Summary
여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.
Abstract
Vivo에서 단백질은 종종 어디 바인딩 특이성 및 역학에는 궁극적으로 기능 출력 지시 하는 큰 고분자 복합물의 부분. 이 일 pre-endosomal 탄 저 균 독 소 조립 이며 복잡 한 endosomal로 전환. 첫째, 시스테인 돌연변이 치명적인 요소 (LFN)의 N 맨끝 도메인은 이황화 보호 항 (PA) prepore (Kd 1 nM)에 바인딩할 수 있도록 최적의 방향으로 커플링을 통해 biolayer 간섭계 (BLI) 바이오 센서에 첨부 됩니다. 최적의 지향된 LFN-펜 실바 니 아prepore 복잡 한 다음 성 모 세관 morphogenic 유전자-2 (CMG2) 세포 표면 수용 체에 바인딩 (Kd 170 오후), 대표적인 균 중 endosomal 복잡 한, pH 7.5에 안정적인 결과. 이 조립된 복잡 한 다음 PAprepore 삽입 막 공 상태로 전환 후반 endosome 환경의 산성화 (pH 5.0) 대표를 거쳐야 합니다. 이 PA기 공 주 CMG2 수용 체와기 공 LFN-펜 실바 니 아와 전환 기 공에서 CMG2의 상당한 분리 사이의 약화 바인딩을 발생합니다. 바이오 센서 표면에 LFN thio 첨부 파일 dithiothreitol에 의해 쉽게 반대입니다. 씨 바이오 센서 표면에 감소 해제 LFN-펜 실바 니 아prepore-CMG2 삼항 복잡 하거나 산 LFN-펜 실바 니 아기 공 단지 microliter 볼륨으로 전환. 출시 된 단지 다음 시각 이며 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석을 사용 하 여 식별. 이러한 실험 레이블 없는 라스 방법론을 사용 하 여 특정 단백질 복합물의 키네틱 조립/분해를 모니터링 하 고 구조를 평가 하는 방법을 보여 하 고이 씨의 신원을 전자 현미경 검사 법 및 질량에 의해 단지 조립 분석, 각각, 쉽게 복제 순차적 절차를 사용 하 여.
Introduction
식별 하 고 이해 하는 특이성 단백질 복잡 한 어셈블리에 vivo에서 통치 생화학 연구자에 대 한 극단적인 관심입니다. 큰 이종 단백질 어셈블리는 예외 보다는 규범. 이 개념은 비보 어셈블리, gentler 셀 중단 기법을 사용 하 여 선호도 기반 정화 방법에서 제품을 평가 하 고 그들을 시각화 하는 것은 단지 분리의 광 모니터링 지원 높은 해상도 사용 하 여 극저온 전자 현미경 (cryo-EM)입니다. 셀 내에 어셈블리 특이성의 제어를 이해 하려면 연구자 고 해야 합니다 정기적으로 격리, 식별, 궁극적으로 이러한 동적 조립/분해 구조를 특징. 자주 이러한 어셈블리의 구성 요소를 식별 하기 위해 가장 많이 사용된 분자 도구 셀 중단 동안 복잡 한 안정성 유지에 의존 하는 항 체 기반 immunoprecipitation이 필요 합니다. 다양 한 분석 기법을 결합된 단지 표면 플라스몬 공명 (SPR) 등 미세 기반 방법을 사용 하 여 셀 샘플에서 캡처 최근 개발 되었다. SPR 표면에서 제거, 다음이 샘플 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)1,2에 의해 분석 되었다. 쉽게 프로토콜을 사용 하 여이 방법론을 발전 하는 것은 연구원을 시각화 하 고 셀룰러 환경에서 발생 하는 예측된 단지 허용할 것 이다. SPR 마이크로 시스템 이기 때문에, 문제는 종종 집계 형성에서 발생 한다. 이 문제를 우회 샘플 희석을, 차례 차례로, 농도 책임 생물 단지의 무결성을 줄일 수 있습니다 필요 합니다.
레이블 없는 기술에 비교적 최근의 발전 biolayer 간섭계 (BLI) 시스템3의 개발 이다. 이러한 특정 빛 기반 반사율 복제, 또는 최고의 시스템 에뮬레이션, SPR 바인딩 및 비용3,4 채널 단위를 사용 하는 경우에 특히의 일부분에서 운동 결과. 씨 참조 레이어 (제어)와 (실험) biolayer 표면 사이 반영된 빛 간섭 패턴의 변화를 측정합니다. 단계에서 결과 변경 운동 및 양적 판독5로 실시간으로 측정 됩니다. 포함 된 특정 immobilization 화학, 바이오 센서 표면 솔루션, 측정 파장 위상 심한 통해 SPR, 미세 접근에 의해 버퍼 변경 반대 사이 물리적으로 전송 됩니다. 대량 전송 효과 해결책을 교 반 하 여 수 없습니다. SPR, 달리 이러한 시스템은 원유 생물학 견본에서 단지 평가에 매우 유용 합니다. 씨 실험 동안 주로 측정 실제 매개 변수는 질량 또는 단백질 복잡 한 어셈블리 또는 해체에서 유래 하는 바이오 센서 표면에 두께 변화에 따라 달라 집니다.
