Summary
ここで提案するグラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) を生成するプロトコル スフェロプ ラストとグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) 明確に可視化し、急速に特徴付けるプロトプ ラストペプチド細菌の相互作用。これは膜透過ペプチドとローカライズを定義する体系的な方法を提供します。
Abstract
細菌内でペプチドの局在パターンを評価する方法としての共焦点顕微鏡の使用は、従来の光顕微鏡の解像度の限界によって阻害される一般的。小さな棒状グラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) とグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) を変換するプロトコルを提案する特定の顕微鏡の解像度は簡単に強化できない、大きく、簡単にイメージ化された球状形態にスフェロプ ラストやプロトプ ラストと呼ばれます。この変換では、迅速かつ明確にペプチド (すなわち膜のローカライズ) 細菌の細胞膜に自分自身を申し立てるか (すなわち、透過) セルを入力する膜を通過するかどうかを決定するためのオブザーバーをことができます。このアプローチでは、ローカライズや透過膜としてペプチドを特徴付けるため体系的な方法を示します。Buforin II P11A の相互作用を観察することによりこのプロトコルの有用性を示す様々 な膜活性ペプチドや細菌の緊張のこのメソッドを使用できますが、(BF2 P11A)、エシェリヒア属大腸菌での抗菌ペプチド (AMP)スフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラスト。
Introduction
抗菌ペプチド (アンペア) は、従来の抗生物質1,2,3,4、5の代わりに、彼らの潜在的な使用のため注目を集めています。アンプによって細胞膜透過や核酸など、細胞内構成要素との相互作用構造のセル内容6漏洩を引き起こす膜で細菌を殺します。、抗生物質として利用に加えてアンプを透過が適応する薬物送達アプリケーションの無停止不浸透性の細胞膜7、8を越えることができるので。我々 は、したがって、創での使用のための基盤を築くためのアクションの基本的なアンプのメカニズムを理解しようとします。
共焦点顕微鏡アクション9,10、11,12,のメカニズムに洞察力を提供する細菌細胞の蛍光に分類されたアンプの局在パターンを評価する方法を提供しています。13,14. 細菌の膜の分類、によって 1 つは蛍光に分類されたペプチドが膜または細菌の細胞の細胞内領域に局在するかどうかを決定できます。ただし、この手法は、従来の光顕微鏡の解像度の限界と可変方向スライド15上の細菌のために挑戦をイメージングすることができます細菌の小さなサイズとロッドの形状によって制限されます。
提案手法の目的は、共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識ペプチドの局在パターンの強化された可視化を有効にすることです。小型、薄型、桿菌グラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) とグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) を回すことによって可視化を強化拡大、球状形態に細菌と呼ばれる(グラム陰性菌) のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト (グラム陽性菌) の16,17,18,19,20,21。スフェロプ ラストとプロトプ ラストは、そのサイズの増加とそのイメージングの無関係なスライドの細菌の向きは、その左右対称の形状のためイメージしやすく。また、ローカライズや透過のいずれかの膜としてアンプを特徴付けるために共焦点顕微鏡データを定量的に解析する体系的なアプローチを提案する.これらの方法を適用しやすく区別蛍光ペプチドの局在パターンに分類します。ここに示すプロトコルは、各種アンプ、セル透過ペプチドを含む以外膜活性剤のローカリゼーションを評価するために使用できます。
この手法の利点は、細胞間の異質性15、一般的に識別するために使用される他の蛍光アッセイではなく明らかにするかもしれない単一セルのレベルのアンプの作用のメカニズムに洞察力を提供することの 1 つ、アンプは、一括見積もり9,22,23,24,25を提供するだけの行為のメカニズム。スフェロプ ラストとアンプ セルへの入力を評価するためにプロトプ ラストの使用特定の有用な26彼らこそ脂質小胞24など、セルへの入力を評価するために使用されるその他のモデルよりももっと生理学的に関連する15 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ソリューションの準備
