Summary
Hier presenteren we een protocol voor de productie van gramnegatieve Escherichia coli (E. coli) spheroplasts en gram-positieve Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasten duidelijk visualiseren en snel karakteriseren Peptide-bacteriën interacties. Dit biedt een systematische methode om te definiëren membraan lokaliseren en translocating peptiden.
Abstract
Het gebruik van de confocal microscopie als een methode om te beoordelen van peptide lokalisatie patronen binnen bacteriën wordt gewoonlijk geremd door de grenzen van de resolutie van conventionele lichte microscopen. Zoals de resolutie voor een bepaalde Microscoop kan niet gemakkelijk worden verbeterd, presenteren we protocollen te transformeren de kleine staafvormige gramnegatieve Escherichia coli (E. coli) en gram-positieve Bacillus megaterium (B. megaterium) in grotere, gemakkelijk verbeelde bolvormige vormen spheroplasts of protoplasten genoemd. Deze transformatie kan waarnemers te snel en duidelijk bepalen of peptiden zelf in het bacteriële membraan (dat wil zeggen, membraan lokaliseren indienen) of kruis het membraan voor het invoeren van de cel (bijvoorbeeld translocating). Met deze aanpak presenteren we ook een systematische methode om te karakteriseren van peptiden als membraan lokaliseren of translocating. Hoewel deze methode kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van membraan-actieve peptiden en bacteriestammen, we tonen het nut van dit protocol door het observeren van de interactie van Buforin II P11A (BF2 P11A), een antimicrobiële peptide (AMP), met E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten.
Introduction
Antimicrobiële peptiden (AMPs) hebben opgedaan aandacht vanwege hun potentiële gebruik als alternatieven voor conventionele antibiotica1,2,3,4,5. Versterkers doden bacteriën door ofwel translocating tussen de celmembranen en de interactie met intracellulaire componenten zoals nucleïnezuren of door het membraan veroorzaakt door lekkage van cel inhoud6permeabilizing. Naast hun gebruik als antibiotica, kan translocating versterkers worden aangepast voor drug delivery toepassingen omdat ze kunnen niet-onverwacht is het oversteken van de ondoordringbare celmembraan7,8. Daarom willen wij, begrijpen fundamentele AMP mechanismen van actie te leggen de basis voor hun gebruik in drug design.
Confocale microscopie biedt een manier om te beoordelen van lokalisatie patronen van fluorescently geëtiketteerde versterkers in bacteriecellen biedt inzichten in hun mechanisme van actie9,10,11,12, 13 , 14. door het labelen van de membraan van de bacteriën, kan men bepalen als een fluorescently geëtiketteerde peptide het membraan of de intracellulaire ruimte van een bacteriële cel lokaliseert. Deze techniek wordt echter beperkt door het kleine formaat en rod vorm van bacteriën, waardoor imaging uitdagend als gevolg van de grenzen van de resolutie van conventionele lichte microscopen en de variabele oriëntatie van de bacteriën op de dia15.
Het doel van de onderhavige methode is om verbeterde visualisatie van de fluorescently geëtiketteerde peptide lokalisatie patronen met behulp van de confocal microscopie. Visualisatie wordt versterkt door het draaien van de kleine, dunne, staafvormige gramnegatieve Escherichia coli (E. coli) en gram-positieve Bacillus megaterium (B. megaterium) bacteriën in uitgebreide, bolvormige vormen genoemd spheroplasts (voor gramnegatieve stammen) en protoplasten (voor gram-positieve stammen)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts en protoplasten zijn gemakkelijker te afbeelding vanwege hun toegenomen omvang zowel hun symmetrische vorm, waardoor de richting van een bacterie op een dia niet relevant voor de beeldvorming. Daarnaast presenteren wij een systematische aanpak kwantitatief confocale microscopie om gegevens te analyseren om de versterkers te karakteriseren als beide membraan lokaliseren of translocating. Toepassing van deze methoden maakt het gemakkelijker om te onderscheiden fluorescently label peptide lokalisatie patronen. De protocollen die hier gepresenteerd kunnen worden gebruikt ter beoordeling van de lokalisatie van een verscheidenheid van membraan-actieve actoren dan versterkers, met inbegrip van cel-penetrating peptiden.
Een duidelijk voordeel van deze techniek is dat het biedt inzicht in het werkingsmechanisme van versterkers op eencellige niveau, die kan onthullen cel-naar-cel heterogeniteit15, in tegenstelling tot andere fluorescentie testen vaak gebruikt om te identificeren de mechanismen van werking van versterkers, waarmee alleen bulk schattingen9,22,23,24,25. Het gebruik van spheroplasts en protoplasten teneinde AMP cel invoeren is bijzonder nuttig26 , omdat ze meer fysiologisch relevante15 dan andere modellen die gebruikt worden voor de beoordeling van de cel invoeren, zoals lipide blaasjes24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oplossing voorbereiding
Opmerking: Bereiden oplossingen beschreven in stap 1.1 – 1,9 en 1,8 – 1.11 om te produceren van E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten, respectievelijk.
- Bereiden van 1 M Tris-Cl, pH 7,8 door ontbinding 10.34 Tris HCl en 4.17 g van Tris OH in 50 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.
- Bereid een (20 mM MgCl2, 0,7 M sacharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8)-oplossing door het oplossen van 0,10 g MgCl2 (95.2 g/mol) en 11.98 g sacharose (342.3 g/mol) in 25 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Voeg 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) en het volume op 50 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.
- Bereid de oplossing B (10 mM MgCl2, 0,8 M sacharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) door het oplossen van 0,05 g MgCl2 (95.2 g/mol) en 13.69 g sacharose (342.3 g/mol) in 25 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Voeg 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) en het volume op 50 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.
- Bereiden van 0,8 M sacharose door ontbinding 13.69 g sacharose (342.3 g/mol) in 50 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.
- Bereiden van 5 mg/mL deoxyribonuclease ik (DNase ik) door het oplossen van 0,015 g DNase ik in 3 mL dH2O in een maatkolf van 50 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan. Aliquot oplossing in microfuge buizen en winkel bij-20 ° C.
- Voorbereiden van 0,125 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), pH 8,0 door het oplossen van 0.698 g EDTA Dinatrium uitdrogen (372.2 g/mol) in 15 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.
- Bereiden 600 µg/mL cephalexin door ontbinding van 0,03 g van cephalexin hydraat (365.404 g/mol) in 50 mL dH2O in een maatkolf van 125 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij 4 ° C.
- 5 mg/mL lysozym voor te bereiden door het oplossen van 0,015 g lysozym in 3 mL dH2O in een maatkolf van 50 mL. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan. Aliquot oplossing in microfuge buizen en winkel bij-20 ° C.
- 3% w/v Trypticase soja Bouillon (TSB) voor te bereiden door het oplossen van 30 g van de TSB in 1 L dH2O in een erlenmeyer van 2 L. Aliquot de oplossing in flacons met 25 mL of 100 mL TSB moet worden gebruikt bij de voorbereiding van E. coli spheroplasts of B. megaterium protoplasten, , respectievelijk. Autoclaaf kolven voor het steriliseren van de vloeistof. Steriele TSB kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur of 4 ° C.
- Bereid de oplossing C (1 M sacharose, 0,04 M maleaat 0,04 M MgCl2, pH 6,5) door ontbinding 34.23 g sacharose (342.3 g/mol), 0.46 g maleïnezuur (116.07 g/mol) en 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) in 100 mL dH2O in een maatkolf van 250 mL. Breng de pH op 6.5. Steriliseren door filteren door middel van een 25 mm spuit filter met een 0,2 µm-membraan en op te slaan in een conische buis bij kamertemperatuur.
- Bereid 200 mL protoplast medium door het mengen van 100 mL 3% w/v TSB en 100 mL oplossing C in een 1 L-fles. Autoclaaf steriliseren van de oplossing te bewaren bij kamertemperatuur.
2. voorbereiding van overnachting cultuur
Opmerking: Voer secties 2-4 met behulp van passend steriele technieken. Indien gewenst, kan een bacteriële stam een plasmide voor antibiotica-resistentie ter beperking van de potentiële verontreiniging bevatten. Als een stam met resistentie tegen antibiotica, voeg de nodige antibiotica in stappen 2.1, 3.1-3.2, en 4.1-4.4.
- Bereid een overnachting cultuur door het plukken van een één kolonie van bacteriën met behulp van een steriele pipette uiteinde en plaatsen het in een tube van 14 mL cultuur met 2-3 mL 3% w/v TSB. Incubeer bij 37 ° C, terwijl het schudden voor 16-21 h.
3. bereiding van gram-negatieve E. coli Spheroplasts
- Verdun in een maatkolf van 250 mL, de nachtelijke 1:100 van de cultuur in 25 mL volume van 3% w/v TSB en Incubeer de bacteriële oplossing bij 37 ° C, terwijl het schudden voor ongeveer 2,5 h totdat de oplossing heeft gevonden een optische dichtheid van 0,5 – 0,8 op 600 nm. Meet de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer.
- In een erlenmeyer van 250 mL, Verdun deze cultuur 1:10 in 30 mL 3% w/v TSB en Incubeer bij 37 ° C, terwijl het schudden gedurende 2,5 uur in aanwezigheid van 60 µg/mL cephalexin (347.4 g/mol) voor de productie van eencellige filamenten van ongeveer 50 – 150 µm lang , die zijn waarneembaar onder 1000 X vergroting met behulp van een lichte Microscoop (figuur 1B).
- Oogst de filamenten door centrifugeren van de bacteriële oplossing bij 1.500 x g, 4 ° C voor 4 min. Decant en verwijder het supernatant, reserveren van de pellet.
- Wassen de filamenten door zachtjes toevoeging van 1 mL van 0,8 M sacharose, dat evenwel niet tot de pellet te verstoren. Incubeer gedurende 1 minuut, en verwijder vervolgens het supernatant zonder de pellet te verstoren.
- Voeg 150 µL van 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL van 5 mg/mL lysozym, 30 µL van 5 mg/mL DNase ik en 120 µL van 0,125 M EDTA in hun respectieve bestellen aan de pellet en de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten uit te broeden.
- Voeg 1 mL van oplossing A geleidelijk aan meer dan 1 min aan de oplossing bereid in 3.5 met behulp van een micropipet, terwijl de oplossing met de hand voorzichtig te zwenken. Laat de oplossing gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- 7 mL oplossing van 4 ° C B gestoken door twee 15 mL conische buizen. Toevoegen van gelijke hoeveelheden van de oplossing bereid in 3.6 aan elk van deze twee buizen. Centrifugeer de oplossing bij 1.500 x g, 4 ° C voor 4 min.
- Met behulp van een serologische precisiepipet, zorgvuldig alle verwijderen 1-2 mL bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet door zachtjes op en neer met behulp van een micropipet P1000 pipetteren. Visueel controleren vorming van de spheroplasts door het observeren van het monster bij 1000 X vergroting met behulp van een lichte Microscoop (Figuur 1 c).
- Bewaar de spheroplasts bij-20 ° C voor maximaal een week of totdat ze hebben 3 bevriezen-ontdooien cycli doorlopen.
4. voorbereiding van gram-positieve B. megaterium protoplasten
- In een erlenmeyer van 250 mL, Verdun de nachtelijke 1:1,000 van de cultuur in 100 mL 3% w/v TSB en Incubeer de bacteriële oplossing bij 37 ° C, terwijl het schudden voor circa 4, 5 h tot de oplossing heeft bereikt een optische dichtheid van 0,9-1.0 op 600 nm. Meet de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer.
- Giet het vloeibare cultuur in twee 50 mL conische buizen en centrifuge 2.000 x g4 ° C gedurende 10 minuten.
- Met behulp van een serologische precisiepipet, verwijder het supernatant van beide conische buizen. Resuspendeer elke pellet in 2.5 mL protoplast medium en de geresuspendeerde oplossingen combineren tot een enkele conische buis. Pipetteer de gecombineerde geresuspendeerde oplossing in een maatkolf van 125 mL.
- Voeg 1 mL 5 mg/mL lysozym en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, terwijl het schudden.
- Toezicht op de groei van protoplasten onder 1000 x vergroting met behulp van een lichte Microscoop, vaststellend van onregelmatigheden, zoals bacteriën die worden weergegeven als gezwollen staven in plaats van bollen (Figuur 2). Met behulp van een serologische precisiepipet, breng de oplossing kwantitatief een conische tube van 15 mL en centrifuge 2.000 x g4 ° C gedurende 10 minuten.
- Giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL protoplast media. Opslaan van protoplasten bij-20 ° C voor maximaal een week of totdat ze hebben 3 bevriezen-ontdooien cycli doorlopen.
5. bereiding van de oplossing van de Peptide en membraan kleurstof voor Imaging
-
Peptide oplossing
- Los in een microfuge buis gewikkeld in aluminiumfolie, 2 mg FITC label BF2 P11A in dH, 800 µL2O. gebruik een peptide met ten minste één tryptofaan residu om eiwit concentratie metingen verrichten.
- Spectrophotometrically, meet de extinctie van de oplossing van de peptide bij 280 nm in drievoud. Bereken de concentratie van de peptide met behulp van de coëfficiënt molaire extinctie voor tryptofaan (5.700/Mcm).
- Verdun de concentratie van de peptide in dH2O om een eindconcentratie van 100 – 200 µM. opslag in een microfuge buis bij-20 ° C gewikkeld in aluminiumfolie te beschermen tegen licht.
-
Membraan kleurstof
- Bereiden in een microfuge buis, een 10 mM voorraad van di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) door het oplossen van 5 mg voor di-8-ANEPPS in 843.3 µL van DMSO. Bewaren bij 4 ° C gewikkeld in aluminiumfolie te beschermen tegen licht.
- In een microfuge buis, bereiden 1 mL van 0.03 mM di-8-ANEPPS door 3 µL van 10 mM di-8-ANEPPS toe te voegen aan 997 µL DMSO. Opslaan in een microfuge buis bij 4 ° C gewikkeld in aluminiumfolie te beschermen tegen licht.
6. visualisatie van E. coli Spheroplasts en B. megaterium protoplasten met behulp van confocale microscopie
- Pipetteer 5 µL van spheroplasts of protoplasten op een poly-L-lysine gecoate glasplaatje. Voeg 2 µL van FITC AMP (100-200 µM) naar de dia met het label en incubeer gedurende 3 minuten beschermd tegen licht.
- Voeg 1 µL van het membraan kleurstof di-8-ANEPPS (0.03 mM) aan de dia en incubeer gedurende 3 minuten beschermd tegen licht. Dek af met een dekglaasje glas aan en verzegel met de nagellak.
- Inschakelen van de confocal microscoop en argon laser. Pas de argon laser 20% vermogen en 20% transmissie.
- Emissie golflengte reeksen van 499 – 532 nm en 670-745 nm voor de FITC-geëtiketteerden peptide emissie kanaal en di-8-ANEPPS-geëtiketteerden membraan kleurstof emissie kanaal, respectievelijk ingesteld.
- Afbeelding protoplasten of spheroplasts (Figuur 1 en Figuur 2) met een 63 X doelstelling. Imaging software gebruiken voor het verkrijgen van 8-bit, 512 x 512 samengestelde z-stack beelden samengesteld van 0,5 µm plakjes van het geheel van de spheroplast of de protoplast.
Opmerking: Neem zorgvuldig om de uitstoot te verminderen bloeden-door terwijl imaging spheroplasts en protoplasten. Zie de beschrijving voor meer informatie.
7. karakterisering van AMP lokalisatie
- Open de afbeelding van de samengestelde z-stack in beeldbewerkingssoftware. Zoek het segment van de center-de meeste van de spheroplast of de protoplast en plaats een circulaire regio van belang (ROI) (0,3 µm in diameter) van de membraan (ROI 1), één in het midden van de spheroplast of de protoplast (ROI 2), en één uit de buurt van spheroplast of protoplast op maat de achtergrond fluorescentie (ROI 3) (Figuur 5). Vermijd de opname van verzadigde pixels. De intensiteit van de fluorescentie in elke ROI kan worden berekend door de beeldbewerkingssoftware.
Opmerking: In gevallen wanneer peptide niet naar het geheel van het membraan lokaliseren doet, trekken ROI 1 op een oppervlakte van het membraan waar de peptide is gelokaliseerd. - De volgende vergelijking gebruiken om te bepalen van de verhouding van intracellulaire peptide fluorescentie intensiteit aan membraan peptide fluorescentie intensiteit:
Opmerking: De intensiteit van de fluorescentie in ROI 3 wordt afgetrokken van de intensiteit van de fluorescentie in ROI 2 en ROI 1 om de rekening voor achtergrond fluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door te vergroten van bacteriën en waardoor ze sferische, kunnen we gemakkelijk onderscheiden of peptiden lokaliseren naar het bacteriële membraan gemakkelijk translocate over het bacteriële membraan. De grenzen van de resolutie van conventionele lichte microscopen maken het uitdagend om te onderscheiden of peptide signalen uit de membraan of de intracellulaire ruimte in normale bacteriën voortvloeien omdat signalen gelokaliseerd op het membraan elkaar overlappen lijken met de intracellulaire ruimte (figuur 3A). In tegenstelling, resulteert de uitgebreide grootte van spheroplasts (2-5 µm) en protoplasten (2 – 3 µm) in vergelijking met de normale bacteriën, die normaal gesproken alleen 1 µm in diameter, in duidelijke resolutie tussen de membraan-markering en de intracellulaire ruimte waardoor het makkelijker te onderscheiden peptide lokalisatie (figuur 3B).
Hier, worden spheroplasts en protoplasten gebruikt voor het weergeven van het patroon van de lokalisatie van de N-terminale FITC AMP BF2 P11A label. We observeren dat FITC label BF2 P11A als u wilt lokaliseren naar de membraan en translocate tussen de celmembranen van E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten (Figuur 4). Terwijl wild type BF2 is waargenomen aan de translocate over de E. coli en lipide vesikel membranen, is de P11A mutatie bekend te verminderen van deze translocatie13,27,28. We gebruikt een niet-antibiotica resistente B. megaterium en ampicilline resistente Top 10 E. coli (pET45B) in de gegevens gepresenteerd. De ampicilline resistente E. coli werd geteeld in het bijzijn van ampicilline (349.4 g/mol) op een uiteindelijke concentratie in oplossing van 25 µg/mL. Voor imaging, werden na de systematische aanpak in hoofdstuk 7, ROIs getrokken op het membraan, intracellulaire ruimte, en de achtergrond (figuur 5B). De verhouding van intracellulaire peptide intensiteit van de fluorescentie naar peptide intensiteit van de fluorescentie op het membraan werd berekend voor elke spheroplast of protoplast interactie met BF2 P11A met behulp van de vergelijking die is beschreven in paragraaf 7.2 vermelde. Figuur 5A toont de verdeling van deze verhouding voor alle spheroplasts en protoplast scoorde. De spheroplasts en protoplasten scoorde grotendeels viel in twee groepen, met de meerderheid van spheroplasts of protoplasten hebben een verhouding van minder dan 0,3 of groter dan 1.
Gezien de verschillende groepen die de verhoudingen vallen, we peptide lokalisatie gedefinieerd als translocating toen de verhouding berekend in paragraaf 7.2 vermelde groter is dan of gelijk is aan 1. Omgekeerd, peptide lokalisatie werd gedefinieerd als membraan lokaliseren toen de verhouding beschreven in paragraaf 7.2 vermelde minder dan 1 was. Na deze methode van scoren, we een soortgelijk lokalisatie patroon voor BF2 P11A in E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten met BF2 P11A lokaliseren naar de membraan in 71% en 70% van de gevallen voor E. coli spheroplasts waargenomen en B. megaterium protoplasten, respectievelijk (tabel 1).
Figuur 1: Representatieve beelden van E. coli. (A) E. coli bacteriën (B) E. coli slang en (C) E. coli spheroplast. Beelden werden genomen bij 100 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Representatieve beelden van B. megaterium. (A) B. megaterium bacteriën en (B) B. megaterium protoplast. Beelden werden genomen bij 100 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Representatieve beelden van B. megaterium. (A) B. megaterium bacteriële cel en (B) B. megaterium protoplast aangeduid met de membraan marker di-8-ANEPPS. Beelden van de middelste z-stack op 100 X (A) en 63 X B vergroting te zien zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Vertegenwoordiger E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten interactie met FITC label BF2 P11A. (A) E. coli spheroplast weergegeven: BF2 P11A lokaliseren naar de membraan. (B) weergegeven van de spheroplast: E. coli BF2 P11A translocating over het membraan. (C) weergegeven van de protoplast: B. megaterium BF2 P11A lokaliseren naar de membraan. (D) weergegeven van de protoplast: B. megaterium BF2 P11A translocating over het membraan. E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten worden aangeduid met de membraan marker di-8-ANEPPS (rood) en FITC label BF2 P11A (groen). Beelden van de middelste z-stack op 63 X vergroting te zien zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: analyse van peptide lokalisatie patronen. (A) verdeling van de verhouding van intracellulaire fluorescentie intensiteit (ROI 2) om de intensiteit van de fluorescentie membraan (ROI 1) na achtergrond aftrekken (ROI 2-ROI (3) / (ROI 1-ROI 3)) voor E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten aangeduid met BF2 P11A (B) E. coli spheroplast interactie met FITC label BF2 P11A. Circulaire regio's van belang (ROI) 0,3 µm in diameter getrokken op de membraan (ROI 1) intracellulaire ruimte (ROI 2) en achtergrond (ROI 3). De intensiteit van de fluorescentie van peptide werd gekwantificeerd in elke ROI en de achtergrond-fluorescentie was verantwoord door af te trekken van de intensiteit van de fluorescentie in ROI 3 vanaf de intensiteit van de fluorescentie in ROI 1 en 2 van de ROI. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Bacteriële stam | Nr. spheroplast of protoplast | Lokaliseren van de membraan van de % | % Translocating |
| E. coli | 84 | 71 | 29 |
| B. megaterium | 70 | 70 | 30 |
Tabel 1: het patroon van de lokalisatie van BF2 P11A interactie met E. coli spheroplasts en B. megaterium protoplasten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protocollen die hier gepresenteerd maken het mogelijk voor onderzoekers sneller het verkrijgen van grotere omvang van de steekproeven van bacteriële beelden omdat de uitgebreide, bolvormige bacteriën veel gemakkelijker zijn te vinden, oriënteren en beeld. Deze verbeterde mogelijkheid om gegevens te verzamelen is waardevol in verschillende opzichten. Eerst, is hierdoor een meer systematische kwantitatieve analyse van peptide lokalisatie patronen. Terwijl kwalitatieve ontwikkelingen kunnen worden aangetoond van kleinere sets van beelden, slechts een grote steekproef set van hoge kwaliteit beelden onthullen meer genuanceerd trends in de patronen van de lokalisatie, zoals het percentage cellen waar een peptide translocates versus lokaliseert aan de membraan. Ook de mogelijkheid om betere vastberadenheid de interne fluorescentie van de membraan lokalisatie gemakkelijker tijd cursus studies om te beoordelen hoe snel peptiden interactie met bacteriële cellen ook hoe lokalisatie patronen na verloop van tijd veranderen te verrichten. De verbeterde resolutie kunt ook onderzoekers te overwegen van trends in peptide lokalisatie die niet mogelijk met kleinere bacteriën zijn. Bijvoorbeeld in sommige van onze waargenomen spheroplasts en protoplasten lijken peptiden te lokaliseren specifieke secties van het membraan, dat wil zeggen, de peptide-signalen niet vormen een complete, samenhangende ring rond de bacteriën en in plaats daarvan Toon Sommige punctate labeling. In andere gevallen, peptiden kunnen niet worden gelijkmatig verdeeld geheel binnen het bacteriële membraan, dat wil zeggen, de peptide signalen vult u de innerlijke ruimte van de bacteriën niet volledig. Terwijl wij hebben deze trends niet nagestreefd in onze huidige analyse, wordt overwegen dergelijke lokalisatie trends haalbaar wanneer imaging spheroplasts en protoplasten in plaats van standaard bacteriële cellen. Deze voordelen zou ook gelden voor de bepaling van de lokalisatie van peptiden dan versterkers, zoals cel-penetrating peptiden. Spheroplasts en protoplasten geproduceerd met behulp van deze benaderingen kunnen ook worden gebruikt voor niet-imaging experimenten die van de toegenomen cellulaire omvang, zoals patch-clamp electrofysiologie metingen18,19 profiteren.
Een laser confocal microscoop scannen werd gebruikt in de ontwikkeling van onze imaging protocol, maar het is van cruciaal belang voor het optimaliseren van de parameters voor elke specifieke imaging systeem. Dit omvat het selecteren van een aantal parameters die maximaliseren van de opsporing van peptide en membraan fluorescentie van de kleurstof, terwijl het minimaliseren van bloeden-door middel van de kleurstof van de membraan van de peptide emissie kanaal en van de FITC-geëtiketteerden peptide in het membraan van emissie kanaal. Bloeden-door middel van de peptide in het membraan van emissie kanaal werd vermeden door het selecteren van een golflengtebereik voor het membraan van emissie kanaal dat geen rekening met enig gedeelte van het emissiespectrum van FITC gehouden. Bloeden-door middel van de membraan kleurstof, was di-8-ANEPPS, in de peptide de emissie kanaal moeilijker te vermijden omdat di-8-ANEPPS emissiespectrum met de meerderheid van het emissiespectrum van FITC overlapt. Specifiek voor dit protocol, bloeden-door middel van de kleurstof van de membraan van de peptide emissie kanaal kan leiden tot de valse karakterisatie van versterkers als membraan gelokaliseerd. Als het bloeden-door middel van deze aard plaatsvindt door imaging spheroplasts of protoplasten die worden uitsluitend aangeduid met membraan kleurstof en controleren om te zien als de fluorescentie zichtbaar in de peptide de emissie kanaal is kan men bepalen. Diverse imaging parameters, met inbegrip van het golflengtegebied gebruikt om te definiëren van de peptide emissie kanaal en de winst en offset waarden, kunnen systematisch worden getest om te bepalen van een aantal parameters die bloeden-through minimaliseert. Zodra een aantal parameters is gevestigd, is het essentieel om te evalueren of imaging sterke detectie van fluorescentie signaal levert wanneer spheroplasts of protoplasten aangeduid met zowel peptide en membraan kleurstof worden gebruikt. Door deze aanpak vastgesteld we met succes imaging parameters die het effect van het afloopgebied-via terwijl het maximaliseren van de detectie van de fluorescentie van zowel FITC-geëtiketteerden AMP en het membraan geminimaliseerd kleurstof di-8-ANEPPS. Specifiek, we vonden dat de emissie bloeden-door middel van de membraan kleurstof in het peptide-kanaal werd geminimaliseerd emissie golflengte bereiken van 499 – 532 nm (peptide) en 670-745 nm (membraan), en wanneer de winst werd aangepast om te worden ≤800 Volt (V) (peptide) gebruiken en ≤900 V (membraan) en de offset werd aangepast aan ≤-10.0% (peptide membraan).
