Summary
Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.
Abstract
Peptid yerelleştirme desenleri bakteri içinde değerlendirmek için bir yöntem olarak confocal mikroskobu kullanımı yaygın olarak konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları ile engellenir. Kolayca çözümlemesi için verilen mikroskop geliştirilemez gibi biz küçük çubuk şekilli gram-negatif Escherichia coli (e.coli) ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) dönüştürmek için protokolleri mevcut daha büyük, kolayca görüntülü küresel formlara spheroplasts veya önceki adı. Bu dönüşüm gözlemciler hızla ve açıkça peptidler kendilerini (Yani, membran yerelleştirme) bakteriyel membran lodge veya girin (Örneğin, translocating) hücre membran çapraz belirlemek izin verir. Bu yaklaşım ile biz de peptidler yerelleştirme veya translocating membran karakterize etmek için sistematik bir yöntem mevcut. Bu yöntem çeşitli membran-aktif peptidler ve bakteri suşları için kullanılabilir iken, biz göstermek belgili tanımlık yarar bu protokolün Buforin II P11A arasındaki etkileşimin gözlemleyerek (BF2 P11A), E. coli ile antimikrobiyal bir peptid (AMP), spheroplasts ve d. megaterium önceki.
Introduction
Antimikrobiyal peptidler (amper) önem onların potansiyel kullanım nedeniyle konvansiyonel antibiyotik1,2,3,4,5alternatif olarak kazanmıştır. Amper ya hücre zarı arasında translocating ve hücre içi bileşenleri veya nükleik asitler gibi ile etkileşerek hücre içeriği6kaçağı neden membran permeabilizing tarafından bakterileri öldürmek. Sigara zorlanarak geçirimsiz hücre zarı7,8çapraz olabilir çünkü antibiyotik olarak kullanımlarının yanı sıra, amper translocating ilaç teslim uygulamalar için adapte. Biz, bu nedenle, temel AMP mekanizmaları uyuşturucu tasarımda kullanımları için zemin hazırlamaya eylem anlamak arıyorlar.
Confocal mikroskobu yerelleştirme desenleri fluorescently etiketli amper onların mekanizması eylem9,10,11,12, ilgili bilgiler sağlayan bakteri hücreleri içinde değerlendirmek için bir yol sunar 13 , 14. bakteri membran etiketleme tarafından kimse fluorescently etiketli bir peptid membran veya bakteri hücre hücre içi boşluğun üzerine yerelleştirir belirleyebilirsiniz. Ancak, bu tekniğin konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları ve değişken yönlendirmesi slayt15bakteri nedeniyle zorlu Imaging yapabilirsiniz bakteriler, küçük boyutu ve çubuk şeklinde ile sınırlıdır.
Gelişmiş görsel olarak fluorescently etiketli peptid yerelleştirme desenleri confocal mikroskobu kullanarak etkinleştirmek için sunulan Yöntem hedefidir. Görselleştirme gelişmiş küçük, ince, çubuk şekilli gram-negatif Escherichia coli (e.coli) ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) kapatarak genişlemiş, küresel formları içine bakteri olarak anılacaktır spheroplasts (için gram-negatif suşları) ve önceki (için gram-pozitif suşları)16,17,18,19,20,21. Artan büyüklükleri ve bir bakteri yönünü bir slaytta, görüntüleme için alakasız yapar simetrik şekilleri nedeniyle spheroplasts ve önceki görüntü için daha kolay olur. Buna ek olarak, biz kantitatif amper yerelleştirme veya translocating her iki membran karakterize için confocal mikroskobu verileri çözümlemek için sistematik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntemler uygulamak ayırt etmek fluorescently peptid yerelleştirme desenleri etiketli kolaylaştırır. Burada sunulan protokolleri membran-aktif ajanlar amper hücre penetran peptidler de dahil olmak üzere dışında çeşitli lokalizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir.