이러한 섬유 광섬유 바이오 센서는 사용 하기 쉽고 상대적으로 저렴 한. 씨의 새로운 유용한 측면 중 하나는 표면에서 새로 조립된 단백질 복합물의 손쉬운 제거 이다. Prepore (PAprepore) 전환으로 탄 저 균 독 소 보호 항 (PA) 구성 요소의 단백질 구조 재배치를 유도 하는 대규모 pH의 실시간으로 활동을 관찰 하기 위해 우리의 실험실을 허용 하는이 방법의 최근 응용 프로그램의 기 공 (PA기 공) 형태입니다. 바이오 센서 팁에이 전환 전자 현미경 (EM)6을 사용 하 여 확인 했습니다. 단지 바이오 센서 표면에서의 제거 마이크로 시스템을 사용 하 여 칩 표면에서 단지 발표 때 자주 발생 하는 큰 볼륨 희석 효과 방지 합니다.
현재 작업에서 탄 저 균 독 소 단지는 조립 및 분해 바이오 센서 표면에 그리고 발표 microliter 볼륨으로. 결과 복잡 한 구성 요소는 기가 EM 및 질량 분석 (MS)를 사용 하 여 유효성이 검사 됩니다.
Protocol
1. 어셈블리 Biolayer 간섭계 (BLI) 바이오 센서 표면에 정의 된 고분자 복합물의
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Prepore 탄 저 균 독 소 PDEA 수정 아민 반응 바이오 센서 표면에 복잡 한 조립
- 수 화는 아민 반응 물 10 분 동안 250 µ L에 2 세대 (AR2G) 씨 바이오 센서 팁.
- 단계 시간, BLI 단위를 제어 하는 소프트웨어에 표 1에 나열 된 프로그램 ( 재료의 표참조).
- 바이오 센서 팁 30 250 µ L 물에 immersing 하 여 실행 하는 라스 시작 바이오 센서 두께 밀도의 초기 기준선을 측정 하는 s.
- 50mm NHS (N hydroxysuccinimide)와 200mm EDC (7 분 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) 250 µ L로 팁을 immersing 하 여는 바이오 센서를 활성화.
- 50mm PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) 0.1 M borate 버퍼 (pH 8.5) 활성화 thiol 반응 표면 생성 하 5 분에 용 해 활성화 된 바이오 센서를 담가.
- 100를 포함 하는 솔루션의 250 µ L로 활성화 thiol 반응 바이오 센서를 담가 5 nM E126C LFN 10 m m 나트륨 아세테이트 ph 5.0, 100 mM NaCl, 버퍼.
- 담가 LFN 팁 50 m L-시스테인, 1 m에서 M NaCl, 0.1 M 나트륨 아세테이트, pH 5.0, 4 분, 나머지 반응 무료 thiol 반응 그룹을 끄다.
- 50mm 트리 스, 50mm 버퍼 기준선을 설정 하는 2 분 동안 NaCl 침묵과 LFN 팁을 담가.
- 50 mM Tris, 50mm LFN-펜 실바 니 아prepore 복잡 한 만드는 데 5 분 NaCl 0.5 µ M 보호 항 원 prepore (PAprepore)으로 침묵과 LFN 팁을 담가.
- PAprepore 연결 된 한 번, PAprepore 솔루션에서 끝을 제거 하 고 50 mM Tris, 50 mM NaCl 어떤 비 특히 바인딩된 PAprepore씻어 30 초 동안에 끝을 담가.
- 젖어 복잡 한 LFN-펜 실바 니 아prepore (없이 막 횡단 도메인), 0.5 µ M CMG2 수용 체로 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 분 동안.
- 담가는 LFN-PAprepore-복잡 한 CMG2 50 mM Tris, 30 초 동안 50 m m NaCl로를 양식 사전 endosomal 단지 어떤 언바운드 CMG2 씻어.
- EM 분석에 대 한 릴리스 LFN-펜 실바 니 아prepore-CMG2 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 m m NaCl, PCR 튜브 안쪽의 5 µ L로 팁을 immersing 하 여 바이오 센서 팁에서 복잡 한.
- 복잡 한에서 펩 티 드의 협동 석사 분석, 릴리스 LFN-펜 실바 니 아prepore-CMG2 5 µ L 50mm DTT, 6 M에는 바이오 센서를 immersing 하 여 바이오 센서 팁에서 복잡 한 GuHCl (각 질 없는) 25 m m 염화 중 탄산염 pH 8.0 PCR 내부 튜브 . 이 EM 분석을 위해 사용 되는 것 보다 다른 바이오 센서에서 수행 됩니다.