Hoewel we op de E. coli en B. megaterium gericht, kon de gepresenteerde protocollen worden aangepast aan het produceren van spheroplasts of protoplasten uit vele verschillende bacteriestammen. Bijvoorbeeld, wij erin geslaagd om met succes het produceren van Bacillus subtilis protoplasten die waren 1 – 2 µm in diameter met behulp van het protocol beschreven in sectie 4, en aanpassingen van het protocol kunnen worden aangebracht in de grootte verder te optimaliseren. De mogelijkheid om te observeren peptide lokalisatie patronen in zowel gram-positieve als gram-negatieve bacteriën is bijzonder nuttig om de studie van versterkers omdat verschillen in de structuur van de celwand tussen deze twee klassen van bacteriën kunnen invloed op de wisselwerking met versterkers cellulaire membranen. Echter, vele imaging studies van Ampère tot nu toe hebben uitsluitend gericht op model E. coli stammen en dus mogelijk niet overeen met het gedrag van peptiden met gram-positieve bacteriestammen.
Spheroplasts en protoplasten kunnen afwijken van de normale bacteriën, met name in hun gebrek aan een buitenste celwand, en bijgevolg niet goede modellen voor alle experimentele vragen. Bijvoorbeeld, is de buitenmembraan van gram-negatieve bacteriën gebleken om op te treden als een moleculaire zeef voor grotere moleculen29. Grotere peptides, daarom, mogelijk translocate in spheroplasts wanneer zij niet in normale bacteriën doen zou. Bovendien, kunnen niet gedetailleerde studies van de interactie van AMP met de celwand van bacteriën, buitenste membraan en cytoplasmatische membraan worden uitgevoerd met behulp van spheroplasts en protoplasten. Bijvoorbeeld, heeft recent werk van de Weisshaar Lab gebruikt imaging te merken de nauwkeuriger posities van de peptide in de mechanismen van het CM15 en melittin van actie30,31. Echter, onze aanpak, zoals hier beschreven, hoeft niet de implementatie van microfluidics in microscopie instrumentatie met het oog op de vereiste resolutie31. Hoewel vorige werk heeft aangetoond dat spheroplasts levensvatbare21,32, toch hebben waarschijnlijk ze enkele metabole en fysiologische verschillen van 'normale' bacteriën die kunnen potentieel membraan interacties in sommige veranderen gevallen. Bovendien, want wij hebben niet beoordeeld op de levensvatbaarheid van de spheroplast bevolking, een geen onderscheid maken tussen een peptide welk vermag gemakkelijk tussen de celmembranen van een levende cel versus een peptide dat kan alleen via een dode translocate translocate of stervende cel. Ondanks deze verschillen hebben we lokalisatie patronen in E. coli spheroplasts voor veel versterkers die met de bekende vormen van actie15, en onze resultaten voor BF2 P11A met B. megaterium protoplasten hier gepresenteerd stroken lijken consistent zijn met andere waarnemingen voor die peptide13,27,28. De composities van de membraan van spheroplasts en protoplasten zijn ook zeker meer fysiologisch relevant dan de typische mengsels gebruikt in andere modelsystemen, zoals lipide blaasjes. Kortom, gezien de verhoogde resolutie en gemak voor imaging geboden door spheroplasts en protoplasten, wij geloven zij nuttige modellen voor het visualiseren van membraan-actieve stoffen, zoals versterkers, in een waaier van bacteriestammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.
Acknowledgments
Onderzoek werd gesteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIH-NIAID) award R15AI079685.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