Bir avantaj bu tekniğin bu hücre hücre heterojenite15, aksine tanımlamak için yaygın olarak kullanılan diğer floresans deneyleri gösterebilir bir tek hücre düzeyinde anlayışlar amper etki mekanizması sağlar eylem yalnızca sağlar toplu tahminleri9,22,23,24,25amper mekanizmaları. Hücre girişini, lipid veziküller24gibi değerlendirmek için kullanılan diğer modellere kıyasla daha fizyolojik ilgili15 oldukları için spheroplasts ve AMP hücre girişini değerlendirmek için önceki belirli yararlı26 yaşında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. çözüm hazırlık
Not: E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki, sırasıyla üretmek için 1.1-1.9 ve 1.8-1,11 adımlarda açıklanan çözümler hazırlamak.
- 1 hazırlamak M Tris-Cl, 10.34 g Tris HCl ve Tris OH 4,17 g 50 ml dH2O 125 mL şişe içinde eriterek tarafından pH 7.8. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.
- Çözüm bir (20 mM MgCl2, 0,7 M sukroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) 0,10 g MgCl2 (95.2 g/mol) ve 25 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 11.98 g sükroz çözülerek hazırlayın. 500 µL eklemek 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ve 50 ml ses seviyesini. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.
- Çözüm B (10 mM MgCl2, 0, 8 M Sükroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) 0,05 g MgCl2 (95.2 g/mol) ve 25 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 13.69 g sükroz çözülerek hazırlayın. 500 µL eklemek 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ve 50 ml ses seviyesini. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.
- 0, 8 M Sükroz 50 mL dH2O 125 mL şişe (342.3 g/mol) 13.69 g sükroz çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.
- 5 mg/mL deoksiribonükleaz hazırlamak ben (DNaz ben) 0,015 g DNaz eriterek tarafından ben dH2O 50 mL şişe içinde 3 ml. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize. Microfuge boru ve mağaza-20 ° C'de içine aliquot çözüm
- 0,125 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) hazırlamak, 0.698 g EDTA disodyum eriterek tarafından pH 8.0 içine 15 mL dH2O'bir 125 mL şişe (372.2 g/mol) kurutmak. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.
- 600 µg/mL sefaleksin 50 ml dH2O'bir 125 mL şişe (365.404 g/mol) sefaleksin hidrat 0,03 g çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp 4 ° C'de depolayın
- 5 mg/mL lizozim 0,015 g lizozim dH2O 50 mL şişe içinde 3 ml çözülerek hazırlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize. Microfuge boru ve mağaza-20 ° C'de içine aliquot çözüm
- %3 w/v Trypticase soya suyu (TSB) TSB dH2O 2 lt şişeye 1 litre içinde 30 g çözülerek hazırlayın. Aliquot çözüm 25 mL veya 100 mL sırasıyla E. coli spheroplasts veya B. megaterium önceki, hazırlanmasında kullanılacak TSB içeren şişeler içine. Sıvı orta sterilize etmek için basınçlı kap şişeler. Steril TSB-ebilmek var olmak stok oda sıcaklığında ya da 4 ° C.
- Çözüm C (1 M Sükroz, 0,04 M maleat, 0,04 M MgCl2, pH 6,5) 34.23 g sükroz (342.3 g/mol), 0,46 g Maleik asit (116.07 g/mol) ve 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O'bir 250 mL şişe 100 ml çözülerek hazırlayın. PH 6,5 için ayarlayın. 0.2 µm membran ile 25 mm şırınga filtre ile filtre uygulayarak sterilize ve konik tüp oda sıcaklığında saklayın.
- 200 mL protoplast orta 100 mL % 3 w/v TSB ve 100 mL solüsyon C 1 L cam şişede karıştırarak hazırlayın. Otoklav çözüm sterilize ve oda sıcaklığında saklamak için.
