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Biology

उत्पादन और बैक्टीरियल Spheroplasts और Protoplasts के दृश्य रोगाणुरोधी पेप्टाइड स्थानीयकरण की विशेषता के लिए

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57904
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 1,2, 1,3
1Biochemistry Program, Wellesley College, 2Department of Chemistry, Wellesley College, 3Department of Biological Sciences, Wellesley College

Summary

यहां हम एक के लिए ग्राम-नकारात्मक ई कोलाई (ई. कोलाई) spheroplasts और ग्राम पॉजिटिव बैसिलस megaterium (बी. megaterium) protoplasts स्पष्ट रूप से कल्पना और तेजी से विशेषता का उत्पादन प्रोटोकॉल मौजूद पेप्टाइड-बैक्टीरिया बातचीत । यह झिल्ली स्थानीयकरण और translocating पेप्टाइड्स को परिभाषित करने के लिए एक व्यवस्थित विधि प्रदान करता है ।

Abstract

एक विधि के रूप में फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग बैक्टीरिया के भीतर पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न का आकलन करने के लिए आमतौर पर पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के संकल्प सीमा से हिचकती है । के रूप में दिया माइक्रोस्कोप के लिए संकल्प आसानी से बढ़ाया नहीं जा सकता है, हम वर्तमान प्रोटोकॉल छोटे रॉड के आकार का ग्राम नकारात्मक ई कोलाई (ई. कोलाई) और ग्राम पॉजिटिव बैसिलस megaterium (बी. megaterium) को बदलने के लिए बड़े में, आसानी से spheroplasts या protoplasts नामक गोलाकार रूपों छवि । यह परिवर्तन पर्यवेक्षकों तेजी से और स्पष्ट रूप से निर्धारित करें कि क्या पेप्टाइड्स खुद को बैक्टीरियल झिल्ली में दर्ज की अनुमति देता है (यानी, झिल्ली स्थानीयकरण) या झिल्ली पार करने के लिए सेल (यानी, translocating) दर्ज करें । इस दृष्टिकोण के साथ, हम भी एक व्यवस्थित करने के लिए पेप्टाइड्स झिल्ली स्थानीयकरण या translocating के रूप में विशेषता विधि प्रस्तुत करते हैं । हालांकि इस विधि झिल्ली सक्रिय पेप्टाइड्स और जीवाणु उपभेदों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम Buforin द्वितीय P11A (BF2 P11A), एक रोगाणुरोधी पेप्टाइड (AMP), ई. कोलाई के साथ की बातचीत देख कर इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता प्रदर्शित spheroplasts व megaterium protoplasts.

Introduction

रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs) पारंपरिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए विकल्प के रूप में उनकी क्षमता का उपयोग करने के कारण ध्यान प्राप्त किया है1,2,3,4,5. AMPs या तो सेल झिल्ली भर में translocating द्वारा बैक्टीरिया को मारने और न्यूक्लिक एसिड के रूप में intracellular घटकों के साथ बातचीत या permeabilizing द्वारा कोशिका सामग्री के रिसाव के कारण झिल्ली6. वे गैर disruptively अभेद्य कोशिका झिल्ली7,8पार कर सकते हैं क्योंकि एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में उनके उपयोग के अलावा, translocating AMPs दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम, इसलिए, कार्रवाई की मौलिक AMP तंत्र को समझने के लिए दवा डिजाइन में उनके उपयोग के लिए नींव रखना चाहते हैं ।

फोकल माइक्रोस्कोपी कार्रवाई के अपने तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के जीवाणु कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट लेबल AMPs के स्थानीयकरण पैटर्न का आकलन करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है9,10,11,12, 13 , 14. बैक्टीरिया की झिल्ली लेबल द्वारा, एक अगर एक फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड झिल्ली या एक जीवाणु कोशिका के intracellular अंतरिक्ष के लिए स्थानीयकरण निर्धारित कर सकते हैं । हालांकि, इस तकनीक छोटे आकार और बैक्टीरिया के रॉड आकार द्वारा सीमित है, जो इमेजिंग पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के संकल्प सीमा और स्लाइड15पर बैक्टीरिया के चर अभिविन्यास के कारण चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं ।

प्रस्तुत विधि के लक्ष्य को फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी के बढ़ाया दृश्य सक्षम है । दृश्य छोटे, पतले, रॉड के आकार का ग्राम-नकारात्मक ई कोलाई (ई. कोलाई) और ग्राम पॉजिटिव बैसिलस megaterium (बी. megaterium) जीवाणु बढ़े, गोलाकार रूपों के रूप में निर्दिष्ट मोड़ से बढ़ाया है spheroplasts (ग्राम-अनिष्ट उपभेदों के लिए) तथा protoplasts (ग्राम-धनात्मक उपभेदों के लिए)१६,१७,१८,१९,२०,२१. Spheroplasts और protoplasts दोनों अपने आकार और उनके सममित आकार है, जो अपनी इमेजिंग के लिए अप्रासंगिक स्लाइड पर एक जीवाणु के उंमुखीकरण बनाता है की वजह से छवि के लिए आसान कर रहे हैं । इसके अलावा, हम एक व्यवस्थित दृष्टिकोण को मात्रात्मक विश्लेषण फोकल माइक्रोस्कोपी डेटा के क्रम में या तो झिल्ली स्थानीयकरण या translocating के रूप में AMPs विशेषताएं प्रस्तुत करते हैं । इन तरीकों को लागू करना आसान फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न भेद करने के लिए बनाता है । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक किस्म की झिल्ली के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-सक्रिय एजेंट AMPs के अलावा अन्य, सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स सहित.