注:エシェリヒア属大腸菌のスフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラストをそれぞれ生産するために手順 1.1-1.9 1.8-1.11 で説明するソリューションを準備します。
- 準備 1 M トリス-Cl、10.34 g トリス塩酸と dH2O 125 mL フラスコ 50 mL にトリスああ 4.17 g を溶解して pH 7.8。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。
- 0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) と 25 mL dH2125 mL フラスコ内 O 11.98 g ショ糖 (342.3 g/mol) を溶解することによりソリューション (20 mM MgCl2、0.7 M ショ糖、10 mM トリス-塩素、pH 7.8) を準備します。500 μ L を追加 1 M トリス Cl (pH 7.8) し、50 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。
- ソリューション B (10 mM MgCl2、0.8 M ショ糖、10 mM トリス-塩素、pH 7.8) を準備するには、0.05 g MgCl2 (95.2 g/mol) と 13.69 g ショ糖 (342.3 g/mol) 25 mL dH2125 mL のフラスコで O に溶解します。500 μ L を追加 1 M トリス Cl (pH 7.8) し、50 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。
- 50 mL dH2O は、125 mL のフラスコで 13.69 g ショ糖 (342.3 g/mol) を溶解することにより 0.8 M ショ糖を準備します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。
- 5 mg/mL デオキシリボヌクレアーゼの準備私 (DNase 私) 0.015 g DNase 溶解 dH250 mL フラスコ O の 3 mL で。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい。Microfuge の管、-20 ° C でストアに割り切れるソリューション
- 0.125 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の準備、0.698 g EDTA 二ナトリウムを溶解して pH 8.0 15 mL dH2O 125 mL のフラスコの中に (372.2 g/mol) を脱水します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。
- 600 μ g/mL セファレキシンを準備するには、50 ml の dH2O 125 mL のフラスコの中のセファレキシン水和物 (365.404 g/mol) の 0.03 g を溶解します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい、4 ° C での円錐管に格納
- DH250 mL フラスコ O の 3 mL で 0.015 g リゾチームを溶解して 5 mg/mL リゾチームを準備します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい。Microfuge の管、-20 ° C でストアに割り切れるソリューション
- 1 l の dH2O 2 L フラスコで TSB の 30 g を溶解することにより、3 w/v トリプチ醤油スープ (TSB) を準備します。因数にフラスコ 25 mL または 100 mL それぞれ大腸菌スフェロプ ラストまたはB. メガテリウムプロトプ ラスト,の準備で使用される TSB を含むソリューション。液体培地を滅菌するオートクレーブ フラスコ。滅菌 TSB は室温または 4 ° C で保存できます。
