Summary
Her presenterer vi en protokoll for å overvåke montering og demontering av miltbrann giften bruker biolayer interferometry (BLI). Etter montering/demontering på biosensor overflaten, store protein komplekser er løslatt fra overflaten for visualisering og identifikasjon av komponenter i komplekser med elektronmikroskop og massespektrometri, henholdsvis.
Abstract
I vivo, proteiner er ofte en del av store macromolecular komplekser der bindende spesifisitet og dynamikk til slutt bestemmer funksjonelle utganger. I dette arbeidet er pre-endosomal miltbrann giften samlet og gått inn endosomal kompleks. Først er N-terminal domenet en cystein mutant dødelige faktor (LFN) knyttet til en biolayer interferometry (BLI) biosensor gjennom disulfide kobling i en optimal retning, slik at beskyttende antigen (PA) prepore binde (Kd 1 nM). Den optimalt orientert LFN-PAprepore komplekse deretter binder til løselig kapillært morphogenic Gen-2 (CMG2) celle overflaten reseptor (Kd 170 pM), resulterer i en representant miltbrann pre-endosomal kompleks, stabil ved pH 7.5. Dette sammensatte komplekset er så utsatt forsuring (pH 5.0) representant for sent endosome miljøet overgangen PAprepore til membran inn pore tilstand. PApore tilstanden resulterer i en svekket binding mellom CMG2 reseptoren og LFN-PApore og en betydelig avstandtagen for CMG2 fra overgangen pore. Deg selv thio-feste LFN til biosensor overflaten reverseres enkelt av dithiothreitol. Reduksjon på BLI biosensor overflaten utgivelser LFN-PA-prepore-CMG2 trefoldig komplekse eller syre overført LFN-PApore komplekser i mikroliter volumer. Utgitt komplekser er så visualisert og identifisert ved hjelp av elektronmikroskop og massespektrometri. Disse eksperimentene viser hvordan du kan overvåke den kinetiske montering/demonteringen av bestemt protein komplekser bruker etikett-fri BLI metoder og evaluere strukturen og identiteten til disse BLI samlet komplekser av elektronmikroskop og masse massespektrometri, henholdsvis, bruker lett-å-replikere sekvensielle prosedyrer.
Introduction
Identifisere og forstå spesifisitet styrende protein komplekse samlingen i vivo er av ekstrem interesse for biokjemiske forskere. Store heterogene protein samlinger er normen snarere enn unntaket. Denne forestillingen er støttet av spektroskopiske overvåking av i vivo forsamling, isolere komplekser bruke mildere celle avbrudd teknikker, vurderer produkter fra affinitet-baserte rensing metoder og visualisere dem med høy oppløsning Kryogenisk elektronmikroskop (cryo-EM). For å forstå kontroll av montering spesifisitet i cellen, må forskere rutinemessig isolere, identifisere og til slutt karakterisere disse dynamiske montering/demontering strukturer. Det mest brukte molekylære verktøyet for å identifisere komponentene i disse samlingene ofte krever antistoff-baserte immunoprecipitation, som bruker opprettholde komplekse stabilitet under celle avbrudd. Ulike kombinert analytiske teknikker ble nylig utviklet for å fange komplekser fra cellen prøver ved microfluidic basert tilnærminger, slik som overflaten plasmon resonans (SPR). Etter fjerning av SPR overflater, disse prøvene ble analysert av matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering tid av fly (MALDI-TOF)1,2. Fremme denne metoden bruker lettere protokoller vil tillate forskere å visualisere og validere spådd komplekser som forekommer i mobilnettet miljøet. Siden SPR er et microfluidics-basert system, oppstår problemer ofte samlet formasjon. Omgå problemet krever eksempel fortynning, som igjen kan redusere integriteten til konsentrasjon ansvarlig biologiske komplekser.