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PDEA 수정 아민 반응 바이오 센서 표면에 복잡 한 기 공 탄 저 균 독 소의 조립
- 복잡 한 pH 전환 후를 보려면 LFN-펜 실바 니 아prepore를 생성 하는 이전 섹션에서 단계 1.1.1-1.1.12 수행-CMG2 복잡 한.
- 10 m m 초 산 pH 5.0 5 분기 공 전환 PA PAprepore 의 전환을 시작으로 바이오 센서 팁을 담가. 이 변화는 진폭을 증가 표시 (약 0.2 nm)로 인해 상당한 또는 완전 한 수용 체 분리 되도록 가설는 큰 진폭 감소 다음 바인딩 선호도 감소.
- 담가 50 mm Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, 산 성 버퍼를 씻어 30 초 동안 LFN-펜 실바 니 아기 공 팁.
- EM 분석 샘플 이황화 출시 후 솔루션에서 집계를 방지 하기 위해 5 분 동안 사용 micelles 1.25 m m (2.5 m m MSP1D1, 25 m m 나-cholate, 162.5 m POPC m)을 포함 하는 솔루션으로 바이오 센서 팁을 담가.
- EM 분석에 대 한 해제는 LFN-펜 실바 니 아공-바이오 센서 팁에서 복잡 한 Micelle 50mm DTT, 50 mM Tris, PCR 튜브 안에 50 m m NaCl의 5 µ L로 팁을 immersing 하 여.
- 복잡 한에서 펩 티 드의 협동 석사 분석 출시 LF에 대 한N-PApoore 복잡 한 (micelle)는 바이오 센서에서 5 µ L 50mm DTT, 6 M GuHCl (각 질 없는) 25 m m 염화 중 탄산염 pH 8.0 PCR 내부에 바이오 센서를 immersing 하 여 팁 튜브입니다. 이 EM 분석을 위해 사용 되는 것 보다 다른 바이오 센서에서 수행 됩니다.
2. 시각화 하 고 검증 발표 부정적인 얼룩 전자 현미경 검사 법에 의해 씨 바이오 센서에서 고분자 어셈블리
- 글로우 방전 탄소 코팅 Cu 300 표. 전형적인 형광 방전 설정은 0.38 mBar 안정적인 분위기 압력, 부정적인 15 mAmps, 공기 방출 다음 20 초입니다.
- 깨끗 한 핀셋의 쌍 사이 그리드 보안.
- 플라스틱 격자에 PCR 튜브에 출시 된 복잡 한 샘플의 4 µ L 고 60에 대 한 흡착.
- 액체 필터 종이 쐐기 남아 멀리 심지.
- 5 초 후 눈금 0.75% 필터링 0.02 미크론 uranyl 편대의 wicking 멀리 초과 얼룩 pipetting 5 µ L에 의해 얼룩. 그리드를 실 온에서 건조를 허용 합니다.
- 전송 전자 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 샘플 격자를 볼 수 있습니다.
3. 식별의 완전 한 사전 endosomal 탄 저 균 독 소 (LFN-펜 실바 니 아prepore-CMG2) 및 전환 복잡 한 (LFN-펜 실바 니 아기 공 CMG2 없이) 사용 하 여 질량 분석.
- 20 µ L에 나온된 샘플을 희석 하 고 1 시간 동안 품 어.
- 55 m m iodoacetamide, 25 m m 염화 중 탄산염, pH 8.0, 2 µ L을 추가 하 고 (알루미늄 호 일로 덮여) 어둠 속에서 실 온에서 1 시간 동안 품 어.
- 25 m m 염화 중 탄산염의, pH 8.0, 1 m guanidine 염 산 염 농도 줄이기 위해 100 µ L로 샘플을 희석.
- 20 ng / µ L에서 학년 수정 trypsin 시퀀싱의 5 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 빙 초 산에 산도 줄이기 위해 5%의 최종 농도에 추가 < 3, 진공 집중 장치에 10 µ L를 볼륨 줄일.
- NLC 1200 uHPLC의 autosampler에 펩 티 드 솔루션 샘플 접시에 전송.
- 5 µ L uHPLC 반전된 단계 열에 펩 티 드 솔루션 탑재 MS의 이온화 단계에 로드 합니다.
- 5 μL/min의 최대 속도에서 0.1% 개미 산의 15 µ L 열 또는 800 psi의 최대 압력 세척.
- A + b (용 매 a: 0.1% 포 름 산, 0.1% 개미 산 성 용 매 b: 95% 이기)의 5% ~ 40% 용 매 B의 직계 그라디언트를 사용 하 여 90 분 동안 350 nL/min 흐름 속도로 반전 단계 C18 열에서 펩 티 드를 elute.