- 34.23 g ショ糖 (342.3 g/mol)、0.46 g マレイン酸 (116.07 g/mol) と 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O 250 mL フラスコ 100 mL に溶解して溶液 (1 の M ショ糖、0.04 M マレイン酸、0.04 M MgCl2、pH 6.5) を準備します。6.5 に pH を調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。
- 100 mL 3 w/v TSB と 100 mL の溶液 C 1 L のガラス瓶を混合することによってプロトプ ラスト中の 200 mL を準備します。オートクレーブ ソリューションを殺菌し、常温で保存します。
2. 一晩かけて培養の準備
注: セクション 2-4 適切な無菌技術を使用してを実行します。必要な場合、細菌は潜在的な汚染を減らすために抗生物質耐性のプラスミドを含めることができます。抗生物質耐性の菌株を使用している場合は、手順 2.1、3.1-3.2 と、図 4.1-4.4 で必要な抗生物質を追加します。
- 滅菌ピペット チップを使用して、それを 3 %w/v TSB の 2-3 mL を含む 14 mL 培養管細菌の単一コロニーをピックアップして一晩かけて培養を準備します。37 ° C で 16-21 h に振りながらインキュベートします。
3 グラム陰性大腸菌スフェロプ ラストの作成
- 250 mL フラスコ 25 mL 量 3 %w/v TSB で一晩文化 1: 100 を希釈し、37 ° C で細菌のソリューションをソリューションは 600 0.5-0.8 の光学濃度に達するまでに約 2.5 時間振りながらインキュベート nm。分光光度計を使用して光の密度を測定します。
- 250 mL フラスコにこの文化 1:10 3 %w/v TSB の 30 ml を希釈し、インキュベート 37 ° C についての 1 つのセルのフィラメントを生成する 60 μ G/ml セファレキシン (347.4 g/mol) の存在下で 2.5 h に振りながら長さ 50-150 μ m、光学顕微鏡 (図 1 b) 1,000 倍の倍率で観察可能であります。
- 1,500 × g、4 ° C で 4 分間デカントで細菌のソリューションを遠心分離によってフィラメントを収穫し、ペレットを予約、上澄みを廃棄します。
- 優しく 0.8 M ショ糖、ペレットを邪魔しないように注意されているの 1 つの mL を追加することでフィラメントを洗います。1 分間インキュベートし、ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。
- 1 の 150 μ L を追加 5 mg/mL リゾチームの 120 μ L、5 Mg/ml の DNase の 30 μ M トリス Cl (pH 7.8)、私は、120 μ L、それぞれ 0.125 M EDTA のペレットに注文し、10 分間室温でソリューションを孵化させなさい。
- 溶液の 1 mL 徐々 に 1 分以上ソリューションに追加、ソリューションを手でゆっくり旋回しながら、マイクロ ピペットを使用して 3.5 の準備します。室温で 4 分のためのソリューションを孵化させなさい。
- 4 ° C の溶液 B の 7 mL を 2 つの 15 mL の円錐管に入れます。これらの 2 つの管のそれぞれに 3.6 で、溶液の同量を追加します。1,500 × g、4 分の 4 ° C で溶液を遠心します。
- ペレットを乱すことがなく 1-2 mL の培養上清を除くすべて削除血清ピペットを使用して、慎重に。P1000 マイクロ ピペットを使用して上下に軽くピペッティングでペレットを再懸濁します。光学顕微鏡 (図 1) を使用して 1,000 倍の倍率でサンプルを観察することによってスフェロプ ラスト形成を視覚的に確認します。
- -20 ° C で 1 週までまたは彼らは 3 凍結融解サイクルを経てまでスフェロプ ラストを格納します。
4. グラム陽性B. メガテリウムプロトプ ラストの調製
- 250 mL のフラスコで 3 %w/v TSB の 100 mL で一晩文化縮尺を希釈し、37 ° C で細菌のソリューションをソリューションが 0.9-の光学密度に達するまで、約 4.5 時間のため震えながらインキュベート 600 1.0 nm。分光光度計を使用して光の密度を測定します。
- 液体培養を注ぎ、2 つの 50 mL の円錐管、2,000 × g、10 分の 4 ° C で遠心します。
- 血清ピペットを使用して、両方の円錐管から上澄みを廃棄します。2.5 mL プロトプ ラスト中でペレットを再懸濁します再懸濁のソリューションを単一の円錐管に結合しています。125 mL のフラスコで結合された再懸濁ソリューションをピペットします。
