 0,001.

Guiden avstånd distribution tillåter systematisk ändringar skall göras i parametrarna för den P(r) som passar. P(r) kurvan är en indirekt fouriertransformen av kurvan passar till experimentella data. Därför är det viktigt att kontrollera att passformen i den vänstra panelen återspeglar experimentella data. För passform visas i detta exempel, en Dmax i 46 Å erhölls.

Figur 11 visar vanliga fel i Dmax urval. En Dmax som artificiellt stora ofta orsakar P(r) värden att bli negativ som funktionen P(r) svänger om x-axeln. En Dmax som är konstgjort små leder till en stympad P(r) kurva med en abrupt övergång till Rmax = 0.

De första stegen i guiden Primus form är identisk med Guinier och avstånd fördelning guider. När denna information har lämnats till skaffa bra passar till experimentella data, konfigureras den rättsverkan modell setup.

Figur 12 visar en korrekt ingång för guiden Primus form. Här experimentella SANS data för IAP var försedd med en skala i nanometer, och det förvänta fil prefixet ”SANSEnvelope” fick. En uppsättning 17 inledande overksam atom modeller ombads skapas med hjälp av ”snabba” modell läge med ingen symmetri (P1) tillämpas och inga anisometry som valts. Uppsättningen 17 modeller kommer att vara i linje, i genomsnitt och filtreras med DAMAVER, och den genomsnittliga modellen förfinas med DAMMIN. Inspektion av prefix-damsel.log textdokument ger en sammanfattning av urvalskriteriet och några modeller som kasserad från uppsättningen. Den slutliga välutvecklad skrevs som SANSEnvelope-1.pdb.

Programmet SUPCOMB för att utföra en överlagring av SANS kuvertet modell med den högupplösta modellen, med endast två PDB struktur filer som indata. Som standard läggs ”r” till namnet omorienteras och överlagras.

En gång SANS kuvert och högupplösta struktur har varit ovanpå varandra, dessa modeller kan visualiseras med hjälp av molekylär grafik titta på program. Resultaten från PyMOL lämpar sig för publikation kvalitetsbilder och kan användas för att betona biofysiska resultat avseende strukturella undersökningen. Här visar vi några grundläggande PyMOL operationer används för att ge 3D representationer och utsikt över de resulterande överlagrade strukturerna.

Figur 13 ger en översikt över processen PyMOL visualisering. När filerna PDB struktur har öppnats i PyMOL ska modellerna synas i fönstret PyMOL Viewer. Ändra representationerna av varje modell med s ' knappen bredvid varje filnamn. Använda en surface representation för SANS kuvertet och en tecknad representation av protein ryggraden från högupplösta modellen. Välj en lämplig färgschema alternativ som finns under knappen 'C'. För proteinkedjor ger en ”chainbow” färg en färgövertoning från N - till C-terminalen till stöd tolkning. Transparens tillämpas på ytan representation att möjliggöra bättre visualisering av proteinstruktur inom kuvertet. För publicering bilder rekommenderas en vit bakgrund. När köerna visualisering har tillämpats, kan 3D-strukturer undersökas. Manipulationer av de perspektiv och molekyl rotation och översättningen kan utföras genom att klicka och dra strukturen.

