Summary
Her præsenterer vi en protokol for at overvåge montering og afmontering af miltbrand toksin ved hjælp af biolayer interferometri (BLI). Efter montering/demontering på biosensor overflade, de store proteinkomplekser er udgivet fra overfladen til visualisering og identifikation af komponenter af komplekser ved hjælp af elektronmikroskopi og massespektrometri, henholdsvis.
Abstract
In vivo proteiner er ofte en del af store makromolekylære komplekser hvor bindende specificitet og dynamik i sidste ende diktere funktionelle udgange. I dette arbejde, er pre-endosomal miltbrand toksin samlet og overført til den komplekse endosomal. Først, N-terminal domænet af en mutant dødbringende faktor cystein (LFN) er knyttet til en biolayer interferometri (BLI) biosensor gennem disulfid kobling i en optimal orientering, så beskyttende antigen (PA) prepore at binde (Kd 1 nM). Den optimalt orienteret LFN-PAprepore komplekse derefter binder sig til opløselige kapillær morphogenic gen-2 (CMG2) celle overflade receptor (Kd 170 pM), hvilket resulterer i et repræsentativt miltbrand pre-endosomal kompleks, stabil pH-værdi på 7,5. Denne samlet komplekset er derefter udsat for forsuring (pH 5,0) repræsentant for den sene endosome miljø til overgangen PAprepore ind i membranen indsat pore tilstand. Dette PApore staten resulterer i et svækket binding mellem CMG2 receptor og LFN-PApore og en betydelig dissociation af CMG2 fra overgangen pore. Thio-udlæg i LFN biosensor overflade er nemt vendes ved dithiothreitol. Reduktion på BLI biosensor overflade frigiver LFN-PAprepore-CMG2 ternære kompleks eller syre skiftet LFN-PApore komplekser i microliter mængder. Frigivne komplekser er derefter visualiseres og identificeret ved hjælp af elektronmikroskopi og massespektrometri. Disse eksperimenter viser, hvordan til at overvåge den kinetiske forsamling/afmontering af specifikke proteinkomplekser ved hjælp af etiket-fri BLI metoder og evaluere strukturen og identitet af disse BLI samlet komplekser ved elektronmikroskopi og masse massespektrometri, henholdsvis, ved hjælp af let at kopiere sekventielle procedurer.
Introduction
At identificere og forstå specificitet for protein kompleks samling i vivo er af ekstrem interesse for biokemiske forskere. Store heterogene protein forsamlinger er normen snarere end undtagelsen. Denne opfattelse understøttes af spektroskopiske overvågning i vivo forsamling, isolere komplekser ved hjælp af blidere celle forstyrrelser teknikker, evaluering produkter fra affinitet-baserede rensning metoder og visualisere dem med høj opløsning kryogene elektronmikroskopi (cryo-EM). For at forstå kontrol af forsamling specificitet i cellen, skal forskerne rutinemæssigt isolere, identificere og i sidste ende karakterisere disse dynamiske montering/demontering strukturer. De mest anvendte molekylære værktøj til at identificere komponenterne i disse forsamlinger ofte kræver antistof-baserede immunoprecipitation, som bygger på at opretholde komplekse stabilitet under celle forstyrrelser. Forskellige koblede analytiske teknikker blev for nylig udviklet fange komplekser fra celle prøver ved hjælp af mikrofluid baserede tilgange, såsom overflade plasmon resonans (SPR). Efter fjernelse fra SPR overflader, disse prøver blev analyseret af matrix assisted laser desorption/Ionisation tid for flyvning (MALDI-TOF)1,2. Fremme denne metode ved hjælp af lettere protokoller vil gøre det muligt for forskere at visualisere og validere forudsagte komplekser, der forekommer i det cellulære miljø. Da SPR er en mikrofluidik-baseret system, opstår problemerne ofte fra samlede dannelse. Omgå dette problem kræver prøveopløsning, hvilket igen kan mindske integriteten af koncentration ansvarlig biologiske komplekser.