- 5 mg/mL リゾチームの 1 mL を追加し、震えながら 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- プロトプ ラスト 1,000 x 倍率球 (図 2) ではなく腫れ棒として表示される細菌などの任意の不正を指摘し、光学顕微鏡下での成長を監視します。血清ピペットを使用して、ソリューションを 15 mL の円錐管と 2,000 × g、10 分の 4 ° C で遠心分離機に転送します。
- 上清をデカントし、再 5 mL プロトプ ラスト メディアでペレットを中断します。-20 ° C で 1 週までまたは彼らは 3 凍結融解サイクルを経てまでプロトプ ラストを格納します。
5. ペプチド溶液および膜色素イメージングのための準備
-
ペプチド ソリューション
- アルミ箔に包まれておよび microfuge の管で FITC 800 μ L dH2O を使用して蛋白質の濃度測定を実施するために、少なくとも 1 つのトリプトファン残基を含むペプチドで BF2 P11A をラベル付けの 2 mg を溶解します。
- オンカラム、280 でペプチド溶液の吸光度を測定 3 通 nm。トリプトファン (5,700/Mcm) における分子吸光係数を用いたペプチド濃度を計算します。
- 光から保護するためにアルミ箔に包まれて2O-20 ° c および microfuge の管で 100-200 μ m ストアの最終濃度に dH でペプチド濃度を希釈します。
-
膜色素
- および microfuge の管でのディ-8-ANEPPS DMSO の 843.3 μ L で 5 mg を溶解してディ-8-ANEPPS (592.9 g/mol) の 10 の mM の在庫を準備します。光から保護するためにアルミ箔に包まれた 4 ° C で保存します。
- および microfuge の管で 997 μ L DMSO に 3 μ L の 10 mM ディ-8-ANEPPS を追加して 0.03 mM ディ-8-ANEPPS の 1 mL を準備します。光から保護するためにアルミ箔に包まれた 4 ° c および microfuge の管に格納します。
6.大腸菌スフェロプ ラストと共焦点顕微鏡を用いたB. メガテリウムプロトプ ラストの可視化
- スフェロプ ラストまたはポリ L リジン コーティング ガラス スライド上にプロトプ ラストの 5 μ L をピペットします。アンプ (100-200 μ M) をスライドにラベルが付いた FITC の 2 μ L を追加し、光から保護 3 分間インキュベートします。
- スライドに、膜色素・ ディ ・-8-ANEPPS (0.03 mM) の 1 μ L を追加し、光から保護 3 分間インキュベートします。ガラス基板カバーし、マニキュアで封印します。
- 共焦点顕微鏡とアルゴン レーザーをオンにします。アルゴン レーザーで出力電力 20% と 20% の伝送を調整します。
- 499-532 nm と FITC 標識ペプチド放出チャネルとディ 8 ANEPPS 標識膜色素放出チャネルの 670-745 nm の発光波長範囲をそれぞれ設定します。
- プロトプ ラスト イメージまたは 63 X 目的としたスフェロプ ラスト (図 1および図 2)。8 ビットを取得するイメージング ソフトウェアを使用して、画像を 512 x 512 複合 z スタックから成るスフェロプ ラストやプロトプ ラストの全体の 0.5 μ m のスライス。
注: は、イメージングのスフェロプ ラストとプロトプ ラスト中の裁ち落としを通じて排出量を減らすための配慮を取る。詳細についてを参照してください。
7 アンプの局在化の特性
- イメージング ソフトウェアで複合 z スタックのイメージを開きます。スフェロプ ラストやプロトプ ラストの中央のスライスを見つけて 1 つ循環地域の利益率 (ROI) を配置 (直径 0.3 μ m)、スフェロプ ラストのプロトプ ラスト (ROI 2) センターで、スフェロプ ラストまたは測定するプロトプ ラストからの膜 (投資収益率 1)背景の蛍光性 (投資収益率 3) (図 5)。飽和ピクセルを含めることを避けてください。各 ROI の蛍光強度は、画像処理ソフトで計算できます。
注: インスタンス ペプチドは、細胞膜の完全ローカライズされていない、描画 ROI 1 ペプチドはローカライズされた膜の領域に。 - 細胞内ペプチド蛍光強度膜ペプチドの蛍光強度の比を決定する次の式を使用します。