Figure 1
Figur 1. Användning av kompost kontrast modulen att bestämma kontrast parametrar för komponenter av dodecyl maltoside (DDM). Inmatade värden visas i fönstret till vänster med efterföljande utdata till höger. Kontrast modul ingång sidan nås genom att klicka på 'Kontrast' (grön cirkel) i navigationsmenyn till vänster på varje skärm. Inleveransområden för projektnamn, buffert komponenter och delenheter 1 och 2 är märkta som sådana. Utskrivna sidorna innehåller viktiga partikel information och kontrast egenskaper för det beskrivna systemet. Relevanta register och beräknade match Poäng har varit förpackade i orange för tydlighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Användning av kompost kontrast modulen att bestämma kontrast parametrar för komponenter av membran protein-tvättmedel komplexet. I detta fall har input givits att beskriva systemets övergripande PDC i buffrad lösning. Subenhet 1 beskriver den kontrast-matchade blandat micelle består av DDM med 43% av mullvad som d25-DDM. Subenhet 2 beskriver proteinet membran, med den amino syra ordnar för MmIAP indata som formel. Deuteration (grön cirkel) beskriver proteinets deuterium substitutionsgrad och har en direkt inverkan på SLD och beräknade match-punkt som kommer att uppskattas för protein. Resultat (orange box) indikerar att match-punkt för blandade tvättmedlet kommer att inträffa i 48,5% D2O, medan proteinets-matchboll uppstår på ~ 90% D2O. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Provpreparering – bioreaktor spår. Process värdena som visas är börtemperatur (orange linje), syre (DO) börvärde (blå linje), agitation börvärdet (röda linjen) och komprimerad luft flöde (rosa linje). Pump 1 (gröna linjen) användes för pH-kontroll. GÖR spetsen vid 18:40 signalerade utarmning av den ursprungliga glycerol och användes för att inleda utfodring av glycerol lösning via pump 2 (svart linje). X-axeln anger timmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Provberedning – FPLC och SDS-PAGE karakterisering av provet. Slutliga storlek utslagning kromatogrammet för d- MmIAP jämviktas med 20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl, 48,5% D2O och 0,05% totalt DDM, varav 44% (w/v) är svans-deutererat d25-DDM. Infällt: SDS-PAGE analys med Coomassie färgning. Poolade fraktionerna är märkta A, B, och C. Region ”B” användes i SANS experimentet. Kommenterad molekylvikt markör är i kDa. Bilden återges med tillstånd från Naing o.a. 65 Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5. Datainsamling – kvarts banjo prova cell och autosampler setup. (A) en tom kvarts banjo cell visas vilar mot blocket autosampler. Celler är fylld med prov och infogas i en av de 15 tillgängliga positionerna. (B) prov blocket är monterad bakom en bländare väljare (visas inte) mellan Beam Tube Extender och kisel fönster vid ingången till detektor tanken. Slangar som ansluter till en temperatur-kontrollerad vattenbad och kanaler i hela kvarteret prov ger temperaturreglering vid prov positioner. Pilen anger riktningen av neutron balken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Datainsamling – översikt över krydda operationer och bord scan. Tabell genomsökningen är tillgängliga från knappen 'Tabell Scan' i menyn längst till vänster av programvaran SPICE instrument kontroll. Gröna pilar beteckna den aktiva fliken överst på skärmen och orange rutorna Markera områden i tabellen för aktiv användare ingångar. (A) den första fliken för den tabell-sökningen används för att tillhandahålla information om provväxlare och prov cell positioner. Tillhandahålla etiketter, prov tjocklekar och typer av prov för varje position som används i provväxlare. Markera rutan 'Genomsök' kommer att lägga till motsvarande rad i tabellen scan kön. (B) på den andra fliken registreras information om instrumentet konfiguration och mäta tiden för varje prov (i sekunder). Instrumentet konfigurationer är förkonfigurerade av Neutron Scattering vetenskapsmannen och ges till användare baserat på informationen i förslaget beam tid och instrument. Ytterligare parametrar kan läggas till kontrollen instrument, exempelvis möjligheten att definiera temperatur börvärden och hålla tider, under mätning kön. (C) den sista fliken ger en översikt av mätningar göras för varje rad i tabellen. Om inga ändringar behövs, initieras den automatiska genomsökningen genom att klicka på knappen 'Kör File'. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Data minskning – översikt över minskning script och MantidPlot verksamhet. MantidPlot programvara är tillgänglig på analys-klustret genom att skriva ”mantidplot” i en terminal kommandotolk på någon aktiv katalog (den gula cirkeln och pilen läggs för betoning). När programvaran är öppen, öppna skriptfönstret (växlas av knapp markerad i grönt) och öppna skriptet som tillhandahålls av Neutron Scattering vetenskapsmannen. Följ instruktionerna i skriptet, som bör endast kräva scan nummer för varje prov och buffert till anges i en lista för automatiserad minskning, samt Skanna nummer för den tomma cellen för subtraktion och Tom beam för överföring och balk Center bestämning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8. Dataanalys – plottning av data med hjälp av MantidPlot. Data refereras som ”arbetsytor” i MantidPlot. Området arbetsyta fylls med filnamn som produceras av användaren minskning skriptet. Arbetsytans data för 1D datauppsättningar kan ritas genom att högerklicka på arbetsytan och välja ”Plot Spectrum med fel...”