Summary
Qui presentiamo un protocollo per produrre gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) Sferoplasti e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplasti di visualizzare chiaramente e rapidamente caratterizzare interazioni del peptide-batteri. Questo fornisce un metodo sistematico per definire membrana localizzazione e dispostamento peptidi.
Abstract
L'uso della microscopia confocale come un metodo per valutare i modelli di localizzazione del peptide all'interno batteri comunemente è inibita dai limiti della risoluzione dei microscopi ottici convenzionali. Come la risoluzione di un microscopio dato non può essere facilmente migliorata, vi presentiamo protocolli per trasformare la piccola a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) in forme sferiche più grandi, facilmente imaged chiamarono Sferoplasti o protoplasti. Questa trasformazione permette agli osservatori di rapidamente e chiaramente determinare se peptidi presentare se stessi nella membrana batterica (cioè, localizzazione di membrana) o attraversano la membrana per entrare nella cellula (cioè, dispostamento). Con questo approccio, inoltre presentiamo un metodo sistematico per caratterizzare i peptidi come membrana localizzazione o dispostamento. Mentre questo metodo può essere utilizzato per una varietà di peptidi attivi di membrana e ceppi batterici, dimostriamo l'utilità del presente protocollo osservando l'interazione di Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobico (AMP), con e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti.
Introduction
Peptidi antimicrobici (amp) hanno guadagnato l'attenzione a causa del loro potenziale utilizzo in alternativa agli antibiotici convenzionali1,2,3,4,5. Amplificatori per uccidono i batteri sia dispostamento attraverso la membrana cellulare e interagendo con componenti intracellulari quali gli acidi nucleici o di permeabilizing la membrana provocando perdite di cella contenuto6. Oltre al loro uso come antibiotici, dispostamento amplificatori può essere adattato per le applicazioni di consegna di droga perché essi senza interruzioni possono attraversare la membrana cellulare impermeabile7,8. Di conseguenza, cerchiamo di capire i meccanismi di azione di gettare le basi per il loro uso nel disegno della droga fondamentali-AMP.
Microscopia confocale offre un modo per valutare i modelli di localizzazione degli amplificatori fluorescente identificati nelle cellule batteriche fornendo intuizioni loro meccanismo di azione9,10,11,12, 13 , 14. identificando la membrana dei batteri, si può determinare se un peptide fluorescente contrassegnato si localizza la membrana o spazio intracellulare di una cellula batterica. Tuttavia, questa tecnica è limitata dalla piccola dimensione e rod forma di batteri, che possono rendere impegnativa a causa di limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali e l'orientamento variabile dei batteri sulla diapositiva15di imaging.
L'obiettivo del metodo presentato è quello di attivare la visualizzazione avanzata dei modelli di localizzazione del peptide fluorescente identificati usando la microscopia confocal. Visualizzazione è migliorato girando la piccola, sottile, a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) batteri in forme sferiche, allargate indicato come Sferoplasti (per ceppi gram-negativi) e protoplasti (per ceppi gram-positivi)16,17,18,19,20,21. Sferoplasti e protoplasti sono più facili da immagine a causa della loro maggiore dimensione sia loro forma simmetrica, che rende l'orientamento di un batterio su un vetrino irrilevante per la sua rappresentazione. Inoltre, vi presentiamo un approccio sistematico per analizzare quantitativamente dati di microscopia confocale per caratterizzare AMPs come entrambi membrana localizzazione o dispostamento. L'applicazione di questi metodi rende più facile distinguere fluorescente etichettati modelli di localizzazione del peptide. I protocolli presentati qui possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di una varietà di agenti di membrana-attivo diverso da AMPs, compresi peptidi cellula-penetrante.
Un vantaggio di questa tecnica è che esso fornisce il meccanismo di azione degli amplificatori: approfondimenti a livello di singola cellula, che può rivelare la cellula--cellula eterogeneità15, al contrario di altre analisi di fluorescenza comunemente utilizzato per identificare il meccanismi di azione degli amplificatori, che forniscono soltanto alla rinfusa stime9,22,23,24,25. L'uso di Sferoplasti e protoplasti al fine di valutare la voce di cella AMP è utile particolare26 perché sono più fisiologicamente rilevanti15 rispetto ad altri modelli utilizzati per la valutazione della voce di cella, ad esempio di vescicole lipidiche24.
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Protocol
1. soluzione preparazione
Nota: Preparare soluzioni descritte nei passaggi 1.1-1.9 e 1.8 – 1.11 per produrre sferoplasti di e. coli e b. megaterium protoplasti, rispettivamente.
- Preparare 1 M Tris-Cl, pH 7,8 sciogliendo 10,34 g Tris HCl e 4,17 g di Tris OH in 50 mL di dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
- Preparare soluzione A (20 mM MgCl2, 0,7 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) e 11,98 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 25 mL dH2O in un pallone da mL 125. Aggiungere 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e regolare il volume di 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
- Preparare soluzione B (10mm MgCl2, 0,8 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) e 13,69 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 25 mL dH2O in un pallone da mL 125. Aggiungere 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e regolare il volume di 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
- Preparate 0,8 M saccarosio sciogliendo 13,69 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 50 mL dH2O in un pallone da mL 125. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
- Preparare desossiribonucleasi 5mg/mL ho (DNasi io) sciogliendo 0,015 g dnasi I a 3 mL di dH2O in un pallone da 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm. Aliquota soluzione in tubi del microfuge e conservare a-20 ° C.
- Preparare 0,125 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 8.0 sciogliendo disodio EDTA 0,698 g disidratare (372.2 g/mol) in 15 mL dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
- Preparare cephalexin µ g/mL 600 sciogliendo 0,03 g di idrato di cephalexin (365.404 g/mol) in 50 mL di dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in una provetta conica a 4 ° C.
- Preparate il lisozima 5mg/mL sciogliendo lisozima 0,015 g in 3 mL di dH2O in un pallone da 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm. Aliquota soluzione in tubi del microfuge e conservare a-20 ° C.
- Preparate 3% p/v Trypticase Soy brodo (TSB) sciogliendo 30 g di TSB in 1 L di dH2O in un pallone da 2 L. Aliquota della soluzione in beute contenenti 25 mL o 100 mL TSB per essere utilizzati nella preparazione di Escherichia coli Sferoplasti o protoplasti megaterium b. , , rispettivamente. Boccette di autoclave per sterilizzare il mezzo liquido. TSB sterile può essere conservato a temperatura ambiente o 4 ° C.
- Preparare soluzione C (1 M saccarosio, maleate di 0,04 M, 0.04 M MgCl2, pH 6.5) sciogliendo 34,23 g di saccarosio (342.3 g/mol), 0,46 g acido maleico (116.07 g/mol) e 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) in 100 mL di dH2O in un pallone da 250 mL. Regolare il pH a 6.5. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
- Preparare 200 mL di terreno di protoplasti mescolando 100 mL 3% p/v TSB e 100 mL di soluzione C in un flacone di vetro 1 L. Autoclave per sterilizzare la soluzione e conservare a temperatura ambiente.
2. preparazione della cultura durante la notte
Nota: Eseguire sezioni 2-4 usando tecniche sterili appropriate. Se lo si desidera, un ceppo batterico può contenere un plasmide per la resistenza antibiotica per ridurre la potenziale contaminazione. Se utilizza un ceppo con resistenza agli Antibiotico, è possibile aggiungere gli antibiotici necessari nei passaggi 2.1, 3.1-3.2 e 4.1 – 4.4.
- Preparare una coltura durante la notte con la scelta di una singola colonia di batteri utilizzando una pipetta sterile e inserirlo in un tubo di cultura 14 mL contenente 2 – 3 mL di 3% p/v TSB. Incubare a 37 ° C, mentre si stringono per h 16 – 21.
3. preparazione di Sferoplasti gram-negativi Escherichia coli
- In un pallone da 250 mL, diluire il pernottamento cultura 1: 100 in 25 mL di volume di 3% w/v TSB e incubare la soluzione batterica a 37 ° C, agitando per circa 2,5 h fino a quando la soluzione raggiunge una densità ottica di 0,5 – 0,8 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.
- In un pallone da 250 mL, diluire questa cultura 01:10 in 30 mL di 3% p/v TSB e incubare a 37 ° C, mentre si stringono per 2,5 h in presenza di cephalexin 60 µ g/mL (347.4 g/mol) per la produzione di filamenti di singola cellula di circa 50 – 150 µm di lunghezza , che sono osservabili sotto 1.000 X ingrandimento utilizzando un microscopio ottico (Figura 1B).
- Raccogliere i filamenti mediante centrifugazione la soluzione batterica a 1.500 x g, 4 ° C per 4 min. decantare e scartare il surnatante, riservando il pellet.
- Lavare i filamenti delicatamente aggiungendo 1 mL di saccarosio di 0,8 M, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Incubare per 1 min e poi scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.
- Aggiungere 150 µ l di 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µ l di lisozima di 5 mg/mL, 30 µ l di 5 mg/mL dnasi I e 120 µ l di 0,125 M EDTA nei rispettivi ordina al pellet e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min.
- Aggiungere 1 mL di soluzione A gradualmente oltre 1 min per la soluzione preparata in 3.5 utilizzando una micropipetta mentre delicatamente agitando la soluzione a mano. Incubare la soluzione per 4 min a temperatura ambiente.
- Mettere 7 mL di soluzione di 4 ° C B in due provette coniche da 15 mL. Aggiunge la stessa quantità di soluzione preparata in 3.6 a ciascuno di questi due tubi. Centrifugare la soluzione a 1.500 x g, 4 ° C per 4 min.
- Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere con cautela tutti ma 1–2 mL di surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet pipettando delicatamente su e giù utilizzando una micropipetta P1000. Controllare visivamente formazione Sferoplasti osservando il campione a 1.000 X ingrandimento utilizzando un microscopio ottico (Figura 1).
- Memorizzare gli Sferoplasti a-20 ° C per fino ad una settimana o fino a quando essi sono passati attraverso 3 cicli di gelo-disgelo.
4. preparazione dei protoplasti di Gram-positivi megaterium b.
- In un pallone da 250 mL, diluire il 1:1,000 durante la notte di cultura in 100 mL di 3% p/v TSB e incubare la soluzione batterica a 37 ° C, agitando per circa 4,5 h fino a quando la soluzione raggiunge una densità ottica di 0,9–1.0 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.
- Versare la coltura liquida in due provette coniche da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 ° C per 10 min.
- Utilizzando una pipetta sierologica, scartare il surnatante da entrambi i tubi conici. Ogni risospendere in 2,5 mL di terreno di protoplasti e combinare le soluzioni sedimento in un singolo tubo conico. Dispensare la soluzione combinata di sedimento in un matraccio da 125 mL.
- Aggiungere 1 mL di lisozima di 5 mg/mL e incubare per 1h a 37 ° C, mentre si stringono.
- Monitorare la crescita dei protoplasti sotto 1.000 x ingrandimento utilizzando un microscopio ottico, rilevando eventuali irregolarità, come i batteri che vengono visualizzati come barre gonfiati invece di sfere (Figura 2). Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 ° C per 10 min.
- Decantare il supernatante e risospendere il pellet in media di protoplasti di 5 mL. Memorizzare i protoplasti a-20 ° C per fino ad una settimana o fino a quando essi sono passati attraverso 3 cicli di gelo-disgelo.
5. preparazione della soluzione Peptide e tintura di membrana per l'Imaging
-
Soluzione peptide
- In un tubo di microfuge avvolto in carta stagnola, sciogliere 2 mg di FITC etichettato BF2 P11A, dH 800 µ l2O. uso un peptide contenente almeno un residuo di triptofano al fine di effettuare misure di concentrazione di proteina.
- Spettrofotometricamente, misurare l'assorbanza della soluzione del peptide a 280 nm in triplice copia. Calcolare la concentrazione di peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare per triptofano (5.700/Mcm).
- Diluire la concentrazione di peptide in dH2O a una concentrazione finale di 100 – 200 µM. Store in un tubo di microfuge a-20 ° C avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.
-
Tintura di membrana
- In un tubo di microfuge, preparare un brodo di 10 mM di-8-ANEPPS (592,9 g/mol) sciogliendo 5 mg di-8-ANEPPS in 843.3 µ l di DMSO. Conservare a 4 ° C, avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.
- In un tubo di microfuge, preparare 1 mL di 0,03 mM di-8-ANEPPS con l'aggiunta di 3 µ l di 10 mM di-8-ANEPPS a 997 µ l DMSO. Conservare in un tubo di microfuge a 4 ° C, avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.
6. visualizzazione di e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti mediante microscopia confocale
- Pipettare 5 µ l di Sferoplasti o protoplasti su una lastra di vetro rivestito di poli-L-lisina. Aggiungere 2 µ l di FITC etichettato AMP (100-200 µM) alla diapositiva e incubare per 3 min al riparo dalla luce.
- Aggiungere 1 µ l della membrana della tintura di-8-ANEPPS (0,03 mM) alla diapositiva e incubare per 3 min al riparo dalla luce. Coprire con un vetrino coprioggetti e sigillare con lo smalto di chiodo.
- Accendere il laser confocale di microscopio e argon. Regolare il laser di argon per potenza di 20% e 20% trasmissione.
- Impostare gli intervalli di lunghezza d'onda emissione di 499 – 532 nanometro e 670 – 745 nm per il peptide FITC-labeled emissione canale e membrana di-8-ANEPPS-labeled tintura emissione, rispettivamente.
- Protoplasti di immagine o Sferoplasti (Figura 1 e Figura 2) con un obiettivo X 63. Utilizzare software di imaging per ottenere 8-bit, 512 x 512 composito z-stack immagini composte di 0,5 µm fette della totalità del sferoplasto o del protoplasto.
Nota: Prendere attenta considerazione per ridurre l'emissione trapasso mentre imaging Sferoplasti e protoplasti. Vedere la discussione per i dettagli.
7. caratterizzazione della localizzazione di AMP
- Aprire l'immagine di z-pila composito in software di imaging. Individuare la fetta più in centro di sferoplasto/i protoplasti e posizionare una regione circolare di interesse (ROI) (0,3 µm di diametro) sulla membrana (ROI 1), uno al centro del sferoplasto o del protoplasto (ROI 2) e una distanza dello spheroplast o protoplasti su misura la fluorescenza di fondo (ROI 3) (Figura 5). Evitare l'inclusione di pixel saturi. L'intensità di fluorescenza in ogni ROI può essere calcolato dal software di imaging.
Nota: In casi quando peptide non localizza all'interezza della membrana, disegno ROI 1 in un'area della membrana dove è localizzato il peptide. - Utilizzare la seguente equazione per determinare il rapporto di intensità di fluorescenza del peptide intracellulare di intensità di fluorescenza del peptide di membrana:
Nota: L'intensità di fluorescenza in ROI 3 viene sottratto dall'intensità di fluorescenza in ROI 2 e ROI 1 per tenere conto di fluorescenza di fondo.
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Representative Results
Ingrandendo i batteri e rendendoli sferica, possiamo distinguere facilmente se peptidi si localizzano la membrana batterica o traslocano facilmente attraverso la membrana batterica. I limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali rendono difficile distinguere se peptide segnali derivano dalla membrana o spazio intracellulare in batteri normali perché segnali localizzati alla membrana apparirà a sovrapporsi con la spazio intracellulare (Figura 3A). Al contrario, la dimensione allargata di Sferoplasti (2 – 5 µm) e protoplasti (2 – 3 µm) rispetto ai batteri normali, che sono in genere solo 1 µm di diametro, provoca chiara risoluzione tra il marcatore di membrana e lo spazio intracellulare, rendendo più facile distinguere la localizzazione del peptide (Figura 3B).
Qui, Sferoplasti e protoplasti vengono utilizzati per mostrare il modello di localizzazione del CIC del N-terminale etichettato P11A BF2 AMP. Osserviamo che FITC etichettato BF2 P11A per localizzare alla membrana sia traslocano nel attraverso la membrana cellulare di e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti (Figura 4). Mentre selvaggio tipo BF2 è stato osservato per traslocare attraverso le membrane delle vescicole e. coli e del lipido, la mutazione P11A è noto per ridurre questa traslocazione13,27,28. Abbiamo utilizzato un non-antibiotico-resistenti b. megaterium e ampicillina resistente Top 10 Escherichia coli (pET45B) nei dati presentati. L' ampicillina resistenti e. coli è stato coltivato in presenza di ampicillina (349.4 g/mol) a una concentrazione finale in soluzione di 25 µ g/mL. Per l'imaging, seguendo l'approccio sistematico delineato nella sezione 7, ROIs sono stati disegnati sulla membrana, spazio intracellulare e lo sfondo (figura 5B). Il rapporto di intensità di fluorescenza del peptide intracellulare di intensità di fluorescenza del peptide sulla membrana è stato calcolato per ogni sferoplasto o protoplasti interagendo con BF2 P11A usando l'equazione descritto nel capitolo 7.2. Figura 5A Mostra la distribuzione di questo rapporto per tutti gli Sferoplasti e protoplasti segnato. Gli sferoplasti e protoplasti segnato in gran parte è caduto in due gruppi, con la maggior parte di Sferoplasti o protoplasti avendo un rapporto di meno di 0,3 o maggiore di 1.
Dato i gruppi distinti che i rapporti rientrano in, abbiamo definito la localizzazione del peptide come dispostamento quando il rapporto calcolato nella sezione 7.2 era maggiore o uguale a 1. Al contrario, la localizzazione del peptide è stato definito come membrana localizzazione quando il rapporto descritto nel capitolo 7.2 era meno di 1. Seguendo questo metodo di scoring, abbiamo osservato un modello simile localizzazione per BF2 P11A in e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti con BF2 P11A localizzazione a livello della membrana nel 71% e il 70% dei casi per e. coli Sferoplasti e B. megaterium protoplasti, rispettivamente (tabella 1).
Figura 1: Immagini rappresentative di e. coli. (A) e. coli serpente di e. coli batteri (B) e (C) e. coli sferoplasto. Immagini sono state scattate a 100 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di b. megaterium. (A) b. megaterium batteri e (B) b. megaterium protoplasti. Immagini sono state scattate a 100 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative di b. megaterium. (A) b. megaterium cellula batterica e (B) b. megaterium protoplasti etichettati con il marcatore di membrana di-8-ANEPPS. Immagini dallo z-stack medio sono mostrati a 100 X (A) e 63 X (B) ingrandimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentante Escherichia coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti interagendo con FITC etichettati BF2 P11A. (A) visualizzando sferoplasto Escherichia coli BF2 P11A localizzazione alla membrana. (B) visualizzando sferoplasto Escherichia coli BF2 P11A dispostamento attraverso la membrana. (C) visualizzando protoplasti b. megaterium BF2 P11A localizzazione alla membrana. (D) visualizzando protoplasti b. megaterium BF2 P11A dispostamento attraverso la membrana. Sferoplasti di e. coli e b. megaterium protoplasti vengono etichettati con la membrana marcatore di-8-ANEPPS (rosso) e FITC etichettato P11A BF2 (verde). Immagini dallo z-stack medio sono mostrati a ingrandimento X 63. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: analisi dei modelli di localizzazione peptide. (A) distribuzione del rapporto di intensità di fluorescenza intracellulare (ROI 2) di intensità di fluorescenza di membrana (ROI 1) dopo la sottrazione del fondo ((2-ROI ROI 3) / (1-ROI ROI 3)) per e. coli Sferoplasti e megaterium b. protoplasti etichettati con BF2 P11A (B) e. coli sferoplasto interagendo con FITC etichettato P11A BF2. Circolare regioni di interesse (ROI) 0,3 µm di diametro disegnato nello spazio intracellulare di membrana (ROI 1) (ROI 2) e lo sfondo (ROI 3). L'intensità di fluorescenza del peptide è stato quantificato in ogni ROI e la fluorescenza di fondo era rappresentata sottraendo l'intensità di fluorescenza in ROI 3 dall'intensità di fluorescenza in ROI 1 e 2 di ROI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ceppo batterico | Lol Sferoplasto o protoplasti | Localizzazione di membrana % | % Translocating |
| E. coli | 84 | 71 | 29 |
| B. megaterium | 70 | 70 | 30 |
Tabella 1: il modello di localizzazione di BF2 P11A interagendo con Escherichia coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti.
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Discussion
I protocolli qui presentati rendono fattibile per i ricercatori per ottenere più rapidamente più grandi dimensioni del campione di immagini batteriche perché i batteri allargati, sferici sono molto più facili da individuare, orientare e dell'immagine. Questa maggiore capacità di raccogliere dati è utile sotto diversi aspetti. In primo luogo, consente un'analisi quantitativa più sistematica dei modelli di localizzazione del peptide. Mentre le tendenze qualitative possono essere dimostrate da più piccoli insiemi di immagini, solo un insieme di immagini di alta qualità grande esempio rivelano più sfumata tendenze nei modelli di localizzazione, come si localizza la percentuale delle cellule dove un peptide trasloca contro il membrana. Inoltre, la capacità di risolvere meglio la fluorescenza interna dalla localizzazione in membrana rende più facile per eseguire studi di corso di tempo per valutare quanto velocemente peptidi interagiscono con le cellule batteriche anche come modelli di localizzazione cambiano nel tempo. La risoluzione migliorata consente inoltre ricercatori a considerare le tendenze nella localizzazione del peptide che non sono possibili con i batteri più piccoli. Ad esempio, in alcuni dei nostri Sferoplasti osservati e protoplasti, peptidi sembrano localizzare a sezioni specifiche della membrana, cioè, i segnali di peptide non formano un anello completo, coesivo attorno i batteri e invece mostrare alcuni punctate etichettatura. In altri casi, peptidi non possono essere distribuiti in modo completamente uniforme all'interno della membrana batterica, cioè, il peptide segnali non riempire completamente lo spazio interno dei batteri. Mentre non abbiamo perseguito queste tendenze nella nostra analisi attuale, considerando tali tendenze di localizzazione diventa fattibile quando imaging Sferoplasti e protoplasti anziché standard delle cellule batteriche. Questi vantaggi si applicherebbe anche per determinare la localizzazione dei peptidi diversi da AMPs, come i peptidi cellula-penetrante. Sferoplasti e protoplasti producerat con questi approcci potrebbero anche essere utilizzati per esperimenti senza ricostruzione dell'immagine che trarre vantaggio dall'aumento delle dimensioni cellulare, quali patch clamp Elettrofisiologia misure18,19.
Microscopio confocale a scansione laser è stata utilizzata nello sviluppo del nostro protocollo di formazione immagine, ma è fondamentale per ottimizzare i parametri per ogni specifico sistema di imaging. Questo include la selezione di un insieme di parametri che massimizzano la rilevazione della fluorescenza di tintura peptide e membrana, mentre minimizza il trapasso dalla tintura di membrana nel canale di emissione di peptide e dal peptide FITC-labeled della membrana canale di emissione. Trapasso dal peptide nel canale di emissione della membrana è stato evitato selezionando un intervallo di lunghezza d'onda per il canale di emissione della membrana che non include qualsiasi porzione dello spettro di emissione di FITC. Trapasso dalla tintura di membrana, di-8-ANEPPS, nel canale di emissione di peptide era più difficile da evitare perché lo spettro di emissione di-8-ANEPPS si sovrappone con la maggior parte dello spettro di emissione di FITC. Specifico al presente protocollo, trapasso dalla tintura di membrana nel canale di emissione di peptide può provocare la falsa caratterizzazione di amplificatori come membrana localizzata. Si può determinare se il trapasso di questa natura è in corso imaging Sferoplasti o protoplasti che esclusivamente sono marcati con membrana colorante e controllando per vedere se la fluorescenza è visibile nel canale di emissione di peptide. Vari parametri di imaging, tra cui la gamma di lunghezza d'onda utilizzata per definire il canale di emissione di peptide e i valori di offset e guadagno, possono essere sistematicamente testati per determinare un insieme di parametri che minimizza il trapasso. Una volta stabilita una serie di parametri, è fondamentale per valutare se imaging produce forte rilevamento del segnale di fluorescenza quando Sferoplasti o protoplasti marcati con colorante del peptide e la membrana sono utilizzati. Attraverso questo approccio, abbiamo stabilito con successo parametri di imaging che ridotto al minimo l'effetto del trapasso massimizzando al contempo la rilevazione della fluorescenza di FITC-labeled AMP e la membrana tingono di-8-ANEPPS. In particolare, abbiamo trovato che trapasso l'emissione dalla tintura di membrana nella scanalatura del peptide è stato minimizzato utilizzando intervalli di lunghezza d'onda di emissione di 499 – 532 nm (peptide) e 670 – 745 nm (membrana), e quando il guadagno è stato regolato per essere ≤800 volt (V) (peptide) e ≤900 V (membrana) e l'offset è stato regolato a ≤ -10,0% (peptide, membrana).
