Summary
Здесь мы представляем протокол производить грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) spheroplasts и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) протопласта четко визуализировать и быстро характеризуют пептид бактерии взаимодействий. Это обеспечивает систематический метод для определения мембраны локализации и translocating пептидов.
Abstract
Использование confocal микроскопии в качестве метода для оценки пептид локализации шаблонов внутри бактерии обычно препятствует резолюции пределы обычных легких микроскопы. Как разрешение для данного Микроскоп невозможно укрепить легко, мы представляем протоколы для преобразования небольшой палочковидные грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) в больших, легко фотосъемка сферической формы называют spheroplasts или протопласта. Это преобразование позволяет наблюдателям быстро и четко определить пептиды подать себя в бактериальной мембраны (то есть, мембраны локализации) или крест мембраны войти в камеру (например, translocating). С этим подходом мы также представляем систематический метод характеризовать пептидов как мембрана локализации или translocating. Хотя этот метод может быть использован для различных мембраны активных пептидов и бактериальных штаммов, мы продемонстрировать полезность настоящего Протокола путем наблюдать взаимодействие Buforin II P11A (BF2 P11A), антимикробного пептида (AMP), с E. coli Spheroplasts и B. megaterium протопласта.
Introduction
Антимикробных пептидов (AMPs) получили внимание из-за их потенциального использования в качестве альтернатив обычные антибиотики1,2,3,4,5. Translocating через клеточную мембрану и взаимодействующих с внутриклеточных компонентов, таких как нуклеиновые кислоты или на permeabilizing мембрану, причиной утечки содержимого ячейки6ампер убивают бактерии. В дополнение к их использования как антибиотики translocating усилители могут быть адаптированы для доставки приложений наркотиков потому, что они могут-непредвиденное крест непроницаемой клеточной мембраны7,8. Мы, таким образом, стремятся понять фундаментальные AMP механизмы действий, чтобы заложить основы для их использования в конструкции снадобья.
Конфокальная микроскопия предлагает способ оценки локализации шаблонов дневно обозначенные усилителей в бактериальных клетках, обеспечивая понимание их механизм действий9,10,,11,12, 13 , 14. путем маркировки мембраны бактерий, можно определить, если дневно обозначенные пептид локализует мембраны или пространство внутриклеточных бактериальных клеток. Однако этот метод ограничен небольшой размер и стержня формы бактерий, которые могут сделать визуализации сложной из-за пределы резолюции обычных легких микроскопов и переменной ориентации бактерии на слайд15.
Цель представленных метода является возможность расширения визуализации дневно обозначенные пептид локализации шаблонов с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация является расширение, превратив маленький, тонкий, палочковидные грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) бактерий в расширенном, сферической формы, именуемый Spheroplasts (для грамотрицательных штаммов) и протопласта (для грамположительных штаммов)16,17,18,19,,2021. Spheroplasts и протопласта легче изображения из-за их увеличение размера и их симметричная форма, которая делает ориентации бактерии на слайде значения для своих изображений. Кроме того мы представляем систематический подход к количественно анализа данных confocal микроскопии для того чтобы характеризовать AMPs как либо мембраны, локализация или translocating. Применение этих методов делает его легче отличить дневно помечены пептид локализации шаблонов. Протоколы, представленные здесь может использоваться для оценки локализации разнообразных мембраны активных агентов помимо усилителей, включая пептиды, проникая в клетки.
Преимущество этой техники является, что он обеспечивает понимание механизма действия усилителей на уровне одной ячейки, который может выявить гетерогенности клеток в15, в отличие от других анализов флуоресценции, обычно используется для идентификации механизмы действия усилителей, которые обеспечивают только массовой оценки9,22,23,24,25. Использование spheroplasts и протопласта для того чтобы оценить AMP запись ячейки является особенно полезным26 потому, что они являются более физиологически соответствующих15 чем другие модели, используемые для оценки записи ячейки, например липидов везикулы24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. решение подготовка
Примечание: Подготовьте решения, описано в шагах, 1,1-1,9 и 1.8 – 1,11 для того чтобы произвести E. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта, соответственно.