. Ytterligare data kan läggas till nuvarande tomten genom helt enkelt dra och släppa arbetsytor. Formatering av fönstret tomt (t.ex. för log-log tomter) kan utföras genom att välja 'Preferences' 'Visa' menyraden, eller dubbelklicka på axeletiketterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9. Dataanalys – ATSAS programvara: grundläggande funktioner och buffert subtraktion. Primusqt ansökan (SAS dataanalys) ger visualisering för korrekt bakgrund (buffert) subtraktion. Filen buffert ska skalas för subtraktion sådan att uppgifter överlappar i hög-Q (där spridningen är platt till följd av återstående signal från osammanhängande bakgrund). När detta high-Q dataområde är markerad gäller skala operationen en skalfaktor för lägre datafilen i tabellen som producerar överlappning i regionen definierad. Efter skalning, kan filen buffert dras för att ge den netto scattering profilen av partikeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10. Dataanalys – Guinier och P(r) (avstånd distribution) bestämning. (A) Primus Guinier guiden används för att utföra en Guinier analys, som tillhandahåller en preliminär uppskattning av jag0 och Rg. Partikel typ och mängd data att passa används för att definiera passformen. En tomt på passform och motsvarande residualer visas till vänster, medan Guinier villkor (jag0 och Rg), Q * Rg gränser och kvalitet av linjära fit tillhandahålls som utgång i området präglas av den orange rutan. (B) guiden för Distribution av Primus-avstånd används för att utföra avstånd distribution analysen, som tillhandahåller P(r) kurvan som definierar sannolikheten för INTRAATOMISK avstånd inom scattering partikeln och inkluderar Dmax eller maximalt INTRAATOMISK avstånd. Parametrar som anges av den orange rutan kan undersökas systematiskt för att fastställa en korrekt avstånd fördelningsfunktionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11. Felaktig resultat från avstånd distribution analysen. En korrekt valda Dmax bör producera en P(r) kurva som toppar med en gradvis förfalla till noll. DMax värden som är för stor kommer sannolikt producera negativa P(r) värden eller svängningar nära x-axeln vid höga värden av r. Dmax värden som är konstgjort små ofta resultera i P(r) kurvor där den övre gränsen ser avklippt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12. Modellering- rättsverkan modell installationen med hjälp av guiden Primus form. Rättsverkan modellering parametrar finns i en enda inmatningsfönstret. Ett prefix medföljer andra alternativ för behandling tillgänglig för utgång filnamn. Glödgning förfarande kan vara snabb (större pärlor med snabbare nedkylning) eller långsam (mindre pärlor med långsammare kylning). Antalet repetitioner bör vara av tillräcklig storlek för att undersöka reproducerbarheten av modell funktioner. Partikel symmetri och anisometry kan tillhandahållas, om känt. Kantiga skala bör motsvara enheterna av uppmätta data. DAMAVER i genomsnitt kommer justera genomsnitt alla dummy atom modeller och applicera sedan ett urvalskriterium som utesluter alla avvikare modeller. En kärna av fast atomer från i genomsnitt modellen kommer att ytterligare förfinats hjälp DAMMIN om detta alternativ är markerat. Denna förfinade modell bör representera 3D lågupplösta kuvertet av den experimentella SANS profil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 13
Figur 13. Visualisering – experimentell SANS kuvert och överlägg med Högupplösningsmodell med PyMOL. Efter öppnandet PDB strukturera filerna i PyMOL, visas modeller i visningsprogrammet PyMOL. Aktiva modeller listas i tabellen till höger, tillsammans med action-knappar som kan användas för att manipulera modellen och dess representation. Grundläggande funktioner tillhandahålls för att visualisera dessa modeller som tillåter regioner av avtal (eller obalans) mellan SANS kuvertet och högupplösta strukturen identifieras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1. Läkarundersökningrekvisitan av tvättmedel som vanligen används i membran protein utredningar. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Strukturbiologi forskare dra nytta av kompletterande strukturella metoder såsom lösning scattering få biokemiska och strukturella detaljer (t.ex. övergripande storleken och formen) från biomolekyler i lösning. SANS är en särskilt attraktiv teknik för bestämning av membranproteiner strukturer på låg upplösning, en kärna fokus modern strukturell biologi och biokemi. SANS kräver mängder renade proteiner jämförbara med kristallografiska studier (1 mg/prov). Den nyligen växande kommersiella tillgången av hög renhet deutererade rengöringsmedel relevanta för membran protein studier gör tillgängligt ett sätt att manipulera detta väte/deuterium innehåll för SANS experiment av membran protein-tvättmedel komplex, vilket gör att protein signalen skall registreras direkt. När framgångsrika, kan rättsverkan modell molekylär kuvert beräknas från data som samlats in under bara några timmar. Således, membran protein biokemister, biophysicists och strukturella biologer lätt kan dra nytta av SANS att få eftertraktade första 3D-modeller av membranproteiner i lösning, strukturer i komplex med bindande partner eller substrat, och modeller som erhållits genom SANS kan användas för att fasa diffraktion data. Rutinmässig användning av SANS att karakterisera membranproteiner skulle vara omvälvande för fältet membran protein biokemi och få dominoeffekter från grundläggande struktur funktion till läkemedelsforskning och utveckling. Fördelen av neutron kontrast matchning med deuterium substitution gör SANS en värdefull teknik för att studera protein-protein, protein-DNA eller andra Biomolekylär komplex, som lätt kan manipuleras i sitt väte/deuterium innehåll.