注: 投資収益率 3 の蛍光強度は蛍光バック グラウンドを考慮するために 2 の投資収益率と投資収益率 1 で蛍光強度から差し引かれます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
細菌を拡大して、球は、簡単に、ペプチドは細菌の細胞膜にローカライズや細菌の細胞膜に容易に若しかどうかを区別できます。従来の光顕微鏡の解像度限界は膜にローカライズされた信号と重複するように見えるために、膜または通常の細菌の細胞内スペースからペプチド信号が発生するかどうかを区別するために挑戦的な、細胞内領域 (図 3 a)。対照的に、膜マーカーと簡単に細胞内のスペースの間のクリアな解像度で結果のスフェロプ ラスト (2-5 μ m) とプロトプ ラスト (2-3 μ m)、直径 1 μ m が通常、通常の細菌に比較して拡大サイズペプチドの局在 (図 3 b) を区別します。
ここでは、スフェロプ ラストとプロトプ ラストは、アンプ 2 阶 P11A ラベル N ターミナル FITC の局在パターンを表示する使用されます。FITC 標識膜にローカライズし、大腸菌スフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラスト (図 4) のセル膜を渡る若し両方に BF2 P11A を遵守します。野生型 BF2 は、エシェリヒア属大腸菌および脂質小胞の膜を渡る若しが観察されており、P11A 突然変異はこの転流13,27,28を減らすために知られています。我々 は非抗生物質耐性B. メガテリウムとアンピシリン耐性トップ 10大腸菌(pET45B) で提示されたデータを活用しました。アンピシリン耐性大腸菌が 25 μ g/mL のソリューションの最終濃度におけるアンピシリン (349.4 g/mol) の存在下で成長しました。用では、次のセクション 7 で説明されている体系的なアプローチ ・ ロワが描かれた膜、細胞内のスペース、および背景 (図 5 b)。それぞれのスフェロプ ラストや 2 阶 P11A と対話するプロトプ ラストのペプチドの蛍光強度膜上に細胞内ペプチドの蛍光強度の比を計算したセクション 7.2 に記載されている数式を使用します。図 5 aは、このすべてのスフェロプ ラストとプロトプ ラストの得点比の分布を示しています。スフェロプ ラストとプロトプ ラストは、主に落ちたスフェロプ ラストまたは未満 0.3 または 1 より大きいの比を有するプロトプ ラストの大半の 2 つのグループを獲得しました。
比率が陥る明確なグループを指定すると、透過セクション 7.2 で計算される比率が 1 以上としてペプチドの局在を定義しました。逆に、ペプチドの局在は膜ローカライズ セクション 7.2 に記載されている率が 1 未満と定義しました。次の得点方法同様ローカリゼーションのパターン 2 阶 P11A のエシェリヒア属大腸菌のスフェロプ ラストと 2 阶 P11A とB. メガテリウムプロトプ ラストで 71%、大腸菌スフェロプ ラストの場合の 70% の膜へのローカライズを見ましたし、B. メガテリウムプロトプ ラスト、それぞれ (表 1)。
図 1:エシェリヒア属大腸菌の代表的なイメージ。(A)エシェリヒア属大腸菌細菌 (B)エシェリヒア属大腸菌のヘビと (C)エシェリヒア属大腸菌のスフェロプ ラスト。画像は、100 倍の倍率で撮影されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: B. メガテリウムの代表的なイメージ。(A) B. メガテリウム細菌と (B) B. メガテリウムプロトプ ラスト。画像は、100 倍の倍率で撮影されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: B. メガテリウムの代表的なイメージ。(A) B. メガテリウム細菌の細胞および (B) B. メガテリウムプロトプ ラストの膜マーカー ・ ディ ・-8-ANEPPS ラベルの付いた。(A) と 100 X 63 X (B) 倍率でミドル z スタックからの画像が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的なエシェリヒア属大腸菌スフェロプ ラストと FITC と対話するB. メガテリウムプロトプ ラスト ラベル 2 阶 P11A 。(A)エシェリヒア属大腸菌スフェロプ ラスト表示 2 阶 P11A の膜にローカライズ。(B)エシェリヒア属大腸菌スフェロプ ラスト表示 2 阶 P11A 膜透過。(C) B. メガテリウムプロトプ ラスト表示 2 阶 P11A の膜にローカライズ。