Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה

doi: 10.3791/57904 Published: August 11, 2018

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצר גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) spheroplasts, גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) protoplasts כדי להמחיש באופן ברור ולאפיין במהירות אינטראקציות פפטיד-חיידקים. זה מספק שיטה שיטתית כדי להגדיר ממברנה ההתאמה לשפות אחרות, translocating פפטידים.

Abstract

השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית כשיטה להעריך פפטיד תבניות לוקליזציה בתוך חיידקים בדרך כלל מעוכב לגבולות ברזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי. כמו הרזולוציה עבור מיקרוסקופ נתון לא יכול להיות משופרת בקלות, אנו מציגים פרוטוקולים להפוך את קטן בצורת מוט גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) ואת גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) בטפסי כדורית, בקלות תמונה גדולים נקרא spheroplasts או protoplasts. שינוי זה מאפשר משקיפים במהירות ובבהירות לקבוע אם פפטידים lodge עצמם לתוך קרום חיידקי (קרי, ממברנה לוקליזציה) או לעבור את הממברנה כדי להזין את התא (קרי: translocating). מתוך תפיסה זו, אנו מציגים גם שיטה שיטתית כדי לאפיין פפטידים כמו קרום לוקליזציה או translocating. ואילו בשיטה זו יכול לשמש למגוון רחב של פפטידים ממברנה-פעיל, זני חיידקים, נדגים את התועלת של פרוטוקול זה על ידי התבוננות האינטראקציה של Buforin השני P11A (BF2 P11A), פפטיד מיקרוביאלית (אמפר), עם e. coli spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פפטידים מיקרוביאלית (אמפר) השיגו תשומת לב בשל שימושם פוטנציאליים כחלופות אנטיביוטיקה קונבנציונלית1,2,3,4,5. מגברים להרוג חיידקים על ידי translocating על פני קרום התא או אינטראקציה עם רכיבים תאיים כגון חומצות גרעין, או על-ידי permeabilizing קרום גורמת זליגת של תוכן התא6. בנוסף, השימוש בהם כמו אנטיביוטיקה translocating אמפר שעשוי להיות מותאם עבור יישומים משלוח סמים כי הם יכולים לעבור ללא disruptively7,את קרום התא אטום8. אנו, לכן מבקשים להבין את המגבר הבסיסי, מנגנוני פעולה כדי להניח את הבסיס לשימוש שלהם בעיצוב סמים.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מציע דרך להערכת לוקליזציה דפוסי אמפר fluorescently שכותרתו תאים חיידקיים לספק תובנות שלהם מנגנון פעולה9,10,11,12, 13 , 14. על-ידי תיוג הקרום של החיידקים, ניתן לקבוע אם פפטיד fluorescently שכותרתו רגישה הקרום או המרחב תאיים של תא החיידק. עם זאת, טכניקה זו הוא מוגבל על ידי הצורה הגודל של רוד קטנה של חיידקים, אשר יכול לגרום הדמיה מאתגר עקב לגבולות ברזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ואת הכיוון משתנה של החיידקים על שקופית15.

מטרת השיטה הציג היא לאפשר הדמיה משופר של הדפוסים לוקליזציה פפטיד fluorescently שכותרתו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ויזואליזציה היא משופרת על-ידי הפעלת את קטן, דק וקל מוט בצורת גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) ואת גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) חיידקים בטפסי מוגדלת, כדורית המכונה spheroplasts (עבור זנים גראם שליליים), protoplasts (עבור זנים גראם חיוביים)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts ו- protoplasts הם קל יותר התמונה בשל גודלם מוגבר והן צורתם סימטרי, מה שהופך את הכיוון של חיידק בשקופית לא רלוונטי עבור הדמיה שלה. בנוסף, אנו מציגים בגישה שיטתית לנתח באופן כמותי מיקרוסקופיה קונפוקלית נתונים על מנת לאפיין אמפר כמו גם קרום לוקליזציה או translocating. יישום שיטות אלה מקל להבחין fluorescently שכותרתו פפטיד לוקליזציה דפוסים. הפרוטוקולים המובאות כאן ניתן להעריך הלוקליזציה של מגוון של ממברנה-פעיל סוכני חוץ אמפר, לרבות פפטידים חודר לתא.

אחד יתרון משמעותי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תובנות מנגנון הפעולה של מגברים ברמה תא בודד, אשר עלול לגלות-לתא הטרוגניות15, לעומת שאר מבחני פלורסצנטיות נפוץ כדי לזהות מנגנוני הפעולה של מגברים, אשר מספקים רק בצובר הערכות9,22,23,24,25. השימוש spheroplasts ו- protoplasts על מנת להעריך את ערך התא המגבר הוא שימושי במיוחד26 כי הם רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית15 מאשר דגמים אחרים בשימוש להערכת ערך התא, כגון שלפוחית השומנים24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. פתרון הכנה

הערה: להכין פתרונות שתואר בשלבים 1.1 – 1.9 ו- 1.8-1.11 כדי לייצר e. coli spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts, בהתאמה.

  1. להכין 1 מ' טריס-קלרנית, pH 7.8 על ידי המסת 10.34 g טריס HCl ו- g 4.17 של טריס או ב- 50 מ של dH2O בבקבוקון 125 מ ל. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  2. להכין פתרון (20 מ מ MgCl2, 0.7 M סוכרוז, 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 7.8) על ידי המסת 0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) ו- 11.98 g סוכרוז (342.3 g/mol) 25 מ ל dH2O בבקבוקון 125 מ. להוסיף 500 µL 1 מ' טריס-קלרנית (pH 7.8) ולכוונן את העוצמה עד 50 מ"ל. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  3. להכין פתרון B (10 מ מ MgCl2, 0.8 מ' סוכרוז, 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 7.8) על ידי המסת 0.05 גרם MgCl2 (95.2 g/mol) ו- 13.69 g סוכרוז (342.3 g/mol) 25 מ ל dH2O בבקבוקון 125 מ. להוסיף 500 µL 1 מ' טריס-קלרנית (pH 7.8) ולכוונן את העוצמה עד 50 מ"ל. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  4. להכין סוכרוז 0.8 מ' על ידי המסת 13.69 גרם סוכרוז (342.3 g/mol) 50 מ ל dH2O בבקבוקון 125 מ. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  5. להכין 5 מ"ג/מ"ל deoxyribonuclease אני (DNase אני) על ידי המסת 0.015 גרם DNase. אני ב- 3 מ"ל של dH2O בבקבוקון 50 מ ל. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום מיקרומטר 0.2. פתרון aliquot לתוך צינורות microfuge, חנות ב-20 ° C.
  6. הכנת 0.125 מ' ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), pH 8.0 על ידי המסת 0.698 g EDTA ניתרן (372.2 g/mol) מייבשים לתוך 15 מ"ל dH2O בבקבוקון 125 מ. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  7. להכין cephalexin µg/mL 600 על ידי המסת 0.03 נקודות גר' cephalexin הידרוקסיד (365.404 g/mol) ב- 50 מ של dH2O בבקבוקון 125 מ. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי ב 4 º C.
  8. להכין 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים על ידי המסת ליזוזים 0.015 גרם ב- 3 מ"ל של dH2O בבקבוקון 50 מ. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום מיקרומטר 0.2. פתרון aliquot לתוך צינורות microfuge, חנות ב-20 ° C.
  9. להכין 3% w/v ציר סויה Trypticase (TSB) על ידי המסת 30 גר' TSB ב- 1 ליטר של dH2O בבקבוקון 2 ל'. Aliquot הפתרון לתוך מבחנות המכילות 25 מ ל או 100 מ ל TSB כדי לשמש בהכנה של e. coli spheroplasts או megaterium נולד ב- protoplasts, בהתאמה. אוטוקלב מבחנות לחטא המדיום הנוזלי. TSB סטרילי ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר או 4 ° C.
  10. להכין פתרון C (1 M סוכרוז maleate 0.04 M, 0.04 M MgCl2, pH 6.5) על ידי המסת סוכרוז 34.23 g (342.3 g/mol), חומצה maleic 0.46 g (116.07 g/mol) ו 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) ב- 100 מ של dH2O בבקבוקון 250 מ. להתאים את ה-pH ל 6.5. לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 25 מ מ עם קרום 0.2 µm ולאחסן צינור חרוטי בטמפרטורת החדר.
  11. להכין 200 מ ל פרוטופלאסט בינוני על ידי ערבוב 100 מ ל 3% w/v TSB 100 מ ל פתרון C בבקבוק זכוכית 1 ליטר. אוטוקלב לעקר את הפתרון ולאחסן בטמפרטורת החדר.

2. הכנת תרבות לילה

הערה: ביצוע סעיפים 2-4 תוך שימוש בטכניקות סטרילי המתאים. אם רצונך בכך, זן חיידקי יכול להכיל פלסמיד של עמידות לאנטיביוטיקה לצמצם את זיהום פוטנציאליים. אם משתמש זן עם עמידות לאנטיביוטיקה, להוסיף את האנטיביוטיקה נחוץ בשלבים 2.1, 3.1 – 3.2, ו- 4.1-4.4.

  1. להכין תרבות הלילה על-ידי בחירת מושבה בודדת של חיידקים באמצעות טיפ פיפטה סטרילי והצבתו לתוך צינור תרבות 14 מ"ל, המכיל 2-3 מ"ל של 3% w/v TSB. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול עבור h 16 – 21.

3. הכנת גראם שליליים e. coli Spheroplasts

  1. בבקבוקון 250 מ ל, לדלל את בטחונות תרבות לילה בכרך 25 מ של 3% w/v TSB, דגירה הפתרון חיידקי ב 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול עבור 2.5 h עד הפתרון הגיע של צפיפות אופטית של 0.5-0.8 על 600 ננומטר. למדוד הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטרים.
  2. בבקבוקון 250 מ ל, לדלל את תרבות 1:10 ב 30 מ של 3% w/v TSB, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול עבור 2.5 h בנוכחות cephalexin µg/mL 60 (347.4 g/mol) כדי לייצר תא בודד חוטים של 50 – 150 מיקרומטר באורכו , אשר מהן נצפות תחת 1,000 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 1B).
  3. הקציר של חוטים מאת צריך שתוציאו את הפתרון חיידקי ב 1,500 x גרם, 4 ° C עבור 4 דק Decant ולמחוק את תגובת שיקוע, את הזמנת את גלולה.
  4. לשטוף את חוטים על-ידי הוספת 1 מ"ל של סוכרוז 0.8 מ', נזהר שלא להפריע בגדר בעדינות. תקופת דגירה של 1 דקות, ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.
  5. להוסיף 150 µL של 1 מ' טריס-קלרנית (pH 7.8), µL 120 של 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים, 30 µL של 5 מ"ג/מ"ל DNase ואני µL 120 של 0.125 מ' EDTA ב שלהם בהתאמה כדי בגדר, דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  6. להוסיף 1 מ"ל של פתרון A בהדרגה מעל 1 דקות הפתרון המבושלות 3.5 באמצעות micropipette בעוד בעדינות מתערבל הפתרון בעבודת יד. דגירה הפתרון עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. מכניסים 7 מ של פתרון 4 ° C B שני צינורות חרוט 15 מ"ל. להוסיף כמויות שוות של הפתרון המבושלות 3.6 לכל אחד שני צינורות אלה. Centrifuge הפתרון ב 1500 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
  8. שימוש של פיפטה סרולוגית, הסר בזהירות והכל אבל תגובת שיקועמ 2 ל 1 מבלי להפריע בגדר. Resuspend בגדר מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה באמצעות micropipette של P1000. בדיקה חזותית לראות היווצרות spheroplasts על ידי התבוננות המדגם-1,000 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 1C).
  9. אחסן את spheroplasts ב-20 מעלות צלזיוס במשך שבוע, או עד שהם עברו 3 מחזורים ההקפאה-הפשרה.

4. הכנת גראם חיוביים megaterium נולד ב- Protoplasts

  1. בבקבוקון 250 מ ל, לדלל את 1:1,000 תרבות לילה ב- 100 מ של 3% w/v TSB, דגירה הפתרון חיידקי ב 37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול עבור 4.5 h עד הפתרון הגיע של צפיפות אופטית של 0.91.0 ב 600 ננומטר. למדוד הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטרים.
  2. שופכים את התרבות נוזלי לתוך שני צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 2,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. שימוש של פיפטה סרולוגית, למחוק את תגובת שיקוע של שני צינורות חרוט. Resuspend כל גלולה במדיום פרוטופלאסט 2.5 מ ל ולשלב את הפתרונות resuspended לתוך צינור חרוטי בודד. Pipette הפתרון resuspended משולב בבקבוקון 125 מ.
  4. להוסיף 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל ליזוזים, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול.
  5. לפקח על הגידול של protoplasts תחת 1,000 x הגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור, וציין חריגות, כגון חיידקים המופיעים כמצייני מוטות נפוחות במקום הספירות (איור 2). שימוש של פיפטה סרולוגית, להעביר את הפתרון צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 2,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. Decant את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה בתקשורת פרוטופלאסט מ. חנות protoplasts ב-20 מעלות צלזיוס במשך שבוע, או עד שהם עברו 3 מחזורים ההקפאה-הפשרה.