- Подготовка 1 М трис-Cl, pH 7,8, растворяя 10.34 g Tris-HCl и 4.17 г трис OH в dH2O в 125 мл флакон 50 мл. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
- Готовят раствор (20 мм MgCl2, 0,7 М сахарозы, 10 мм трис-Cl, pH 7,8) путем растворения 0.10 g MgCl2 (95.2 г/моль) и 11.98 г сахарозы (342.3 г/моль) в 25 мл dH2O в 125 мл флакон. Добавьте 500 мкл 1 М трис-Cl (pH 7,8) и отрегулируйте громкость до 50 мл. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
- Подготовьте решение B (10 мм MgCl2, 0,8 М сахарозы, 10 мм трис-Cl, pH 7,8) путем растворения 0,05 г MgCl2 (95.2 г/моль) и 13.69 г сахарозы (342.3 г/моль) в 25 мл dH2O в 125 мл флакон. Добавьте 500 мкл 1 М трис-Cl (pH 7,8) и отрегулируйте громкость до 50 мл. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
- Подготовьте 0,8 М сахарозы, растворяя 13.69 г сахарозы (342.3 г/моль) в 50 мл dH2O в 125 мл флакон. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
- Подготовить 5 мг/мл дезоксирибонуклеаза я (DNase я), растворяя 0,015 г DNase I в 3 мл dH2O в 50 мл флакон. Стерилизуйте при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Аликвота решение в отцентрифугировать трубы и хранить при-20 ° C.
- Подготовить 0,125 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), рН 8,0, растворяя 0.698 g ЭДТА динатриевая дигидрат (372.2 г/моль) в 15 мл dH2O в 125 мл флакон. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
- Подготовка 600 мкг/мл цефалексин, растворяя 0,03 г гидрата цефалексин (365.404 г/моль) в 50 мл dH2O в 125 мл флакон. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при 4 ° C.
- Подготовьте 5 мг/мл лизоцима путем растворения 0,015 г лизоцима в 3 мл dH2O в 50 мл флакон. Стерилизуйте при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Аликвота решение в отцентрифугировать трубы и хранить при-20 ° C.
- Подготовка 3% w/v Trypticase соевый бульон (TSB), растворяя 30 g БСЭ в 1 Л dH2O в колбе 2 Л. Алиготе решение во флаконы, содержащие 25 мл или 100 мл TSB использоваться в подготовке E. coli spheroplasts или B. megaterium протопласта, , соответственно. Фляги автоклав для стерилизации жидкой среды. Стерильные TSB может храниться при комнатной температуре или 4 ° C.
- Подготовьте решение C (1 М сахарозы 0,04 М малеат, MgCl 0.04 M2, рН 6,5), растворяя 34.23 г сахарозы (342.3 г/моль), 0,46 г малеиновой кислоты (116.07 г/моль) и 0,38 g MgCl2 (95.21 г/моль) в 100 мл dH2O в 250 мл флакон. Отрегулируйте пэ-аш до 6,5. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
- Подготовка 200 мл протопластов среднего путем смешивания 100 мл 3% w/v TSB и 100 мл раствора C в стеклянной бутылке 1 Л. Автоклав для стерилизации решение и хранить при комнатной температуре.
2. Подготовка ночь культуры
Примечание: Выполнение разделы 2-4 с использованием соответствующих методов стерильные. При желании, бактериальный штамм может содержать плазмиду для антибиотикорезистентности сокращения масштабов потенциального заражения. Если с помощью штамм с устойчивостью к антибиотикам, добавьте необходимые антибиотики в шагах 2.1, 3.1-3.2 и 4.1-4.4.
- Подготовьте на ночь культуры, выбирая один колонии бактерий с помощью стерильной пипеткой кончика и поместив его в пробирку культуры 14 мл, содержащих 2 – 3 мл 3% w/v TSB. Инкубируйте при 37 ° C, при встряхивании для 16 – 21 h.
3. Подготовка грамотрицательные E. coli Spheroplasts
- В 250 мл флакон разбавляют ночь культуры масштаба 1: 100 в объеме 25 мл 3% w/v TSB и инкубировать бактериальных решение при 37 ° C, при встряхивании примерно 2,5 часа, до тех пор, пока решение достиг оптическая плотность 0,5 – 0,8 на 600 Нм. Измерение оптической плотности, используя спектрофотометр.
- В 250 мл флакон разбавляют этот культуры 1:10 в 30 мл 3% w/v TSB и инкубировать при 37 ° C, при встряхивании для 2,5 ч присутствии 60 мкг/мл цефалексин (347.4 г/моль) для производства одноклеточного нити около 50 – 150 мкм в длину , которые наблюдаются при 1000-кратном с использованием световой микроскоп (рис. 1B).
- Урожай нити центрифугированием бактериальных решение на 1500 x g, 4 ° C на 4 мин Decant и отбросить супернатанта, резервируя гранулы.
- Вымойте нитей, осторожно добавив 1 мл 0,8 М сахарозы, стараясь не нарушить гранулы. Инкубировать в течение 1 мин, а затем удалить супернатант не нарушая гранулы.
- Добавить 150 мкл 1 М трис-Cl (рН 7,8), 120 мкл лизоцима 5 мг/мл, 30 мкл 5 мг/мл DNase я и 120 мкл 0,125 M ЭДТА в их соответствующих для Пелле и Инкубируйте решение при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Добавьте 1 мл раствора A постепенно более 1 мин в раствор, приготовленный в 3.5 с помощью микропипеткой, в то время как нежно закрученного решение вручную. Инкубируйте решение для 4 мин при комнатной температуре.
- Положите 7 мл раствора B 4 ° C в два 15 мл конические трубы. Добавьте равное количество раствор, приготовленный в 3.6 для каждого из этих двух труб. Центрифуга решение на 1500 x g, 4 ° C на 4 мин.
- С помощью Серологические Пипетки, осторожно удалите все, кроме 1–2 мл супернатант не нарушая гранулы. Ресуспензируйте гранулы, мягко закупорить вверх и вниз с помощью P1000 микропипеткой. Визуально проверьте spheroplasts формирования, наблюдая выборки в 1000 кратном увеличении с помощью световой микроскоп (рис. 1 c).
- Магазин spheroplasts при-20 ° C до недели или до тех пор, пока они прошли через 3 циклов замораживания оттаивания.
4. Подготовка грамположительных B. megaterium протопластов
- В 250 мл флакон разбавляют ночь культуры 1:1,000 в 100 мл 3% w/v TSB и инкубировать бактериальных решение при 37 ° C, при встряхивании для приблизительно 4.5 ч до решения оптической плотности 0,9–и 1.0 на 600 Нм. Измерение оптической плотности, используя спектрофотометр.
- Налейте жидкость культуры два 50 мл конические трубы и центрифуги на 2000 x g, 4 ° C на 10 мин.
- С помощью Пипетки серологические, отбросить супернатант от обоих конические трубы. Ресуспензируйте каждой гранулы в 2,5 мл протопластов среднего и объединить однотрубные коническая ресуспензированы решения. Пипетка комбинированного ресуспензированы решения в 125 мл флакон.
- Добавьте 1 mL лизоцима 5 мг/мл и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C, при встряхивании.
- Контролировать рост протопласта под 1000 кратном увеличении с помощью световой микроскоп, отметив любые нарушения, такие как бактерии, которые появляются как опухшие стержней вместо сферах (рис. 2). С помощью Пипетки серологические, передать решение 15 мл Конические трубки и центрифуги на 2000 x g, 4 ° C на 10 мин.
- Декант супернатант и вновь приостановить гранулы в 5 мл протопластов СМИ. Хранить протопласта при-20 ° C до недели или до тех пор, пока они прошли через 3 циклов замораживания оттаивания.