- 방출 선 협동 MS를 사용 하 여 펩 티 드를 분석 합니다.
- 2500 볼트 및 이온 전송 온도 250 ° c로 이온화 소스 설정
- 3 s 기간에 최대한 많은 협동 MSM 뒤 지속적으로 한 MS 검색을 수행 하는 자동 제어에서 질량 분석기를 작동 CID 및 35의 정규화 된 충돌 에너지를 사용 하 여.
- 표준 방법을 사용 하 여 펩 티 드 및 단백질 구성 요소를 식별 합니다. 이 작품에 대 한 펩 티 드 및 단백질 분석의 두 세트를 수행 했다.
Representative Results
모니터링 하 고 큰 고분자 복합물의 조립 능력 특이성 및 대형 바이오 어셈블리의 기능을 이해를 향한 중요 한 단계입니다. 여기에 소개 하는 방법의 결과 큰 단백질 복합물으로 쉽게 설명 (> 150 kDa 대량) 모든 활동 및 어셈블리의 진폭을 모니터링 하면서 biolayer 간섭계를 사용 하 여 조립 될 수 있다. 바이오 센서 표면의 독특한 소형 자연 어셈블리 분석이 조립된 단지 작은 microvolumes에 공개 하 여 확장할 수 있습니다. 이 microvolumes는 그들을 사용 하 여 단지의 초기 물리적 구조를 시각화 하 고 MS를 사용 하 여 복잡 한 구성의 id를 확인할 사용할 수 있습니다. 이 전체 프로세스에 대 한 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다.
성공적인 어셈블리 및 바이오 센서 표면에 고분자 복합물의 확인에 대 한 핵심 요소 포함 초기 시드 단백질의 적절 한 방향. 그러면, 단백질 단백질 상호 작용 사이트 액세스할 수, sterically 차단, 그리고 바이오 센서 표면에서 최적의 위치는. 그림 2에서 같이, 복잡 한 탄 저 균 독 소의 올바른 방향 치명적인 요소 (LFN)의 특별히 설계 된 N 맨끝 파편을 사용 하 여 이루어집니다 그래서 LFN-펜 실바 니 아prepore 바인딩 사이트는 항상 위치 바이오 센서 공유 첨부 파일 사이트6,7의 반대 야. 다음에 수용 성 CMG2 바인딩 PA LFN 씨 바이오 센서에 펜 실바 니 아의 바인딩과 함께 복잡 한의 후속 증강 궁극적으로 전 유능한 탄 저 균 독 소를 복잡 한 만듭니다.
씨 sensogram 추적은 탄 저 균 독 소 부품의 특정 추가 인해 진폭 변화에서 실시간 읽기는 바이오 센서에 추가 됩니다. 그림 3 대표 추적 대응 과정에서 그 단계에서 형태를 예측 하는 복잡 한 모델을 보여 줍니다. 첫 번째 상승 LFN 끝에 로드 이다. 냉각 및 기준선, 후 다음 펜 실바 니 아prepore LFN LFN-펜 실바 니 아prepore의 조립된 전 endosomal 복잡 한 결과 수용 성 CMG2 수용 체의 추가 의해 다음 바인딩-CMG2. 늦은 endosome 환경으로 진행, 단지 약화 수용 체 바인딩, prepore 그것의 삽입 확장된 막 기 공 구조를 전환 허용 하는 낮은 pH 펄스 (pH 5.0) 복종 된다. 6 단계는 산성화의 Sensogram 흔적 그림 4에 나와 있습니다. 초기 증가 또는 진폭에 ' 스파이크' 기 공 확장6 CMG2 수용 체 바인딩의 감소 하기 전에 발생 해야 하는 가능성이 높습니다. 더 큰 진폭 감소 감소 바인딩 선호도 때문에 가장 가능성이 상당한 또는 완전 한 수용 체 분리 이다. 이 실험실에서 이전 작품 표시 완전히 확장 PA기 공 에 대 한 CMG2 바인딩을 무시할 수 CMG2 PAprepore 상호 작용6에 비해. 또한, sensogram 운동 추적 관찰 LFN-펜 실바 니 아prepore의 모든 sensograms-LFN-PA pH 드롭기 공 CMG2 전환 끝났습니다 재현할 수 여러 번 실행.
이전에 그리고 후에 산성화, 바이오 센서 연결 단지 쉽게 부정적인 얼룩 EM에 의해 시각화 및 MS (그림 5)에 의해 식별에 대 한 해제 됩니다. EM 결과에서 대표적인 단지는 그림 6에 나와 있습니다. 사전-endosomal 샘플 격자 표시 밀도 LFN-펜 실바 니 아prepore구성 된 그대로 삼항 단지와 일치-CMG2. 후 산성화 복잡 한 격자 표시 펜 실바 니 아 기 공에 전환 하 고 아무 명백한 CMG2 밀도 micelle 포함에 의해 solubilized.
