Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para produzir Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) spheroplasts e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastas claramente Visualizar e caracterizar rapidamente interações de peptídeo-bactérias. Isso fornece um método sistemático para definir membrana localizando e se peptídeos.
Abstract
O uso da microscopia confocal como um método para avaliar padrões de localização de peptídeo dentro bactérias comumente é inibido nos limites de resolução de microscópios de luz convencionais. Como a resolução de um microscópio de determinado não pode ser facilmente reforçada, apresentamos os protocolos para transformar a pequena bacilares Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) em formas esféricas maiores, facilmente imagens chamado spheroplasts ou protoplastas. Esta transformação permite que os observadores rapidamente e claramente determinar se peptídeos apresentar-se na membrana bacteriana (ou seja, localização de membrana) ou atravessam a membrana para entrar na célula (ou seja, se). Com esta abordagem, também apresentamos um método sistemático de caracterização de peptídeos como membrana localizando ou se. Enquanto este método pode ser usado para uma variedade de peptídeos de membrana-ativo e cepas bacterianas, demonstramos a utilidade do presente protocolo, observando a interação de Buforin II P11A (BF2 P11A), um peptídeo antimicrobiano (AMP), com e. coli SPHEROPLASTS e b. megaterium protoplastas.
Introduction
Peptídeos antimicrobianos (AMPs) ganharam atenção devido ao seu potencial uso como alternativas para os antibióticos convencionais1,2,3,4,5. Amplificadores de matam as bactérias, ou se através da membrana celular e interagindo com componentes intracelulares, como os ácidos nucleicos ou por permeabilizing da membrana, causando vazamento de célula conteúdo6. Além de sua utilização como antibióticos, se AMPs pode ser adaptado para aplicações de entrega de drogas porque interrupções podem atravessar a membrana impermeável7,8. Nós, portanto, procurar compreender mecanismos fundamentais de AMP de ação para estabelecer as bases para a sua utilização em design de drogas.
Microscopia confocal oferece uma forma de avaliar os padrões de localização de AMPs fluorescente etiquetadas em células bacterianas, fornecendo insights sobre seu mecanismo de ação9,10,11,12, 13 , 14. através da marcação da membrana da bactéria, um pode determinar se um peptídeo fluorescente etiquetado localiza a membrana ou espaço intracelular de uma célula bacteriana. No entanto, esta técnica é limitada pelo pequeno tamanho e haste forma de bactérias, que pode tornar a imagem desafiadora devido os limites de resolução dos microscópios de luz convencionais e a variável orientação das bactérias no slide15.
O objetivo do método apresentado é permitir melhorar a visualização dos padrões fluorescente etiquetadas peptídeo localização utilizando microscopia confocal. Visualização é reforçada pelo pequeno, magro, em forma de haste Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) ligando e desligando o Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) bactérias em formas esféricas, alargadas referido como SPHEROPLASTS (por cepas de bactérias Gram-negativas) e protoplastas (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. SPHEROPLASTS e protoplastas são mais fáceis de imagem devido à sua forma simétrica, o que torna a orientação de uma bactéria em um slide, irrelevante para a sua imagem e seu tamanho aumentado. Além disso, apresentamos uma abordagem sistemática para analisar quantitativamente dados de microscopia confocal para caracterizar AMPs como qualquer membrana localizando ou se. Aplicar esses métodos torna mais fácil distinguir fluorescente etiquetado padrões de localização de peptídeo. Os protocolos aqui apresentados podem ser usados para avaliar a localização de uma variedade de agentes de membrana-ativo diferente de AMPs, incluindo peptídeos penetra no celular.
Uma vantagem desta técnica é que ele fornece insights sobre o mecanismo de ação dos amplificadores em um nível de célula única, que pode revelar a heterogeneidade de célula para célula15, ao contrário de outros ensaios de fluorescência comumente usado para identificar o mecanismos de ação dos amplificadores, que fornecem apenas em massa estimativas9,22,23,24,25. O uso de spheroplasts e protoplastas para avaliar a entrada de celular AMP é especial útil26 porque eles são fisiologicamente mais relevantes15 do que outros modelos utilizados para avaliar a entrada da pilha, tais como de vesículas lipídicas24.
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Protocol
1. preparação da solução
Nota: Prepare soluções descritas nos passos 1.1 – 1.9 e 1.8 – 1.11 para produzir spheroplasts de e. coli e b. megaterium protoplastas, respectivamente.
- Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7,8 dissolvendo 10,34 Tris HCl e 4,17 g de Tris OH em 50 mL de dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
- Prepare a solução A 20 mM MgCl2, 0,7 M de sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 dissolvendo 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) e sacarose g 11,98 (342.3 g/mol), em 25 mL dH2O num 125 mL. Adicionar 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
- Prepare a solução B (10 mM MgCl2, 0,8 M de sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo-se 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) e 13,69 g sacarose (342.3 g/mol), em 25 mL dH2O num 125 mL. Adicionar 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
- Prepare-se pela dissolução de sacarose g 13,69 (342.3 g/mol) em 50 mL dH2O num 125 mL 0,8 M de sacarose. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
- Preparar a desoxirribonuclease 5mg/mL eu (DNase eu) pela dissolução de 0,015 g DNase I em 3 mL de dH2O num balão de 50 mL. Esterilize por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm. Alíquota solução nos tubos de microcentrífuga e loja a-20 ° C.
- Preparar a 0,125 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8.0, dissolvendo dissódico de EDTA 0,698 g desidratar (372.2 g/mol) em 15ml dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
- Prepare-se 600 cefalexina µ g/mL, dissolvendo 0,03 g de hidrato de Cefalexina (365.404 g/mol) em 50 mL de dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em 4 ° C.
- Prepare lisozima de 5 mg/mL, dissolvendo lisozima 0,015 g em 3 mL de dH2O num balão de 50 mL. Esterilize por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm. Alíquota solução nos tubos de microcentrífuga e loja a-20 ° C.
- Prepare-se 3% w/v trypcase soja caldo (TSB) dissolvendo-se 30 g de TSB em 1 L de dH2O em um frasco de 2 L. Alíquota da solução em frascos contendo 25 mL ou 100 mL TSB para ser usado na preparação de Escherichia coli spheroplasts ou b. megaterium protoplastas, , respectivamente. Frascos de autoclave para esterilizar o meio líquido. TSB estéril pode ser armazenado em temperatura ambiente ou em 4 ° C.
- Prepare a solução C (1 M de sacarose, maleato de 0,04 M, 0,04 M MgCl2, pH 6.5) dissolvendo-se sacarose g 34,23 (342.3 g/mol), ácido maleico de 0,46 g (116.07 g/mol) e 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) em 100 mL de dH2O num balão de 250 mL. Ajuste o pH para 6,5. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
- Prepare 200 mL de meio de protoplastos misturando 100 mL 3% w/v TSB e 100 mL solução C em um frasco de vidro de 1 L. Autoclave para esterilizar a solução e armazenar à temperatura ambiente.
2. preparação da cultura durante a noite
Nota: Execute seções 2-4 usando técnicas estéreis adequadas. Se desejado, uma estirpe bacteriana pode conter um plasmídeo para resistência a antibióticos reduzir o potencial de contaminação. Se usando uma tensão com a resistência aos antibióticos, adicione os antibióticos necessários em passos 2.1, 3.1, 3.2 e 4.1 – 4.4.
- Prepare uma cultura durante a noite, escolher uma única colônia de bactérias, usando a ponta da pipeta estéril e colocando-o em um tubo de cultura de 14 mL contendo 2-3 mL de 3% w/v TSB. Incube a 37 ° C, agitando para 16 – 21 h.
3. preparação de bactérias Gram-negativas Escherichia coli Spheroplasts
- Em um balão de 250 mL, diluir a 1: 100 cultura durante a noite em volume de 25 mL de 3% w/v TSB e incubar a solução bacteriana a 37 ° C, agitando-se por cerca de 2,5 h até que a solução alcançou uma densidade óptica de 0,5-0,8 em 600 nm. Medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro.
- Em um balão de 250 mL, diluir esta cultura 01:10 em 30 mL de 3% w/v TSB e incubar a 37 ° C, agitando para 2,5 h na presença de cefalexina de 60 µ g/mL (347.4 g/mol) para produzir filamentos unicelulares de cerca 50 – 150 µm de comprimento , que são observáveis sob magnificação de X 1.000 usando um microscópio de luz (figura 1B).
- Recolher os filamentos por centrifugação a solução bacteriana a 1.500 x g, 4 ° C por 4 min. decantar e descartar o sobrenadante, reservando-se o pellet.
- Lave os filamentos, suavemente, adicionando 1 mL de 0,8 M de sacarose, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Incubar durante 1 min e em seguida, descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Adicionar 150 µ l de 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µ l de lisozima de 5 mg/mL, 30 µ l de 5mg/mL DNase I e 120 µ l de 0,125 M EDTA em seus respectivos a fim da pelota e incubar a solução à temperatura ambiente por 10 min.
- Adicione 1 mL da solução A gradualmente mais 1 min a solução preparada no 3.5 usando uma micropipeta, enquanto suavemente agitando a solução à mão. Incube a solução para 4 min à temperatura ambiente.
- 7 mL de solução de 4 ° C B colocar dois tubos cônico de 15 mL. Adicione quantidades iguais de solução preparada no 3.6 a cada um destes dois tubos. Centrifugue a solução a 1.500 x g, 4 ° C por 4 min.
- Usando uma pipeta sorológica, cuidadosamente remova todos, mas 1–2 mL do sobrenadante sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet pipetando delicadamente acima e para baixo usando uma micropipeta P1000. Verifique visualmente para ver a formação de spheroplasts, observando a amostra na ampliação de X 1.000 usando um microscópio de luz (Figura 1).
- Armazene os spheroplasts a-20 ° C por até uma semana ou até que eles passaram por 3 ciclos de congelamento e descongelamento.
4. preparação de protoplastas de Gram-positivas b. megaterium
- Em um balão de 250 mL, diluir o 1:1,000 durante a noite de cultura em 100 mL de 3% w/v TSB e incubar a solução bacteriana a 37 ° C, agitando para aproximadamente 4.5 h até que a solução alcançou uma densidade óptica de 0,9–1.0 em 600 nm. Medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro.
- Despeje a líquido cultura em dois tubos de Erlenmeyer de 50 mL e centrifugar a 2.000 x g, 4 ° C por 10 min.
- Usando uma pipeta sorológica, desprezar o sobrenadante de ambos os tubos cónicos. Cada Ressuspender em 2,5 mL de meio de protoplastos e combinar as ressuspensa soluções em um único tubo cónico. Adicionar a solução de ressuspensa combinada em um balão de 125 mL.
- Adicionar 1 mL de lisozima de 5 mg/mL e incubar durante 1 h a 37 ° C, agitando.
- Monitore o crescimento dos protoplastas sob a ampliação de x 1.000 usando um microscópio de luz, anotando quaisquer irregularidades, tais como bactérias que aparecem como varetas inchadas em vez de esferas (Figura 2). Usando uma pipeta sorológica, transferi a solução para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a 2.000 x g, 4 ° C por 10 min.
- Decante o sobrenadante e ressuspender o sedimento em mídia de protoplastos de 5 mL. Loja protoplastas a-20 ° C por até uma semana ou até que eles passaram por 3 ciclos de congelamento e descongelamento.
5. preparação da solução de peptídeo e tintura de membrana para a imagem latente
-
Solução de peptídeo
- Em um tubo de microcentrífuga envolvido em papel alumínio, dissolva 2 mg de FITC rotulado P11A BF2 em 800 µ l dH2O. uso um peptídeo contendo pelo menos um resíduo de triptofano a fim de realizar medições de concentração de proteína.
- Espectrofotometria, medir a absorvância da solução de peptídeo em 280 nm em triplicado. Calcule a concentração de peptídeo usando o coeficiente de extinção molar para triptofano (5.700/Mcm).
- Dilua a concentração de peptídeo em dH2O a uma concentração final de 100 – 200 µM. armazene-o em um tubo de microcentrífuga a-20 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.
-
Tintura de membrana
- Em um tubo de microcentrífuga, prepare um estoque de 10 mM de di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) dissolvendo-se 5 mg de di-8-ANEPPS em 843.3 µ l de DMSO. Armazenar a 4 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.
- Em um tubo de microcentrífuga, prepare-se 1 mL de 0,03 mM di-8-ANEPPS adicionando 3 µ l de 10mm di-8-ANEPPS de 997 µ l DMSO. Armazenar em um tubo de microcentrífuga a 4 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.
6. visualização de Escherichia coli Spheroplasts e b. megaterium protoplastas usando microscopia Confocal
- Pipete 5 µ l de spheroplasts ou protoplastas numa lâmina de vidro revestido de poli-L-lisina. Adicionar 2 µ l de FITC rotulado AMP (100-200 µM) para o slide e incubar durante 3 min, protegido da luz.
- Adicionar 1 µ l da membrana tintura di-8-ANEPPS (0,03 mM) para o slide e incubar durante 3 min, protegido da luz. Cobrir com uma lamela de vidro e lacre com o esmalte.
- Ligue o laser confocal de microscópio e argônio. Ajuste o laser de argônio de potência de saída de 20% e 20% de transmissão.
- Defina intervalos de comprimento de onda de emissão de 499-532 nm e 745 – 670 nm para o canal de emissão do peptídeo FITC-etiquetadas e canal de emissão de tintura di-8-ANEPPS-rotulado de membrana, respectivamente.
- Protoplastas de imagem ou spheroplasts (Figura 1 e Figura 2) com um objetivo X 63. Use o software de imagem para obter 8 bits, imagens de 512 x 512 composto z-pilha composta de 0,5 µm fatias da totalidade dos protoplastos ou do spheroplast.
Nota: Levar consideração cuidadosa para reduzir a emissão de infiltração enquanto imagem spheroplasts e protoplastas. Consulte a discussão para mais detalhes.
7. Caracterização da localização da AMP
- Abra a imagem do composto z-pilha em software de imagem. Localize a centro mais fatia do spheroplast ou protoplastos e coloque uma região circular de interesse (ROI) (0,3 µm de diâmetro) sobre a membrana (ROI 1), um no centro do spheroplast ou protoplastos (ROI 2) e um longe do spheroplast ou protoplastos para medir a fluorescência de fundo (ROI 3) (Figura 5). Evite a inclusão de pixels saturados. A intensidade de fluorescência em cada ROI pode ser calculada pelo software de imagem.
Nota: Em casos quando não localizar o peptídeo para a totalidade da membrana, desenhe 1 ROI em uma área da membrana onde o peptídeo é localizado. - Use a seguinte equação para determinar a relação de intensidade de fluorescência do peptide intracelular a intensidade de fluorescência de peptídeo de membrana:
Nota: A intensidade de fluorescência em ROI 3 é subtraída de intensidades de fluorescência no ROI 2 e 1 de ROI para dar conta da fluorescência do fundo.
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Representative Results
Ampliando as bactérias e tornando-os esféricos, podemos facilmente distinguir peptídeos localizar à membrana bacteriana ou translocar prontamente através da membrana bacteriana. Os limites de resolução dos microscópios de luz convencionais torná-lo desafiador para distinguir se o peptídeo sinais surgem da membrana ou espaço intracelular de bactérias normais porque sinais localizados na membrana aparecerá para coincidir com o espaço intracelular (Figura 3A). Em contraste, o tamanho ampliado dos spheroplasts (2 – 5 µm) e protoplastas (2 – 3 µm) em comparação com as bactérias normais, que são tipicamente somente 1 µm de diâmetro, resulta em uma resolução clara entre o marcador de membrana e o espaço intracelular, tornando mais fácil para distingui a localização do peptide (Figura 3B).
Aqui, spheroplasts e protoplastas são usados para demonstrar o padrão de localização do FITC N-terminal rotulado AMP BF2 P11A. Observamos que FITC rotulado BF2 P11A para localizar à membrana e translocar através da membrana celular de spheroplasts de e. coli e b. megaterium protoplastas (Figura 4). Enquanto o tipo selvagem BF2 tem sido observado para translocar através das membranas de vesículas de e. coli e lipídico, a mutação P11A é conhecida por reduzir esta translocação13,,27,28. Utilizamos um resistente não-antibiótico b. megaterium e resistente à ampicilina Top 10 Escherichia coli (pET45B) nos dados apresentados. O resistente à ampicilina, Escherichia coli foi cultivada na presença de ampicilina (349.4 g/mol), em uma concentração final de 25 µ g/mL em solução. Para tratamento de imagens, seguindo a abordagem sistemática descrita na secção 7, ROIs foram desenhados no espaço intracelular, a membrana e o fundo (Figura 5B). A relação de intensidade de fluorescência do peptide intracelular a intensidade de fluorescência do peptídeo na membrana foi calculada para cada do spheroplast ou protoplastos interagindo com BF2 P11A usando a equação descrita na seção 7.2. Figura 5A mostra a distribuição desta relação para todos os spheroplasts e protoplastos marcado. O spheroplasts e protoplastas marcaram em grande parte caiu em dois grupos, com a maioria dos spheroplasts ou protoplastas, tendo uma relação de menos de 0,3 ou maior que 1.
Dada os grupos distintos que se enquadram os rácios, definimos a localização do peptide como se quando a proporção calculada na seção 7.2 foi maior ou igual a 1. Por outro lado, localização de peptídeo foi definida como membrana localizando quando a relação descrita na seção 7.2 foi menor que 1. Seguindo este método de marcar um gol, observamos um localização padrão semelhante para BF2 P11A em Escherichia coli spheroplasts e protoplastas b. megaterium com BF2 P11A localizando à membrana em 71% e 70% dos casos de e. coli spheroplasts e B. megaterium protoplastas, respectivamente (tabela 1).
Figura 1: Imagens representativas de e. coli. (A) e. coli cobra de Escherichia coli bactérias (B) e (C) Escherichia coli spheroplast. Imagens foram tiradas na ampliação de 100 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de b. megaterium. (A) b. megaterium bactérias e (B) b. megaterium protoplastos. Imagens foram tiradas na ampliação de 100 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de b. megaterium. (A) b. megaterium célula bacteriana e (B) b. megaterium protoplastos rotulado com o marcador de membrana di-8-ANEPPS. São mostradas imagens da z-pilha média 100 X (A) e ampliação de X (B) 63. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representante Escherichia coli spheroplasts e protoplastas b. megaterium interagindo com FITC rotulado BF2 P11A. (A) apresentando do spheroplast de e. coli BF2 P11A localizando à membrana. (B) apresentando do spheroplast de e. coli P11A BF2-se através da membrana. (C) b. megaterium apresentando de protoplastos BF2 P11A localizando à membrana. (D) b. megaterium apresentando de protoplastos BF2 P11A se através da membrana. Spheroplasts de e. coli e b. megaterium protoplastas são rotulados com a membrana marcador di-8-ANEPPS (vermelho) e FITC rotulado P11A BF2 (verde). Imagens da z-pilha média são mostradas na ampliação de X 63. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: análise de padrões de localização de peptídeo. (A) distribuição do rácio da intensidade de fluorescência intracelular (ROI 2) a intensidade de fluorescência de membrana (1 de ROI) após subtracção de fundo (ROI 2-ROI (3) / (1 ROI-ROI 3)) para spheroplasts de e. coli e b. megaterium protoplastas rotulados com BF2 P11A (B) Escherichia coli spheroplast interagindo com FITC rotulado P11A BF2. Circular regiões de interesse (ROI) 0,3 µm de diâmetro, desenhado no espaço intracelular de membrana (ROI 1) (2 de ROI) e fundo (ROI 3). A intensidade da fluorescência do peptídeo foi quantificada em cada ROI e a fluorescência de fundo foi contabilizada subtraindo-se a intensidade de fluorescência em ROI 3 da intensidade de fluorescência em ROI 1 e 2 de ROI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Estirpe bacteriana | Não. SPHEROPLAST ou protoplastos | Localização de membrana % | Se % |
| Escherichia coli | 84 | 71 | 29 |
| B. megaterium | 70 | 70 | 30 |
Tabela 1: O padrão de localização de BF2 P11A interagindo com Escherichia coli spheroplasts e b. megaterium protoplastas.
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Discussion
Os protocolos aqui apresentados torná-lo viável para os investigadores mais rapidamente obter maiores tamanhos de amostra de imagens bacterianas porque as bactérias alargadas, esféricas são mais fáceis de localizar, orientar e da imagem. Melhorada a capacidade de coletar dados é valiosa em vários aspectos. Em primeiro lugar, permite uma análise quantitativa mais sistemática dos padrões de localização de peptídeo. Enquanto tendências qualitativas podem ser demonstradas de pequenos conjuntos de imagens, apenas um conjunto de amostra grande de imagens de alta qualidade revelar mais matizada tendências em padrões de localização, tais como a percentagem de células onde um peptídeo translocates versus localiza para o membrana. Também, a capacidade de resolver melhor a fluorescência interna da localização da membrana torna mais fácil para realizar estudos de curso do tempo para avaliar quão rapidamente peptídeos interagirem com células bacterianas, bem como a forma como os padrões de localização mudam ao longo do tempo. A melhor resolução também permite que os pesquisadores a considerar tendências na localização de peptídeo que não são possíveis com bactérias menores. Por exemplo, em alguns dos nossos observados spheroplasts e protoplastas, peptídeos parecem localizar para seções específicas da membrana, ou seja, os sinais de peptídeo não formar um anel completo, coeso em torno de bactérias e em vez disso mostrar alguns punctate rotulagem. Em outros casos, peptídeos não podem ser distribuídos uniformemente inteiramente dentro da membrana bacteriana, ou seja, o peptídeo sinaliza não preencher completamente o espaço interno das bactérias. Enquanto não perseguimos a estas tendências em nossa análise atual, considerar tais tendências de localização torna-se viável quando spheroplasts e protoplastas em vez de células bacterianas padrão de imagem. Estas vantagens também se aplicaria para determinar a localização de peptídeos além de amplificadores, tais como peptídeos penetra no celular. SPHEROPLASTS e protoplastas produzidos com estas abordagens também poderiam ser utilizados para experiências de não-imagem que se beneficiam do aumento do tamanho celular, tais como remendo-braçadeira eletrofisiologia medições18,19.
Um microscópio confocal de varredura de laser foi utilizado no desenvolvimento do nosso protocolo de imagem, mas é fundamental para otimizar os parâmetros para cada sistema de imagem específico. Isso inclui a seleção de um conjunto de parâmetros que maximizam a detecção de fluorescência de tintura de peptídeo e membrana, enquanto minimiza a infiltração da membrana tintura no canal de emissão do peptide e do peptide FITC-etiquetados para a membrana canal de emissão. Infiltração do peptide em canal de emissão da membrana foi evitada, selecionando um intervalo de comprimento de onda para o canal de emissão da membrana que não inclui qualquer porção do espectro de emissão do FITC. Infiltração da tintura da membrana, di-8-ANEPPS, no canal de emissão do peptide era mais difícil de evitar, pois o espectro de emissão dos di-8-ANEPPS sobrepõe-se com a maioria do espectro de emissão do FITC. Específico ao presente protocolo, infiltração da membrana tintura no canal de emissão do peptide pode resultar na caracterização falsa de amplificadores como membrana localizada. Um pode determinar se a infiltração desta natureza está ocorrendo por imaging spheroplasts ou protoplastas que são exclusivamente rotulados com tintura de membrana e verificar para ver se a fluorescência é visível no canal de emissão do peptide. Vários parâmetros de imagem, incluindo o intervalo de comprimento de onda usado para definir o canal de emissão do peptide e os valores de ganho e offset, podem ser sistematicamente testados para determinar um conjunto de parâmetros que minimiza a infiltração. Uma vez estabelecido um conjunto de parâmetros, é fundamental para avaliar se a imagem produz forte deteção do sinal de fluorescência quando spheroplasts ou protoplastas rotulados com tintura de peptídeo e a membrana são utilizados. Através desta abordagem, estabelecemos com sucesso imagens parâmetros que minimizou o efeito da infiltração enquanto maximiza a detecção de fluorescência de ambos AMP FITC-etiquetadas e a membrana tingem di-8-ANEPPS. Especificamente, nós encontramos que a emissão infiltração da tintura da membrana para o canal de peptídeo foi minimizado usando intervalos de comprimento de onda de emissão de 499-532 nm (peptídeo) e 745 – 670 nm (membrana), e quando o ganho foi ajustado para ser ≤ 800 volts (V) (peptídeo) e V ≤900 (membrana) e o deslocamento foi ajustada para ≤-10.0% (peptídeo, membrana).
Embora nós focado em e. coli e b. megaterium, os protocolos apresentados podem ser adaptados para produzir spheroplasts ou protoplastas de muitas diferentes cepas bacterianas. Por exemplo, nós fomos capazes de produzir com sucesso protoplastas de Bacillus subtilis que eram 1 a 2 µm de diâmetro, usando o protocolo descrito na seção 4, e adaptações do protocolo poderiam ser feitas para otimizar ainda mais o tamanho. A capacidade de observar o peptídeo padrões de localização em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas é particularmente útil para o estudo dos amplificadores como diferenças na estrutura da parede celular entre essas duas classes de bactérias podem afetar como AMPs interagem com membranas celulares. No entanto, muitos estudos de imagiologia de amplificadores para data concentraram-se exclusivamente em estirpes de Escherichia coli de modelo e, assim, podem não refletir o comportamento de peptídeos com cepas bacterianas Gram-positivas.
SPHEROPLASTS e protoplastas diferem das bactérias normais, mais notavelmente em sua falta de uma parede exterior da célula e consequentemente não podem ser bons modelos para todas as perguntas experimentais. Por exemplo, demonstrou-se a membrana exterior de bactérias Gram-negativas para atuar como uma peneira molecular para maiores moléculas29. Peptídeos maiores, portanto, podem ser capazes de translocar em spheroplasts, quando não o fariam em bactérias normais. Além disso, estudos detalhados da interação do AMP com a parede celular de bactérias, membrana externa e membrana citoplasmática não podem ser executados usando spheroplasts e protoplastas. Por exemplo, trabalho recente do laboratório Weisshaar utilizou a imagem para observar as posições mais precisas do peptide nos CM15 e Melitina mecanismos de ação de30,31. No entanto, a nossa abordagem, conforme descrito aqui, não requer a implementação de microfluídica em Instrumentação de microscopia para alcançar a necessária resolução31. Embora trabalhos anteriores mostrou que esse spheroplasts viável21,,32, não obstante provavelmente têm algumas diferenças metabólicas e fisiológicas de bactérias "normais" que podem potencialmente alterar interações membrana em alguns casos. Além disso, porque nós não avaliaram a viabilidade das populações do spheroplast, um não pode distinguir entre um peptídeo que é facilmente capaz de translocar através da membrana celular de uma célula viva contra um peptídeo que só pode translocar através de um morto ou célula a morrer. Apesar dessas diferenças, temos visto os padrões de localização em Escherichia coli spheroplasts para muitos amplificadores que são consistentes com mecanismos conhecidos de ação15e nossos resultados para BF2 P11A com b. megaterium protoplastas apresentados aqui parece consistente com outras observações para esse peptídeo13,,27,28. As composições de membrana de spheroplasts e protoplastas também são certamente mais fisiologicamente relevantes que as misturas típicas usadas em outros sistemas modelo, tais como vesículas lipídicas. Em resumo, dado a resolução avançada e facilidade de imagem proporcionada por spheroplasts e protoplastas, acreditamos que eles são modelos úteis para a visualização da membrana agentes ativos, tais como amplificadores, em uma variedade de cepas bacterianas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse são declarados.
Acknowledgments
Pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID-NIH) prêmio R15AI079685.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
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