5. Подготовка решения пептида и мембраны краситель для изображений
-
Решение пептида
- В трубу отцентрифугировать, завернутые в фольгу растворяют 2 мг FITC помечены BF2 P11A 800 мкл dH2O. Использование пептида, содержащие по крайней мере один триптофан остатков с целью проведения измерения концентрации белка.
- Спектрофотометрически, измерения оптической плотности раствора пептида в 280 Нм в трех экземплярах. Вычислите концентрация пептида, используя коэффициент молярной вымирания для триптофана (5700/мкм).
- Разбавьте концентрация пептида в dH, которую2O до конечной концентрации 100 – 200 мкм. хранить в трубу отцентрифугировать при-20 ° C, завернутые в фольгу для защиты от света.
-
Краситель мембраны
- В трубке отцентрифугировать Подготовьте 10 мм запас ди-8-ANEPPS (592.9 г/моль), растворяя 5 мг ди-8-ANEPPS в 843.3 мкл ДМСО. Хранить при 4 ° C, завернутые в фольгу для защиты от света.
- В трубке отцентрифугировать Подготовьте 1 мл 0,03 мм ди-8-ANEPPS путем добавления 3 мкл 10 мм ди-8-ANEPPS 997 мкл ДМСО. Хранить в трубу отцентрифугировать на 4 ° C, завернутые в фольгу для защиты от света.
6. Визуализация E. coli Spheroplasts и B. megaterium протопласта с помощью конфокальная микроскопия
- Пипетка 5 мкл spheroplasts или протопласта на слайд поли L-лизин стекла с покрытием. 2 мкл FITC помечены AMP (100-200 мкм) на слайд и Инкубируйте 3 мин, защищенном от света.
- 1 мкл мембраны краситель ди-8-ANEPPS (0,03 мм) на слайд и Инкубируйте 3 мин, защищенном от света. Крышка с coverslip стекла и печать с ногтей.
- Включите конфокальный лазерный микроскоп и аргон. Отрегулируйте Аргонового лазера мощностью 20% и 20% передач.
- Задайте диапазоны выбросов волны 499 – 532 нм и 670-745 Нм для FITC-меченых пептид выбросов канал и канал выбросов краситель ди-8-ANEPPS-меченых мембраны, соответственно.
- Протопласта изображения или spheroplasts (рис. 1 и рис. 2) с 63 X цели. Использование изображений программное обеспечение для получения 8-бит, 512 x 512 композитного z стек изображений состоящий из 0,5 мкм ломтика полностью сферопласт или протопластов.
Примечание: Принять тщательного рассмотрения для уменьшения выбросов через кровь при визуализации spheroplasts и протопласта. Смотрите обсуждение для деталей.
7. характеристика AMP локализации
- Откройте изображение композитного z стека в визуализации программного обеспечения. Найдите центр большинство среза сферопласт или протопластов и место один круговой региона интерес (ROI) (0,3 мкм в диаметре) на мембраны (ROI 1), один в центре сферопласт или протопластов (ROI 2) и один от сферопласт или протопластов для измерения фон флюоресценция (ROI 3) (рис. 5). Избегайте включения насыщенных пикселей. Интенсивности флуоресценции в каждом ROI может рассчитываться путем визуализации программного обеспечения.