(D) B. メガテリウムプロトプ ラスト表示 2 阶 P11A 膜透過。エシェリヒア属大腸菌のスフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラストの膜マーカー ・ ディ ・-8-ANEPPS (赤) が付いています、FITC 標識 2 阶 P11A (緑)。63 倍の倍率でミドル z スタックからの画像が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ペプチドの局在パターンの解析。バック グラウンド減算後細胞内蛍光強度 (ROI 2) 膜の蛍光強度 (ROI 1) の比 (A) 分布 ((ROI 2-ROI 3)/(ROI 1-ROI 3))エシェリヒア属大腸菌スフェロプ ラストのB. メガテリウムBF2 P11A の付いたプロトプ ラスト (B)エシェリヒア属大腸菌スフェロプ ラスト FITC と対話するというラベルの付いた 2 阶 P11A。膜 (ROI 1) 細胞内領域 (ROI 2) に描かれた直径円形領域の関心 (ROI) 0.3 μ m と背景 (ROI 3)。ペプチドの蛍光定量した各投資収益率と投資収益率 ROI 1・2 で蛍光強度から ROI 3 の蛍光強度を引いてバック グラウンド蛍光を占めた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 菌株 | 違います。スフェロプ ラストやプロトプ ラスト | % 膜をローカライズします。 | % 透過 |
| エシェリヒア属大腸菌 | 84 | 71 | 29 |
| B. メガテリウム | 70 | 70 | 30 |
表 1: 2 阶 P11A のやり取りの局在パターン大腸菌スフェロプ ラストと B. メガテリウムプロトプ ラスト。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここに示すプロトコルより急速に拡大、球形の細菌がはるかに簡単検索、向き、およびイメージのため細菌画像のより大きなサンプル サイズを取得する研究者を実現可能にします。データを収集するためにこの拡張機能は、いくつかの点で重要です。まず、ペプチドの局在パターンのより体系的な定量分析を有効化します。高画質画像のセットでのみ大きなサンプルを明らかに局在する細胞ペプチドが対移行の割合など局在パターンの動向により微妙な画像のセットが小さいから定性的な傾向を示すことができます中、膜。またより良い解決する機能膜のローカリゼーションから内部の蛍光やすくローカリゼーション パターンは時間をかけて変更方法としてどのように迅速にペプチドが細菌細胞同様と対話するを評価する時間コース研究を実施します。改良された解像度小さい細菌では実現できないペプチドの局在化の動向を検討する研究ができます。たとえば、いくつかの私たちの観測のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト、ペプチドは、膜、すなわち、ペプチド信号細菌の周り完全なまとまりのあるリングを形成していないいくつかの点状の代わりに表示の特定のセクションに合わせてローカライズする表示されます。ラベリング。他のケースでペプチドがある完全均等に分散されない細菌の細胞膜の内側すなわち、ペプチド信号を完全に菌の内部スペースを入力しないでください。一方、私たちの現在の分析にこれらの傾向を追求していない、このようなローカライズの動向を考慮した可能となるスフェロプ ラストと標準細菌細胞ではなくプロトプ ラストをイメージングするとき。これらの利点は、アンプ以外セル透過ペプチドなどのペプチドの局在を決定する場合も当てはまります。スフェロプ ラストとこれらのアプローチしたプロトプ ラストはパッチ ・ クランプ電気生理測定18,19など、携帯電話サイズの増加の恩恵非イメージング実験にも利用できます。
レーザー共焦点顕微鏡、イメージング プロトコルの開発に利用されたが、各特定のイメージング システムのパラメーターを最適化することが重要です。これは写りにペプチドの放出チャネル膜色素膜の FITC 標識ペプチドから最小限に抑えながら、ペプチドと膜の色素蛍光検出を最大化するパラメーターのセットを選択する含まれています放射チャネル。膜の発光チャンネルにペプチドから写りは FITC の発光スペクトルの任意の部分を含んでいない膜の放射チャネルの波長範囲を選択することによって回避されました。写り膜色素から、ディ 8 ANEPPS ペプチドの放出チャネルにはディ 8 ANEPPS の発光スペクトルは、FITC の発光スペクトルの大部分と重複を避けるためにより困難でした。