इस तकनीक का एक अलग लाभ यह है कि यह एक एकल कोशिका स्तर पर AMPs की कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जो सेल के लिए सेल विविधता15प्रकट कर सकते हैं, के रूप में अंय प्रतिदीप्ति सामांयतः की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया परख के खिलाफ AMPs, जो केवल थोक अनुमान प्रदान की कार्रवाई के तंत्र9,22,23,24,25. spheroplasts और protoplasts के उपयोग के क्रम में AMP सेल प्रविष्टि का आकलन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है26 क्योंकि वे अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है15 अंय मॉडलों की तुलना में ऐसे लिपिड बुलबुले24के रूप में सेल का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया ।

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Protocol

1. समाधान तैयारी

नोट: समाधान तैयार चरणों में वर्णित 1.1 – 1.9 और 1.8 – 1.11 क्रम में ई. कोलाई spheroplasts और बी megaterium protoplasts, क्रमशः का उत्पादन करने के लिए.

  1. 1 मीटर Tris-सीएल, पीएच ७.८ को भंग करके १०.३४ ग्राम Tris एचसीएल और ४.१७ ग्राम के Tris OH में ५० एमएल के डीएच2हे को एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी में तैयार करें । एक ०.२ µm झिल्ली के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने और कमरे के तापमान पर एक शंकु ट्यूब में स्टोर द्वारा निष्फल ।
  2. समाधान एक (20 मिमी MgCl2, ०.७ एम सुक्रोज, 10 मिमी Tris-सीएल, पीएच ७.८) को भंग करके ०.१० ग्राम MgCl2 (९५.२ ग्राम/मॉल) और ११.९८ जी सुक्रोज (३४२.३ जी/मॉल) 25 मिलीलीटर डीएच2में एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी में । ५०० µ l 1 M Tris-Cl (pH ७.८) जोड़ें और वॉल्यूम को ५० mL पर समायोजित करें । एक ०.२ µm झिल्ली के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने और कमरे के तापमान पर एक शंकु ट्यूब में स्टोर द्वारा निष्फल ।
  3. समाधान B तैयार करें (10 mm MgCl2, ०.८ M सुक्रोज, 10 mm Tris-Cl, pH ७.८) को भंग करके ०.०५ g MgCl2 (९५.२ g/मोल) और १३.६९ g सुक्रोज (३४२.३ g/मोल) 25 एमएल डीएच2ओ में एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी में । ५०० µ l 1 M Tris-Cl (pH ७.८) जोड़ें और वॉल्यूम को ५० mL पर समायोजित करें । एक ०.२ µm झिल्ली के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने और कमरे के तापमान पर एक शंकु ट्यूब में स्टोर द्वारा निष्फल ।
  4. ०.८ मीटर सुक्रोज को भंग करके १३.६९ ग्राम सुक्रोज (३४२.३ ग्राम/मोल) को ५० मिलीलीटर डीएच2हे में एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी में तैयार करें । एक ०.२ µm झिल्ली के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने और कमरे के तापमान पर एक शंकु ट्यूब में स्टोर द्वारा निष्फल ।
  5. तैयार 5 मिलीग्राम/एमएल deoxyribonuclease मैं (DNase आई) को भंग करके ०.०१५ ग्राम DNase मैं 3 मिलीलीटर में डीएच2हे एक ५० मिलीलीटर कुप्पी में । एक ०.२ µm झिल्ली के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने से निष्फल. microfuge ट्यूबों और स्टोर में Aliquot समाधान-20 डिग्री सेल्सियस ।
  6. तैयार ०.१२५ मीटर ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), पीएच ८.० को भंग करके ०.६९८ ग्राम EDTA disodium निर्जलीकरण (३७२.२ ग्राम/मॉल) में 15 मिलीलीटर डीएच2हे में एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी । एक ०.२ µm झिल्ली के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने और कमरे के तापमान पर एक शंकु ट्यूब में स्टोर द्वारा निष्फल ।
  7. तैयार ६०० µ g/mL cephalexin को भंग करके ०.०३ ग्राम के cephalexin हाइड्रेट (३६५.४०४ ग्राम/मॉल) में ५० मिलीलीटर की डीएच2हे एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी में । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शंकु ट्यूब में एक ०.२ µm झिल्ली और दुकान के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने से निष्फल.
  8. 5 मिलीग्राम/mL lysozyme को भंग करके ०.०१५ ग्राम lysozyme में 3 मिलीलीटर डीएच2हे में एक ५० मिलीलीटर कुप्पी में तैयार करें । एक ०.२ µm झिल्ली के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने से निष्फल. microfuge ट्यूबों और स्टोर में Aliquot समाधान-20 डिग्री सेल्सियस ।
  9. तैयार 3% w/वी Trypticase सोया शोरबा (TSB) को भंग करके TSB के 30 माम 1 एल में डीएच2हे की एक 2 एल कुप्पी में । Aliquot 25 मिलीलीटर या १०० मिलीलीटर TSB युक्त कुप्पी में हल करने के लिए ई. कोलाई spheroplasts या बी megaterium protoplasts, क्रमशः की तैयारी में इस्तेमाल किया जाएगा । आटोक्लेव कुप्पी से तरल माध्यम निष्फल होता है. बाँझ TSB या तो कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  10. तैयार समाधान C (1 m सुक्रोज, ०.०४ मी maleate, ०.०४ एम MgCl2, पीएच ६.५) को भंग करके ३४.२३ ग्राम सुक्रोज (३४२.३ ग्राम/मोल), ०.४६ ग्राम पुरुष अम्ल (११६.०७ ग्राम/मोल), और ०.३८ ग्राम MgCl2 (९५.२१ ग्राम/मोल) में १०० एमएल डीएच2ओ की कुप्पी में २५० मिलीलीटर । ६.५ के लिए पीएच समायोजित करें । एक ०.२ µm झिल्ली के साथ एक 25 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने और कमरे के तापमान पर एक शंकु ट्यूब में स्टोर द्वारा निष्फल ।
  11. 1 L ग्लास बोतल में १०० मिलीलीटर 3% w/v TSB और १०० ml सॉल्यूशन सी को मिलाकर २०० एमएल protoplast मीडियम तैयार करें । आटोक्लेव कमरे के तापमान पर समाधान और स्टोर निष्फल करने के लिए ।

2. रातोंरात संस्कृति की तैयारी

नोट: उपयुक्त बाँझ तकनीक का उपयोग कर वर्गों 2-4 प्रदर्शन. यदि वांछित, एक जीवाणु तनाव एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए संभावित संदूषण को कम करने के लिए एक प्लाज्मिड शामिल कर सकते हैं । यदि एंटीबायोटिक प्रतिरोध के साथ एक तनाव का उपयोग कर, कदम में आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें २.१, 3.1 – 3.2, और 4.1 – 4.4 ।

  1. बैक्टीरिया की एक एकल कॉलोनी एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग कर उठा और यह एक 14 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में रखने के द्वारा एक रात संस्कृति तैयार 2 3% डब्ल्यू के 3 मिलीलीटर/v TSB । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन, जबकि 16 के लिए मिलाते हुए-21 एच ।

3. चना-निगेटिव ई. कोलाई Spheroplasts की तैयारी

  1. एक २५० मिलीलीटर कुप्पी में, 3% डब्ल्यू के 25 मिलीलीटर मात्रा में रातोंरात संस्कृति 1:100 पतला/TSB और ३७ डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल समाधान मशीन, जबकि लगभग २.५ एच के लिए मिलाते हुए समाधान 0.5 के एक ऑप्टिकल घनत्व-0.8 पर पहुंच गया है जब तक ६०० एनएम । एक spectrophotometer का उपयोग कर ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।
  2. एक २५० मिलीलीटर कुप्पी में, इस संस्कृति 1:10 3% डब्ल्यू के 30 मिलीलीटर में TSB और ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, जबकि ६० µ g/एमएल cephalexin की उपस्थिति में २.५ एच के लिए मिलाते हुए (३४७.४ जी/) के बारे में 50 के एकल सेल रेशा उत्पादन के लिए-150 µm लंबाई में , जो 1 के तहत देख रहे हैं, 000X आवर्धन एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग (आंकड़ा 1b) ।
  3. १,५०० x gपर बैक्टीरियल घोल, 4 ° c 4 मिनट के लिए और supernatant त्याग, गोली से बचाकर के लिए रेशा फसल ।
  4. ०.८ मीटर सुक्रोज की 1 मिलीलीटर को धीरे से जोड़कर तंतुओं को धोकर, गोली को परेशान करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है । 1 मिनट के लिए मशीन, और फिर गोली परेशान बिना supernatant त्यागें ।
  5. जोड़ें १५० µ एल के 1 एम Tris-सीएल (पीएच ७.८), १२० µ एल के 5 मिलीग्राम/एमएल lysozyme, 30 µ एल के 5 मिलीग्राम/एमएल DNase मैं, और १२० µ के एल ०.१२५ एम EDTA उनके संबंधित आदेश में गोली करने के लिए और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान की मशीन ।
  6. समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें एक धीरे-३.५ में तैयार समाधान के लिए 1 मिनट से अधिक एक micropipette का उपयोग करते हुए धीरे हाथ से समाधान घूमता । कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए समाधान की मशीन ।
  7. २ १५ मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में 4 ° c समाधान B के 7 मिलीलीटर रखो । इन दो ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए ३.६ में तैयार समाधान के बराबर मात्रा में जोड़ें । १,५०० x जी, 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान केंद्रापसारक ।
  8. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, ध्यान से सभी लेकिन 1-2 supernatant के मिलीलीटर गोली परेशान बिना हटा दें । धीरे pipetting ऊपर और नीचे एक P1000 micropipette का उपयोग करके गोली resuspend । नेत्रहीन 1 पर नमूना देख कर spheroplasts गठन देखने के लिए जांच, 000X आवर्धन एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 1C) का उपयोग कर ।
  9. एक सप्ताह तक के लिए या वे 3 फ्रीज-गल चक्र के माध्यम से चला गया है जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर spheroplasts स्टोर ।