Примечание: В случаях когда пептид не локализовать в объеме мембраны, нарисуйте ROI 1 на площади мембраны где локализуется пептида. - Используйте следующее уравнение для определения коэффициента интенсивности флуоресценции внутриклеточных пептид интенсивности флуоресценции пептид мембраны:
Примечание: Интенсивности флуоресценции в ROI 3 вычитается из интенсивности флуоресценции в ROI 2 и ROI 1 для учета фона флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Путем увеличения числа бактерий и делая их сферических, мы можно легко отличить пептиды локализовать бактериальной мембраны или легко перемещать через мембрану бактерий. Резолюции пределы обычных легких Микроскопы сделать это сложно отличить ли пептид сигналы возникают из мембраны или внутриклеточного пространства в нормальных бактерий, потому что сигналы, локализованные в мембраны появится перекрываются с внутриклеточное пространство (рис. 3A). В противоположность этому увеличенный размер spheroplasts (2-5 мкм) и протопласта (2-3 мкм) по сравнению с нормальной бактерий, которые, как правило, только 1 мкм в диаметре, результаты в четкие резолюции между мембраной и внутриклеточного пространства, что делает его легче отличить пептиды локализации (рис. 3B).
Здесь чтобы показать локализации модель N-терминальный FITC помечены AMP BF2 P11A используются spheroplasts и протопласта. Мы отмечаем, что FITC помечены BF2 P11A как локализовать мембраны и перемещают через клеточную мембрану E. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта (рис. 4). В то время как наблюдается дикого типа BF2 чтобы перемещать через E. coli и липидные мембраны везикул, мутации P11A известно уменьшить этот транслокации13,27,28. Мы использовали, не-антибиотикам B. megaterium и устойчивостью ампициллин Топ 10 E. coli (pET45B) в представленных данных. Ампициллин устойчивостью E. coli был выращиваемых в присутствии ампициллин (349.4 г/моль) в конечной концентрации в растворе 25 мкг/мл. Для изображений, систематический подход, изложенный в разделе 7, после трансформирования были нарисованы на мембрану, внутриклеточного пространства и фон (Рисунок 5B). Коэффициент интенсивности флуоресценции внутриклеточных пептид пептид интенсивности флуоресценции на мембране была рассчитана для каждой сферопласт или протопластов, взаимодействующих с BF2 P11A с помощью уравнения, описано в разделе 7.2. Рисунок 5A показывает распределение этого показателя для всех spheroplasts и забил протопластов. Spheroplasts и протопласта забил основном упал на две группы, с большинством spheroplasts или протопласта имеют соотношение меньше чем 0,3 или больше 1.
С учетом отдельных групп, которые коэффициенты попадают в, мы определили пептид локализации как translocating когда коэффициент рассчитывается в разделе 7.2 было больше или равно 1. И наоборот пептид локализации был определен как мембрана локализации когда описано в разделе 7.2 составляло менее 1. После этого метод начисления очков, мы наблюдали аналогичные локализации шаблон для BF2 P11A в E. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта с BF2 P11A локализация мембраны в 71% и 70% случаев для E. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта, соответственно (Таблица 1).
Рисунок 1: Представитель образы E. coli. Змея E. coli (A) E. coli бактерии (B) и (C) E. coli сферопласт. Изображения были взяты на 100 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель образы B. megaterium. Бактериями B. megaterium (A) и (B) B. megaterium протопластов. Изображения были взяты на 100 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель образы B. megaterium. Бактериальной клетки B. megaterium (A) и (B) B. megaterium протопластов помечены мембране маркер ди-8-ANEPPS. Изображения из среднего z стека отображаются в 100 X (A) и 63 X (B) масштаб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представитель E. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта, взаимодействующих с FITC помечены BF2 P11A. (A) E. coli сферопласт показаны BF2 P11A локализация мембраны. (B) E. coli сферопласт показаны BF2 P11A translocating через мембрану. (C) B. megaterium протопластов показаны BF2 P11A локализация мембраны. (D) B. megaterium протопластов показаны BF2 P11A translocating через мембрану. E. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта помечены мембране маркер ди-8-ANEPPS (красный) и FITC помечены BF2 P11A (зеленый). Изображения из среднего z стека отображаются в 63 X увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: анализ моделей локализации пептид. (A) распределение коэффициента интенсивности флуоресценции внутриклеточных (ROI 2) интенсивности флуоресценции мембраны (ROI 1) после вычитание фона ((ROI 2-ROI 3) / (ROI 1-ROI 3)) для е. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта помечены BF2 P11A (B) E. coli сферопласт, взаимодействующих с FITC помечены BF2 P11A. Циклические регионы интереса (ROI) 0,3 мкм в диаметре, обращено на пространстве внутриклеточные мембраны (ROI 1) (ROI 2) и фон (ROI 3). Интенсивность флуоресценции пептид был количественно в каждом ROI и фон флуоресценции приходилось путем вычитания интенсивности флуоресценции в ROI 3 от интенсивности флуоресценции в ROI 1 и ROI 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Бактериальный штамм | Нет. Сферопласт или протопластов | % Мембраны локализация | % Translocating |
