Summary
여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.
Abstract
박테리아 내에서 펩 티 드 지역화 패턴을 평가 하는 방법으로 confocal 현미경 검사 법의 사용은 일반적으로 기존의 가벼운 현미경의 해결책 한계에 의해 억제 됩니다. 선물이 작은 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 변환 하는 프로토콜 특정된 현미경에 대 한 해상도 쉽게 향상 될 수 없습니다, 더 큰, 쉽게 군데 둥근 모양으로 spheroplasts 또는 protoplasts 라고합니다. 이 변환 관찰자를 펩 티 드 (즉, 막 지역화) 세균 막으로 자신을 결 사 또는 교차 하는 셀 (예: translocating) 입력을 막 신속 하 고 명확 하 게 결정할 수 있습니다. 이 방법을 우리는 또한 막 지역화 또는 translocating으로 펩 티 드를 특성화 하는 체계적인 방법을 제시. 이 메서드를 사용 하 여 막 활성 펩 티 드 및 세균성 긴장의 다양 한 수, 있지만 우리 Buforin II P11A의 상호 작용을 관찰 하 여이 프로토콜의 유틸리티 설명 (BF2 P11A), 대장균 과 항균 성 펩타이드 (AMP), spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts입니다.
Introduction
항균 성 펩 티 드 (암페어)는 기존의 항생제1,2,3,,45대 안으로 그들의 잠재적인 사용 주의 얻고 있다. 앰프는 여 세포 막에 걸쳐 translocating 핵 산 또는 세포내 구성 요소와 상호 작용 하는 셀 내용을6의 누설을 일으키는 막 permeabilizing 여 박테리아를 죽 일. 항생제로 그들의 사용 이외에 앰프를 translocating 수 있습니다 적응 시킬 약물 전달 응용 프로그램에 대 한 그들은 불 침투성 세포 막7,8교차 비 비정상적으로 수 있기 때문에. 우리, 따라서, 약물 디자인에 그들의 사용을 위한 기초를 누워 행동의 근본적인 앰프 메커니즘을 이해 하고자 합니다.
지역화 액션9,10,,1112, 의 자신의 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 세균성 세포에 붙일 라벨의 패턴을 평가 하는 방법을 제공 하는 confocal 현미경 검사 법 13 , 14. 박테리아의 막의 라벨, 하나 붙일 레이블된 펩 티 드 막에 세균성 세포의 세포내 공간 localizes 경우 확인할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 및 슬라이드15에 박테리아의 변수 방향 도전 이미징 할 수 있는 박테리아의 작은 크기와 막대 모양에 의해 제한 됩니다.
Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 붙일 레이블된 펩 티 드 지역화 패턴의 향상 된 시각화 수 있도록 제시 방법의 목표가입니다. 시각화는 작고, 얇은, 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium)를 설정 하 여 향상 된 확대, 둥근 형태로 박테리아 라고도 (그람 음성 긴장)에 대 한 spheroplasts 그리고 protoplasts (그람 양성 긴장)에 대 한16,17,18,19,,2021. Spheroplasts와 protoplasts는 그들의 증가 크기와 그 영상에 대 한 관련성이 없는 슬라이드에 박테리아의 방향을 만드는 그들의 대칭 모양 때문에 이미지 하기 쉽습니다. 또한, 우리는 양적 앰프 중 막 지역화 또는 translocating로 성격을 나타내기 위하여 confocal 현미경 검사 법 데이터를 분석 하는 체계적인 접근 방법을 제시. 이러한 방법을 적용 쉽게 구별에 놓여있는지 펩 티 드 지역화 패턴 표시 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 다양 한 앰프, 세포 관통 펩 티 드를 포함 하 여 다른 막-활성 에이전트의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
뚜렷한이 기술의 장점은 그것 셀이15, 일반적으로 식별 하는 데 사용 하는 다른 형광 분석에 반대를 공개 수 있습니다 단일 세포 수준에서의 행동의 메커니즘에 통찰력을 제공 하나는 대량 견적9,22,23,,2425만 제공 하는 앰프의 행동의 메커니즘. Spheroplasts 및 protoplasts 앰프 셀 항목을 평가 사용 때문에 지질 소포24등 셀 항목을 평가 하기 위해 사용 되는 다른 모델 보다 더 순수 관련15 특정 유용한26 입니다.