4. चना-पॉजीटिव की तैयारी megaterium Protoplasts

  1. एक २५० मिलीलीटर कुप्पी में, रात भर संस्कृति को पतला 1:3% डब्ल्यू के १०० मिलीलीटर में 1000/TSB और ३७ ° c पर बैक्टीरियल समाधान मशीन, जबकि लगभग ४.५ के लिए मिलाते हुए एच समाधान तक पहुंच गया है ०.९ के एक ऑप्टिकल घनत्व-१.० एनएम पर । एक spectrophotometer का उपयोग कर ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।
  2. २ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में तरल संस्कृति डालो और २,००० x जी, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
  3. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, दोनों शंकु ट्यूबों से supernatant त्यागें । २.५ मिलीलीटर protoplast मध्यम में प्रत्येक गोली resuspend और एक एकल शंकु ट्यूब में resuspend समाधान गठबंधन । पिपेट ने १२५ एमएल कुप्पी में कंबाइंड रिसस्पेंडेड सॉल्यूशन निकाला ।
  4. मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल lysozyme और मशीन के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. 1 के तहत protoplasts के विकास की निगरानी, 000x आवर्धन एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, किसी भी अनियमितता टिप्पण, जैसे बैक्टीरिया है कि के बजाय क्षेत्रों की सूजन छड़ के रूप में दिखाई देते हैं (चित्रा 2). एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण और २,००० एक्स जी, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
  6. supernatant और फिर से 5 मिलीलीटर protoplast मीडिया में गोली निलंबित कर सकते हैं । एक सप्ताह तक के लिए या वे 3 फ्रीज-गल चक्र के माध्यम से चला गया है जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर protoplasts स्टोर ।

5. इमेजिंग के लिए पेप्टाइड समाधान और झिल्ली डाई की तैयारी

  1. पेप्टाइड समाधान
    1. एल्यूमीनियम पंनी में लिपटे एक microfuge ट्यूब में, 2 मिलीग्राम FITC लेबल BF2 P11A में ८०० µ एल डीएच2ओ. एक पेप्टाइड का प्रयोग करें जिसमें कम से एक tryptophan अवशेषों के लिए प्रोटीन एकाग्रता माप का संचालन करने के लिए ।
    2. Spectrophotometrically, तपसिल में २८० एनएम पर पेप्टाइड समाधान के अवशोषण को मापने । tryptophan (5700/एमसीएम) के लिए दाढ़ विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर पेप्टाइड एकाग्रता की गणना ।
    3. डीएच2ओ में पेप्टाइड एकाग्रता को पतला 100 की एक अंतिम एकाग्रता के लिए-200 µ एम. स्टोर पर एक microfuge ट्यूब में-20 ° c एल्यूमीनियम पंनी में लिपटे प्रकाश से बचाने के लिए ।
  2. झिल्ली डाई
    1. एक microfuge ट्यूब में, DMSO के ८४३.३ µ एल में 5 मिलीग्राम di-8-ANEPPS भंग करके di-8-ANEPPS (५९२.९ g/मोल) के 10 मिमी स्टॉक तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर एल्यूमीनियम पंनी में लिपटे प्रकाश से बचाने के लिए ।
    2. एक microfuge ट्यूब में 10 एमएम डि-8-ANEPPS के 3 µ l को जोड़कर ०.०३ एमएम डि-8-ANEPPS के 1 एमएल को ९९७ µ l DMSO से तैयार कर लें । प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पंनी में लिपटे 4 ° c पर एक microfuge ट्यूब में स्टोर ।

6. ई. कोलाई Spheroplasts और megaterium Protoplasts के दृश्य का उपयोग फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. एक पाली-l-lysine लेपित गिलास स्लाइड पर spheroplasts या protoplasts के पिपेट 5 µ l । स्लाइड के लिए FITC लेबल AMP (100-200 µ m) के 2 µ एल जोड़ें और 3 प्रकाश से सुरक्षित मिनट के लिए मशीन ।
  2. झिल्ली डाई di-8 के 1 µ एल जोड़ें-ANEPPS (०.०३ मिमी) स्लाइड करने के लिए और 3 प्रकाश से सुरक्षित मिनट के लिए मशीन । एक ग्लास coverslip के साथ कवर और नेल पॉलिश के साथ सील ।
  3. फोकल माइक्रोस्कोप और आर्गन लेजर चालू करें । आर्गन लेजर 20% बिजली उत्पादन और 20% संचरण को समायोजित करें ।
  4. सेट उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर्वतमाला के 499-532 एनएम और 670-745 एनएम FITC के लिए-लेबल पेप्टाइड उत्सर्जन चैनल और di-8-ANEPPS-लेबल झिल्ली डाई उत्सर्जन चैनल, क्रमशः ।
  5. छवि protoplasts या spheroplasts (चित्रा 1 और चित्रा 2) एक 63X उद्देश्य के साथ । spheroplast या protoplast की संपूर्णता के ०.५ µm स्लाइस से बना 8-bit, ५१२ x ५१२ कम्पोजिट z-स्टैक छवियों को प्राप्त करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ।
    नोट: इमेजिंग spheroplasts और protoplasts जबकि उत्सर्जन खून को कम करने के लिए सावधान विचार रखना । विवरण के लिए चर्चा देखें ।

7. AMP स्थानीयकरण का लक्षण वर्णन

  1. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में मिश्रित z-स्टैक छवि खोलें । केंद्र का पता लगाएँ-spheroplast या protoplast का सबसे टुकड़ा और ब्याज की एक परिपत्र क्षेत्र जगह (रॉय) (०.३ व्यास में µm) झिल्ली पर (रॉय 1), spheroplast या protoplast के केंद्र में एक (रॉय 2), और एक दूर spheroplast या protoplast से मापने के लिए नेपथ्य प्रतिदीप्ति (रॉय ३) (चित्रा ५). संतृप्त पिक्सल के शामिल होने से बचें । प्रत्येक रॉय में प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की जा सकती है ।
    नोट: उदाहरण में जब पेप्टाइड झिल्ली की संपूर्णता के लिए स्थानीयकरण नहीं करता है, जहां पेप्टाइड स्थानीयकृत है झिल्ली के एक क्षेत्र पर रॉय 1 आकर्षित ।
  2. झिल्ली पेप्टाइड प्रतिदीप्ति तीव्रता करने के लिए intracellular पेप्टाइड प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात निर्धारित करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
    Equation
    नोट: रॉय 3 में प्रतिदीप्ति तीव्रता रॉय 2 और रॉय 1 में आदेश पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए खाते में प्रतिदीप्तिता से घटाया है ।

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Representative Results

जीवाणुओं के विस्तार और उन्हें गोलाकार बनाने के द्वारा, हम आसानी से यह भेद कर सकते हैं कि पेप्टाइड जीवाणु झिल्ली को स्थानीयकरण या जीवाणु झिल्ली के पार आसानी से translocate. पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के संकल्प सीमा यह अंतर करने के लिए कि पेप्टाइड संकेत झिल्ली या intracellular अंतरिक्ष से उत्पन्न सामान्य जीवाणुओं में संकेत है क्योंकि झिल्ली के लिए स्थानीय संकेतों के साथ ओवरलैप करने के लिए दिखाई देगा करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाने intracellular अंतरिक्ष (चित्रा 3ए) । इसके विपरीत, spheroplasts के बढ़े हुए आकार (२-५ µm) और protoplasts (२-३ µm) सामान्य जीवाणुओं की तुलना में, जो सामान्यतया केवल १ µm व्यास में होते हैं, झिल्ली मार्कर और intracellular स्थान के बीच स्पष्ट संकल्प में परिणाम यह आसान बना पेप्टाइड स्थानीयकरण (चित्र बी) भेद ।

यहाँ, spheroplasts और protoplasts एन टर्मिनल FITC लेबल AMP BF2 P11A के स्थानीयकरण पैटर्न दिखाने के लिए उपयोग किया जाता है. हम निरीक्षण FITC लेबल BF2 P11A करने के लिए दोनों स्थानीयकरण करने के लिए झिल्ली और translocate ई. कोलाई spheroplasts और बी megaterium protoplasts (चित्रा 4) की कोशिका झिल्ली के पार । जबकि जंगली प्रकार BF2 ई. कोलाई और लिपिड पुटिका झिल्ली भर में translocate के लिए मनाया गया है, P11A उत्परिवर्तन इस translocation13,27,28को कम करने के लिए जाना जाता है । हम एक गैर एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बी megaterium और एम्पीसिलीन प्रतिरोधी शीर्ष 10 ई. कोलाई (pET45B) प्रस्तुत आंकड़ों में उपयोग किया । एम्पीसिलीन प्रतिरोधी ई कोलाई एम्पीसिलीन की उपस्थिति में उगाया गया था (३४९.४ g/) 25 µ g/एमएल के समाधान में एक अंतिम एकाग्रता में । इमेजिंग के लिए, धारा 7 में उल्लिखित व्यवस्थित दृष्टिकोण के बाद, ROIs झिल्ली, intracellular अंतरिक्ष, और पृष्ठभूमि (चित्रा 5B) पर तैयार किया गया । झिल्ली पर पेप्टाइड प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए intracellular पेप्टाइड प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात प्रत्येक spheroplast के लिए गणना की गई थी या protoplast धारा ७.२ में वर्णित समीकरण का उपयोग कर BF2 P11A के साथ बातचीत. चित्र 5 ए सभी spheroplasts और protoplast रन के लिए इस अनुपात के वितरण से पता चलता है । spheroplasts और protoplasts रन बनाए मोटे तौर पर दो समूहों में गिर गया, spheroplasts या protoplasts से कम ०.३ या अधिक से अधिक का अनुपात होने के बहुमत के साथ 1 ।

अलग समूहों है कि अनुपात में गिरावट को देखते हुए, हम translocating के रूप में पेप्टाइड स्थानीयकरण परिभाषित जब खंड ७.२ में गणना अनुपात से अधिक या 1 के बराबर था । इसके विपरीत, जब खंड ७.२ में वर्णित अनुपात 1 से कम था, तो पेप्टाइड स्थानीयकरण झिल्ली स्थानीयकरण के रूप में परिभाषित किया गया था । स्कोरिंग के इस विधि के बाद, हम ई . कोलाई spheroplasts और megaterium protoplasts के लिए BF2 P11A में झिल्ली को ७१% और ई. कोलाई spheroplasts के लिए मामलों के ७०% के साथ एक समान स्थानीयकरण पैटर्न BF2 P11A के लिए मनाया और B. megaterium protoplasts, क्रमशः (Table 1).