Id는 사전 및 사후 산성화 단지 MS에 의해 확인 되었다. 데이터베이스 어디 펜 실바 니 아, P13423;의 시퀀스 LFN, P15917; 그리고 CMG2, P58335 NCBInr 저장소에서 파생 된 마우스 단백질 데이터베이스의 백그라운드에 포함 됐다. 관심사의 단백질만이 첫 번째 데이터베이스 검색, 삼진 및 이진 단지에 대 한 다음 아미노산 보도에서 가져온: 54% 및 PA에 대 한 22%, 36%와 LF에 대 한 6%, 43 %CMG2, 각각 (CMG2 인식 되지 이진 복잡 한에). 단백질 아미노산 범위를 최대화 하기 위해 두 번째 펩타이드/단백질 식별 관심의 3 개의 단백질만을 포함 하는 단백질 데이터베이스를 사용 하 여 수행 되었다. 사전-endosomal MS 샘플 60.46%, 67.97% 54.15% 범위와 모든 3 개의 독 구성 요소에서 펩 티 드를 위해 포함 된 LFN, PA, 및 CMG2, 각각 (그림 7). 포스트 endosomal 결과 그림 8에 포함 된 LFN 및 PA에서 펩 티 드 (57.41% 67.79% 적용, 각각). 게시물 endosomal 샘플에서 CMG2의 부족은 기 공 형성 동안 관찰된 라스 nm 감소와 일치 하는.
그림 1. 단백질 복합물의 분석에 대 한 도식 개요에 조립 및 양 및 그들을 사용 하 여 씨 바이오 센서에서 고립 된 를이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. 바이오 센서 활성화: 첫 번째 단계는 오리엔테이션 특정 어셈블리에 씨 바이오 센서에. E126C 치명적인 요소 N 맨끝 도메인 (LFN) thio 연계 제대로 방향의 PAprepore 바인딩 인터페이스 만들기를 통해 연결 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3. 탄 저 균 독 소 조립과 해체 씨와 모니터링:에서 sensogram 진폭 변화 시간 때문에 탄 저 균의 특정 추가 기능으로 독 소 구성 요소 보여 줍니다 LFN 로드 (단계 4에서 시작 하는 바이오 센서에 추가 표 1)입니다. PAprepore 수용 성 CMG2 수용 체의 뒤 표면에 다음 로드 됩니다. LF-펜 실바 니 아prepore-CMG2 조립된 전 endosomal 복합물에 의하여 이루어져 있다. 늦은 endosome 환경으로 진행, 전체 조립 기능 탄 저 균 독 소 수용 체 바인딩, 전환의 삽입 확장된 막 기 공 구조를 prepore 수 있도록 약화는 낮은 pH 펄스 (pH 5.0) 복종 된다. 기 공에 걸친 막의 노출 확인 이며 solubilized micelles의 추가 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. CMG2 릴리스 씨 sensogram: 산성화 단계의 흔적 보기 초기 증가 또는 진폭에 ' 스파이크' 가능성이 더 큰 진폭 감소 다음 기 공 형성 및 수용 체 분리, 각각. 수직 점선된 레드 라인 새로운 단계의 시작을 나타냅니다. Sensograms 레드 라인을 점선 굵게에 정렬 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5. 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 EM 및 MS를 사용 하 여 씨 바이오 센서에서 격리: 연결 된 단지 쉽게 부정적인 얼룩 EM에 의해 시각화 및 양 에 의해 식별 여기를 클릭 하십시오를 위한 DTT를 포함 하는 버퍼의 5 µ L로 출시 하는 바이오 센서 이 그림의 확대 이미지 보기.