| E. coli | 84 | 71 | 29 |
| B. megaterium | 70 | 70 | 30 |
Таблица 1: шаблон локализации BF2 P11A взаимодействия с E. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы, представленные здесь сделать возможным для исследователей более быстро получить более крупные выборки бактериальных изображений, потому что увеличены, сферические бактерии являются гораздо проще найти, ориентации и изображения. Это расширение возможностей для сбора данных является ценным в нескольких отношениях. Во-первых он позволяет более систематический количественный анализ пептид локализации шаблонов. В то время как качественная тенденции может быть продемонстрирована от небольших наборов изображений, только большой образец набор высококачественных изображений раскрыть больше нюансов тенденциям в области локализации, такие как процент клеток, где пептид translocates против локализуется в мембрана. Кроме того способность лучше устранить внутренние флуоресценции от локализации мембраны делает его легче выполнять исследования курс время оценить, насколько быстро пептиды взаимодействовать с бактериальной клетки также как локализации шаблонов меняться с течением времени. Улучшение резолюции также позволяет исследователям рассмотреть тенденции в пептидной локализации, которые не возможны с меньше бактерий. Например в некоторых из наших наблюдаемых spheroplasts и протопласта, пептидов, как представляется, локализовать к определенным разделам мембраны, т.е., пептид сигналов не образуют полный, сплоченной кольцо вокруг бактерии и вместо этого показать некоторые пунктата маркировки. В других случаях, пептиды не могут быть полностью равномерно распределены внутри бактериальной мембраны, т.е., пептид сигналов, не полностью заполняет внутреннее пространство бактерий. Хотя мы не проводили эти тенденции в нашей текущего анализа, учитывая такие тенденции локализации становится возможным при визуализации spheroplasts и протопласта вместо стандартных бактериальных клеток. Эти преимущества будут применяться для определения локализации пептиды помимо усилителей, как пептиды, проникая в клетки. Spheroplasts и протопласта производится с этими подходами может также использоваться для не изображений экспериментов, которые приносят пользу от увеличения сотовой размера, например патч зажим электрофизиологии измерения18,19.
Лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп был использован в развитии нашей визуализации протокола, но важно, чтобы оптимизировать параметры для каждой конкретной системы визуализации. Это включает в себя выбор набора параметров, которые максимально обнаружения пептида и мембраны флуоресценции краситель, при сведении к минимуму кровотечения через из мембраны красителя в пептидной выбросов канал, а из FITC-меченых пептида в мембраны канал выбросов. Через кровь от пептида в мембраны выбросов канал удалось избежать, выбрав диапазон длин волн для мембранных выбросов канала, который не включает любую часть спектра излучения FITC. Кровотечение через от мембраны краситель, ди-8-ANEPPS, в пептидной выбросов канал был более трудно избежать, потому что ди-8-ANEPPS спектра излучения перекрывается с большинством FITC в спектре излучения. Характерных для настоящего Протокола, через кровь от мембраны красителя в пептидной выбросов канал может привести в ложной характеристике AMPs как мембрана локализованные. Можно определить, если кровотечение через такого рода происходит изображений spheroplasts или протопласта, которые помечены как исключительно с красителем мембраны и проверка того, виден ли флуоресценции в канале пептид выбросов. Различные параметры визуализации, включая диапазон длин волн, используемых для определения пептид выбросов канала и усиление и смещение ценностей, может испытываться систематически определить набор параметров, минимизирует через кровь. После создания набора параметров, важно оценить ли изображений дает сильный обнаружения сигнала флуоресценции, при spheroplasts или протопласта помечены пептида и мембраны краситель используются. Путем использования этого подхода мы успешно создали изображений параметров, которые к минимуму эффект кровотечения через при максимальном флуоресцентным обнаружением FITC-меченых AMP и мембраны красителя ди-8-ANEPPS. В частности, мы обнаружили, что кровоточить выбросов через от мембраны красителя в канал пептид было сведено к минимуму с помощью волны диапазоны выбросов 499 – 532 нм (пептид) и 670-745 Нм (мембраны), и когда прибыль была скорректирована быть ≤800 вольт (V) (пептид) и ≤900 V (мембраны) и смещение была скорректирована до ≤ -10.0% (пептид, мембраны).