Figure 1
चित्रा 1: ई. कोलाईके प्रतिनिधि छवियां । (क) ई . कोलाई जीवाणु (ख) ई. कोलाई साँप और (ग) ई. कोलाई spheroplast. चित्र 100X आवर्धन पर ले जाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: B. megateriumके प्रतिनिधि छवियां । (A) b. megaterium जीवाणु और (b) b . megaterium protoplast. चित्र 100X आवर्धन पर ले जाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: B. megateriumके प्रतिनिधि छवियां । (A) b. megaterium जीवाणु कोशिका और (b) b. megaterium protoplast झिल्ली मार्कर di-8-ANEPPS के साथ लेबल. मध्य z-स्टैक से छवियां 100X (A) और 63X (B) आवर्धन पर दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा ४: प्रतिनिधि ई. कोलाई spheroplasts र megaterium protoplasts साथ सहभागिता FITC त्यसपछि BF2 P11A । (क) ई. कोलाई spheroplast दिखा BF2 P11A information to झिल्ली. (ख) ई. कोलाई spheroplast दिखा BF2 P11A translocating भर झिल्ली । (ग) बी. megaterium protoplast दिखा BF2 P11A information to झिल्ली. (घ) ख. megaterium protoplast दिखा BF2 P11A झिल्ली भर translocating. ई. कोलाई spheroplasts और बी megaterium protoplasts झिल्ली मार्कर di-8-ANEPPS (लाल) और FITC लेबल BF2 P11A (हरा) के साथ लेबल कर रहे हैं । मध्य z-स्टैक से छवियाँ 63X आवर्धन पर दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न का विश्लेषण. (A) intracellular प्रतिदीप्ति तीव्रता (रॉय 2) के अनुपात के वितरण के लिए झिल्ली प्रतिदीप्ति तीव्रता (रॉय 1) के बाद पृष्ठभूमि घटाव ((रॉय 2-रॉय 3)/(रॉय 1-रॉय 3) ई. कोलाई spheroplasts और बी megaterium के लिए) protoplasts त्यसपछि साथ BF2 P11A (ख) ई. कोलाई spheroplast साथ सहभागिता FITC त्यसपछि BF2 P11A । ब्याज के परिपत्र क्षेत्रों (रॉय) ०.३ µm झिल्ली पर तैयार व्यास में (रॉय 1) intracellular अंतरिक्ष (रॉय 2) और पृष्ठभूमि (रॉय 3) । पेप्टाइड की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रत्येक रॉय में quantified था और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति रॉय 1 और रॉय 2 में प्रतिदीप्ति तीव्रता से प्रतिदीप्ति 3 में तीव्रता से घटाकर के लिए जवाबदेह था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बैक्टीरियल तनाव नहीं. spheroplast या protoplast % झिल्ली information % Translocating
ई. कोलाई ८४ ७१ 29
B. megaterium ७० ७० 30

तालिका 1: BF2 P11A के स्थानीयकरण पैटर्न के साथ बातचीत ई. कोलाई spheroplasts र ब. megaterium protoplasts.

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल और अधिक तेजी से जीवाणु छवियों का बड़ा नमूना आकार प्राप्त करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए यह संभव बनाने के लिए, क्योंकि बढ़े, गोलाकार बैक्टीरिया बहुत खोजने के लिए आसान कर रहे हैं, ओरिएंट, और छवि । इस बढ़ाया डेटा इकट्ठा करने की क्षमता कई मामलों में मूल्यवान है । सबसे पहले, यह पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न के एक अधिक व्यवस्थित मात्रात्मक विश्लेषण सक्षम बनाता है । जबकि गुणात्मक रुझान छवियों के छोटे सेट से प्रदर्शन किया जा सकता है, केवल उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों का एक बड़ा नमूना सेट स्थानीयकरण पैटर्न में और अधिक सूक्ष्म प्रवृत्तियों, जैसे कोशिकाओं का प्रतिशत जहां एक पेप्टाइड translocates बनाम स्थानीयकरण के लिए झिल्ली. इसके अलावा, बेहतर आंतरिक प्रतिदीप्ति झिल्ली स्थानीयकरण से हल करने की क्षमता बनाता है यह आसानी से आकलन करने के लिए समय पाठ्यक्रम अध्ययन करने के लिए कैसे जल्दी पेप्टाइड जीवाणु कोशिकाओं के साथ बातचीत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्थानीयकरण पैटर्न समय के साथ बदल जाते हैं. बेहतर संकल्प भी शोधकर्ताओं के लिए पेप्टाइड स्थानीयकरण में प्रवृत्तियों पर विचार करने की अनुमति देता है कि छोटे बैक्टीरिया के साथ संभव नहीं हैं. उदाहरण के लिए, हमारे कुछ मनाया spheroplasts और protoplasts में, पेप्टाइड्स झिल्ली के विशिष्ट वर्गों के लिए स्थानीयकरण दिखाई देते हैं, यानी, पेप्टाइड संकेतों बैक्टीरिया के आसपास एक पूर्ण, एकजुट अंगूठी फार्म नहीं है और इसके बजाय कुछ कबरा दिखाने लेबल. अन्य मामलों में, पूरी तरह से बैक्टीरियल झिल्ली के अंदर पेप्टाइड्स वितरित नहीं किया जा सकता है, यानी, पेप्टाइड संकेतों बैक्टीरिया के भीतरी अंतरिक्ष पूरा नहीं भर । जब तक हम अपने वर्तमान विश्लेषण में इन प्रवृत्तियों का पीछा नहीं किया है, ऐसे स्थानीयकरण प्रवृत्तियों पर विचार संभव हो जाता है जब इमेजिंग spheroplasts और protoplasts के बजाय मानक बैक्टीरियल कोशिकाओं । ये लाभ भी AMPs के अलावा अन्य पेप्टाइड्स के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए लागू होता है, जैसे कि सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स. Spheroplasts और protoplasts इन दृष्टिकोण के साथ उत्पादित भी गैर इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है कि वृद्धि हुई सेलुलर आकार से लाभ, जैसे पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप18,19.