그림 6. EM와 단백질 복합물의 시각화: Pre-endosomal 샘플 격자 표시 밀도 LFN-펜 실바 니 아prepore구성 된 그대로 삼항 단지와 일치-CMG2. 포스트 endosomal 복잡 한 격자 표시 펜 실바 니 아 기 공에 전환 하 고 아무 명백한 CMG2 밀도 micelle에 의해 solubilized. 모델 예측된 단지 (왼쪽)의 개별 입자 표시와 동일한 축척에 있습니다. (EM 밀도의 크기에 따라) 예측 단백질 colorized 입자는 각 입자 아래와 같습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7. MS와 단백질 복합물의 확인: 사전 endosomal MS 샘플 60.46%, 67.97% 54.15% 범위와 모든 3 개의 독 구성 요소에서 펩 티 드를 위해 포함 된 LFN, PA, 및 CMG2, 각각. 틀린 발견 비율 (루즈벨트) 동등 또는 노란색, 루즈벨트 동등 또는 녹색으로 표시 하는 1% 이상에서 5% 보다에서 펩 티 드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8. MS와 단백질 복합물의 확인: LFN 및 PA에서 게시물 endosomal 샘플에 포함 된 펩 티 드 (57.41% 67.79% 적용, 각각), CMG2 하지 하지만. 루즈벨트 같거나 에서처럼 노란색, 루즈벨트 동등 또는 녹색으로 표시 하는 1% 이상 5% 보다 더 높은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | 시간 (s) | 설명 |
| 1 | 30 | 초기 기준선 |
| 2 | 420 | 정품 인증 |
| 3 | 300 | 정품 인증 |
| 4 | 300 | LFN 로드 |
| 5 | 240 | 시스테인 끄다 |
| 6 | 120 | 초기 계획 |
| 7 | 300 | PAprepore 협회 |
| 8 | 30 | 초기 계획 |
| 9 | 300 | CMG2 협회 |
| 10 | 30 | 초기 계획 |
| 11 | 300 | 산 성 전환 |
| 12 | 30 | 초기 계획 |
| 13 | 300 | Micelle 협회 |
표 1. 단일 단계 시간 씨는 복잡 한 어셈블리 탄 저 균 독 소를 실행 하 고. Note 베이스 라인 이전 단계에서 언바운드 단백질을 멀리 세척 하 고는 그리고/또한 새로운 버퍼 기준을 설정 하는 데 사용 됩니다.
Discussion
이 데모에서는 고분자 복잡 한 형성은 biolayer 간섭계를 사용 하 여 쉽게 모니터링할 수 있는, 어떻게 EM을 사용 하 여 시각화 하 고 MS, 모두 짧은 기간에 microvolumes와 함께 확인. 구조 부품 및 생물학 관련 예측, 추가 확인이 결합 된 방법론에 따라 관찰 된 단지. 결과 섹션에서 설명 했 듯이 어셈블리 성공 위한 핵심 요소 인터페이스는 복잡 한 단백질-단백질 바이오 센서 표면에서 제대로 방향이 되도록 합리적으로 설계 된 시스테인 mutagenesis를 필요 합니다.
이전 시스템 2 및 3 구성 요소 시스템의 단백질 바인딩 뿐만 아니라 표현한 단백질의 수용 체 바인딩의 무결성을 평가 하 씨와 MS 기술을 사용 하지만, 두 경우에는 방법 탠덤 EM/MS의 활용 개발 되지 않은 8,9에 접근. 만 다른 간섭계 시스템 특성 상호 작용 수 있도록 MS 분석을 결합 하는 이중 분극 간섭계10했다. 불행히도,이 시스템은 더 이상 일반적인 용도로 사용할 수 있는. 소개에서 설명 했 듯이, 다양 한 연구 샘플 같은 SPR 바이오 센서 표면에 형성 했다 및 MS 분석에서 제거 완료 되었습니다. 그 예의 없음 단지 그들을 사용 하 여 시각화 결과.
이 순차적 방법의 한계 다 수 있지만 풀 수 있습니다. 초기 immobilization, 따라서 어셈블리의 기초 단계에 대 한 구조 상호 작용 표면의 지식 부족 모니터링 초기 어셈블리 단계와 관련 된 진행을 방해 확실히 것 이다. 구조 정보 부족 한 엔지니어링 설계 하 여 해결할 수 있습니다 재단 구성 어디 첨부 화학 (예: sulfhydryl moiety 이황화 결합 / 그의 태그 위치)는 코어 내에서 다양 한 영역을 이동할 수 있습니다 어셈블리 시스템입니다. 복잡 한 탄 저 균 독 소의 경우 PAprepore 에 바인딩된 LFN 의 구조는 사용할 수 있는11행운 이었다. 조작된 시스테인의 합리적인 배치 PAprepore 바인딩 얼굴에서 지역에 지역화 되었습니다. 시스테인 결합 화학, 그것은 다른 반응 시스테인 단백질 표면에 존재 하는 것이 좋습니다.
단백질의 표면에 특정 첨부 파일 사이트를 사용할 수 있는 다양 한 첨부 파일 화학이 있다. 가장 인기 있는 특정 첨부 파일 중 하나는 단백질 표면12에 구체적으로 정의 된 위치에 biotin moiety 위치 포함 됩니다. 불행히도, avidin 또는 streptavidin biotin 바인딩 표면 코팅은 매우 빡 빡. 바인딩 상호 작용의 간단 하지 않습니다. 설계 그의 태그에는 N-또는 C-말단의 사용 및 Ni NTA 표면에 첨부 파일의 후속 용이성 선호도 동원 정지의 더 많은 보편적인 응용 프로그램입니다. 물론, 그의 태그 시스템 엔지니어링 조립 첨부 파일 사이트에 대 한 주의 사항 중 하나는 핵심 어셈블리 단백질 N와 C 테르미니 남아 노출 및 첨부 파일은 쉽게 분리 요구 사항입니다. 로 모든 어셈블리 프로세스와 핵심 어셈블리 단백질의 상호 작용 인터페이스 있어야 합니다 복잡 한 어셈블리 진행으로 사용할 수 있습니다.