Et relativt nytt fremskritt i etikett-fri technologies er utvikling av biolayer interferometry (BLI) systemet3. Disse spesielle lys-baserte refleksjon systemer Repliker eller beste etterligne, SPR binding og kinetisk resultater på en brøkdel av kostnaden3,4 spesielt hvis enkeltkanals enheter som skal brukes. BLI måler endringer i reflektert lys forstyrrelser mønstre mellom et referanselag (kontroll) og biolayer overflaten (eksperimentell). Den resulterende forandringen i fase måles i sanntid som en kinetisk og kvantitativ avlesning5. Biosensor overflaten, som inneholder spesifikke immobilisering kjemikalier, overføres fysisk mellom løsninger, i motsetning til buffer endringer av microfluidic tilnærminger i SPR, for måling via bølgelengde fase avvisninger er. Masse overføring effekter er hindret av agitating løsningen. I motsetning til SPR er disse systemene nyttig i å vurdere komplekser fra råolje biologiske prøver. Parameteren fysiske målt under BLI eksperimenter primært avhengig av masse eller tykkelsen på biosensor overflaten som resultatene fra protein komplekse samlingen eller demontering.
Disse fiber optisk biosensors er enkel å bruke og relativt billig. En av de nye nyttige aspektene av BLI er lettvinte fjerning av nylig montert protein komplekser fra overflaten. En nyere anvendelse av denne metoden gjorde vårt laboratorium å observere sanntid kinetics av storskala pH indusert protein struktur omorganisering av miltbrann gift beskyttende antigen (PA) komponenten som prepore (PAprepore) overført til sin pore (PApore) form. Denne overgangen på den biosensor spissen ble bekreftet bruker elektronmikroskop (EM)6. Fjerning av komplekser fra biosensor overflater unngår større volum fortynning effekter ofte spurte når slippe komplekser fra chip overflater når du bruker microfluidics systemer.
I arbeidet, er anthrax gift komplekser samlet og demontert på biosensor overflaten og deretter utgitt i mikroliter volumer. De resulterende komplekse komponentene valideres ortogonalt bruker EM og massespektrometri (MS).
Protocol
1. montering av definerte Macromolecular komplekser på Biolayer Interferometry (BLI) Biosensor overflater
-
Montering av prepore miltbrann toxin komplekse på en PDEA-modifisert Amin reaktive biosensor overflate
- Hydrat et Amin reaktive andre generasjon (AR2G) BLI biosensor tips i 250 µL av vann i ti minutter.
- Programmet trinn ganger, oppført i tabell 1på programvaren kontrollere BLI enheten (se Tabell for materiale).
- Starte BLI drevet av leve biosensor spissen i 250 µL vann i 30 å måle en første opprinnelige biosensor tykkelse og tetthet.
- Aktivere biosensor ved immersing spissen til 250 µL 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide) og 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) i 7 minutter.
- Fordype aktivert biosensor i 50 mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) oppløst inne 0.1 M borate buffer (pH 8.5) i 5 minutter å generere en aktivert thiol-reaktive overflate.
- Dyppe den aktivert thiol-reaktive biosensor i 250 µL løsning som inneholder 100 nM E126C LFN i 10 mM natrium acetate pH 5.0 100 mM NaCl, buffer i 5 minutter.
- Fordype LFN tipset i 50 mM L-cystein, 1 M NaCl, 0.1 M natrium acetate, pH 5.0 i 4 minutter, å slukke eventuelle gjenværende reaktive gratis thiol-reaktive grupper.
- Fordype Let LFN tipset i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 2 minutter å etablere buffer grunnlinjen.
- Dyppe Let LFN spissen i 0,5 µM beskyttende antigen prepore (PAprepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 5 minutter å lage LFN-PAprepore kompleks.
- Når PAprepore er tilknyttet, fjerne tipset fra PAprepore løsning og dyppe spissen i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 30 sekunder å vaske bort noen nonspecifically bundet PAprepore.
- Dyppe LFN-PAprepore kompleks i 0,5 µM CMG2 reseptor (uten transmembrane domenet), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, i 5 minutter.
- Dyppe den LFN-PAprepore -CMG2 kompleks i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 30 sekunder for å vaske bort noen ubundet CMG2 til skjemaet pre-endosomal kompleks.
- For EM analyse, slipper LFN-PA-prepore-CMG2 komplekse fra biosensor spissen ved immersing spissen i 5 µL 50 mm DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, innenfor et PCR-rør.