このプロトコルに固有のペプチドの放出チャネルに膜色素から裏写りで起因できるローカライズされた膜としてアンプの false 評価。このような性質の写りが発生しているかどうかは、スフェロプ ラストまたは膜色素が付いています専用プロトプ ラストをイメージングと蛍光ペプチドの放出チャネルに表示されますを参照してくださいにチェックを決定できます。ペプチドの放出チャネルとのゲインとオフセットの値を定義するために使用する波長の範囲を含む、さまざまな撮像パラメーターは、写りを最小化するパラメーターのセットを決定する体系的にテストできます。パラメーターの設定後、スフェロプ ラストまたはペプチドと膜の色素の付いたプロトプ ラストを利用時にイメージングが蛍光信号の厳密な検出を生成するかどうかを評価するために重要です。これにより、我々 は正常に FITC 標識アンプと膜の蛍光検出を最大化しながら写りの影響を最小限に抑える撮像パラメーターを染めるディ 8 ANEPPS を設立しました。そのペプチド チャネルに膜色素から排出裁ち落としを通じて最小化された発光波長範囲 ≤800 ボルト (V) (ペプチド) をする、ゲインが調整された、499-532 nm (ペプチド) の 670-745 nm (膜) を使用して具体的には、わかったと≤900 V (膜) とオフセット調整した ≤-10.0% (ペプチド、膜)。
エシェリヒア属大腸菌およびB. メガテリウムに着目、示されたプロトコル スフェロプ ラストまたは多くの異なる細菌株からのプロトプ ラストの生成するのに適してことがあります。たとえば、我々 は、セクション 4 で説明されているプロトコルを使用して直径 1-2 μ m をした枯草菌プロトプ ラストを正常に生成することがされている、プロトコルの適応は、さらにサイズを最適化するために作ることができます。細菌のこれらの 2 つのクラスの細胞壁構造の違いがアンプとの対話方法に影響を与えるために、ペプチドのグラム陰性菌およびグラム陽性細菌の局在パターンを観察する能力は特にアンプの研究に役に立つ細胞膜。ただし、日付にアンプの多くのイメージング研究はモデル大腸菌にのみ焦点を当てているし、したがって、グラム陽性の細菌の緊張のペプチドの動作が反映されないことがあります。
スフェロプ ラストとプロトプ ラスト外側の細胞壁の欠如が最も顕著で、通常の細菌とは異なる、したがってすべての実験の質問の良いモデルをできない場合があります。たとえば、グラム陰性菌の外膜は大きい分子29分子ふるいとして示されています。したがって、大きなペプチドがスフェロプ ラストで若し彼らの通常の細菌で、そうはしないだろうとすることがあります。さらに、アンプの細菌細胞壁、外膜と細胞膜との相互作用の詳細な研究は、スフェロプ ラストとプロトプ ラストを使用して実行できません。たとえば、Weisshaar ラボからの最近の作品ではアクション30,31CM15 メリチン機構のペプチッドのより正確な位置を確認するイメージングを利用されています。ただし、我々 のアプローチでは、前述のようは不要顕微鏡検査機器にマイクロ流体システムの実装31必要な解像度を達成するために。前作、示しているスフェロプ ラスト実行可能な21,32、それにもかかわらず可能性があるいくつかの代謝および生理学的な違い「普通の」細菌膜相互作用のいくつかを変えることができる可能性があるからケース。また、スフェロプ ラストの集団の生存率をまだ評価していない私たちは、ため 1 つを区別できません死んで間若しできますのみペプチドと生きている細胞の細胞膜を挟んだ若しする容易にことができるペプチドまたは死細胞。これらの違いにもかかわらず、我々 は紹介B. メガテリウムプロトプ ラストは BF2 P11A アクション15と我々 の結果の知られているメカニズムと一貫性のある、多くのアンペアの大腸菌スフェロプ ラストの局在パターンを見ています。そのペプチド13,27,28の他の観測と一致して見えます。スフェロプ ラストとプロトプ ラストの膜組成がまた脂質ベシクルなどの他のモデル システムで使用される典型的な混合物よりも確かにもっと生理学的に関連します。要約すると、強化された解像度と画像のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト、によって与えられるの容易でアンプなど、細菌株の範囲で膜活性剤を可視化の役に立つモデルが、考えています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
研究は、国立研究所のアレルギーと感染症 (NIH NIAID) 賞 R15AI079685 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