För ytterligare detaljer om små-vinkel scattering instrument design och teori, de följande recensionerna rekommenderas: Bio-SANS instrument vid hög Flux isotopen reaktorn av Oak Ridge National Laboratory,79 Small-angle spridning för strukturbiologi – utöka gränsen samtidigt undvika de fallgropar,72 och små-vinkel scattering studier av biologiska makromolekyler i lösning. 80 den Neutron Scattering vetenskapsman kan även diskutera aktuella instrument konfigurationer och de optimala parametrarna för ett givet system. Data på lägre Q (som är en funktion av scattering vinkel och neutron våglängden) önskas exempelvis generellt för större system. Den vanligaste instrument konfigurationen på Bio-SANS ger en Qmin av 0,003 Å-1 och är lämplig för större proteinkomplex upp till hundratals kDa. En lösning innehållande ~ 3 mg mL-1 av membranprotein av ungefärlig storlek på 30 kDa (monomer) i kontrast-matchade miceller med 48,5% D2O i lösning kräver en typisk mättid ca 8 timmar varje för prov, buffert och tom cell (24 timmar = 1 dag totalt). Instrumentet mättider på en viss kontrast skick kan skalas ungefär enligt produktens spridning partikelns molekylärt samlas och koncentration. Scattering partiklar måste dock mätas på icke-interagera villkor, inklusive eventuella icke-specifika protein aggregering, som förlägger en praktisk övre gräns på koncentrationen av provet. Timslånga mätningar tidsgränser för stabiliteten i vissa proteiner. Lyckligtvis, SANS mätningar kan göras rutinmässigt i kylskåpstemperatur till förbättra protein livstid och sysselsatta stråla av låg energi neutroner orsakar inte någon strålning skada under mätningen.