- For tandem MS analyse av peptider fra komplekset, slipper LFN-PA-prepore-CMG2 komplekse fra biosensor spissen av leve av biosensor i 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratin-ledig), 25 mM ammonium bikarbonat pH 8.0 inne en PCR rør . Dette utføres på en annen biosensor enn den som brukes for EM analyse.
-
Montering av pore miltbrann toxin komplekse på PDEA endret Amin reaktive biosensor overflaten
- For å vise komplekset etter pH overgangen, utføre trinn 1.1.1-1.1.12 i forrige avsnitt for å generere LFN-PAprepore-CMG2 komplekset.
- Fordype biosensor spissen i en 10 mM acetate pH 5.0 i 5 minutter å starte overgangen til PAprepore PApore overgang. Denne overgangen er angitt ved å øke amplituden (ca 0.2 nm) etterfulgt av en større amplitude er hypotesen å være betydelig eller fullstendig reseptor dissosiasjon grunn redusert forpliktende tilhørighet.
- Fordype LFN-PApore tips i 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, i 30 sekunder å vaske av Sure buffer.
- For EM analyse prøven, dyppe biosensor spissen i en løsning som inneholder 1,25 mM micelles (2,5 mM MSP1D1, 25 mM Na-cholate, 162.5 mM POPC) i 5 minutter å hindre samling i løsningen etter disulfide løslate.
- For EM analyse, slipp den LFN-PApore -Micelle komplekse fra biosensor spissen ved immersing spissen i 5 µL 50 mm DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl innenfor et PCR-rør.
- For tandem MS analyse av peptider fra komplekset løslate LFN-PApoore kompleks (ingen micelle) fra biosensor tips ved å fordype biosensor i 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratin-ledig), 25 mM ammonium bikarbonat pH 8.0 inne en PCR rør. Dette utføres på en annen biosensor enn den som brukes for EM analyse.
2. visualisere og validere utgitt Macromolecular samlinger fra BLI Biosensors av Negative flekken elektronmikroskop
- Glød utslipp et karbon-belagt Cu 300 rutenett. Typisk glød utslipp innstillingene er 0.38 mBar stabil atmosfære press, negative 15 mAmps, 20 sekunder, deretter ventilasjon med luft.
- Sikre rutenettet mellom ren pinsett.
- Pipetter 4 µL av utgitt komplekse utvalg i PCR-rør på rutenettet og la adsorpsjon for 60s.
- Veken bort igjen av væske med filter papir kile.
- Stain rutenettet av pipettering 5 µL 0,75% 0.02 mikron filtrert uranyl formatter og fuktspredende bort overflødig flekken etter 5 sekunder. Tillat å tørke ved romtemperatur.
- Vis farget eksempelliste nett bruker transmission elektronmikroskop.
3. identifikasjon av fullstendig Pre-endosomal Anthrax gift komplekse (LFN-Paprepore-CMG2) og gått komplekse (LFN-Papore uten CMG2) bruke massespektrometri.
- Fortynne utgitt prøver å 20 µL og ruge i 1 time.
- Legg 2 µL av 55 mM iodoacetamide, 25 mM ammonium bikarbonat, pH 8.0, og ruge i 1 time ved romtemperatur i mørket (dekket med aluminiumsfolie).
- Fortynne prøven med 100 µL av 25 mM ammonium bikarbonat, pH 8.0, redusere guanidine hydroklorid konsentrasjonen under 1 M.
- Legg til 5 µL av sekvensering karakter endret trypsin på 20 ng/µL og ruge på 37 ° C over natten.
- Legge til iseddik i en endelig konsentrasjon på 5% å redusere pH til < 3, redusere volumet til 10 µL i vakuum konsentrator.
- Overfør peptid løsningen til eksempel plate for autosampler av nLC 1200 uHPLC.
- Laste 5 µL peptid løsningen på en uHPLC omvendt fase kolonne montert på ionisering scenen av MS.
- Vask kolonne med 15 µL av 0,1% maursyre med en maksimal hastighet på 5 µL/min og/eller maksimalt trykk av 800 psi.
- Elute peptider fra kolonnen reverseres-fase C18 på en strømningshastighet på 350 nL/min over en 90 min periode med lineal gradering av 5% til 40% løsemiddel B i A + B (løsemiddel A: 0,1% maursyre, løsemiddel B: 95% acetonitrile med 0,1% maursyre).