En forholdsvis ny fremgang i label-frie teknologier er udviklingen af biolayer interferometri (BLI) system3. Disse særlige lys-baserede Reflektionsgraden systemer Repliker, eller bedste emulere, SPR bindende og kinetic resultater på en brøkdel af omkostningerne3,4 især hvis single channel-enheder bruges. BLI måler ændringer i reflekteret lys indblanding mønstre mellem et referencelag (kontrol) og biolayer overflade (eksperimentel). Den deraf følgende ændring i fase måles i realtid som en kinetisk og kvantitative udlæsning5. Biosensor overflade, der indeholder specifikke immobilisering kemi, er fysisk overført mellem løsninger, i modsætning til buffer ændringer af mikrofluid tilgange i SPR, for måling via bølgelængde fase omlægges. Masse overførsel effekter forhindres af agiterer løsningen. I modsætning til SPR er disse systemer ganske nyttig ved vurdering komplekser fra rå biologiske prøver. Parameteren fysiske målt under BLI eksperimenter primært afhænger af en ændring i masse eller tykkelse på biosensor overfladen, som resulterer fra protein kompleks montering eller afmontering.
Disse fiber optic biosensorer er brugervenlige og relativt billige. En af de nye nyttige aspekter af BLI er letkøbt fjernelse af nyligt forsamlede proteinkomplekser fra overfladen. En nylig anvendelse af denne metode er tilladt vores laboratorium at observere realtid kinetik af stor skala pH induceret protein struktur omlejring af miltbrand toksin beskyttende antigen (PA) komponent som prepore (PAprepore) skiftet til sin pore (PApore) form. Denne overgang i biosensor tippet blev kontrolleret ved hjælp af elektronmikroskopi (EM)6. Fjernelse af komplekser fra biosensor overflader undgår større volumen fortynding effekter ofte stødt når frigive komplekser fra chip overflader, når du bruger mikrofluidik systemer.
I den nuværende arbejde, er miltbrand toksin komplekser samlet og afmonterede på biosensor overflade og derefter frigives i microliter mængder. De resulterende komplekse komponenter valideres ortogonalt ved hjælp af EM og massespektrometri (MS).
Protocol
1. montering af definerede makromolekylære komplekser på Biolayer interferometri (BLI) Biosensor overflader
-
Montering af prepore miltbrand toksin kompleks på en PDEA-ændret Amin reaktive biosensor overflade
- Hydrat en reaktiv Amin anden generation (AR2G) BLI biosensor tip i 250 µL vand i ti minutter.
- Program trin gange, der er anført i tabel 1, på softwaren kontrollerende BLI enhed (Se Tabel af materialer).
- Start BLI køre ved at nedsænke biosensor tip i 250 µL vand til 30 s til at måle en indledende baseline biosensor tykkelse og tæthed.
- Aktivere biosensor ved nedsænkning spidsen i 250 µL 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide) og 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) i 7 minutter.
- Fordybe den aktiverede biosensor i 50 mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) opløses i 0,1 M Borat buffer (pH 8,5) i 5 minutter til at generere en aktiveret thiol-reaktive overflade.
- Fordybe den aktiverede thiol-reaktiv biosensor i 250 µL opløsning indeholdende 100 nM E126C LFNielsen i 10 mM natrium acetat pH 5,0, 100 mM NaCl, buffer i 5 minutter.
- Fordyb LFN tip i 50 mM L-Cystein, 1 M NaCl, 0,1 M natriumacetat, pH 5,0, for 4 minutter, til at slukke eventuelle resterende reaktive frie thiol-reaktive grupper.
- Fordyb quenched LFN spidsen i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 2 minutter at etablere buffer baseline.
- Fordyb quenched LFN spidsen ind i 0,5 µM beskyttende antigen prepore (PAprepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 5 minutter at oprette LFN-PAprepore kompleks.
- Når PAprepore er forbundet, fjerne spidsen fra PAprepore løsning og fordybe aflæsse i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 30 sekunder til at vaske væk enhver ikke-specifikt bundet PAprepore.
- Fordybe LFN-PAprepore kompleks i 0,5 µM CMG2 receptor (uden den transmembrane domæne), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, i 5 minutter.
- Fordybe LFN-PAprepore -CMG2 kompleks i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 30 sekunder for at vaske væk enhver ubundne CMG2 form pre-endosomal kompleks.
- Til EM analyse, frigive LFN-PAprepore-CMG2 komplekse fra biosensor tip ved at nedsænke spidsen ind 5 µL af 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, inde i en PCR rør.
- For tandem MS analyse af peptider fra komplekset, frigive LFN-PAprepore-CMG2 komplekse fra biosensor tip ved at nedsænke biosensor i 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratin-fri), 25 mM ammoniumbicarbonat pH 8,0 inde en PCR rør . Dette udføres på en anden biosensor end den, der anvendes til EM analyse.
-
Montering af pore miltbrand toksin komplekse på PDEA-ændret Amin reaktive biosensor overflade
- For at se komplekse efter pH overgang, udføre trin 1.1.1-1.1.12 i forrige afsnit for at generere LFN-PAprepore-CMG2 kompleks.
- Fordybe biosensor tip i en 10 mM acetat pH 5,0 5 minutter til at iværksætte overgangen af PAprepore til PApore overgang. Denne overgang er indiceret ved at øge amplitude (ca 0.2 nm) efterfulgt af en større amplitude tilbagegang, der er en hypotese at være væsentlig eller fuldstændig receptor dissociation grund formindsket bindende affinitet.
- Fordyb LFN-PApore tip i 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0, for 30 sekunder til at vaske af sure buffer.
- For eksemplet EM analyse fordybe biosensor tip i en oploesning indeholdende 1,25 mM micelles (2,5 mM MSP1D1, 25 mM Na-cholat, 162,5 mM POPC) i 5 minutter for at forhindre akkumulering i løsning efter disulfid udgivelse.
- Til EM analyse, frigive LFN-PApore -Micelle komplekse fra biosensor tip ved at nedsænke spidsen ind 5 µL af 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl inde i en PCR rør.
- For tandem MS analyse af peptider fra komplekset, frigive LFN-PApoore komplekse (ingen micelle) fra biosensor tip ved at nedsænke biosensor i 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratin-fri), 25 mM ammoniumbicarbonat pH 8,0 inde en PCR rør. Dette udføres på en anden biosensor end den, der anvendes til EM analyse.
2. visualisere og validere udgivet makromolekylære samlinger fra BLI biosensorer af Negative pletten elektronmikroskopi
- Glød decharge en kulstof-belagt Cu 300 gitter. Typiske glød decharge indstillinger er 0.38 mBar stabil atmosfære pres, negative 15 mAmps, 20 sekunder, derefter udluftning med luft.
- Sikker gitter mellem et par ren pincet.
- Afpipetteres 4 µL af frigivne komplekse prøve i PCR rør ind på nettet og tillade adsorption til 60 'er.
- Vægen væk resterende væske med en filtrerpapir kile.
- Pletten gitteret af pipettering 5 µL af 0,75% 0,02 micron filtreret uranyl formate og fugtspredende væk overskydende pletten efter 5 sekunder. Tillad gitter til tørt ved stuetemperatur.
- Se farvede prøve net ved hjælp af et transmissions-elektronmikroskop.
3. identifikation af komplet Pre-endosomal miltbrand toksin komplekse (LFN-Paprepore-CMG2) og skiftet komplekse (LFN-Papore uden CMG2) ved hjælp af massespektrometri.
- Fortynd frigivne prøver til 20 µL og Inkuber i 1 time.
- Tilføj 2 µL af 55 mM iodoacetamide, 25 mM ammoniumbicarbonat, pH 8,0, og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i mørke (dækket med alufolie).
- Fortyndes prøven med 100 µL af 25 mM ammoniumbicarbonat, pH 8,0, at reducere guanidin hydrochlorid koncentration under 1 M.
- Tilsæt 5 µL af sekventering grade ændret trypsin på 20 ng/µL og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Tilføje iseddike til en endelig koncentration på 5% til at reducere pH til < 3, derefter reducere lydstyrken til 10 µL i vakuum koncentrator.
- Overføre peptid løsning til prøve plade på autosampler af nLC 1200 uHPLC.
- Indlæse 5 µL peptid løsning på en uHPLC med omvendt fase kolonne monteret på stadiet ionisering af MS.
- Vaske kolonnen med 15 µL af 0,1% myresyre med en maksimal hastighed på 5 µL/min og/eller gribeflade er højst 800 psi.
- Elueres peptider fra omvendt fase C18 kolonne med en væskehastighed på 350 nL/min over en 90 min periode ved hjælp af en lineal forløb på 5% til 40% af opløsningsmiddel B i A + B (solvent A: 0,1% myresyre; opløsningsmiddel B: 95% acetonitril med 0,1% myresyre).
- Analysere fremstilling peptider på linje ved hjælp af tandem Massespektrometri.
- Angiv ionisering kilden til 2500 volt og ion overførsel temperaturen til 250 ° C.
- Betjene massespektrometer under automatisk kontrol til at foretage løbende en MS efterfulgt af så mange tandem MSMS som muligt i en 3 s periode, ved hjælp af CID og en normaliseret kollisionen energi på 35.
- Identificere peptid og protein komponenter ved hjælp af standard metoder. For dette arbejde, blev to sæt af peptid og protein analyse udført.
Representative Results
Evnen til at overvåge og validere samling af store makromolekylære komplekser er et afgørende skridt mod forståelse specificitet og funktionalitet af store Biomolekylær forsamlinger. Resultaterne af de metoder, der præsenteres heri påvise lethed med hvilken store proteinkomplekser (> 150 kDa masse) kan samles ved hjælp af biolayer interferometri, alt imens overvågning kinetik og amplitude af forsamlingen. Unik kompakt arten af biosensor overfladen muliggør forsamling analyse bør udvides ved at frigive forsamlede komplekser i små microvolumes. Disse microvolumes kan bruges til at visualisere den oprindelige fysiske struktur af de komplekser, ved hjælp af EM og til at bekræfte identiteten af de komplekse komponenter ved hjælp af MS. En skematisk oversigt over hele denne proces er vist i figur 1.
Et centralt element for vellykket forsamling og verifikation af makromolekylære kompleks på biosensor overflade indebærer ordentlig orientering af startbasis protein. Dette sikrer, at protein-protein interaktion websteder er tilgængelige, ikke sterically blokerede og optimalt placeret væk fra biosensor overflade. Som vist i figur 2, den korrekte orientering af miltbrand toksin komplekse er opnået ved hjælp af et specielt manipuleret N-terminale fragment af dødbringende faktor (LFN) så LFN-PAprepore bindingssted placeres altid modsatte af biosensor kovalente vedhæftet fil site6,7. Den efterfølgende ophobning af komplekset med bindingen af PA til LFN BLI biosensor efterfulgt af opløselige CMG2 binding til PA i sidste ende skaber en translokation kompetente miltbrand toksin komplekse.
BLI sensogram spor er en real-time læse ud af amplitude ændringer som følge af specifikke tilsætning af miltbrand toksin komponenter, når de føjes til biosensor. Figur 3 viser en repræsentativ trace parret med en model af komplekset forudsagt til at danne ved at trin i processen. Den første stigning er LFN indlæsning på spidsen. Efter dæmper og baseline, PAprepore derefter binder til LFN efterfulgt af tilsætning af opløselige CMG2 receptor resulterer i det forsamlede pre-endosomal kompleks af LFN-PAprepore-CMG2. For at gøre fremskridt mod den afdøde endosome miljø, er hele komplekset underkastes en lav pH puls (pH 5,0), der svækker receptor binding, så prepore til overgangen til dens udvidede membran indsat pore kropsbygning. 6 Sensogram spor af trinnet forsuring er vist i figur 4. Indledende stigning eller 'spike' i amplitude er sandsynligvis pore udvidelse6 der skal opstå forud for faldet i CMG2 receptor bindingen. Den større amplitude tilbagegang er sandsynligvis væsentlig eller fuldstændig receptor dissociation på grund af formindsket bindende affinitet. Tidligere arbejde i dette laboratorium angivet CMG2 binding til det fuldt udbygget PApore er ubetydelig i forhold til CMG2-PAprepore interaktion6. Derudover sensogram kinetic spor, observeret i alle sensograms af LFN-PAprepore-CMG2 overgange til LFN-PApore med et pH fald, er reproducerbare over flere kørsler.
Forud for og efter forsuring udgivet biosensor knyttet komplekser nemt for visualisering af negative pletten EM og identifikation af MS (figur 5). Repræsentative komplekser fra EM resultater er vist i figur 6. Pre-endosomal prøve gitre, Vis tætheder overensstemmelse med intakt ternære komplekser bestående af LFN-PAprepore-CMG2. Efter forsuring komplekse gitre, Vis PA skiftet til pore og oploeses ved micelle integration med ingen indlysende CMG2 tæthed.
Identitet af den før og efter forsuring komplekser blev kontrolleret af MS. En database hvor sekvenser af PA, P13423; LFNielsen, P15917; og CMG2, P58335 indgik i en baggrund af en mus proteiner database stammer fra NCBInr-lageret. Kun proteiner af interesse stammer fra denne første databasesøgning, med de følgende aminosyre dækning for de ternære og binære komplekser: 54% og 22% for PA, 36% og 6% for LF og 43% for CMG2, henholdsvis (CMG2 blev ikke fundet på den binære kompleks). For at maksimere protein aminosyre dækning, blev en anden peptid/protein identifikation udført ved hjælp af en protein database indeholder kun de tre proteiner af interesse. Pre-endosomal MS prøver indeholdt peptider fra alle tre toksin komponenter med 60,46%, 67.97% og 54.15% dækning for LFNielsen, PA og CMG2, henholdsvis (figur 7). Post-endosomal resultaterne, vist i figur 8, indeholdt kun peptider fra LFNielsen og PA (57.41% og 67.79% dækning, henholdsvis). Manglen CMG2 i prøverne, indlæg-endosomal er i overensstemmelse med de observerede BLI nm fald under pore dannelse.
Figur 1. Skematisk oversigt for analyse af proteinkomplekser samles på og isoleret fra BLI biosensor ved hjælp af EM og MS. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Biosensor aktivering: første skridt i retningen specifikke forsamling på BLI biosensor. Domænet E126C dødbringende faktor N-terminal, (LFN) er forbundet gennem en thio-sammenkædning oprettelse ordentligt orienteret PAprepore bindende interface. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Overvågning af miltbrand toksin forsamling og demontering med BLI: sensogram viser amplitude ændringer som funktion af tiden på grund af særlige tilføjelsen af miltbrand toksin komponenter som de er tilføjet på biosensor startende med LFN lastning (trin 4 i Tabel 1). PAprepore der derefter indlæses overfladen, efterfulgt af tilsætning af opløselige CMG2 receptor. Samlet pre-endosomal-komplekset består af en LF-PAprepore- CMG2. For at gøre fremskridt mod den afdøde endosome miljø, samle hele funktionelle miltbrand toksin er udsat for en lav pH puls (pH 5,0), der svækker receptor binding, så prepore til overgangen til dens udvidede membran indsat pore kropsbygning. Eksponering af membranen spanning pore er bekræftet og oploeses ved tilsætning af micelles. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4. BLI sensogram af CMG2 release: spor af forsuring trin viser en indledende stigning eller 'spike' i amplitude efterfulgt af en større amplitude tilbagegang, der sandsynligvis pore dannelse og receptor dissociation, henholdsvis. Lodrette stiplede røde linjer angiver starten af et nyt skridt. Sensograms er justeret på fed prikket rød linje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Analysere proteinkomplekser samles på og isoleret fra BLI biosensor ved hjælp af EM og MS: Biosensor vedlagte komplekser frigives let i 5 µL af buffer indeholdende DTT for visualisering af negative pletten EM og identifikation af MS. venligst klik her for at Se en større version af dette tal.
Figur 6. Visualisering af proteinkomplekser med EM: Pre-endosomal prøve gitre, Vis tætheder overensstemmelse med intakt ternære komplekser bestående af LFN-PAprepore-CMG2. Post-endosomal komplekse gitre, Vis PA skiftet til pore og oploeses ved micelle med ingen indlysende CMG2 tæthed. Modeller af forudsagte komplekser (venstre side) er på den samme skala som individuelle partiklers vist. Partikler farvelagt med forudsagte protein (baseret på størrelsen af EM tæthed) er vist nedenfor hver partikel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Verifikation af proteinkomplekser med MS: Pre-endosomal MS prøver indeholdt peptider fra alle tre toksin komponenter med 60,46%, 67.97% og 54.15% dækning for LFNielsen, PA og CMG2, henholdsvis. Peptider opdaget en falsk opdagelse sats (FDR) lig med eller højere end 5% vist i gult, FDR lig med eller højere end 1% vist i grøn. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Verifikation af proteinkomplekser med MS: Post-endosomal prøver indeholdt peptider fra LFNielsen og PA (57.41% og 67.79% dækning, henholdsvis), men ikke CMG2. FDR lig med eller højere end 5% vist i gult, FDR lig med eller højere end 1% vist i grøn. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Tid (s) | Beskrivelse |
| 1 | 30 | Første grundlinje |
| 2 | 420 | Aktivering |
| 3 | 300 | Aktivering |
| 4 | 300 | LFN lastning |
| 5 | 240 | Cystein dæmpningen |
| 6 | 120 | Baseline |
| 7 | 300 | PAprepore forening |
| 8 | 30 | Baseline |
| 9 | 300 | CMG2 forening |
| 10 | 30 | Baseline |
| 11 | 300 | Syre overgang |
| 12 | 30 | Baseline |
| 13 | 300 | Micelle association |
Bord 1. Trin gange for enkelt BLI køre til forsamling miltbrand toksin komplekse. Bemærk, at oprindelige planer bliver brugt til at vaske væk ubundet protein fra forrige trin og/eller etablere en ny buffer baseline.