एक लेज़र स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप हमारे इमेजिंग प्रोटोकॉल के विकास में उपयोग किया गया था, लेकिन यह प्रत्येक विशिष्ट इमेजिंग प्रणाली के लिए मापदंडों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह पैरामीटर का एक सेट है कि पेप्टाइड और झिल्ली डाई प्रतिदीप्ति का पता लगाने को अधिकतम का चयन भी शामिल है, जबकि खून के माध्यम से कम है पेप्टाइड उत्सर्जन चैनल में झिल्ली डाई से, और FITC-में लेबल पेप्टाइड से झिल्ली की उत्सर्जन चैनल । झिल्ली के उत्सर्जन चैनल में पेप्टाइड से खून के माध्यम से झिल्ली के उत्सर्जन चैनल है कि FITC उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के किसी भी हिस्से को शामिल नहीं किया था के लिए एक तरंग दैर्ध्य सीमा का चयन करके टाल दिया गया था । -झिल्ली डाई, di-8-ANEPPS से खून के माध्यम से, पेप्टाइड के उत्सर्जन चैनल में अधिक कठिन था क्योंकि di-8-ANEPPS ' उत्सर्जन स्पेक्ट्रम FITC के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के बहुमत के साथ ओवरलैप. इस प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट, खून के माध्यम से है पेप्टाइड उत्सर्जन चैनल में झिल्ली डाई के माध्यम से झिल्ली स्थानीयकृत के रूप में AMPs के झूठी लक्षण वर्णन में परिणाम कर सकते हैं । एक यह निर्धारित कर सकते हैं कि इस प्रकृति के खून के माध्यम से इमेजिंग spheroplasts या protoplasts विशेष रूप से झिल्ली डाई के साथ लेबल कर रहे हैं और अगर प्रतिदीप्ति पेप्टाइड के उत्सर्जन चैनल में दिखाई दे रहा है देखने के लिए जाँच द्वारा हो रही है । विभिंन प्रकार की तरंग दैर्ध्य है पेप्टाइड उत्सर्जन चैनल को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया रेंज सहित इमेजिंग पैरामीटर, और लाभ और ऑफसेट मूल्यों, व्यवस्थित करने के लिए पैरामीटर का एक सेट है कि खून के माध्यम से ंयूनतम निर्धारित परीक्षण किया जा सकता है । एक बार पैरामीटर का एक सेट की स्थापना की है, यह मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इमेजिंग पैदावार मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने जब spheroplasts या protoplasts दोनों पेप्टाइड और झिल्ली डाई के साथ लेबल का उपयोग कर रहे हैं । इस दृष्टिकोण के माध्यम से, हम सफलतापूर्वक, जबकि दोनों FITC-लेबल AMP और झिल्ली डाई di-8-ANEPPS के प्रतिदीप्ति का पता लगाने के माध्यम से खून के प्रभाव को कम करने इमेजिंग मापदंडों की स्थापना की । विशेष रूप से, हमने पाया है कि उत्सर्जन खून पेप्टाइड चैनल में झिल्ली डाई से के माध्यम से 499 के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर्वतमाला का उपयोग कम किया गया-532 एनएम (पेप्टाइड) और 670-745 एनएम (झिल्ली), और जब लाभ के लिए ≤ हो समायोजित किया गया था ८०० वोल्ट (वी) (पेप्टाइड) और ≤ ९०० V (झिल्ली) और ऑफसेट ≤-१०.०% (पेप्टाइड, झिल्ली) को समायोजित किया गया था ।