Anche se ci siamo concentrati su e. coli e b. megaterium, i protocolli presentati potrebbero essere adattati per produrre Sferoplasti o protoplasti da molti differenti ceppi batterici. Ad esempio, siamo stati in grado di produrre con successo protoplasti di Bacillus subtilis che erano 1-2 µm di diametro utilizzando il protocollo descritto nella sezione 4, e adattamenti del protocollo potrebbero essere fatto per ottimizzare ulteriormente la dimensione. La capacità di osservare peptide modelli di localizzazione nei batteri sia Gram-negativi e Gram-positivi è particolarmente utile per lo studio di amplificatori perché le differenze nella struttura parete cellulare tra queste due classi di batteri possono influenzare come AMPs interagiscono con membrane cellulari. Tuttavia, molti studi di formazione immagine di Ampere fino ad oggi sono concentrati esclusivamente su ceppi di Escherichia coli del modello e, quindi, potrebbero non riflettere il comportamento di peptidi con ceppi di batteri Gram-positivi.
Sferoplasti e protoplasti differiscono dalle normali batteri, in particolare nella loro mancanza di una parete cellulare esterna e di conseguenza potrebbero non essere buoni modelli per tutte le domande sperimentale. Ad esempio, la membrana esterna dei batteri gram-negativi ha dimostrata di agire come un setaccio molecolare per più grandi molecole29. Peptidi più grandi, pertanto, possono essere in grado di traslocare in Sferoplasti quando non lo farebbero in batteri normali. Inoltre, studi dettagliati dell'interazione di AMP con la parete cellulare di batteri, membrana esterna e membrana citoplasmatica non possono essere eseguiti utilizzando Sferoplasti e protoplasti. Ad esempio, recenti lavori dal laboratorio Weisshaar ha utilizzato imaging per notare le posizioni più precise del peptide in CM15 e melittin meccanismi di azione30,31. Tuttavia, il nostro approccio, come descritto qui, non richiede l'implementazione di microfluidica in Strumentazione di microscopia per conseguire la risoluzione richiesta31. Anche se il lavoro precedente ha dimostrato che sferoplasti sono vitali21,32, comunque probabilmente hanno alcune differenze metaboliche e fisiologiche da batteri "normali" che potenzialmente potrebbero alterare interazioni membrana in alcuni casi. Inoltre, perché non abbiamo valutato la vitalità delle popolazioni dello spheroplast, uno non può distinguere tra un peptide che è facilmente in grado di traslocare attraverso la membrana cellulare di una cellula vivente contro un peptide che può traslocano solo attraverso un morto o morte delle cellule. Nonostante queste differenze, abbiamo visto modelli di localizzazione in e. coli Sferoplasti per molti amplificatori che sono coerenti con i meccanismi conosciuti di azione15e i nostri risultati per BF2 P11A con b. megaterium protoplasti presentati qui sembra coerente con altre osservazioni per quello del peptide13,27,28. Le composizioni di membrana di Sferoplasti e protoplasti inoltre sono certamente più fisiologicamente rilevante che le miscele tipiche utilizzate in altri sistemi di modello, come vescicole lipidiche. In sintesi, data la risoluzione potenziata e la facilità di formazione immagine conferita da Sferoplasti e protoplasti, crediamo che essi sono modelli utili per la visualizzazione di agenti attivi della membrana, come amplificatori, in una gamma di ceppi batterici.
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Disclosures
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive (NIAID-NIH) award R15AI079685.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
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