2. gecede kültür hazırlanması
Not: Bölüm 2-4 uygun steril teknikleri kullanarak gerçekleştirin. İstenirse, bakteriyel bir yük bir plazmid potansiyel kirlilik azaltmak antibiyotik direnci için içerir. Bir tür antibiyotik direnci ile kullanıyorsanız, gerekli antibiyotikler adımları 2.1, 3.1-3.2 ve 4.1-4.4 ekleyin.
- Bir gecede kültür steril pipet ucu kullanarak ve 2-3 mL % 3 w/v TSB içeren 14 mL kültür tüp içine yerleştirerek bir koloni bakterilerin seçerek hazırlayın. 37 ° C'de 16 – 21 h için sallayarak süre kuluçkaya.
3. gram-negatif E. coli Spheroplasts hazırlanması
- 250 mL şişeye gecede kültür 1: %100 3 w/v TSB 25 mL hacminde sulandırmak ve 37 ° C'de bakteriyel çözüm çözüm 0,5-0,8 600 optik bir yoğunluk ulaşmıştır kadar yaklaşık 2,5 h sallayarak süre kuluçkaya nm. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ölçer.
- Bu kültür 1:10 % 3 w/v TSB 30 ml 250 mL şişeye sulandırmak ve 37 ° C'de yaklaşık tek hücre filamentler üretmek için 60 µg/mL Sefaleksin (347.4 g/mol) huzurunda 2,5 h için sallayarak süre kuluçkaya uzunluğu 50-150 µm , gözlemlenebilir ışık mikroskobu (Şekil 1B) kullanarak 1000 X büyütme altında olan.
- Bakteriyel çözüm 1.500 x g, 4 dk. Decant 4 ° C de centrifuging tarafından filamentler hasat ve Pelet rezerve etme süpernatant, atın.
- Filamentler yavaşça 0,8 M sukroz, Pelet bozmamaya dikkat edin 1 mL ekleyerek yıkayın. 1 dk. için kuluçkaya ve sonra süpernatant Pelet bozmadan atın.
- 1 150 µL eklemek M Tris-Cl (pH 7.8), 5 mg/mL lizozim 120 µL, 5 mg/ml DNaz 30 µL ben ve sipariş için Pelet ve çözüm için 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya 120 µL 0,125 M EDTA içinde onların anılan sıraya göre.
- Çözüm A 1 mL 1 dk yavaşça çözüm el ile dönen bir micropipette kullanarak 3.5 içinde hazırlanan solüsyona yavaş yavaş ekleyin. Oda sıcaklığında 4 dk için çözüm kuluçkaya.
- 7 mL 4 ° C çözeltisi B iki 15 mL konik tüpler içine koymak. 3.6 her iki tüpler içinde hazırlanan solüsyona eşit miktarda ekleyebilirsiniz. Belgili tanımlık eriyik vasıl 1.500 x g, 4 ° C 4 dk için santrifüj kapasitesi.
- Serolojik pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde tüm 1-2 mL süpernatant Pelet bozmadan çıkarın. Pelet yavaşça P1000 micropipette kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Görsel olarak spheroplasts oluşumu 1000 X büyütme ışık mikroskobu (Şekil 1 c) kullanarak da örneğine gözlemleyerek denetleyin.
- Spheroplasts-20 ° C'de için en fazla bir hafta veya 3 donma-çözülme başlatıldıkları gittiler kadar saklayın.
4. gram-pozitif B. megaterium önceki hazırlanması
- Bir 250 mL şişe 100 ml % 3 w/v TSB gecede kültür 1:1,000 sulandırmak ve 37 ° C'de bakteriyel çözüm çözüm 0,9-optik bir yoğunluğa ulaşmıştır kadar yaklaşık 4.5 için s sallayarak süre kuluçkaya 1.0 600 nm. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ölçer.
- Sıvı kültür iki 50 mL konik boru ve 2.000 x de g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüj içine dökün.
- Serolojik pipet kullanarak, her iki konik boru üzerinden süpernatant atmak. Her Pelet 2.5 mL protoplast ortamda resuspend ve resuspended çözümleri tek bir konik tüp birleştirebilirsiniz. 125 mL şişe kombine resuspended çözümünde pipette.
- 5 mg/mL lizozim 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya sallayarak süre.
- Önceki küreler (Şekil 2) yerine şişmiş çubuklar olarak görüntülenir bakteri gibi herhangi bir usulsüzlük belirterek hafif bir mikroskop kullanarak 1000 x büyütme altında gelişimini izlemek. Serolojik pipet kullanarak, çözüm 15 mL konik tüp ve 2.000 x de g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüj aktarın.
- Süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet 5 mL protoplast medyada yeniden askıya alma. Önceki-20 ° C'de için en fazla bir hafta veya 3 donma-çözülme başlatıldıkları gittiler kadar saklayın.
5. peptid çözüm ve membran boya görüntüleme için hazırlanması
-
Peptid çözüm
- Alüminyum Folyo sarılı bir microfuge tüp içinde BF2 P11A 800 µL dH2içinde O. kullanım protein konsantrasyonu ölçümleri yapmak için en az bir triptofan kalıntı içeren bir peptid etiketli FITC 2 mg geçiyoruz.
- Spectrophotometrically, peptid çözüm 280, absorbans ölçmek nüsha nm. Molar tükenme katsayısı triptofan (5.700/Mcm) kullanarak peptid konsantrasyonu hesaplayın.
- 2O 100-200 µM. Store-20 ° C'de microfuge tüp içinde son bir konsantrasyon için ışıktan korumak için alüminyum folyo sarılmış dH peptid konsantrasyon sulandırmak.
-
Membran boya
- Bir microfuge tüp di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) 10 mM stokunun di-8-ANEPPS 843.3 µL DMSO, içinde 5 mg çözülerek hazırlayın. Işıktan korumak için alüminyum folyo sarılı 4 ° C'de depolayın.
- Bir microfuge tüp 0,03 mM di-8-ANEPPS 1 mL 997 µL DMSO için 10 mM di-8-ANEPPS 3 µL ekleyerek hazırlayın. Microfuge tüp ışıktan korumak için alüminyum folyo sarılı 4 ° C'de depolayın.
6. E. coli Spheroplasts ve d. megaterium önceki kullanarak Confocal mikroskobu görselleştirme
- Spheroplasts veya önceki bir poli-L-lizin kaplamalı cam slayt üzerine 5 µL pipet. AMP (100-200 µM) slayt için etiketli FITC 2 µL ekleyin ve 3 dak ışıktan korunan için kuluçkaya.
- Membran boya di-8-ANEPPS (0,03 mM) 1 µL slayda ekleyin ve 3 dak ışıktan korunan için kuluçkaya. Bir cam coverslip ile kapak ve oje ile kapatın.
- Confocal mikroskop ve argon lazeri aç. Argon lazer % 20 güç çıkışı ve % 20 iletim ayarlayın.
- Emisyon dalga boyu aralığı 499-532 nm ve 670-745 nm FITC etiketli peptid emisyon kanal ve di-8-ANEPPS-etiketli membran boya emisyon kanalında, anılan sıraya göre ayarlayın.
- Görüntü önceki veya 63 X amacı ile spheroplasts (resim 1 ve Şekil 2). 8-bit almak için görüntüleme yazılımı kullanın, 512 x 512 bileşik z-yığın görüntüleri spheroplast veya protoplast tamamını 0.5 µm dilim oluşur.
Not: taşma payı-aracılığıyla görüntüleme spheroplasts ve önceki emisyon azaltmak için dikkatli bir değerlendirme alın. Ayrıntılar için bkz.
7. AMP yerelleştirme karakterizasyonu
- Bileşik z-yığın görüntü görüntüleme yazılımı açın. Spheroplast veya işgal merkezi en dilim bulun ve bir dairesel bölge, faiz (ROI) yerleştirin (çapı 0.3 µm) membran (yatırım getirisi 1), spheroplast veya işgal (ROI 2) ortasına bir tane ve bir yere spheroplast veya ölçmek için işgal arka plan Floresan (ROI 3) (Şekil 5). Doymuş piksel dahil kaçının. Her yatırım getirisi floresan yoğunluğu görüntüleme yazılımı tarafından hesaplanır.
Not: peptid membran bütünlüğü için Yerelleştir değil ne zaman, nerede peptid yerelleştirilmiştir alan membran üzerinde yatırım getirisi 1 durumlarda çizin. - Aşağıdaki eşitliği hücre içi peptid floresan yoğunluğu membran peptid floresan yoğunluğu için oranını belirlemek için kullanın:
Not: Yatırım getirisi 3 floresan yoğunluğu arka plan floresan için hesap için floresans yoğunluklarda ROI 2 ve yatırım getirisi 1 den çıkarılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peptidler bakteriyel membran yerelleştirmek veya bakteriyel membran arasında kolayca translocate bakteri büyütmek ve onları küresel yaparak, biz kolayca ayırt edebilirsiniz. Konvansiyonel ışık mikroskoplar çözünürlük sınırları membran için yerelleştirilmiş sinyalleri ile üst üste gözükeceği peptid sinyalleri membran veya normal bakteri hücre içi alan ortaya olup olmadığını ayırt etmek zor yapmak hücre içi alanı (Şekil 3A). Buna ek olarak, membran marker ve kolaylaştırmak için hücre içi alanı arasında açık çözünürlükte genişlemiş boyutu olan genellikle sadece çapı 1 µm, normal bakteri için karşılaştırıldığında önceki (2-3 µm) ve spheroplasts (2-5 µm) sonuçları peptid yerelleştirme (Şekil 3B) ayırt.
Burada, spheroplasts ve önceki AMP BF2 P11A etiketli N-terminal FITC yerelleştirme desenini göstermek için kullanılır. Biz FITC BF2 hem membran için yerelleştirilmesine ve E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki (Şekil 4) arasında hücre membran translocate P11A etiketli görmekteyiz. Vahşi türü BF2 E. coli ve lipid vezikül membranlar arasında translocate için gözlenen iken, P11A mutasyon bu translocation13,27,28azaltmak için bilinir. Bir sigara antibiyotik dirençli B. megaterium ve ampisilin dayanıklı Top 10 E. coli (pET45B) sunulan veri içinde kullanılmaktadır. Ampisilin dirençli E. coli ampisilin (349.4 g/mol) 25 µg/mL çözelti içinde son bir konsantrasyon, huzurunda yetişkin. Görüntüleme için 7, bölümünde özetlenen sistematik bir yaklaşım takip ROIs membran, hücre içi alanı ve arka plan (Şekil 5B) çizildi. Hücre içi peptid floresan yoğunluğu peptid floresan yoğunluğu membran üzerinde için oranı her spheroplast veya protoplast BF2 P11A ile etkileşim için hesaplanan 7.2 bölümünde açıklanan denklemi kullanarak. Şekil 5A bu oran tüm spheroplasts ve attı protoplast dağılımını gösterir. Spheroplasts ve önceki büyük ölçüde düştü spheroplasts veya daha az 0.3 veya 1'den büyük bir oranını sahip önceki çoğunluğu ile iki gruba attı.
Oranları içine düşmek farklı gruplar göz önüne alındığında, 7.2 bölümünde hesaplanan oranı sıfırdan büyük veya 1'e eşit iken translocating olarak peptid yerelleştirme tanımlı. Diğer taraftan, peptid yerelleştirme 7.2 bölümünde açıklanan oranı az 1 yaşındayken membran yerelleştirme olarak tanımlanmıştır. Puanlama yöntemi, biz % 71 ve E. coli spheroplasts dolapları % 70'i membran için yerelleştirme benzer yerelleştirme için bir desen BF2 P11A E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki BF2 P11A ile gözlenen ve B. megaterium önceki, sırasıyla (Tablo 1).
Resim 1: E.coli temsilcisi görüntüler. (A) E. coli bakteri (B) E. coli yılan ve (C) E. coli spheroplast. Görüntüleri 100 X büyütme oranında alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: B. megateriumtemsilcisi görüntülerini. (A) B. megaterium bakteri ve (B) B. megaterium işgal. Görüntüleri 100 X büyütme oranında alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: B. megateriumtemsilcisi görüntülerini. (A) B. megaterium bakteri hücre ve (B) B. megaterium protoplast membran marker di-8-ANEPPS ile etiketlenmiş. Görüntüleri orta z yığından 100 X (A) ve 63 X (B) büyütme gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Temsilcisi E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki FITC ile etkileşim etiketli BF2 P11A. (A) E. coli spheroplast gösteren BF2 P11A membran için yerelleştirme. (B) E. coli spheroplast gösteren BF2 P11A membran arasında translocating. (C) B. megaterium protoplast gösteren BF2 P11A membran için yerelleştirme. (D) B. megaterium protoplast gösteren BF2 P11A membran arasında translocating. E. coli spheroplasts ve d. megaterium önceki membran marker di-8-ANEPPS ile (kırmızı) etiketlenir ve FITC BF2 P11A (yeşil) etiketli. Görüntüleri orta z yığından 63 X büyütme oranında gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: analiz peptid yerelleştirme kalıplarının. Hücre içi floresan yoğunluğu (ROI 2) membran floresan yoğunluğu (yatırım getirisi 1) için oranını(a)dağıtım arka plan çıkarma sonra ((ROI 2-YG 3) / (yatırım getirisi 1-YG 3)) E. coli spheroplasts ve d. megaterium için BF2 P11A ile etiketli önceki FITC ile etkileşim (B) E. coli spheroplast etiketli BF2 P11A. Dairesel bölgeler, faiz (ROI) 0.3 µm membran (yatırım getirisi 1) hücre içi alan (ROI 2) çizilmiş çapı ve arka plan (ROI 3). Peptid floresan yoğunluğu her yatırım getirisini sayılabilir ve arka plan floresans yatırım getirisi 1 ve yatırım getirisi 2 floresan yoğunluğu düşük yatırım getirisi 3 floresan yoğunluğu çıkararak sorumluydu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bakteriyel zorlanma | No spheroplast veya işgal | Membran % yerelleştirme | % Translocating |
| E. coli | 84 | 71 | 29 |
| B. megaterium | 70 | 70 | 30 |
Tablo 1: BF2 P11A ile etkileşim yerelleştirme desen E. coli spheroplasts ve B. megaterium önceki.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokolleri genişlemiş, küresel bakteri bulun, yönlendirmek ve görüntü çok daha kolay olduğundan daha büyük örnek boyutları bakteriyel görüntülerin daha hızlı elde etmek araştırmacılar için uygun olun. Birkaç açıdan değerli, veri toplamak için geliştirilmiş bu yeteneğidir. İlk olarak, peptid yerelleştirme desen daha sistematik bir kantitatif analiz sağlar. Nitel eğilimleri daha küçük görüntüleri kümelerinden göstermiş olabilir iken, yüksek-nitelik imge sadece büyük örnek bir dizi ortaya daha nüanslı yerelleştirme desenleri, eğilimler için nerede bir peptid translocates karşı hücre yüzdesi yerelleştirir gibi membran. Ayrıca, yeteneği daha iyi çözmek için membran yerelleştirme üzerinden iç floresans yerelleştirme desenler zaman içinde değişim ne kadar ne kadar hızlı peptidler de bakteri hücreleri ile etkileşim değerlendirmek için zaman ders çalışmaları gerçekleştirmek daha kolay yapar. Geliştirilmiş çözünürlük de araştırmacılar daha küçük bakteri ile mümkün olmayan peptid yerelleştirme eğilimler dikkate almak sağlar. Örneğin, bazı bizim gözlenen spheroplasts ve önceki, membran, peptid sinyalleri değil tam, tutarlı bir halka bakteriler üremelerine rağmen ve yerine biraz punctate göstermek Yani, belirli bölümlerini yerelleştirmek için peptidler görünür etiketleme. Diğer durumlarda, peptidler tamamen eşit olarak bakteriyel membran içinde dağıtılamaz peptid sinyalleri değil tamamen doldurmak bakterilerin iç mekan yani . Biz bu eğilimleri geçerli analizimizi takip değil iken, böyle yerelleştirme eğilimleri göz önüne alındığında düşsel spheroplasts ve standart bakteri hücreleri yerine önceki uygulanabilir duruma gelir. Bu avantajları da hücre penetran peptidler gibi amper dışında peptidler lokalizasyonu belirlemek için geçerli olacak. Spheroplasts ve bu yaklaşımları ile üretilen önceki yama-kelepçe Elektrofizyoloji ölçümleri18,19gibi artan hücresel boyutu parası olmayan görüntüleme deneyler için yararlanılabilir.
Confocal mikroskobu tarama bir lazer bizim görüntüleme Protokolü geliştirilmesinde kullanılmıştır, ama her belirli görüntüleme sistemi parametrelerini optimize etmek için önemlidir. Bu peptid ve membran taşma payı aracılığıyla peptid'ın emisyon kanal içine membran boya ve membran'ın içine FITC etiketli peptid en aza indirirken floresans boya, tespiti en üst düzeye çıkarmak parametreleri kümesini seçmeyi içerir emisyon kanal. Taşma payı-üzerinden peptid membran'ın emisyon kanal içine herhangi bir bölümünü FITC'ın emisyon spektrum içermiyordu membran'ın emisyon kanal için bir dalga boyu aralığı seçerek kaçınılması. Taşma payı-yoluyla membran boya gelen di-8-ANEPPS, peptid'ın emisyon kanal içine di-8-ANEPPS emisyon spektrum FITC'ın emisyon spektrum çoğunluğu ile örtüştüğünden önlemek daha zor. Bu protokole özgü, taşma payı-üzerinden membran boya peptid'ın emisyon kanal içine amper yanlış karakterizasyonu olarak lokalize membran neden olabilir. Kimse taşma payı ile bu tür spheroplasts veya sadece membran boya ile etiketlenir önceki görüntüleme ve floresan peptid'ın emisyon kanalda görünür olup olmadığını görmek için kontrol oluşup oluşmadığını belirleyebilirsiniz. Peptid'ın emisyon kanal ve kazanç ve uzaklık değerleri tanımlamak için kullanılan dalgaboyu aralığı da dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme parametreleri sistematik olarak taşma payı ile en aza indirir parametreleri kümesini belirlemek için test edilecek. Bir parametre kümesi oluşturulduğunda, spheroplasts veya peptid ve membran boya ile etiketli önceki kullanılmaktadır zaman görüntüleme floresans sinyalinin güçlü algılama verir olup olmadığını değerlendirmek için önemlidir. Bu yaklaşımla, taşma payı-FITC etiketli AMP ve membran floresans tespiti en üst düzeye çıkarma sırasında aracılığıyla etkisini en aza indirgemek görüntüleme parametreleri di-8-ANEPPS boya başarıyla kuruldu. Özellikle, emisyon taşma payı-yoluyla membran boya peptid kanal içine gelen emisyon dalga boyu aralığı 499-532 nm (peptid) ve 670-745 nm (membran) ve kazanç ≤800 volt (V) (peptid) olarak ayarlandığında kullanarak simge durumuna küçültülmüş olduğunu bulduk ve ≤900 V (membran) ve uzaklık ≤ -10.0 düzeltilmiş % (peptid, membran).