यद्यपि हम ई. कोलाई और megaterium, प्रस्तुत प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित करने spheroplasts या कई अलग जीवाणु उपभेदों से protoplasts उत्पादन अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हम सफलतापूर्वक बैसिलस सबटिलिस protoplasts है कि 1 थे उत्पादन में सक्षम है-2 धारा 4 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर व्यास में µm, और प्रोटोकॉल के रूपांतरों को और अधिक आकार का अनुकूलन किया जा सकता है । दोनों ग्राम में पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न का निरीक्षण करने की क्षमता नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया विशेष रूप से amps के अध्ययन के लिए उपयोगी है क्योंकि बैक्टीरिया के इन दो वर्गों के बीच सेल दीवार संरचना में मतभेद को प्रभावित कर सकते हैं कैसे amps के साथ बातचीत सेलुलर झिल्ली । हालांकि, कई तिथि करने के लिए AMPs के इमेजिंग अध्ययन केवल मॉडल ई. कोलाई उपभेदों पर ध्यान केंद्रित किया है और, इस प्रकार, ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरियल उपभेदों के साथ पेप्टाइड्स के व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते.

Spheroplasts और protoplasts सामांय बैक्टीरिया से अलग, सबसे विशेष रूप से एक बाहरी कोशिका दीवार की उनकी कमी में, और फलस्वरूप सभी प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए अच्छा मॉडल नहीं हो सकता है । उदाहरण के लिए, ग्राम की बाहरी झिल्ली-नकारात्मक जीवाणुओं को बड़े अणुओं के लिए एक आणविक छलनी के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है29. बड़े पेप्टाइड्स, इसलिए, वे सामान्य बैक्टीरिया में ऐसा नहीं होगा जब spheroplasts में translocate करने में सक्षम हो सकता है. इसके अतिरिक्त, बैक्टीरिया कोशिका दीवार, बाहरी झिल्ली, और cytoplasmic झिल्ली के साथ AMP की बातचीत का विस्तृत अध्ययन spheroplasts और protoplasts का उपयोग किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, Weisshaar लैब से हाल ही में काम इमेजिंग का उपयोग किया गया है और CM15 और melittin कार्रवाई के तंत्र30,31में पेप्टाइड के सटीक पदों पर ध्यान दें । हालांकि, हमारे दृष्टिकोण, जैसा कि यहां वर्णित है, के लिए आवश्यक संकल्प31प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोपी इंस्ट्रूमेंटेशन में microfluidics के कार्यांवयन की आवश्यकता नहीं है । हालांकि पिछले काम से पता चला है कि spheroplasts व्यवहार्य है21,३२, वे फिर भी संभावना है कुछ चयापचय और शारीरिक मतभेद से "सामांय" बैक्टीरिया है कि संभवतः कुछ में झिल्ली बातचीत बदल सकता है मामलों. इसके अतिरिक्त, क्योंकि हम spheroplast आबादी की व्यवहार्यता का मूल्यांकन नहीं किया है, एक एक पेप्टाइड कि आसानी से एक पेप्टाइड है कि केवल एक मरा या भर में translocate कर सकते हैं बनाम एक सेल झिल्ली के सेल के पार translocate करने में सक्षम है के बीच भेद नहीं कर सकते बिफोर सेल. इन मतभेदों के बावजूद, हम ई. कोलाई spheroplasts में स्थानीयकरण पैटर्न कई AMPs कि कार्रवाई के ज्ञात तंत्र के साथ संगत कर रहे हैं के लिए देखा है15, और megaterium protoplasts के साथ BF2 P11A के लिए हमारे परिणाम यहाँ प्रस्तुत कि पेप्टाइड13,27,28के लिए अन्य टिप्पणियों के साथ संगत लग रहे हैं । spheroplasts और protoplasts की झिल्ली रचनाएं भी निश्चित रूप से अधिक शारीरिक विशिष्ट ऐसे लिपिड बुलबुले के रूप में अंय मॉडल प्रणालियों, में इस्तेमाल मिश्रण से प्रासंगिक हैं । सारांश में, बढ़ाया संकल्प दिया और इमेजिंग की आसानी spheroplasts और protoplasts द्वारा afforded, हम मानते हैं कि वे झिल्ली सक्रिय एजेंटों, जैसे AMPs के लिए उपयोगी मॉडल हैं, बैक्टीरियल उपभेदों की एक श्रेणी में.

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया जाता.

Acknowledgments

शोध को राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान (NIH-NIAID) पुरस्कार R15AI079685 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl) Sigma T3253
Trizma base (Tris OH) Sigma T1503
Magnesium chloride Sigma M8266
Sucrose Sigma S7903
Lysozyme Sigma L6876
Deoxyribonuclease I Sigma D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma 106361 Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate Sigma C4895
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
BBL Trypticase soy broth Fisher Scientific B11768
BF2 P11A FITC NeoScientific Custom ordered
di-8-ANEPPS Biotium 61012
DMSO Sigma 34869 Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid Sigma M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane Pall Corporation 4192
Laser scanning confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 II For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Leica Microsystems For image processing

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जीव विज्ञान अंक १३८ रोगाणुरोधी पेप्टाइड protoplast spheroplast माइक्रोस्कोपी फोकल translocation permeabilization
उत्पादन और बैक्टीरियल Spheroplasts और Protoplasts के दृश्य रोगाणुरोधी पेप्टाइड स्थानीयकरण की विशेषता के लिए
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Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).

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