아마도 바이오 센서 표면 화학을 사용 하 여 가장 일반적인 관심사는 비 특정 바인딩. Streptavidin 팁은 종종 중요 한 일반적인 바인딩 효과의 소스입니다. 연결 된 이황화 biotin 단단히 고정된 streptavidin 바이오 센서13에 바인딩된 감소 S biotin 링크 뒤에 남겨두고 매우 구체적인 단지 릴리스 사용할 수 있습니다. 다른 가역 화학 iminoboronates 등와 낮은 범위 ketoamide14에 제공 되 고 있다. 이 필드는 현재 저 개발, 하지만 일반적으로 공유 대상된 약물 개발의 사용을 동반 하는 대상에서 약물 독성 효과 피하기 위해 가역 공유 프로토콜 개발에 높은 관심.
EM을 사용 하 여 단지 시각화의 제한 해석, 조립된 단지의 구조 처음 알려져 있지 않습니다 경우에 특히 이다. 특정 운동 및 구조상 감 적으로 단일 클론 항 체 (mAb)를 사용 하 여 구성 요소 내에 정의 되지 않은 조립 고분자의 공간 위치를 확인할 수 있습니다. 예를 들어 복잡 한 형성 되 면 단일 클론 항 체 추가할 수 있습니다는 특정 구성 요소에 바인딩합니다. 이 방법은 큰 어셈블리15내의 특정 구성 요소를 식별 하는 그들에 자주 사용 됩니다. 또 다른 한계는 복잡 한의 크기에 관련, 어디 70 kDa (숙소 heptamer)는 쉽게 작은 정의 된 대칭 어셈블리를 사용 하 여 해결 하는 경우 부정적인 얼룩 EM 되었습니다 있지만. 조립된 단지 그들에 의해 분석 되는 ~ 100 Å 이상 직경에서의 크기 범위에서 일반적 으로입니다. 그러나 최근에, 작은 20 kDa 단백질 해결 되 고 낮은 해상도 구조 우수한 방법론16얼룩을 사용할 때 얻은.
MS 분석을 위해 femtomolar (attomoles) 수준의 현재 MS 계측의 증가 감도 높일 수 있습니다 어떤 경우에 라스 검출의 감도. 그것은 높은 단백질 신호 진폭에 최소 하지만 반복 상승을 나타내는 문제의 단백질의 id 발생 합니다 생각할 수 있는. 또한, 단백질 단백질 상호 작용에는 바이오 센서 및 셀룰러 환경에서 다른 파트너 중 하나를 검색 효과 정화와 새로 형성 된 복잡 한 이후에 쉽게 탐지에 발생 합니다. 현재 매우 민감한 MS 시스템으로 관찰 될 수 있는 한 가지 한계는 관심사의 단백질 데이터베이스에 되지 않을 수도 있습니다 하지만이 관측은 드문 (드문 종에서예: proteomes). 관심사의 단백질의 시퀀스는 알려진 경우,이 문제는 배경 단백질 데이터베이스 (프로토콜 섹션에서이 작업에서와 같이)에 protein(s) 아미노산 시퀀스를 포함 하 여 쉽게 해결 된다. Trypsinolysis 단백질의 저항에서 방법론 결과의 또 다른 잠재적인 제한. 트립 신 소화는 일반적으로 상향식 단백질 식별의 기본 방법입니다. 그러나, 단백질 Arg 및 리스 잔류물 부족 또는 이러한 잔류물에 대 한 액세스는 접힌된 구조에 의해 제한 하는 경우 trypsin에 저항력이 있을 수 있습니다. 이러한 제한은 대안 또는 프로 테아의 조합을 사용 하 여 또는 효소 소화 전에 전개 시 약 (우 레 아 또는 guanidine HCl, 1.1.14와 1.2.6에 표시 된 대로)를 포함 하 여, 각각, 해결 됩니다.
이 방법론의 가능한 확장을 따라 원유 세포 lysates에서 셀룰러 어셈블리 단지 식별 사용자 포함 됩니다. 그것은 밝혀 테스트 위한 집중된 세포 추출 구성 요소 어셈블리 biolayer 간섭계 절차를 사용 하 여 수행 하기 쉽습니다. 막힘을 하는 경향이 하 고 집계에 민감한 더 일반적으로 사용 된 미세 기반 방법론 달리 씨 방법은 직접 biolayer 센서 팁 잠재적으로 특정 단지를 직접 조립 하 원유 추출 물에 젖어 사용할 수 있습니다. 이러한 불순 한 샘플을 집중. 일단 조립, 그것은을 사용 하 여 특정 항 체 프로브 씨 시스템 후속으로 식별 하 고 심지어 MS microvolume 메서드를 사용 하 여 파악 된 세포 추출 물에 의심 스러운된 구성 요소를 quantitate 전적으로 가능 합니다. 다시, 여기 키 특정 선호도 조사로 정의 된, 제대로 지향적인 핵심 단백질을 사용 하는.