Discussion
Denne demonstration illustrerer hvordan makromolekylære kompleks dannelse kan overvåges let, ved hjælp af biolayer interferometri, visualiseret ved hjælp af EM, og verificeret med MS, alle med microvolumes i et kort tidsrum. Strukturelle forsamling og observerede komplekser følge de biologisk relevante forudsigelser, yderligere validering af denne kombinerede metode. Som nævnt i afsnittet resultater, kræver det centrale element for forsamling succes rationelt manipuleret cystein mutagenese til at sikre, at komplekse protein-protein-grænseflader er korrekt orienteret fra biosensor overflade.
Tidligere systemer har brugt BLI og MS teknikker til at evaluere protein binding af to og tre komponent systemer og integritet af receptor binding af udtrykt protein, men i begge tilfælde, metoderne, der blev ikke udviklet for at drage fordel af tandem EM/MS tilgang8,9. Kun andre interferometri systemet der kombineret MS analyse for at hjælpe med at karakterisere interaktioner var en dual-polarisering interferometri10. Desværre, dette system er ikke længere tilgængelig til almindelig brug. Som nævnt i indledningen, har der været en række undersøgelser afsluttet hvor prøver blev dannet på SPR-lignende biosensor overflader og fjernet fra MS analyse. Ingen af disse eksempler resulterede i komplekser visualiseres ved hjælp af EM.
Begrænsningerne i denne sekventielle metode kan være mange, men kan løses. For indledende immobilisering og derfor foundation trin af forsamlingen, ville en manglende viden om de strukturelle interaktion overflader sikkert hindre fremskridt forbundet med overvågning indledende forsamling faser. Manglen strukturoplysninger kan løses ved at designe en manipuleret foundation konstruere hvor vedhæftet fil kemi (fx sulfhydryl gruppe for disulfid forbindelser / hans-mærket positionering) kan blive flyttet til forskellige regioner i kernen montering system. I tilfælde af miltbrand toksin kompleks var det heldigt, at strukturen af LFN bundet til PAprepore er tilgængelige11. Rationel placering af de manipuleret cystein var lokaliseret til regionerne fra PAprepore bindende ansigt. Med cystein kobling kemi er det at foretrække, at ingen andre reaktive cysteines er til stede på protein overflade.
Der er forskellige vedhæftede kemi, som kan bruges til ingeniør specifikke vedhæftet fil site på et protein overflader. En af de mest populære bestemte vedhæftede filer indebærer positionering et biotin gruppe på en specielt defineret placering på protein overflade12. Desværre, biotin binding til en streptavidin eller begærlighed belagt overflader er ganske stramme. Tilbageførsel af bindende interaktion er ikke enkle. Brug af en manipuleret hans-tag på N - eller C-terminus og den efterfølgende lethed af tilknytning til Ni-NTA overflader er en mere universel anvendelse af affinitet immobilisering. Selvfølgelig, er en af forbehold for engineering forsamling vedhæftede fil sites med hans-mærkede systemer kravet om, at N - og C-termini core forsamling protein forblive udsat og adskilt så at den vedhæftede fil er let. Som med alle forsamling processer, skal core forsamling protein interaktion grænseflade forblive tilgængelig som komplekse forsamling skrider frem.