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Protocol
1. 솔루션 준비
참고: 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts를 각각 일으키기 위하여 1.1-1.9, 1.8-1.11 단계에 설명 된 솔루션을 준비 합니다.
- 1 준비 M Tris-Cl, pH 7.8 10.34 g Tris HCl와 dH2O 125 mL 플라스 크에 50 mL에 트리 스 오의 4.17 g을 용 해 하 여. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
- 0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 25 mL dH2O 125 mL 플라스 크에 11.98 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 (20 m m MgCl2, 0.7 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
- 0.05 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 25 mL dH2125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 B (10 m m MgCl2, 0.8 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
- 50 mL dH2125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 0.8 M 자당을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
- 5 mg/mL deoxyribonuclease 준비 나 (DNase 나) 0.015 g DNase를 용 해 하 여 dH2O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 나. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게
- 0.125 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 준비, EDTA disodium 0.698 g을 용 해 하 여 pH 8.0으로 15 mL dH2O 125 mL 플라스 크에 (372.2 g/mol)를 탈수. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
- 세 팔 렉 신 하이드 레이트 (365.404 g/mol) dH2O 125 mL 플라스 크에 50 ml에서의 0.03 g을 용 해 하 여 600 µ g/mL 세 팔 렉 신을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 및 4 ° c.에 원뿔 튜브에 저장
- 5 mg/mL lysozyme 0.015 g lysozyme dH2O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 용 해 하 여 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게
- DH2O 2 L 플라스 크에 1 리터에 TSB의 30 g을 용 해 하 여 3 %w / v Trypticase 간장 국물 (TSB)를 준비 합니다. 약 수 25 mL 100 mL TSB 각각 대장균 spheroplasts 또는 B. megaterium protoplasts, 의 준비에 사용할 수를 포함 하는 플라스 크에 솔루션. 오토 클레이 브 소독 액체 매체를 플라스 크입니다. 살 균 TSB 실내 온도 또는 4 ° C에서 저장 될 수 있다
- 34.23 g 자당 (342.3 g/mol), 0.46 g maleic 산 (116.07 g/mol), 그리고 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O 250 mL 플라스 크에 100 mL에 용 해 하 여 솔루션 C (1 M 자당, 0.04 M maleate, 0.04 M MgCl2, pH 6.5)를 준비 합니다. PH 6.5 조정 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.
- 100 mL 3 %w / v TSB와 100 mL 해결책 C 1 리터 유리병에 혼합 하 여 200 mL 원생 동물 매체를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독 솔루션을 상 온에서 저장.
2입니다. 준비의 숙박 문화
참고: 섹션 2-4 적절 한 무 균 기술을 사용 하 여 수행 합니다. 원하는 경우, 세균성 긴장을 잠재적인 오염 줄이기 위해 항생제 내성에 대 한 플라스 미드를 포함할 수 있습니다. 항생제 저항 긴장을 사용 하 여, 단계 2.1, 3.1-3.2, 그리고 4.1-4.4에에서 필요한 항생제를 추가 합니다.
- 살 균 피 펫 팁을 사용 하 고 3 %w / v TSB의 2-3 mL를 포함 하는 14 mL 문화 관으로 배치 박테리아에의 한 식민지를 선택 하 여 숙박 문화를 준비 합니다. 16-21 h를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어.
3. 그람 음성의 대장균 Spheroplasts의 준비
- 250 mL 플라스 크에 25 mL 볼륨 3 %w / v TSB의 숙박 문화 1: 100 희석 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 600 0.5-0.8의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 2.5 h를 흔들어 동안 품 어 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.
- 250 mL 플라스 크에 희석이 문화 1:10 3 %w / v TSB의 30 ml에서 및 2.5 h 60 µ g/mL 세 팔 렉 신 (347.4 g/mol) 단일 셀 필 라 멘 트의 약 생산의 존재를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어 50-150 µ m 길이에서 는 가벼운 현미경 (그림 1B)를 사용 하 여 1000 X 배율에서 관찰.
- 1500 x g, 4 분 Decant 4 ° C에서 세균성 솔루션 centrifuging 여는 필 라 멘 트를 수확 하 고 상쾌한, 펠 릿 예약 취소.
- 부드럽게 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하는 0.8 M 자당의 1 mL을 추가 하 여는 필 라 멘 트를 씻어. 1 분 동안 incubate 고은 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.
- 150 µ L 1의 추가 M Tris-Cl (pH 7.8), lysozyme 5 mg/mL의 120 µ L, 5 mg/mL DNase의 30 µ L, 그리고 펠 릿을 주문 하 고 10 분 동안 실내 온도에 솔루션을 품 어는 그들의 각각에서 0.125 M EDTA의 120 µ L.
- 추가 솔루션의 1 mL 점차적으로 1 분 이상 3.5 동안 부드럽게 손으로 솔루션을 소용돌이 micropipette를 사용 하 여 준비 하는 솔루션을 합니다. 실 온에서 4 분에 대 한 솔루션을 품 어.
- 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 4 ° C 솔루션 B의 7 mL를 넣어. 이 두 튜브의 각 3.6에서 준비 하는 솔루션의 동일 금액을 추가 합니다. 1500 x g, 4 분 4 ° C에서 솔루션 원심
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 제거 1-의 2 개 mL 상쾌한 제외 하 고 모두는 펠 렛을 방해 하지 않고. 부드럽게 P1000 micropipette를 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 시각적으로 확인 spheroplasts 형성 1000 X 확대 가벼운 현미경 (그림 1C)을 사용 하 여 샘플을 관찰 하 여.
- -20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 spheroplasts를 저장 합니다.
4. 그람 양성 B. megaterium Protoplasts의 준비
- 250 mL 플라스 크에 희석 3 %w / v TSB의 100 mL에서 하룻밤 문화 1:1,000 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 0.9-의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 4.5 h 흔들어 동안 품 어 1.0 600 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.
- 2 50 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기에 액체 문화를 부 어.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 두 원뿔 튜브에서 상쾌한을 삭제 합니다. 2.5 mL 원생 동물 매체에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 resuspended 솔루션을 결합 하 여 단일 원뿔 관으로. 125 mL 플라스 크에 결합 된 resuspended 솔루션 플라스틱
- 5 mg/mL lysozyme의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C에서 1 시간 흔들어 동안 품 어.
- 1000 배 확대 가벼운 현미경, 부정, 분야 (그림 2) 대신 부 봉으로 표시 되는 박테리아와 같은 지적을 사용 하 여 아래 protoplasts의 증가 모니터링 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 솔루션 15 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 전송.
- 가만히 따르다는 상쾌한 고 다시 5 mL 원생 동물 미디어에 펠 릿을 중단. -20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 protoplasts를 저장 합니다.
5. 펩타이드 솔루션 및 이미징 막 염료의 준비
-
펩 티 드 솔루션
- 알루미늄 호 일에 싸여 microfuge 관, FITC BF2 P11A 800 µ L dH2오 사용 펩 티 드 단백질 농도 측정을 수행 하려면 적어도 하나의 트립토판 잔류물을 포함 표시의 2 밀리 그램을 디졸브.
- 280에서 펩 티 드 용액의 흡 광도 측정 하는 spectrophotometrically, 3 중에 nm. 트립토판 (5,700/Mcm)에 대 한 어 금 니 소멸 계수를 사용 하 여 펩 티 드 농도 계산 합니다.
- DH-20 ° C에서 microfuge 관에서 100-200 µ M. 저장소의 최종 농도에2O 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸여 있는 펩 티 드 농도 희석.
-
막 염료
- Microfuge 관에서 DMSO의 843.3 µ L에 디-8-ANEPPS의 5 mg를 용 해 하 여 디-8-ANEPPS (592.9 g/mol)의 10 m m 재고를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 저장 합니다.
- Microfuge 관에서 10 m m 디-8-ANEPPS의 3 µ L 997 µ L DMSO를 추가 하 여 0.03 m m 디-8-ANEPPS의 1 mL를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 microfuge 관에 저장 합니다.
6. 대장균 Spheroplasts 및 B. megaterium Protoplasts를 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법의 시각화
- Spheroplasts 또는 protoplasts 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드에 5 µ L 플라스틱 FITC 앰프 (100-200 µ M) 슬라이드에 표시 된의 2 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어.
- 슬라이드에는 막 염료 디-8-ANEPPS (0.03 m m)의 1 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어. 유리 coverslip로 커버 하 고 매니큐어와 함께 인감.
- Confocal 현미경 및 아르곤 레이저를 켭니다. 20% 전원 출력을 20% 전송 아르곤 레이저를 조정 합니다.
- 각각 499-532 nm와 FITC 표시 된 펩 티 드 방출 채널 및 디-8-ANEPPS-표시 막 염료 방출 채널, 670-745 nm의 방출 파장 범위를 설정 합니다.
- 이미지 protoplasts 또는 spheroplasts (그림 1 및 그림 2) 63 X 목표. 8 비트를 이미징 소프트웨어를 사용 하 여, 512 x 512 복합 z-스택 이미지 구성 0.5 µ m 조각 spheroplast 또는 원생 동물의 전체.
참고: 이미징 spheroplasts 및 protoplasts 동안 피가 통해 방출 감소를 신중 하 게 고려 걸릴. 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
7입니다. 앰프 지역화의 특성
- 이미징 소프트웨어에 복합 z-스택 이미지를 엽니다. Spheroplast 또는 원생 동물의 센터-대부분 슬라이스를 찾아서 한 원형 지역의 관심 (ROI)을 배치 (직경에서 0.3 μ m) 막 (ROI 1), spheroplast 또는 원생 동물 (ROI 2)의 중심에와 spheroplast 또는 측정 하는 원생 동물에 배경 형광 (ROI 3) (그림 5) 포화 픽셀의 포함을 하지 마십시오. 이미징 소프트웨어에 의해 각 ROI의 형광 강도 계산할 수 있습니다.
참고: 경우에 펩 티 드를 막의 전체를 지역화 하지 않습니다, 그릴 때 투자 수익 1 펩 티 드 지역화는 막의 지역에. - 다음 방정식을 사용 하 여 막 펩 티 드 형광 강도 세포내 펩 티 드 형광 강도의 비율 결정.
참고: 투자 수익 3에서 형광 강도에서 뺍니다 2 투자 수익 및 투자 수익 1 형광 강렬 배경 형광에 대 한 계정을 위해.
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Representative Results
박테리아를 확대 하 고 구형, 여 우리가 쉽게 펩 티 드 세균 막에 지역화 또는 세균 막에 걸쳐 이동 쉽게 구분할 수 있습니다. 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 게 도전 막에 지역화 신호 겹칠 나타납니다 때문에 막 또는 정상적인 박테리아 세포내 공간에서 펩 티 드 신호 발생 여부를 구별 하는 세포내 공간 (그림 3A)입니다. 반면, 확대의 크기 spheroplasts (2-5 µ m) 및 protoplasts (2-3 µ m)는 일반적으로 단지 1 개의 µ m 직경에서 정상적인 박테리아에 비해 막 마커를 쉽게 하는 세포내 공간 사이 명확 해상도 결과 펩 티 드 지역화 (그림 3B)를 구별 합니다.
여기, spheroplasts 및 protoplasts 앰프 BF2 P11A 표시 된 N 맨끝 FITC의 지역화 패턴을 표시 하는 데 사용 됩니다. 우리는 FITC 라는 막에 지역화와 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts (그림 4)의 세포 막에 걸쳐 이동 BF2 P11A 관찰 합니다. 반면 야생 타입 BF2 대장균 과 지질 소포 막에 걸쳐 이동 관찰 되었습니다, P11A 돌연변이를 줄이기 위해이 전13,,2728알려져 있다. 우리는 비 항생제 내성 B. megaterium 와 암 피 실린 내성 톱 10 대장균 (pET45B) 데이터에 활용. 암 피 실린 내성 대장균 25 µ g/mL의 솔루션에서 최종 농도에 암 피 실린 (349.4 g/mol)의 면 전에 서 성장 했다. 이미징, 체계적인 접근 방법 섹션 7에에서 설명 된 다음 ROIs 했다에 그려진 막, 세포내 공간, 그리고 배경 (그림 5B). 멤브레인에 펩 티 드 형광 강도 세포내 펩 티 드 형광 강도의 비율 각 spheroplast 또는 BF2 P11A와 상호 작용 하는 원생 동물에 대 한 계산 섹션 7.2에서에서 설명 하는 수식을 사용 하 여. 그림 5A 는 모든 spheroplasts 및 득점 하는 원생 동물에 대 한이 비율의 분포를 보여 줍니다. Spheroplasts와 protoplasts spheroplasts 또는 protoplasts 미만 0.3 또는 1 보다 큰 비 데의 대다수와 가진 두 그룹으로 크게 떨어진 득점.
비율에 있는 분명 한 그룹을 감안할 때, 우리가 정의 펩 티 드 지역화 섹션 7.2에서에서 계산 비율 1 보다 크거나 때 translocating. 반대로, 펩 티 드 지역화 막 지역화 때 섹션 7.2에서에서 설명 하는 비율 1 미만으로 정의 되었다. 득점의이 방법에 따라 우리는 유사한 지역화에 대 한 패턴 BF2 P11A 대장균 spheroplasts 및 BF2 P11A와 B. megaterium protoplasts 71%와 70%의 경우 대장균 spheroplasts에 대 한 막에 지역화를 관찰 하 고 B. megaterium protoplasts, 각각 (표 1).
그림 1: 대장균의 대표 이미지. (A) 대장균 박테리아 (B) 대장균 뱀 및 (C) 대장균 spheroplast. 이미지는 100 X 배율에서 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: B. megaterium의 대표 이미지. (A) B. megaterium 박테리아 그리고 원생 동물 (B) B. megaterium . 이미지는 100 X 배율에서 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: B. megaterium의 대표 이미지. (A) B. megaterium 세균성 세포 및 (B) B. megaterium 원생 동물 막 마커 디-8-ANEPPS로 표시. 중간 z 스택의 이미지 100 X (A)과 63 X (B) 확대 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표적인 대장균 spheroplasts와 FITC와 상호 작용 하는 B. megaterium protoplasts BF2 P11A 표시 되어 있다. (A) 대장균 spheroplast 보여주는 BF2 P11A 막에 지역화. (B) 대장균 spheroplast 보여주는 BF2 P11A 막에 걸쳐 translocating. (C) B. megaterium 원생 동물 보여주는 BF2 P11A 막에 지역화. (D) B. megaterium 원생 동물 보여주는 BF2 P11A 막에 걸쳐 translocating. E. 콜라이 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts는 막 마커 디-8-ANEPPS (적색) 표시 됩니다 그리고 FITC 표시 BF2 P11A (녹색). 중간 z 스택의 이미지 63 X 확대 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 펩 티 드 지역화 패턴의 분석. 배경 빼기 후 막 형광 강도 (투자 수익 1) 세포내 형광 강도 (ROI 2)의 비율의 (A) 배포 (ROI 2-수익 (3) / 투자 수익 1-수익 (3)) 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium BF2 P11A 표시 protoplasts FITC와 상호 작용 하는 (B) 대장균 spheroplast BF2 P11A 표시. 원형 지역의 관심 (ROI) 0.3 µ m 직경 멤브레인 (ROI 1) 세포내 공간 (ROI 2)에 그려진 배경 (ROI 3). 펩 티 드의 형광 강도 각 ROI에 계량 하 고 배경 형광 투자 수익 1 및 ROI 2 형광 강도에서 ROI 3의 형광 강도 빼서 차지 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 세균성 긴장 | 롤 spheroplast 또는 원생 동물 | % 막 지역화 | % Translocating |
| 대장균 | 84 | 71 | 29 |
| B. megaterium | 70 | 70 | 30 |
표 1: BF2 P11A 상호 작용의 지역화 패턴 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts.
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Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 연구자를 더 빠르게 세균 이미지의 더 큰 샘플 크기 확대, 구형 박테리아, 오리엔트, 찾아서 이미지를 훨씬 더 쉽게 하기 때문에 가능 하 게. 이 향상 된 기능은 데이터를 수집 하는 여러 가지 면에서 유용 합니다. 첫째, 펩 티 드 지역화 패턴의 체계적인 정량 분석을 수 있습니다. 동안 질적 동향은 이미지의 작은 세트에서 설명 될 수 있다, 높은-품질의 이미지의 큰 샘플 집합에 대해서만 공개 더 nuanced 지역화 패턴, 동향 펩 티 드 대 translocates 셀의 비율을 localizes 같은 막입니다. 또한, 더 나은 해결 수 막 지역화에서 내부 형광 쉽게 시간 과정 연구를 얼마나 빨리 펩 티 드와 상호 작용 뿐만 아니라 세균성 세포 지역화 패턴 시간이 지남에 변경 하는 방법으로 평가 수행할 수 있습니다. 향상 된 해상도 또한 작은 박테리아 가능 하지 않은 펩 티 드 지역화 추세를 고려 하는 연구를 수 있습니다. 예를 들어 일부 우리의 관찰 된 spheroplasts와 protoplasts, 펩 티 드 표시 막, 즉, 펩 티 드 신호 박테리아 주위는 완전 한, 응집력 반지를 형성 고 대신 일부 punctate 표시 하지 않습니다의 특정 부분을 지역화 하려면 라벨. 다른 경우에, 펩 티 드 배포할 수 없습니다 전적으로 균등 하 게 세균 막 내부 즉, 펩 티 드 신호 박테리아의 내부 공간을 완전히 채우지 않습니다. 우리가 우리의 현재 분석에 이러한 경향을 추구 하지, 하는 동안 같은 지역화 동향 고려 되 가능한 이미징 spheroplasts과 protoplasts 표준 세균성 세포 대신. 이러한 장점 또한 세포 관통 펩 티 드 같은 앰프, 다른 펩 티 드의 지역화 결정에 적용 됩니다. Spheroplasts 및 protoplasts이 접근 생산 증가 세포 크기, 패치 클램프 전기 생리학 측정18,19등 으로부터 혜택을 받는 비 이미징 실험에 대 한 이용 될 수 있습니다.
각 특정 이미징 시스템에 대 한 매개 변수를 최적화 하는 것이 중요 하지만 레이저 confocal 현미경 검사 우리의 이미징 프로토콜의 개발에 활용 되었다. 이 포함 하는 화상 물림 재단 통해 펩 티 드의 방출으로로 막 염료에서 고 막의에 FITC 표시 된 펩 티 드에서 최소화 하면서 펩 티 드와 막 염료 형광의 탐지를 극대화 하는 매개 변수 집합을 선택 하 방출 채널입니다. 막의 방출 채널에 펩 티 드에서 도련 통해 FITC의 방출 스펙트럼의 모든 부분을 포함 하지 않은 막의 방출 채널에 대 한 파장 범위를 선택 하 여 피할 되었습니다. 출혈-통해 막 염료에서 디-8-ANEPPS, 펩 티 드의 방출 채널에 있었다 더 디-8-ANEPPS' 방출 스펙트럼 FITC의 방출 스펙트럼의 대다수와 중복 때문에 피하기 어렵다. 이 프로토콜에 특정 펩 티 드의 방출으로 막 염료에서 도련 통해 발생할 수 있습니다 지역화 막으로 앰프의 잘못 된 특성. 하나는이 자연의 도련 통해 발생 하는지 spheroplasts 또는 독점적으로 막 염료 표시 됩니다 protoplasts 이미징 형광에 펩 티 드의 방출 채널에서 볼 수 있는지 확인 하 여 확인할 수 있습니다. 펩 티 드의 방출 채널 이득 및 오프셋 값을 정의 하는 데 사용 하는 파장 범위를 포함 하 여 다양 한 이미징 매개 변수 화상 물림 재단을 통해 최소화 하는 매개 변수 집합을 결정 하기 위해 체계적으로 테스트할 수 있습니다. 매개 변수 집합이 설정 되 면 그것은 이미징 생성 강한 형광 신호 검출 spheroplasts 또는 protoplasts 펩 티 드와 막 염료와 표시 활용 여부를 평가 하는 중요 한. 이 방법을 통해 우리는 성공적으로 FITC 표시 된 앰프와 막의 형광 검출을 극대화 하면서 피가 통해의 효과 최소화 하는 이미징 매개 변수 염색 디-8-ANEPPS 설립. 특히, 우리는 그는 방출 출혈-통해 펩 티 드로 막 염료에서 최소화 했다 방출 파장 범위 499-532 nm (펩타이드) 670-745 nm (막)의 고 이득 조정 되었다 ≤800 볼트 (V) (펩 티 드)를 사용 하 여 발견 하 고 ≤900 V (막) 및 오프셋 조정 했다 ≤-10.0% (펩타이드, 막).