기 공 씨와 운동 전환 프로세스 prepore를 볼 수 있는 능력 특히 늦은 endosomal, 낮은 pH (5.0)에서 작동 하는 단백질 전환의 잠재적인 "항 독 소" 작은 분자 억제제를 식별에 매우 도움이 될 것입니다. 조건입니다. 이 유도 하는 pH prepore 전환 기 공 글리세롤 등 자당, 안정제 (osmolytes)를 접는 존재 저해 하 고 따라서 대출해 PA를 방지 하는 특정 타겟된 접는 안정기 개발을 위한 강력한 지원기 공 형성. 이 특정 접근 방지 하 고 원유 집계 기반 분석 실험 pH 단백질 강 수에 리드를 삭제 하는 어디를 대체. 이 후자의 방법을 주 해 방법에 대 한 좋은 있지만 종종 끈다 거짓 긍정적인 결과 특정 화합물 보다는 실제 분자 전환 집계를 억제.
다운스트림 구조 관찰 및 작은 microvolume 샘플 내에서 개별 조립된 부품의 식별 유용할 수 있습니다 또한 잠재적인 리드 화합물을 유효성 검사에. 이 경우 특정 어셈블리 안정화 또는 불안이 대상 결과에 적용할 수 있습니다. 운동/구조/식별 병렬 이렇게 직접 어셈블리의 의심된 리드 복합 이펙터의 유효성을 확인 하는 데 유용 하 고 합리적인 보조 심사 단계 또는 중간 처리량 접근 역할.
Cryo-EM 어셈블리의 다양 한 국가에서 고분자 복합물의 원자 세부 사항 공부 하는 유용한 기술입니다. 곳을 알아내는-EM 샘플 준비, 전에 먼저 준비를 들어 부정적인 얼룩 EM과 합리적으로 순수 동종 단지 확인 하기 중요 하다. 여기에 소개 하는 작업 어셈블리 씨 바이오 센서 표면에 단백질 복합물의 EM 시각화에 대 한이 단지의 출시와 MS를 사용 하 여 이러한 구성 요소 식별 방법을 보여 줍니다. 제어 부품 및 자료의이 특정 방법론 부정적인 얼룩 EM에 전진 하기 전에 증명 해야 하는 필요한 단계에 대 한 동질적인 순차적 샘플 준비를 강화 하는 매우 구체적인 프로토콜을 생성에 유용할 수 있습니다. 곳을 알아내는-EM. 낮은 해상도 3 차원 구조를 얻으려면 복잡 한만 30-50 입자는 필요할 방향 다양성 (여러 개의 다른 전망) 제공 원뿔 기울기 시리즈 (입자 당 70 다른 2D 이미지 조회)을 수행 하.
MS 방법 강화, 관련 감도 발전과 샘플 볼륨 감소 개선 하기 위해 계속 합니다. 나노 흐름과 빠른 의무와 질량 분석기의 개발 함께 초 고압 액체 크로마토그래피 주기, 증가 된 감도 및 분해능. Orbitrap 질량 분석기의 최근 도입, 특히 검색 알고리즘 뿐만 아니라 최신 버전 (orbitrap 퓨전 Lumos 예상된 후속 Orbitrap 퓨전 Lumos 1 M) 크게 용이 하 게이 과정.
현재 방법론 키네틱 조립과 해체 탄 저 균 독 소 구성 요소 레이블 없는 라스 방법론을 사용 하 여 모니터링 하 고 평가 구조와 각각 EM와 MS를 사용 하 여 이러한 구성 요소의 id. 간단한 단일 채널 씨 시스템의 사용 루틴 EM 분석 얼룩 네거티브와 결합 되며 초등 MS 기술을 조립 공정 특성에 적절 한 이상.
Disclosures
이 이번에 아무 공개입니다.
Acknowledgments
이 작품은 매디슨과 라일라 자기 대학원 친교 (AJM), NIH 5T32GM008359에 의해 지원 되었다 (PTO), KUMC 생물 의학 연구 훈련 프로그램 (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), 구 브리징 자금 및 Biomolecule 상호 작용 기술 센터 (BITC) 부여 ( 코네티컷 그리고 MTF)입니다. 저자는 바바라 Fegley KUMC 전자 현미경 검사 법 핵심 편 이미지 수집 지원 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
| 0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
| Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
| Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
| Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
| Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
| BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
| Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
| Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
| Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
| Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
| Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
| L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
| Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
| MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
| Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
| PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
| Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
| Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
| Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
| Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |
References
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