Måske er den mest almindelige bekymring for at bruge biosensor overfladen kemi ikke-specifik binding. Streptavidin tips er ofte en kilde til betydelige ikke-specifikke bindende virkninger. Disulfid knyttet biotin kan bruges til at frigive meget specifikke komplekser efterlod nedsat S-biotin koblingen stramt bundet til immobiliseret streptavidin biosensorer13. Der er andre reversible kemi bliver til rådighed som iminoboronates og et mindre omfang ketoamide14. Dette felt er i øjeblikket underudviklede, men der er stor interesse i videreudvikling af reversibel kovalente protokoller for at undgå off målet narkotika toksiske virkninger, som almindeligt ledsager brugen af udvikling af kovalent målrettede lægemidler.
En begrænsning af bruger EM til at visualisere komplekser er fortolkning, især i tilfælde hvor strukturerne af de forsamlede komplekser i første omgang ikke er kendt. Den rumlige placering af komponenter i en udefineret forsamlede makromolekylære komplekset kan identificeres ved hjælp af monoklonale antistoffer (mAb) som specifikke kinetisk og strukturelle markører. For eksempel, når en kompleks er dannet, kan monoklonale antistoffer tilføjes at binde sig til specifikke komponenter. Denne metode bruges ofte i EM til at identificere bestemte komponenter inden for store forsamlinger15. En anden begrænsning er relateret til størrelsen af komplekset, selvom der har været tilfælde hvor definerede symmetrisk forsamlinger så lille som 70 kDa (GroES heptamer) er nemt løses ved hjælp af negativ pletten EM. Samlet komplekser, som er analyseret ved EM er typisk i størrelsesområde for ~ 100 Å i diameter eller ovenfor. Seneste dog proteiner så små som 20 kDa er blevet løst og lav opløsning strukturer er opnået, når du bruger superior farvning metoder16.
For MS analyse, kan den øgede følsomhed nuværende MS instrumentering ned på femtomolar (attomoles) i nogle tilfælde øge følsomheden af BLI påvisning. Det er meget tænkeligt, at protein signaler, der viser en minimal, men repeterbare stigning i amplituder vil føre til identifikation af det pågældende protein. Derudover vil sondering protein-protein interaktioner med en af partnerne fastgjort på biosensor og den anden i en cellulære miljø i realiteten resultere i en rensning og efterfølgende lettere afsløring af den nydannede kompleks. Én begrænsning, som kan observeres med de nuværende meget følsomme MS systemer er, at protein af interesse er muligvis ikke i databasen, men denne observation er sjældne (f.eks. proteomes fra sjældne arter). Hvis sekvenser af proteiner af interesse er kendt, er dette problem uden sammenligning løst af herunder de(n) aminosyresekvens i en baggrund protein database (som beskrevet i dette arbejde i afsnittet protokol). En anden potentiel begrænsning af metoden, der skyldes modstanden i et protein til trypsinolysis. Trypsin fordøjelsen er typisk standardmetoden til bottom-up-protein identifikation. Dog kan proteiner være modstandsdygtige over for trypsin, hvis de mangler Arg og Lys restkoncentrationer eller adgang til disse rester er begrænset af den foldede struktur. Disse begrænsninger er løst, henholdsvis ved hjælp af alternativ eller en kombination af proteaser eller herunder et udfoldelsen reagens (urinstof eller guanidin HCl, som anført i 1.1.14 og 1.2.6) før Enzymatisk nedbrydning.
Mulige udvidelser af denne metode omfatter, tillade bruger hen til følge og identificere cellulære forsamling komplekser fra rå cellulære lysates. Det slår test for forsamling komponenter i koncentreret cellulære ekstrakter er let at udføre ved hjælp af biolayer interferometri procedurer. I modsætning til mere almindeligt anvendte mikrofluid baserede metoder, der er udsat for tilstopning og følsom over for sammenlægning, kan BLI tilgang bruges til direkte Fordyb biolayer sensor tips til rå ekstrakter til potentielt samle specifikke komplekser direkte fra disse koncentrerede urene prøver. Når samlet, er det helt muligt at bruge specifikke antistof sonder som opfølgning på BLI system til yderligere at identificere og kvantificere selv mistænkt komponenter i cellulære ekstrakter, der blev identificeret ved hjælp af metoden microvolume MS. Igen, centrale her er at bruge definerede, korrekt orienterede core proteiner som specifik affinitet sonder.