E. coli ve B. megateriumodaklı, sunulan iletişim kuralları spheroplasts veya önceki birçok farklı bakteri suşları üzerinden üretmek için adapte olabilir. Örneğin, biz başarılı bir şekilde 1-2 µm çapı 4 bölümünde özetlenen protokolünü kullanarak edildi Bacillus subtilis önceki üretmek mümkün olmuştur ve uyarlamalar Protokolü'nün daha fazla boyutu optimize etmek için yapılmış olabilir. Hücre duvar yapısı bakterilerin iki bu sınıflar arasındaki farkları amper ile etkileşimini etkileyebilir çünkü peptid yerelleştirme okuduğunuzda, gram-negatif ve gram-pozitif bakteriler gözlemek için yetenek amper çalışma için yararlıdır hücresel zarları. Ancak, birçok görüntüleme çalışmaları amper bugüne sadece modeli E. coli suşları odaklanmış ve böylece, peptidler gram-pozitif bakteri suşları ile davranışını yansıtmıyor olabilir.
Spheroplasts ve önceki normal bakteri, en önemlisi onların eksikliği bir dış hücre duvarı farklı ve sonuç olarak tüm deneysel sorular için iyi modelleri olmayabilir. Örneğin, dış membran Ayagin Gram-negatif bakteri daha büyük moleküllerin29moleküler bir elek olarak hareket olduğu gösterilmiştir. Daha büyük peptidler, bu nedenle, ne zaman onlar çok normal bakteri yapmak istiyorsunuz değil spheroplasts içinde translocate mümkün olabilir. Ayrıca, AMP bakteri hücre duvarı, dış membran ve sitoplazmik membran ile etkileşim ayrıntılı çalışmalar spheroplasts ve önceki kullanılarak gerçekleştirilemez. Örneğin, WEISSHAAR Laboratuarı'ndan son çalışma eylem30,31CM15 ve melittin mekanizmaları daha kesin pozisyonlarda peptid, Not için görüntüleme kullanıldığında vardır. Ancak, yaklaşımımız, burada açıklandığı gibi Havacilik uygulanması mikroskobu araçları içine gerekli çözünürlük31ulaşmak için gerektirmez. Önceki çalışma spheroplasts uygun21,32olduğunu göstermiştir rağmen onlar yine de büyük olasılıkla bazı metabolik ve fizyolojik farklılıklar potansiyel olarak bazı membran etkileşimleri alter "normal" bakterilerden var durumlarda. Çünkü biz spheroplast nüfus canlılığı değerlendirildi değil, Ayrıca, bir kolayca sadece bir ölü arasında translocate bir peptid karşı bir yaşam hücrenin hücre zarı arasında translocate yapabiliyor bir peptid arasında ayırt edemez veya hücre ölüyor. Bu farklılıklara rağmen biz burada sunulan B. megaterium önceki ile BF2 P11A eylem15ve sonuçlarımız bilinen mekanizmaları ile tutarlı olduğundan birçok amper için yerelleştirme okuduğunuzda, E. coli spheroplasts gördük Bu peptid13,27,28diğer gözlemleri ile tutarlı görünüyor. Spheroplasts ve önceki membran besteleri de kesinlikle daha fizyolojik lipid veziküller gibi diğer model sistemlerde kullanılan tipik karışımları daha ilgilidir. Özetle, geliştirilmiş çözünürlük ve spheroplasts ve önceki, tarafından tanınan görüntüleme kolaylığı verilen onların yararlı modelleri membran etkin ajanlar, amper gibi bir dizi bakteri suşları görüntülenmesi için olduğunu düşünüyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları bildirilir.
Acknowledgments
Araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (NIH-NIAID) ödülü R15AI079685 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