- Analysere eluting peptider på linje med tandem MS.
- Angi ionisering kilden til 2500 volt og ion overføring temperaturen til 250 ° C.
- Drive masse spectrometer under automatisk kontroll å utføre kontinuerlig en MS skanning etterfulgt av så mange tandem MSMS som mulig i løpet 3 s CID og en normalisert kollisjon energi 35.
- Identifisere peptid og protein komponenter ved hjelp av standard metoder. For dette arbeidet, var to sett av peptid og protein analyse utført.
Representative Results
Overvåke og validere montering av store macromolecular komplekser er et avgjørende skritt mot forstå spesifisitet og funksjonaliteten til store biomolecular samlinger. Resultatene av metodene presenteres her demonstrere hvor lett som store protein komplekser (> 150 kDa masse) kan samles i biolayer interferometry, alt mens overvåking kinetics og amplituden til montering. Unikt kompakt natur biosensor overflaten muliggjør montering analyse utvides av frigir sammensatte komplekser i små microvolumes. Disse microvolumes kan brukes til å visualisere første strukturen i komplekser bruke EM og kontrollere identiteten til komplekse komponentene bruker MS. En skjematisk oversikt over hele denne prosessen er vist i figur 1.
Et viktig element for vellykket montering og verifisering av macromolecular-komplekset på biosensor overflaten innebærer riktig retning av innledende frø protein. Dette sikrer at protein-protein samhandling områder er tilgjengelig, ikke sterically blokkert og optimalt posisjonerte fra biosensor overflaten. Som vist i figur 2, riktig retning av miltbrann giften komplekse oppnås ved hjelp av et spesielt konstruert N-terminal fragment av dødelige faktor (LFN) så LFN-PAprepore binding området er alltid plassert motsatt av biosensor kovalente vedlegg-område6,7. Påfølgende oppbygging av komplekset med binding av PA til LFN BLI biosensor etterfulgt av løselig CMG2 binding til PA til slutt oppretter en translokasjon kompetent miltbrann gift komplekse.
BLI er sensogram en sanntid lese ut av amplituden endringene på grunn av bestemte tillegg av miltbrann gift komponenter som de er lagt til i biosensor. Figur 3 viser et representativt spor sammen med en modell av komplekset spådd skjema på dette trinnet i prosessen. Første stige er LFN lasting onto drikkepengene. Etter slukke og planlagt, PAprepore deretter binder til LFN etterfulgt av tillegg av løselig CMG2 reseptor resulterer i sammensatte pre-endosomal komplekset av LFN-PAprepore-CMG2. Fremgang mot slutten endosome miljøet, er hele komplekset utsatt for en puls med lav pH (pH 5.0) som svekker reseptoren bindende, slik at prepore overgang til dens utvidede membran inn pore konformasjon. 6 Sensogram spor av forsuring trinnet er vist i Figur 4. Den første økningen eller "topp" i amplitude er sannsynlig pore forlengelsen6 som må skje før nedgangen i CMG2 reseptor bindingen. Større amplitude nedgangen er sannsynligvis vesentlig eller fullstendig reseptor dissosiasjon på grunn av redusert forpliktende tilhørighet. Tidligere arbeid i dette laboratoriet angitt CMG2 binding til det fullt utvidede PApore er ubetydelig i forhold til CMG2-PAprepore interaksjon6. I tillegg sensogram kinetic spor, observert i alle sensograms av LFN-PAprepore-CMG2 overgang til LFN-PApore med en pH slipp, er reproduserbare over flere kjører.
Før og etter forsuring frigis lett biosensor knyttet komplekser for visualisering av negative flekken EM og identifikasjon av MS (figur 5). Representant komplekser fra EM resultater er vist i figur 6. Pre-endosomal eksempelliste nett, Vis tettheter samsvar med intakt trefoldig komplekser bestående av LFN-PAprepore-CMG2. Etter forsuring komplekse rister, Vis PA overført for å pore og solubilized av micelle inkludering med ingen åpenbare CMG2 tetthet.
Identiteten til den pre og post forsuring komplekser ble bekreftet av MS. En database der sekvenser av PA, P13423; LFN, P15917; og CMG2, P58335 var inkludert i en bakgrunn av en mus proteiner database avledet fra NCBInr depotet. Bare proteiner rundt Hentet fra denne første databasesøk, med følgende aminosyre dekning for trefoldig og binære komplekser: 54% og 22% for PA, 36% og 6% for LF og 43% for CMG2, henholdsvis (CMG2 ble ikke funnet på binære komplekset). For å maksimere protein aminosyre dekning, ble en andre peptid/protein-ID utført med en protein-database som inneholder bare tre proteiner av interesse. Pre-endosomal MS prøver inneholdt peptider fra alle tre gift komponenter med 60,46% 67.97% og 54.15% dekning for LFN, PA og CMG2, henholdsvis (figur 7). Post-endosomal resultater, som vist i Figur 8, inneholdt bare peptider fra LFN og PA (57.41% og 67.79% dekning, henholdsvis). Mangel på CMG2 i post-endosomal prøvene er konsekvent med observert BLI nm nedgang under pore dannelsen.
Figur 1. Skjematisk oversikt for analyse av protein komplekser sammen på og isolert fra BLI biosensor EM og MS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Biosensor aktivisering: første trinn i retning bestemt samling på BLI biosensor. E126C dødelig faktor N-terminal domenet, (LFN) er tilknyttet via en deg selv thio-kobling oppretter riktig orientert PAprepore binding grensesnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Overvåking miltbrann gift montering og demontering med BLI: sensogram viser amplituden endringer som en funksjon av tid på bestemte tillegg av anthrax gift komponenter som de er lagt på biosensor starter med LFN lasting (trinn 4 i Tabell 1). PAprepore er så lastet på overflaten etterfulgt av tillegg av løselig CMG2 reseptor. Samlet pre-endosomal komplekset består av en LF-PAprepore- CMG2. Fremgang mot slutten endosome miljøet, hele montere funksjonelle miltbrann gift er utsatt for en puls med lav pH (pH 5.0) som svekker reseptoren bindende, slik at prepore overgang til dens utvidede membran inn pore konformasjon. Eksponering av membranen som spenner over pore er bekreftet og solubilized med tillegg av micelles. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. BLI sensogram av CMG2 release: spor av forsuring trinnet viser en subtil eller "topp" i amplitude avløst av en større amplitude som pore dannelse og reseptor dissosiasjon, henholdsvis. Vertikale stiplede røde linjene betegne starten på et nytt skritt. Sensograms justeres til uthevet prikket rød linje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Analysere protein komplekser sammen på og isolert fra BLI biosensor EM og MS: Biosensor vedlagt komplekser enkelt slippes 5 µL bufferen som inneholder DTT for visualisering av negative flekken EM og identifikasjon av MS. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Visualisering av protein komplekser med EM: Pre-endosomal eksempelliste nett, Vis tettheter samsvar med intakt trefoldig komplekser bestående av LFN-PAprepore-CMG2. Post-endosomal komplekse rister, Vis PA overført for å pore og solubilized av micelle med ingen åpenbare CMG2 tetthet. Modeller av spådd komplekser (venstre side) er på samme skala som enkelte partiklene vises. Partikler fargelegges med anslått protein (basert på størrelsen på EM tetthet) er vist nedenfor hver partikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Verifisering av protein komplekser med MS: Pre-endosomal MS prøver inneholdt peptider fra alle tre gift komponenter med 60,46% 67.97% og 54.15% dekning for LFN, PA og CMG2, henholdsvis. Peptider oppdaget på en false oppdagelsen rate (FDR) lik eller høyere enn 5% vises gule FDR lik eller høyere enn 1% vises i grønt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Verifisering av protein komplekser med MS: Post-endosomal prøver inneholdt peptider fra LFN og PA (57.41% og 67.79% dekning, henholdsvis), men ikke CMG2. FDR lik eller høyere enn 5% vises gule FDR lik eller høyere enn 1% vises i grønt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Tid (s) | Beskrivelse |
| 1 | 30 | Første opprinnelige |
| 2 | 420 | Aktivisering |
| 3 | 300 | Aktivisering |
| 4 | 300 | LFN lasting |
| 5 | 240 | Cystein quench |
| 6 | 120 | Opprinnelig plan |
| 7 | 300 | PAprepore association |
| 8 | 30 | Opprinnelig plan |
| 9 | 300 | CMG2 forening |
| 10 | 30 | Opprinnelig plan |
| 11 | 300 | Acid overgang |
| 12 | 30 | Opprinnelig plan |
| 13 | 300 | Micelle forening |
Tabell 1. Trinn times for enkelt BLI kjørt til montering miltbrann giftstoffer komplekse. Merk at opprinnelige planer er å vaske bort ubundet protein fra forrige trinn og/eller fastsette nye buffer baseline.
Discussion
Denne demonstrasjonen viser hvordan macromolecular komplekse formasjon kan lett overvåkes ved hjelp av biolayer interferometry, visualisert bruke EM, og bekreftet med MS, med microvolumes i et kort tidsrom. Strukturelle montering og observerte komplekser følge biologisk relevante spådommer, ytterligere validering denne kombinerte metodikken. Som nevnt i resultatinndelingen, krever viktig element for montering suksess rasjonelt utviklet cystein mutagenese å sikre at de komplekse protein-protein grensesnittene er riktig orientert fra biosensor overflaten.
Tidligere systemer har brukt BLI og MS teknikker for å evaluere protein binding av to og tre komponentsystemer og integriteten til reseptoren binding av uttrykt protein, men i begge tilfeller metodene ble ikke utviklet for å dra nytte av tandem EM/MS nærme8,9. Bare ble andre interferometry som kombinert MS analyse for å karakterisere interaksjoner systemet en dual-polarisering interferometry10. Dessverre, dette systemet er ikke lenger tilgjengelige for generell bruk. Som nevnt i innledningen, har det vært en rekke studier der prøver ble dannet på SPR-lignende biosensor overflater og fjernet fra MS analyse. Ingen av de eksemplene resulterte i komplekser visualisert bruke EM.
Begrensningene for denne sekvensielle metoden kan være mange, men er solvable. For første immobilisering og derfor foundation trinn av forsamlingen, ville mangel på kunnskap av strukturelle samhandling overflater absolutt hindrer fremgang tilknyttet overvåking første montering faser. Mangel på strukturinformasjon kan rettes ved å utforme en konstruert foundation konstruere hvor vedlegg kjemikalier (f.eks sulfhydryl moiety for disulfide sammenhengene / hans-merket posisjonering) kan flyttes til ulike regioner i kjernen montering system. I tilfelle av miltbrann giften komplekse var det heldig at strukturen i LFN bundet til PAprepore er tilgjengelig11. Rasjonell plassering av konstruert cystein var lokalisert til områder fra PAprepore binding ansiktet. Med cystein sammenhengen kjemikalier er det best at ingen andre reaktive cysteinene finnes på protein overflaten.
Det finnes ulike vedlegg kjemikalier som kan brukes til ingeniør spesifikk tilknytning nettstedet på et protein overflater. En av de mest populære bestemt vedleggene innebærer posisjonering en biotin moiety et spesifikt definert sted på protein overflaten12. Dessverre biotin binding til en streptavidin eller avidin belagt overflater er ganske stramt. Reversering av bindende samspillet er ikke enkel. Bruk av en utviklet hans-tag på N - eller C-terminus og påfølgende brukervennlighet vedlegg til Ni-NTA overflater er en mer universell anvendelse av affinitet immobilisering. Selvfølgelig, er en av begrensningene for engineering montering vedlegg nettsteder med hans-merket systemer kravet som N - og C-termini av kjernen montering protein er utsatt og atskilt slik at vedlegget er lett. Som med alle assembly prosesser, må samhandling grensesnittet av kjernen montering protein være tilgjengelig som komplekse samlingen utvikler seg.
Kanskje er den mest felles interesse av benytter biosensor overflaten kjemikalier uspesifisert bindende. Streptavidin tips er ofte en kilde til betydelig uspesifisert bindende effekter. Disulfide knyttet biotin kan brukes til å gi svært spesifikke komplekser etterlot redusert S-biotin sammenhengen bundet til immobilisert streptavidin biosensors13. Det er andre reversibel kjemikalier blir tilgjengelig som iminoboronates og en mindre grad ketoamide14. Dette feltet er for tiden underutviklet, men det er høy interesse videreutvikle reversibel kovalente protokoller for å unngå off-målet medikament toksisitet-effekter som ofte følger bruk av kovalente målrettet narkotika utvikling.
En begrensning av bruke EM for å visualisere komplekser er tolkning, spesielt i tilfeller der strukturer av sammensatte komplekser ikke er opprinnelig kjent. Romlig plasseringen av komponentene i en udefinert sammensatte macromolecular kompleks kan identifiseres ved hjelp monoklonale antistoffer (mAb) som bestemte kinetic og strukturelle markører. For eksempel når en kompleks er dannet, kan monoklonale antistoffer legges som binder seg til bestemte komponenter. Denne metoden brukes ofte i EM for å identifisere bestemte komponenter i store samlinger15. En annen begrensning er relatert til størrelsen på anlegget, men det har vært tilfeller der definerte symmetrisk samlinger så liten som 70 kDa (GroES heptamer) er lett løses ved hjelp av negative flekken EM. Samlet komplekser som analyseres av EM er vanligvis i området størrelse ~ 100 Å diameter eller over. Nylig imidlertid proteiner så små som 20 kDa har blitt løst og lav oppløsning strukturer er anskaffet ved bruk av overlegen flekker metoder16.
For MS analyse, kan økt følsomhet av gjeldende MS instrumentering ned til femtomolar (attomoles)-nivå i noen tilfeller øke sensitiviteten av BLI gjenkjenning. Det er svært tenkelig at protein signaler som viser en minimal, men repeterbare amplituder vil resultere i identifikasjon av proteinet i spørsmålet. I tillegg vil sondering protein-protein interaksjoner med en av partnerne festet på biosensor og den andre i en mobilnettet miljø faktisk føre en rensing og senere enklere påvisning av nydannede komplekset. En begrensning som kan observeres med gjeldende svært følsom MS systemer er at protein rundt ikke er i databasen, men denne observasjonen er sjelden (f.eks proteomes fra sjeldne arter). Hvis sekvenser av proteiner av interesse er kjent, er problemet lett løste av inkludert protein(s) aminosyresekvens i bakgrunnen protein database (som beskrevet i dette arbeidet i delen protokollen). En annen potensiell begrensning av metodikken resultater fra motstanden av et protein til trypsinolysis. Trypsin fordøyelsen er vanligvis standardmetoden for bunnen protein identifikasjon. Proteiner kan imidlertid være motstandsdyktig mot trypsin hvis de mangler Arg og Lys rester eller tilgang til disse rester er begrenset av brettet strukturen. Disse begrensningene er løst, henholdsvis ved å bruke alternativ eller en kombinasjon av proteaser inkludert en unfolding reagens (urea eller guanidine HCl, som angitt i 1.1.14 og 1.2.6) før enzymatisk fordøyelsen.
Mulig utvidelser av denne metodikken inkluderer tillater brukeren å følge og identifisere mobilnettet montering komplekser fra råolje mobilnettet lysates. Det viser seg testing for montering komponenter i konsentrerte mobilnettet ekstrakter er enkel å utføre bruke biolayer interferometry prosedyrer. I motsetning til vanlige microfluidic basert metoder som er utsatt for tilstopping og følsom for aggregering, kan BLI tilnærming brukes til direkte dyppe biolayer sensor tips i råolje ekstrakter å potensielt montere bestemt komplekser direkte fra konsentrert urene prøvene. Når samlet, er det helt mulig å bruke spesifikt antistoff sonder som en oppfølging til BLI systemet å identifisere ytterligere og selv quantitate mistanke om komponentene i mobilnettet ekstrakter som ble identifisert med metoden microvolume MS. Igjen, nøkkelen her er å bruke definerte, riktig orientert kjernen proteiner som spesifikk affinitet sonder.
Visning av prepore for å pore overgangsprosessen kinetically med BLI vil være svært nyttig i å identifisere potensielle "anti-gift" små molekyl hemmere av protein overgangene som spesielt fungere under sent endosomal, lav pH (5.0) forhold. Denne pH indusert prepore til pore overgangen er hemmet i nærvær av folding stabilisator (osmolytes) som glyserol eller sukrose, og dermed gir sterk støtte for å utvikle bestemte målrettet folding stabilisatorer som hindrer PApore formasjon. Denne spesifikke unngår og erstatter råolje aggregering-baserte analyser der pH drops føre til protein nedbør. Denne siste metoden, fører selv om det er bra for primære kvalifisering prescreening metoder, ofte til falske positive resultater der bestemte forbindelser hemme aggregering i stedet for de faktiske molekylær overgangene.
Nedstrøms observasjoner av strukturen og identifisering av de sammensatte enkeltkomponenter i små microvolume prøver kan også være nyttig i validere potensielle bly forbindelser. Dette kan brukes i tilfeller der bestemte montering stabilisering eller destabilisering er målet utfallet. Denne kinetiske/struktur/identifikasjon parallelle tilnærmingen er nyttig for direkte bekrefter gyldigheten av mistenkte bly sammensatte effektor av forsamlingen og fungerer som en rimelig sekundær screening trinn eller medium gjennomstrømming tilnærming.
Cryo-EM er en nyttig teknikk å studere atomic detaljene i Makromolekyl komplekser i ulike statene montering. Før forberede cryo-EM prøver, er det viktig å først kontrollere en forberedelse inneholder rimelig ren homogen komplekser med negative flekken EM. Arbeidet presentert her viser montering av protein komplekser på BLI biosensor overflater, utgivelsen av disse kompleksene for EM visualisering, og identifisering av disse komponentene bruker MS. Denne spesielle metoden av kontrollert montering og slipp kan være nyttig å generere svært spesifikke protokoller som forbedrer homogen sekvensiell eksempel forberedelse til negative flekken EM, et nødvendig skritt som må påvises før fremme til Cryo-EM. For å få lav oppløsning 3D struktur, ville bare 30-50 partikler av komplekse være nødvendig å utføre en konisk tilt serie (70 forskjellige 2D-bilde visninger per partikkel) forutsatt at det er retningen mangfold (flere forskjellige visninger).
Med hensyn til styrke MS metoder, fortsette fremskritt i følsomhet og reduksjon i eksempel volum å forbedre. Nano strømmer og svært høyt trykk væske kromatografi sammen med utviklingen av masse spektrometre med en rask plikt syklus, økt følsomhet og oppløsningsevne. Siste innføring av orbitrap masse spectrometer, spesielt den nyeste versjonen (orbitrap Fusion Lumos, og etterfølgeren forventet Orbitrap Fusion Lumos 1M) samt søkealgoritmer forenkle denne prosessen.
Gjeldende metodikken overvåker kinetic montering og demontering av miltbrann gift komponenter ved hjelp av etikett-fri BLI metoder og evaluerer struktur og identiteten til disse komponentene med EM og MS, henholdsvis. Bruk av enkle én kanal BLI systemet kombinert med rutine negative flekker EM analyse og elementære MS teknikker er mer enn tilstrekkelig til å beskrive en monteringen.
Disclosures
Ingen avsløringer på dette tidspunktet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Madison og Lila selv Graduate Fellowship (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC biomedisinsk forskning Training Program (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU Bridging midler og Biomolecule samspillet teknologi Center (BITC) gi ( CT og MTF). Forfatterne vil gjerne takke Barbara Fegley KUMC elektronmikroskop kjernen for hjelp med TEM bildeopptak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
| 0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
| Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
| Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
| Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
| Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
| BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
| Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
| Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
| Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
| Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
| Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
| L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
| Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
| MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
| Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
| PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
| Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
| Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
| Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
| Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |
References
- Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis. Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).
- Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis. The Analyst. 137, 386-392 (2012).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).
- Pall. BLI Technology. , Available from: http://www.fortebio.com/bli-technology.html (2018).
- Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance. Biochemistry. , (2013).
- Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs. Protein Science. 22, 492-501 (2013).
- Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens. Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).
- Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system. Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).
- Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring. Biosensors & Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).
- Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers. Nature Structural & Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).
- Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).
- Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry. Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).
- Bandyopadhyay, A., Gao, J. Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators. Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).
- Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding. The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).
- Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research. Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).