Evnen til at se prepore for at pore overgangsprocessen kinetically hos BLI vil være yderst nyttigt til at identificere potentielle "anti-toksin" lille molekyle hæmmere af protein overgange, som specielt fungerer under sent endosomal, lav pH (5,0) betingelser. Denne pH induceret prepore til pore overgang hæmmes ved tilstedeværelse af folde stabilisator (osmolytes) som glycerol eller saccharose, og dermed låner stærk støtte til udvikling af specifikke målrettede folde stabilisatorer, der forhindrer PApore dannelse. Denne særlige tilgang undgår og erstatter rå sammenlægning-baserede assays hvor pH falder føre til protein nedbør. Sidstnævnte metode, fører selvom godt for primære prescreening metoder, ofte til falsk-positive resultater hvor specifikke stoffer hæmmer sammenlægning i stedet for de faktiske molekylære overgange.
Downstream observationer af strukturen og identifikation af de enkelte forsamlede komponenter inden for små microvolume prøver kan også være nyttige i at validere potentielle blyforbindelser. Dette kan anvendes i tilfælde hvor enten specifikke forsamling stabilisering eller destabilisering er målet resultatet. Denne kinetiske/struktur/identifikation parallel tilgang er nyttig for direkte bekræftelse af validiteten af formodede bly sammensatte effektorer forsamlingsfrihed og fungerer som en rimelig sekundær screening trin eller medium gennemløb tilgang.
Cryo-EM er en nyttig teknik til at studere atomare detaljerne i makromolekyle komplekser i forskellige stater i forsamling. Forud for udarbejdelsen af cryo-EM prøver, er det vigtigt først bekræfte et præparat indeholder nogenlunde ren homogen komplekser med negative pletten EM. Det arbejde, der præsenteres heri viser samling af proteinkomplekser på BLI biosensor overflader, frigivelse af disse komplekser til EM visualisering og identifikation af disse komponenter ved hjælp af MS. Denne særlige metode af kontrollerede forsamling og udgivelse kan være nyttig i generere meget specifikke protokoller, der forbedrer homogen sekventielle prøveforberedelse til negative pletten EM, et nødvendigt skridt, der skal godtgøres inden man rykkede til Cryo-EM. For at opnå lav opløsning 3D struktur, vil kun 30-50 partikler af komplekse være nødvendigt at udføre en konisk tilt serie (70 forskellige 2D billede visninger pr partikel), forudsat der er orientering mangfoldighed (flere forskellige visninger).
Med hensyn til forbedring af MS-analysemetoder, fortsat fremskridt inden for følsomhed og reduktion i stikprøven volumen forbedre. Nano strømme og ultra-højtryk væskekromatografi sammen med udviklingen af massespektrometre med en hurtig pligt cyklus, øget følsomhed og opløsningsevne. Nylige indførelse af orbitrap massespektrometer, navnlig i den nyeste version (orbitrap Fusion Lumos, og dens forventede efterfølger Orbitrap Fusion Lumos 1M) samt søgealgoritmer høj grad lette denne proces.
Den nuværende metode overvåger kinetic montering og afmontering af miltbrand toksin komponenter ved hjælp af etiket-fri BLI metoder og evaluerer strukturen og identitet af disse komponenter ved hjælp af EM og MS, henholdsvis. Brugen af en simpel enkelt kanals BLI system kombineret med rutine negative farvning EM analyse og elementære MS teknikker er mere end tilstrækkelige til at karakterisere en samling proces.
Disclosures
Ingen oplysninger på nuværende tidspunkt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Madison og Lila Self Graduate stipendium (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC biomedicinsk forskning træning Program (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU Bridging midler og biomolekyle interaktion teknologier Center (BITC) tilskud ( CT og MHF). Forfatterne vil gerne takke Barbara Fegley KUMC elektronmikroskopi kernen for bistand med TEM billede erhvervelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
| 0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
| Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
| Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
| Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
| Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
| BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
| Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
| Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
| Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
| Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
| Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
| L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
| Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
| MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
| Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
| PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
| Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
| Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
| Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
| Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |
References
- Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis. Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).
- Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis. The Analyst. 137, 386-392 (2012).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).
- Pall. BLI Technology. , Available from: http://www.fortebio.com/bli-technology.html (2018).
- Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance. Biochemistry. , (2013).
- Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs. Protein Science. 22, 492-501 (2013).
- Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens. Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).
- Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system. Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).
- Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring. Biosensors & Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).
- Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers. Nature Structural & Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).
- Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).
- Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry. Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).
- Bandyopadhyay, A., Gao, J. Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators. Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).
- Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding. The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).
- Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research. Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).