Хотя мы сосредоточились на E. coli и B. megaterium, представленные протоколы могут быть адаптированы для производства spheroplasts или протопласта от много различных штаммов бактерий. Например мы смогли успешно производить Bacillus subtilis протопласта, которые были 1 – 2 мкм в диаметре, с использованием протокола говорится в разделе 4, и адаптация протокола можно было бы дополнительно оптимизировать размер. Способность наблюдать пептид локализации шаблонов в грамотрицательных и грамположительных бактерий является особенно полезной для изучения AMPs потому, что различия в структуре клеточной стенки между этими двумя классами бактерий может повлиять на взаимодействие усилителей с клеточные мембраны. Однако многие изображений исследования усилителей на сегодняшний день исключительно сосредоточены на модель штаммов E. coli и, таким образом, могут не отражать поведение пептиды с штаммов грамположительных бактерий.
Spheroplasts и протопласта отличаются от обычных бактерий, особенно в отсутствие у них внешней клеточной стенки и следовательно не может быть хорошей модели для всех экспериментальных вопросов. Например в качестве молекулярного сита для больших молекул29было показано внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Более крупные пептиды, таким образом, может быть возможность перемещать в spheroplasts, когда они не будут делать это в нормальных бактерий. Кроме того подробные исследования взаимодействия AMP с клеточной стенки бактерий, внешней мембраны и цитоплазматической мембраны не может быть выполнена с использованием spheroplasts и протопласта. Например последние работы из лаборатории Weisshaar использовал imaging для Обратите внимание на более точные положения пептида в CM15 и мелиттин механизмов действий30,31. Однако наш подход, как описано здесь, не требуют осуществления микрофлюидика в микроскопии инструментария для достижения требуемых резолюция31. Хотя предыдущая работа показала, что spheroplasts являются жизнеспособной21,32, они тем не менее вероятно иметь некоторые метаболические и физиологические различия от «нормального» бактерий, которые потенциально могут изменить мембраны взаимодействий в некоторых случаев. Кроме того, потому что мы еще не оценены жизнеспособность сферопласт населения, нельзя отличить пептид, который способен легко перемещать через клеточную мембрану живой клетки против пептид, который можно только перемещать через мертвых или умирающие клетки. Несмотря на эти различия мы видели локализации моделей, в E. coli spheroplasts для многих усилителей, которые согласуются с известными механизмами действий15, и наши результаты BF2 P11A с B. megaterium протопласта, представленные здесь как представляется, согласуется с другими наблюдениями за что пептид13,27,28. Мембраны композиции spheroplasts и протопласта актуальны также безусловно более физиологически чем типичный смеси, используемые в других системах модели, например липидов везикулы. В целом, учитывая расширение резолюции и простота изображений, обеспечиваемой spheroplasts и протопласта мы считаем, что они являются полезными моделями для визуализации активных агентов мембраны, такие как усилители, в диапазоне бактериальных штаммов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявляются.
Acknowledgments
Поддержка исследования осуществлялась в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (низ-NIAID) премии R15AI079685.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