비록 우리가 대장균 및 B. megaterium에 초점을 맞춘, 제시 프로토콜 spheroplasts 또는 많은 다른 세균성 긴장에서 protoplasts 생산에 적응 될 수 있습니다. 예를 들어 우리가 성공적으로 1-2 µ m 직경 섹션 4에에서 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 했다 새 균의 subtilis protoplasts를 생산할 수 있었고 프로토콜의 적응 더 크기를 최적화 하기 위해 만들 수 있는. 이러한 두 클래스 박테리아의 세포 벽 구조 차이 앰프 상호 작용 하는 방법을 영향을 미칠 수 있기 때문에 펩 티 드 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에서 지역화 패턴을 관찰 하는 능력은 앰프의 연구에 특히 유용 세포 막입니다. 그러나, 많은 이미징 연구의 최신 모델 대장균 변종에 전적으로 초점을 맞춘 그리고, 따라서, 그람 양성 세균 변종으로 펩 티 드의 동작을 반영 하지 않을 수 있습니다.
Spheroplasts와 protoplasts과 다는 외부 세포 벽의 그들의 부족에 가장 주목할 만한 정상적인 박테리아를 따라서 실험의 모든 질문에 대 한 좋은 모델을 되지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 그램 음성 박테리아의 외부 막 큰 분자29분자 체로 표시 되었습니다. 더 큰 펩 티 드, 따라서, 그들은 일반적인 박테리아에서 그렇게을 할 것 이다 때 spheroplasts에 이동 수 수 있습니다. 또한, spheroplasts 및 protoplasts를 사용 하 여 박테리아 세포 벽, 외부 막과 세포질 막 앰프의 상호 작용의 상세한 연구를 수행할 수 없습니다. 예를 들어 Weisshaar 연구소에서 최근 작품 액션30,31의 CM15 및 melittin 메커니즘에는 펩 티 드의 더 정확한 위치를 주의 하는 이미징 활용 하고있다. 그러나, 우리의 접근, 여기에 설명 된 대로 필요 하지 않습니다 구현의 마이크로 현미경 계측에 필요한 해상도31달성 하기 위하여. 이전 작업으로 나타났습니다 spheroplasts 가능한21,32, 하지만 그들은 그럼에도 불구 하 고 가능성이 있다 대사 및 생리 적 차이가 잠재적으로 일부 막 상호 작용을 변경할 수 있는 "정상적인" 박테리아에서 케이스입니다. 또한, 우리 spheroplast 인구의 생존 능력을 평가 하지는, 때문에 하나 쉽게 수만 죽은 걸쳐 이동 펩 티 드 대 살아있는 세포의 세포 막에 걸쳐 이동 수 있는 펩 티 드 사이 구별할 수 없습니다 또는 죽어가는 셀입니다. 이러한 차이도 불구 하 고 우리가 본 대장균 spheroplasts에서 지역화 패턴 B. megaterium protoplasts 여기에 제시 된 BF2 P11A 행동15, 그리고 우리의 결과의 알려진된 메커니즘에 일치 하는 많은 앰프에 대 한 그 펩 티 드13,,2728다른 관측으로 일관 된 것. Spheroplasts 및 protoplasts의 막 작곡 지질 소포 등 다른 모델 시스템에 사용 되는 일반 혼합물 보다 확실히 더 순수 관련 있습니다. 요약, 향상 된 해상도 영상 spheroplasts 및 protoplasts에 의해 여유의 용이성에서에서 그들은 막 활성 에이전트, 앰프 등 다양 한 세균성 긴장을 시각화에 대 한 유용한 모델 우리 믿습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언 됩니다.
Acknowledgments
연구는 국립 연구소의 알레르기와 감염 증 (NIAID NIH) 수상 R15AI079685에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