Detta manuskript presenteras en översikt av denna process och bestämning av många viktiga faktorer mot framgångsrika inspelningen av neutronspridning från ett prov mätt på kontrast match pekar av tvättmedel. Detta inkluderar det kritiska steget mot att erhålla en komplett match av det sammanlagda tvättmedlet genom att utforma en rengöringsmedel blandningen med en enhetlig neutron kontrast mellan tvättmedel huvud grupp och alkyl kedja komponenter. Mätningar vid denna enda tvättmedel matchboll ger en spridning profil tillskrivs endast membran proteinet av intresse och får rättsverkan kuvert som representerar den membranprotein rekonstrueras från data. Den dataanalys och rättsverkan modellering protokoll också påvisa den eventuella information som erhålls från sådana utredningar, som kan ha som syfte att ta itu med övergripande struktur, konfirmerande förändringar, Oligomera stater, bland annat. En begränsning är att hittills endast mycket få rengöringsmedel är kommersiellt tillgängliga med deuterium substitutioner. 19

Medan perdeuteration inte kan vara nödvändigt, målet i det här fallet bör vara att uppnå ett protein med > 65% deuterium märkning i proteinet. Alternativt, om tvättmedel med selektivt-deutererat huvud grupper och svansar är tillgänglig, och CMP av den tvättmedel micelle uppstår nära 100% D2O, då tillräcklig kontrast från proteinet kan uppnås utan behov av deuterium märkning. Fastställa lämpliga deuteration av proteinet att uppnå tillräcklig spridning mätt på kontrast-match av tvättmedel. I området i närheten finns det många utmaningar i samband med membran proteinuttryck och rening,81 som fortfarande är utanför ramen för denna artikel. Tyvärr, höga nivåer av deuteration är för närvarande inte (ännu) möjligt för eukaryota system. Medan vi inser att detta är en begränsning för vissa eukaryota proteiner, har de flesta membranproteiner bakteriell orthologs som denna metod är lämplig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss och Ryan C. Oliver är kontrakterade genom UT-Battelle med oss DOE att stödja Neutron Science användarprogram och Bio-SANS instrument vid Oak Ridge National Laboratory används i denna artikel.

Detta manuskript har varit medförfattare av UT-Battelle, LLC, enligt avtal DE-AC05-00OR22725 med oss Department of Energy (DOE). Den amerikanska regeringen behåller och förlaget, genom att godkänna artikeln för publicering, erkänner att den amerikanska regeringen behåller en icke-exklusiv, inbetalda, oåterkallelig, global licens att publicera eller reproducera det publicerade formuläret av detta manuskript eller tillåta andra att göra det, för amerikanska regeringen ändamål. DOE kommer att ge allmänheten tillgång till dessa resultat av federalt sponsrade forskning i enlighet med planen DOE allmänhetens tillgång. 82

Acknowledgments

Den kontor av biologiska- och miljöforskning stöds forskning vid ORNL'S Center för strukturella molekylärbiologi (CSMB) och Bio-SANS med faciliteter som stöds av vetenskapliga användaren faciliteter Division, Office av grundläggande Energivetenskaper, US Department av energi. Strukturella arbete på membranproteiner i Lieberman labbet har stötts av NIH (DK091357, GM095638) och NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735 (2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Tags

Biokemi fråga 140 liten vinkel scattering neutronspridning biofysik membranprotein kontrast variation tensid micelle intermembrana aspartyl proteashämmare presenilin signal peptid-hämmare
Kontrast-matchande tvättmedel i liten vinkel Neutron Scattering experiment för membran Protein strukturell analys och <em>Ab Initio</em> modellering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss,… More

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter