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Biology

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

doi: 10.3791/57904 Published: August 11, 2018

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) produzieren Spheroplasts und gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) Protoplasten deutlich sichtbar zu machen und schnell charakterisieren Peptid-Bakterien Interaktionen. Dies bietet eine systematische Methode zur Membran Lokalisierung und translocating Peptide zu definieren.

Abstract

Die Verwendung der konfokalen Mikroskopie als eine Methode zur Bewertung von Peptid-Lokalisierung-Muster in Bakterien ist häufig durch die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen gehemmt. Da die Auflösung für einen bestimmten Mikroskop nicht leicht verbessert werden kann, präsentieren wir Protokolle, um die kleinen stabförmigen Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) und die gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) verwandeln in größeren, leicht abgebildeten Sphärische Formen Spheroplasts oder Protoplasten genannt. Diese Transformation ermöglicht Beobachter schnell und eindeutig zu bestimmen, ob Peptide sich in die bakterielle Membran (z.B. Membran Lokalisierung nisten) oder überqueren Sie die Membran die Zelle (z.B. translocating) eingeben. Mit diesem Ansatz stellen wir auch eine systematische Methode zur Charakterisierung von Peptiden als Membran Lokalisierung oder translocating. Während diese Methode für eine Vielzahl von Membran-aktive Peptide und Bakterienstämme verwendet werden kann, zeigen wir die Nützlichkeit dieses Protokolls durch Beobachtung der Interaktion von Buforin II P11A (BF2 P11A), eine antimikrobielle Peptide (AMP), mit E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten.

Introduction

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Antimikrobielle Peptide (AMPs) haben Aufmerksamkeit durch ihre mögliche Verwendung als Alternative zu herkömmlichen Antibiotika1,2,3,4,5gewonnen. Ampere töten Bakterien, indem Sie entweder über die Zellmembran translocating und Interaktion mit intrazellulären Komponenten wie Nukleinsäuren oder durch die Membran verursacht Leckage der Zelle Inhalt6permeabilizing. Neben dem Einsatz als Antibiotika kann translocating AMPs für Drug Delivery Anwendungen angepasst werden, weil sie unterbrechungsfrei die wasserundurchlässigen Zellmembran7,8überqueren können. Wir versuchen daher, grundlegende AMP Wirkmechanismen, legen Sie den Grundstein für ihre Nutzung in Wirkstoffdesign zu verstehen.

Konfokalen Mikroskopie bietet eine Möglichkeit, Lokalisierung Muster von eindringmittel beschriftet Ampere in Bakterienzellen, die Einblicke in den Mechanismus der Aktion9,10,11,12, bewerten 13 , 14. durch Kennzeichnung der Membran der Bakterien, kann man feststellen, ob eine eindringmittel beschriftete Peptid, die Membran oder den intrazellulären Raum einer bakteriellen Zelle lokalisiert. Allerdings ist diese Technik durch die kleine Größe und Rod Form von Bakterien, begrenzt die imaging anspruchsvoll durch die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen und die Variable Ausrichtung der Bakterien auf der Folie15machen kann.

Die vorgestellte Methode soll verbesserte Visualisierung der Gewebekulturen beschrifteten Peptid Lokalisierung Muster mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie ermöglichen. Visualisierung wird ergänzt durch Drehen der kleinen, dünnen, stabförmige Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) und gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) Bakterien in erweiterten, sphärische Formen genannt Spheroplasts (bei Gram-negativen Stämme) und Protoplasten (für Gram-positive Stämme)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts und Protoplasten sind aufgrund ihrer Größe und ihrer symmetrischen Form, wodurch die Ausrichtung eines Bakteriums auf einer Folie irrelevant für die Bildgebung einfacher zu Bild. Darüber hinaus präsentieren wir einen systematischen Ansatz, um quantitativ konfokalen Mikroskopie Daten auswerten, um AMPs als entweder Membran Lokalisierung oder translocating zu charakterisieren. Anwendung dieser Methoden macht es leichter zu unterscheiden eindringmittel Peptid Lokalisierung Muster beschriftet. Die hier vorgestellten Protokolle können verwendet werden, um die Lokalisierung von einer Vielzahl von Membran-aktive Akteure als Verstärker, einschließlich der Zelle eindringen Peptide zu beurteilen.

Ein Vorteil dieser Technik ist, dass es Einblicke in den Mechanismus der Wirkung von AMPs auf eine einzelne Zelle-Ebene bietet die Heterogenität von Zelle zu Zelle15, im Gegensatz zu anderen Fluoreszenz-Assays häufig verwendet, um ermitteln zu offenbaren, kann die Mechanismen der Wirkung von AMPs, die nur lose Schätzungen9,22,23,24,25zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von Spheroplasts und Protoplasten AMP Zelleintrag Beurteilung ist insbesondere nützlich26 , weil sie mehr physiologisch relevanten15 als andere Modelle zur Bewertung von Zelleintrag wie Lipid Vesicles24sind.

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Protocol

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1. Vorbereitung der Lösung

Hinweis: Bereiten Sie Lösungen beschrieben Schritte 1.1 – 1,9 und 1,8 – 1.11 um E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten, bzw. zu produzieren.

  1. Bereiten Sie 1 M Tris-Cl, pH 7,8 von aufzulösen 10,34 g Tris HCl und 4,17 g Tris OH in 50 mL dH2O in einer 125 mL Flasche. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  2. Bereiten Sie Lösung A (20 mM MgCl2, 0,7 M Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 vor) durch Auflösen von 0,10 g MgCl2 (95,2 g/Mol) und 11,98 g Saccharose (342.3 g/Mol) in 25 mL dH2O in einer 125 mL Flasche. Hinzufügen von 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) und stellen Sie die Lautstärke auf 50 mL. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  3. Bereiten Sie Lösung B (10 mM MgCl2, 0,8 M Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 vor) durch Auflösen von 0,05 g MgCl2 (95,2 g/Mol) und 13,69 g Saccharose (342.3 g/Mol) in 25 mL dH2O in einer 125 mL Flasche. Hinzufügen von 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) und stellen Sie die Lautstärke auf 50 mL. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  4. Bereiten Sie 0,8 M Saccharose durch Auflösen von 13,69 g Saccharose (342.3 g/Mol) in 50 mL dH2O in einer 125 mL Flasche vor. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  5. Vorbereiten von 5 mg/mL Deoxyribonuclease ich (DNase ich) durch Auflösen von 0,015 g DNase I 3 mL dH2O in ein 50 mL Fläschchen. Sterilisieren Sie durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit einer 0,2 µm-Membran. Aliquoten Lösung in Microfuge Tuben und Speicher bei-20 ° C.
  6. Bereiten Sie 0,125 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), pH 8,0 durch Auflösen 0,698 g EDTA binatrium entwässern (372.2 g/Mol) in 15 mL dH2O in einer 125 mL Flasche. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  7. Bereiten Sie 600 µg/mL Cephalexin durch Auflösen von 0,03 g von Cephalexin Hydrat (365.404 g/Mol) in 50 mL dH2O in einer 125 mL Flasche vor. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und speichern in einem konischen Rohr bei 4 ° C.
  8. Bereiten Sie 5 mg/mL Lysozym durch Auflösen von 0,015 g Lysozym in 3 mL dH2O in ein 50 mL Fläschchen vor. Sterilisieren Sie durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit einer 0,2 µm-Membran. Aliquoten Lösung in Microfuge Tuben und Speicher bei-20 ° C.
  9. Bereiten Sie 3 % w/V Trypticase-Soja-Bouillon (TSB vor) durch Auflösen von 30 g TSB in 1 L dH2O in eine 2 L Flasche. Aliquoten die Lösung in Flaschen mit 25 mL oder 100 mL TSB bzw. bei der Vorbereitung von E. Coli Spheroplasts oder B. Megatherium Protoplasten, verwendet werden. Autoklaven-Fläschchen, das flüssige Medium zu sterilisieren. Sterile TSB kann bei Raumtemperatur oder 4 ° c aufbewahrt werden
  10. Bereiten Sie Lösung C (1 M Saccharose, 0,04 M Maleat, 0,04 M MgCl2, pH 6,5 vor) durch Auflösen 34,23 g Saccharose (342.3 g/Mol), 0,46 g Maleic Acid (116.07 g/Mol) und 0,38 g MgCl2 (95.21 g/Mol) in 100 mL dH2O in ein 250-mL-Fläschchen. Stellen Sie ein pH-Wert bis 6,5. Sterilisieren durch Filterung durch eine 25 mm-Spritze-Filter mit 0,2 µm Membran und in einem konischen Rohr bei Raumtemperatur lagern.
  11. Bereiten Sie 200 mL Protoplasten Medium durch Mischen 100 mL 3 % w/V TSB und 100 mL Lösung C in einer 1 L Glasflasche. Autoklaven sterilisieren die Lösung und bei Raumtemperatur lagern.

2. Vorbereitung der Nacht Kultur

Hinweis: Führen Sie Abschnitte 2 bis 4 mit entsprechenden sterile Techniken. Falls gewünscht, kann ein Bakterienstamm ein Plasmid für Antibiotika-Resistenz, Verringerung der möglichen Kontamination enthalten. Bei einer Belastung mit Antibiotika-Resistenz, fügen Sie die notwendigen Antibiotika in Schritte 2.1, 3.1, 3.2 und 4.1 – 4.4.

  1. Bereiten Sie eine Übernachtung Kultur durch Abnehmen eine einzige Kolonie von Bakterien mit einer sterilen Pipettenspitze und stellen Sie es in ein 14 mL-Kultur-Rohr mit 2 – 3 mL 3 % w/V TSB. Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln für 16 – 21 h.

3. Vorbereitung der Gram-negativen E. Coli Spheroplasts

  1. In einem 250 mL-Kolben, verdünnen die Nacht Kultur 1: 100 in 25 mL Volumen von 3 % w/V TSB und inkubieren Sie die bakterielle Lösung bei 37 ° C unter Schütteln für ca. 2,5 Stunden, bis die Lösung eine optische Dichte von 0,5 – 0,8 bei 600 erreicht hat nm. Messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer.
  2. In einem 250 mL-Kolben, verdünnen Sie diese Kultur 01:10 in 30 mL 3 % w/V TSB und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln für 2,5 h in Anwesenheit von 60 µg/mL Cephalexin (347.4 g/Mol), einzelne Zelle Filamente von etwa produzieren 50 – 150 µm in der Länge , sind die beobachtbaren unter 1.000 X Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 1 b).
  3. Ernte der Filamente durch Zentrifugieren die bakterielle Lösung bei 1.500 X g, 4 ° C für 4 min. dekantieren und entsorgen des Überstands, das Pellet zu reservieren.
  4. Waschen Sie die Filamente durch sanft Zugabe von 1 mL von 0,8 M Saccharose, wobei Sie darauf achten, nicht zu stören das Pellet. 1 min inkubieren, und ohne zu stören das Pellet überstand verwerfen.
  5. Fügen Sie 150 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL 5 mg/mL Lysozym, 30 µL von 5 mg/mL DNase I und 120 µL 0,125 M EDTA in ihren jeweiligen, um die Pellets und die Lösung bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
  6. 1 mL der Lösung A nach und nach mehr als 1 min der Projektmappe fügen Sie in 3,5 mit einer Mikropipette, während sanft wirbeln die Lösung von hand zubereitet hinzu. Inkubieren Sie die Lösung für 4 Minuten bei Raumtemperatur.
  7. Genommen Sie 7 mL 4 ° C Lösung B in zwei 15 mL konische Röhrchen. Fügen Sie gleiche Mengen der Lösung in 3.6 zu jedem dieser beiden Röhren vorbereitet. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.500 X g, 4 ° C für 4 min.
  8. Mit einer serologischen Pipette, sorgfältig entfernen Sie alle 12 mL überstand ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen der Pellets durch sanft nach oben und unten mit einer Mikropipette P1000 pipettieren. Überprüfen Sie visuell Spheroplasts Bildung durch die Beobachtung der Probe bei 1.000 X Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 1).
  9. Speichern Sie die Spheroplasts bei-20 ° C bis zu einer Woche oder bis sie 3 Gefrier-tau-Zyklen durchlaufen haben.

4. Vorbereitung der gram-positiven B. Megatherium Protoplasten

  1. In einem 250 mL-Kolben, verdünnen die Nacht Kultur 1:1,000 in 100 mL 3 % w/V TSB und inkubieren Sie die bakterielle Lösung bei 37 ° C unter Schütteln für ca. 4.5 h, bis die Lösung eine optische Dichte von 0,9erreicht hat 1.0 bei 600 nm. Messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer.
  2. Gießen Sie die Flüssigkultur in zwei 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge bei 2.000 X g, 4 ° C für 10 Minuten.
  3. Mit einer serologischen Pipette, verwerfen des Überstands von beiden konischen Rohren. Aufschwemmen Sie jedes Pellet in 2,5 mL Protoplasten Medium und kombinieren Sie die resuspendierte Lösungen in einem einzigen konischem Rohr. Pipette die kombinierte resuspendierte Lösung in einer 125 mL Flasche.
  4. Fügen Sie 1 mL 5 mg/mL Lysozym und beim Schütteln für 1 h bei 37 ° C inkubieren.
  5. Überwachen Sie das Wachstum von Protoplasten unter 1.000 X Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop, Feststellung von Unregelmäßigkeiten, wie z.B. Bakterien, die als geschwollene Stäbe anstelle von Kugeln (Abbildung 2) angezeigt werden. Mit einer serologischen Pipette, die Lösung auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 2.000 X g, 4 ° C für 10 min übertragen.
  6. Abgießen Sie den überstand und wieder auszusetzen Sie das Pellet in 5 mL Protoplasten Medien. Speichern Sie Protoplasten bei-20 ° C bis zu einer Woche oder bis sie 3 Gefrier-tau-Zyklen durchlaufen haben.

5. Vorbereitung des Peptidlösung und Membran Farbstoff für die Bildgebung

  1. Peptidlösung
    1. Lösen sich in einem Microfuge Rohr in Alufolie gewickelt 2 mg FITC beschriftet BF2 P11A 800 µL dH2O. Einsatz ein Peptid enthält mindestens eine Tryptophan-Rückstand um Protein-Konzentration-Messungen durchführen.
    2. Spektrophotometrisch, Messen Sie die Absorption der Peptid-Lösung bei 280 nm in dreifacher Ausfertigung. Berechnen Sie die Peptid-Konzentration mit der molaren Aussterben Koeffizient für Tryptophan (5.700/Mcm).
    3. Verdünnen Sie die Peptid-Konzentration in dH,2O, eine Endkonzentration von 100 – 200 µM. Store in einem Microfuge Rohr bei-20 ° C in Alufolie eingewickelt um vor Licht zu schützen.
  2. Membran-Farbstoff
    1. Bereiten Sie in einem Microfuge Rohr ein 10 mM Lager an di-8-ANEPPS (592.9 g/Mol) durch 5 mg di-8-ANEPPS in 843.3 µL von DMSO auflösen. Lagerung bei 4 ° C, eingewickelt in Alufolie um vor Licht zu schützen.
    2. Bereiten Sie in einem Microfuge Rohr 1 mL von 0,03 mM di-8-ANEPPS 997 µL DMSO 3 µL 10 mM di-8-ANEPPS hinzu. Speichern Sie in einem Microfuge Rohr bei 4 ° C, eingewickelt in Alufolie um vor Licht zu schützen.

(6) Visualisierung von E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten verwenden konfokalen Mikroskopie

  1. Pipette 5 µL des Spheroplasts oder Protoplasten in einem Poly-L-Lysin beschichtetes Glas-Folie. Fügen Sie 2 µL FITC AMP (100-200 µM) zur Folie beschriftet und inkubieren Sie 3 min vor Licht geschützt werden.
  2. Fügen Sie 1 µL der Membran Farbstoff di-8-ANEPPS (0,03 mM hinzu) zur Folie und inkubieren Sie für 3 min vor Licht geschützt werden. Mit ein Glas Deckglas abdecken und mit den Nagellack versiegeln.
  3. Schalten Sie das konfokale Mikroskop und Argon-Laser. Der Argonlaser auf 20 % Leistung und 20 % Übertragung einstellen.
  4. Emission Wellenlängenbereiche 499 – 532 nm und 670 – 745 nm für die FITC-markierte Peptid Emission und di-8-ANEPPS-Label Membran Farbstoff Emission Kanal, "bzw." festgelegt.
  5. Bild Protoplasten oder Spheroplasts (Abbildung 1 und Abbildung 2) mit einem 63 X Objektiv. Imaging-Software zu verwenden, zu 8-Bit, 512 x 512 zusammengesetzte Z-Stapel Bilder aus 0,5 µm Scheiben die Gesamtheit des Spheroplast oder des Protoplasten.
    Hinweis: Nehmen Sie Durchbluten und bildgebende Spheroplasts und Protoplasten reiflicher Überlegung, die Emissionen zu reduzieren. Siehe Diskussion für Details.

(7) Charakterisierung der AMP-Lokalisierung

  1. Öffnen Sie das zusammengesetzte Z-Stapel-Bild im imaging-Software. Suchen Sie die Mitte-die meisten Scheibe des Spheroplast oder des Protoplasten und legen Sie eine kreisförmige Region von Interesse (ROI) (0,3 µm im Durchmesser) auf die Membran (ROI 1), in der Mitte des Spheroplast oder des Protoplasten (ROI-2) und vom Spheroplast oder Protoplasten nach Maß die Hintergrundfluoreszenz (ROI 3) (Abbildung 5). Vermeiden Sie die Aufnahme von gesättigten Pixel. Die Fluoreszenzintensität in jedem ROI kann durch imaging-Software berechnet werden.
    Hinweis: In Fällen wenn Peptid nicht auf die Gesamtheit der Membran zu lokalisieren, ziehen Sie ROI 1 auf einer Fläche der Membran, wo das Peptid lokalisiert ist.
  2. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das Verhältnis von intrazellulären Peptid Fluoreszenzintensität Membran Peptid Fluoreszenz Intensität zu bestimmen:
    Equation
    Hinweis: Der Fluoreszenzintensität ROI 3 wird von Fluoreszenz-Intensität im ROI 2 und ROI 1 subtrahiert, um Hintergrundfluoreszenz Rechnung zu tragen.

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Representative Results

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Durch die Vergrößerung der Bakterien und sphärische zu machen, können wir leicht unterscheiden, ob Peptide, die bakterienmembran lokalisieren oder leicht über die bakterienmembran translozieren. Die Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopen machen es schwierig um zu unterscheiden, ob Peptid Signale aus der Membran oder intrazellulären Raum im normalen Bakterien entstehen, weil die Signale an die Membran lokalisiert angezeigt werden, um Überschneidungen mit den intrazellulären Raum (Abb. 3A). Im Gegensatz dazu führt die vergrößerten Spheroplasts (2 – 5 µm) und Protoplasten (2 – 3 µm) im Vergleich zu normalen Bakterien, die in der Regel nur 1 µm im Durchmesser sind, klare Auflösung zwischen dem Membran-Marker und den intrazellulären Raum erleichtert Peptid-Lokalisierung (Abb. 3 b) zu unterscheiden.

Hier sind Spheroplasts und Protoplasten verwendet, um die Lokalisierung Muster von der N-terminalen FITC beschriftet AMP BF2 P11A zeigen. Wir beobachten, dass FITC beschriftet BF2 P11A zu lokalisieren, die Membran und translozieren in der Zellmembran von E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten (Abbildung 4). Während Wildtyp BF2 um zu translozieren über E. Coli und Lipid-Vesikel-Membranen beobachtet wurde, ist die P11A Mutation bekannt, diese Translokation13,27,28zu reduzieren. Wir nutzten ein nicht-resistenten B. Megatherium und Ampicillin resistente Top 10 E. Coli (pET45B) im dargestellten Daten. Die Ampicillin-resistente E. Coli wurde im Beisein von Ampicillin (349.4 g/Mol) auf eine Endkonzentration von 25 µg/mL Lösung. Für die Bildgebung, wurden nach dem systematischen Ansatz in Abschnitt 7 beschriebenen ROIs auf der Membran, intrazellulären Raum und Hintergrund (Abb. 5 b) gezogen. Das Verhältnis von intrazellulären Peptid Fluoreszenzintensität Peptid Fluoreszenz Intensität auf der Membran wurde für jede Spheroplast oder Interaktion mit BF2 P11A Protoplasten berechnet unter Verwendung der Gleichung beschrieben in Abschnitt 7.2. Abbildung 5A zeigt die Verteilung der dieses Verhältnis für alle Spheroplasts und Protoplasten erzielte. Die Spheroplasts und Protoplasten erzielte weitgehend fiel in zwei Gruppen mit den meisten Spheroplasts oder Protoplasten mit einem Verhältnis von weniger als 0,3 größer oder gleich 1.

Angesichts der unterschiedlichen Gruppen, denen die Verhältnisse in fallen, definierten wir Peptid Lokalisierung als translocating, wenn das Verhältnis berechnet in Abschnitt 7.2 größer als oder gleich 1 war. Im Gegensatz dazu wurde Peptid Lokalisierung als Membran zu lokalisieren, wenn das Verhältnis in Kapitel 7.2 beschrieben weniger als 1 war definiert. Nach dieser Methode der Punktwertung, beobachteten wir ein ähnliches Lokalisierung Muster für BF2 P11A in E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten mit BF2 P11A Lokalisierung der Membran bei 71 % und 70 % der Fälle für E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten, bzw. (Tabelle 1).

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von E. Coli. (A) E. Coli Bakterien (B) E. Coli Schlange und (C) E. Coli Spheroplast. Bilder wurden bei 100 X Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von B. Megatherium. (A) B. Megatherium Bakterien und (B) B. Megatherium Protoplasten. Bilder wurden bei 100 X Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von B. Megatherium. (A) B. Megatherium Bakterienzelle und (B) B. Megatherium Protoplasten mit Membran-Marker di-8-ANEPPS beschriftet. Bilder aus dem mittleren Z-Stapel werden bei 100 X (A) und 63 X (B) Vergrößerung angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten mit FITC interagieren mit der Bezeichnung BF2 P11A. (A) E. Coli Spheroplast zeigt BF2 P11A Lokalisierung der Membran. (B) E. Coli Spheroplast zeigt BF2 P11A translocating durch die Membran. (C) B. Megatherium Protoplasten zeigt BF2 P11A Lokalisierung der Membran. (D) B. Megatherium Protoplasten zeigt BF2 P11A translocating durch die Membran. E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten sind beschriftet mit der Membran Marker di-8-ANEPPS (rot) und FITC Bezeichnung BF2 P11A (grün). Bilder aus dem mittleren Z-Stapel werden bei 63 X Vergrößerung angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Analyse von Peptid Lokalisierung Mustern. (A) Verteilung des Verhältnisses von intrazellulären Fluoreszenzintensität (ROI 2) Membran Fluoreszenzintensität (ROI 1) nach Hintergrundabzug ((ROI 2-ROI 3) / (ROI 1-ROI 3)) für E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten mit BF2 P11A beschriftet (B) E. Coli Spheroplast Interaktion mit FITC beschriftet BF2 P11A. Kreisförmige Regionen von Interesse (ROI) 0,3 µm im Durchmesser auf der Membran (ROI 1) intrazellulären Raum (ROI 2) gezeichnet und Hintergrund (ROI 3). Der Fluoreszenzintensität von Peptid wurde in jedem ROI quantifiziert und die Hintergrundfluoreszenz entfielen durch Subtraktion der Fluoreszenzintensität ROI 3 aus der Fluoreszenzintensität in ROI 1 und ROI-2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Bakterienstamm Nein. Spheroplast oder Protoplasten % Membran Lokalisierung % Translocating
E. coli 84 71 29
B. Megatherium 70 70 30

Tabelle 1: die Lokalisierung Muster der BF2 P11A Interaktion mit E. Coli Spheroplasts und B. Megatherium Protoplasten.

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Discussion

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Die hier vorgestellten Protokolle machen es möglich für Forscher, schneller größere Stichprobengrößen der bakteriellen Bilder zu erhalten, weil die erweiterten, kugelförmigen Bakterien viel einfacher sind zu finden, orientieren und Bild. Diese verbesserte Fähigkeit, Daten zu sammeln lohnt sich in mehrfacher Hinsicht. Erstens ermöglicht es eine systematischere Quantitative Analyse der Peptid-Lokalisierung-Muster. Während qualitative Entwicklung von kleineren Mengen von Bildern nachgewiesen werden können, nur eine große Stichprobe Reihe von qualitativ hochwertigen Bilder zeigen mehr nuancierte Trends in der Lokalisierung Muster, wie z. B. der Anteil der Zellen, wo eine Peptid im Vergleich zu translocates, lokalisiert die Membran. Darüber hinaus erleichtert die Fähigkeit, besser lösen die interne Fluoreszenz von der Membran-Lokalisierung auszuführenden Kurs Zeitstudien zur Bewertung, wie schnell die Peptide mit Bakterienzellen sowie interagieren, wie Lokalisierung Muster im Laufe der Zeit ändern. Die verbesserte Auflösung erlaubt auch Forschern Trends im Peptid Lokalisierung berücksichtigen, die mit kleineren Bakterien nicht möglich sind. Zum Beispiel erscheinen in einigen unserer beobachteten Spheroplasts und Protoplasten, Peptide, auf bestimmte Abschnitte der Membran, d. h. zu lokalisieren, die Peptid-Signale nicht bilden einen vollständigen, geschlossenen Ring um die Bakterien und stattdessen zeigen einige punctata Kennzeichnung. In anderen Fällen Peptide können nicht gleichmäßig verteilt werden vollständig innerhalb der bakteriellen Membran, d. h. das Peptid signalisiert den inneren Raum der Bakterien nicht ausfüllt. Während wir nicht diese Trends in unserer aktuellen Analyse verfolgt haben, wird in Anbetracht solcher Trends Lokalisierung möglich, beim Spheroplasts und Protoplasten statt standard Bakterienzellen abbilden. Diese Vorteile gelten auch zur Bestimmung der Lokalisierung von Peptiden als Verstärker, wie Zelle eindringen Peptide. Spheroplasts und Protoplasten produziert mit diesen Ansätzen könnte auch für nicht-abbildende Experimente genutzt werden, die von erhöhten zellulären Größe, z. B. Patch-Clamp Elektrophysiologie Messungen18,19profitieren.

Ein Laser-scanning-confocal Mikroskop wurde bei der Entwicklung unserer bildgebenden Protokoll genutzt, aber es ist kritische Parameter für jede spezifische imaging-System optimiert. Dazu gehören Auswählen einer Reihe von Parametern, die die Erkennung von Peptid und Membran Farbstoff Fluoreszenz, bei gleichzeitiger Minimierung der Durchbluten von der Membran Farbstoff in das Peptid Emission Kanal und von der FITC-markierte Peptid in der Membran zu maximieren Emission-Kanal. Durchbluten von Peptid in der Membran Emission Kanal wurde vermieden, indem die Auswahl einem Wellenlängenbereich für die Membran Emission Kanal, der einen Teil der FITC Emissionsspektrum nicht enthalten. Durchbluten von der Membran-Farbstoff, war di-8-ANEPPS, in das Peptid Emission Kanal schwieriger zu vermeiden, da di-8-ANEPPS Emissionsspektrum überschneidet sich mit der Mehrheit der FITC Emissionsspektrum. Speziell für dieses Protokoll, kann die falsche Charakterisierung des AMPs als Membran lokalisiert Durchbluten von der Membran Farbstoff in das Peptid Emission Kanal führen. Man kann feststellen, ob das Durchbluten dieser Art geschieht durch bildgebende Spheroplasts oder Protoplasten, die ausschließlich mit Membran Farbstoff gekennzeichnet sind und überprüfen, ob die Fluoreszenz sichtbar in das Peptid Emission Kanal ist. Verschiedene bildgebende Parameter wie den Wellenlängenbereich verwendet, um das Peptid-Emission-Kanal und der Gain und Offset Werte definieren können systematisch getestet werden, um einen Satz von Parametern zu bestimmen, der durchscheinen minimiert. Sobald eine Reihe von Parametern festgelegt ist, ist es wichtig zu beurteilen, ob Bildgebung liefert starke Detektion der Fluoreszenzsignal bei Spheroplasts oder Protoplasten beschriftet mit Peptid und Membran Farbstoff genutzt werden. Durch diesen Ansatz haben wir erfolgreich imaging Parameter, die die Wirkung von Durchbluten bei gleichzeitiger Maximierung der Fluoreszenz-Detektion von FITC-markierte AMP und die Membran minimiert di-8-ANEPPS färben. Speziell, wir fanden, dass die Emission Durchbluten von der Membran Farbstoff in den Peptid-Kanal mit Emission Wellenlängenbereiche von 499 – 532 nm (Peptid) und 670 – 745 nm (Membran), und minimiert wurde wenn die Verstärkung eingestellt wurde, zu ≤800 Volt (V) (Peptid) und ≤900 V (Membran) und der Offset wurde angepasst auf ≤-10.0 % (Peptid, Membran).

Obwohl wir auf E. Coli und B. Megatheriumkonzentriert, könnte der vorgestellten Protokolle zur Herstellung von Spheroplasts oder Protoplasten aus vielen verschiedenen Bakterienstämmen angepasst werden. Zum Beispiel konnten wir erfolgreich produzieren Bacillus Subtilis Protoplasten, die 1 – 2 µm im Durchmesser, die über das Protokoll beschrieben in Abschnitt 4 waren, und Anpassungen des Protokolls könnte zur weiteren Optimierung der Größe. Die Fähigkeit, Peptid Lokalisierung Muster in Gram-negativen und grampositiven Bakterien zu beobachten ist besonders nützlich, um die Studie des AMPs, weil Unterschiede in der Zellwand zwischen diesen beiden Klassen von Bakterien wie AMPs beeinflussen können mit interagieren Zellmembranen. Jedoch viele bildgebende Untersuchungen von Ampere bis dato konzentrierten sich ausschließlich auf Modell E. Coli -Stämme und somit möglicherweise nicht reflektieren das Verhalten von Peptiden mit gram-positiven Bakterienstämme.

Spheroplasts und Protoplasten unterscheiden sich von normalen Bakterien, vor allem in ihrem Mangel an einer äußeren Zellwand und folglich möglicherweise nicht gute Modelle für alle experimentellen Fragen. Zum Beispiel die äußere Membran von gramnegativen Bakterien nachweislich als Molekularsieb für größere Moleküle29fungieren. Größere Peptide, möglicherweise deshalb, translozieren in Spheroplasts, wenn sie nicht in normalen Bakterien tun würde. Darüber hinaus können nicht detaillierte Untersuchungen der Interaktion von AMP mit der Bakterien-Zellwand, äußere Membran und zytoplasmatischen Membran mit Spheroplasts und Protoplasten durchgeführt werden. Zum Beispiel hat neuere Arbeiten aus dem Labor Weisshaar genutzt um die genauere Positionen des Peptids in der CM15 und Melittin Mechanismen der Aktion30,31beachten imaging. Unser Ansatz, erfordert wie hier beschrieben nicht die Umsetzung der Mikrofluidik in Mikroskopie Instrumentierung jedoch um die benötigte Auflösung31zu erreichen. Obwohl bisherige Arbeit gezeigt hat, dass Spheroplasts tragfähige21,32 sind, haben sie dennoch wahrscheinlich einige metabolischen und physiologischen Unterschiede von "normalen" Bakterien, die potenziell Membran Interaktionen in einigen verändern könnte Fällen. Zusätzlich, weil wir nicht die Lebensfähigkeit der Spheroplast Bevölkerung bewertet haben, man kann nicht unterscheiden zwischen ein Peptid, das ist ohne weiteres in der Lage, über die Zellmembran der lebenden Zelle im Vergleich zu einem Peptid translozieren, die nur über einen Toten translozieren kann oder sterbende Zelle. Trotz dieser Unterschiede haben wir Lokalisierung Muster in E. Coli Spheroplasts für viele Ampere gesehen, die mit bekannten Mechanismen der Aktion15und unsere Ergebnisse für BF2 P11A mit B. Megatherium Protoplasten hier vorgestellten übereinstimmen scheinen Sie mit anderen Beobachtungen für das Peptid13,27,28. Die Membran-Kompositionen von Spheroplasts und Protoplasten sind auch sicherlich mehr physiologisch relevanten als die typische Mischungen in anderen Modellsysteme wie Lipid Vesicles verwendet. Fazit: Angesichts der Erhöhung der Auflösung und der Leichtigkeit der Bildgebung gewährten Spheroplasts und Protoplasten glauben wir, dass sie nützliche Modelle zur Visualisierung von Membran Wirkstoffe, wie z.B. Verstärker, in einer Reihe von Bakterienstämmen sind.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte werden erklärt.

Acknowledgments

Forschung wurde vom National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (NIH-NIAID) Award R15AI079685 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl) Sigma T3253
Trizma base (Tris OH) Sigma T1503
Magnesium chloride Sigma M8266
Sucrose Sigma S7903
Lysozyme Sigma L6876
Deoxyribonuclease I Sigma D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma 106361 Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate Sigma C4895
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
BBL Trypticase soy broth Fisher Scientific B11768
BF2 P11A FITC NeoScientific Custom ordered
di-8-ANEPPS Biotium 61012
DMSO Sigma 34869 Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid Sigma M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane Pall Corporation 4192
Laser scanning confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 II For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Leica Microsystems For image processing

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Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren
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Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).More

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).

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