5. הכנת פפטיד פתרון וצבע קרום עבור הדמיה

  1. פתרון פפטיד
    1. צינור microfuge עטוף בנייר אלומיניום, לפזר 2 מ ג של FITC הנקרא BF2 P11A 800 µL dH2O. שימוש פפטיד המכיל משקע טריפטופן אחד לפחות כדי לאפשר לבצע מדידות ריכוז חלבון.
    2. . Spectrophotometrically, למדוד את ספיגת של הפתרון פפטיד ב 280 ננומטר דולר. חשב את ריכוז פפטיד באמצעות המקדם הכחדה טוחנת טריפטופן (5700/מלמ ק).
    3. לדלל את ריכוז פפטיד ב- dH2O כדי ריכוז סופי של 200-100 מיקרומטר. חנות צינור microfuge ב-20 ° C עטופות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.
  2. ממברנה לצבוע
    1. צינור microfuge, להכין מלאי 10 מ מ של די-8-ANEPPS (592.9 g/mol) על ידי המסת 5 מ"ג של די-8-ANEPPS ב µL 843.3 של דימתיל סולפוקסיד. לאחסן ב 4 ° C עטופות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.
    2. צינור microfuge, להכין 1 מ"ל של 0.03 נקודות מ מ di-8-ANEPPS על-ידי הוספת 3 µL של 10 מ מ di-8-ANEPPS 997 דימתיל סולפוקסיד µL. לאחסן צינור microfuge ב 4 ° C עטופות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.

6. ויזואליזציה של e. coli Spheroplasts, נולד ב- megaterium Protoplasts באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. פיפטה 5 µL של spheroplasts או protoplasts לשקופית פולי-L-ליזין מצופה זכוכית. להוסיף 2 µL של FITC עם התווית המגבר (100-200 מיקרומטר) לשקופית ולאחר תקופת דגירה של 3 דקות מוגן מפני אור.
  2. להוסיף 1 µL של קרום לצבוע di-8-ANEPPS (0.03 נקודות מ מ) לשקופית ולאחר תקופת דגירה של 3 דקות מוגן מפני אור. מכסה עם coverslip זכוכית, חותם עם הלק.
  3. הפעל את לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ וארגון. התאם ללייזר פלט חשמל 20% ולא 20% שידור.
  4. הגדר פליטה טווחים אורך הגל של 499-532 ננומטר, 670 – 745 nm כדי להפוך את התווית על-ידי FITC פפטיד פליטה ערוץ di-8-ANEPPS-הנקרא קרום לצבוע פליטה ערוץ, בהתאמה.
  5. תמונה protoplasts או spheroplasts (איור 1 ו- 2 איור) עם יעד X 63. בתוכנת הדמיה כדי להשיג 8 סיביות, תמונות 512 x 512 מרוכבים z-בערימה המורכב 0.5 מיקרומטר פרוסות של מכלול של spheroplast או פרוטופלאסט.
    הערה: לקחת שיקול דעת זהיר כדי להפחית את הפליטה בליד-דרך בעוד דימות spheroplasts ו protoplasts. ראה דיון לפרטים.

7. אפיון של המגבר לוקליזציה

  1. פתחו את התמונה ללא הפרדות צבע z-מחסנית ב תוכנות ליצירת תמונות. לאתר הפרוסה מרכז ביותר של spheroplast או פרוטופלאסט ומניחים אחד מעגלי באזור של הריבית (ROI) (0.3 מיקרומטר בקוטר) על הקרום (רועי 1), אחד במרכז של spheroplast או פרוטופלאסט (רועי 2), ואחד spheroplast או פרוטופלאסט למדוד קרינה פלואורסצנטית הרקע (רועי 3) (איור 5). הימנע ההכללה של פיקסלים רוויים. ניתן לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב- ROI כל על ידי הדמיה בתוכנה.
    הערה: במקרים כאשר פפטיד בתרגום לא כדי מכלול של הקרום, ציירו רועי 1 על שטח של הקרום איפה פפטיד הוא מקומי.
  2. להשתמש במשוואה הבאה כדי לקבוע את היחס בין פפטיד תאיים עוצמת קרינה פלואורסצנטית כדי עוצמת קרינה פלואורסצנטית פפטיד ממברנה:
    Equation
    הערה: עוצמת קרינה פלואורסצנטית רועי 3 זה הוחסרו מ עוצמות קרינה פלואורסצנטית 2 רועי, רועי 1 כהתאמה רקע זריחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

על ידי הגדלת חיידקים ולגרום להם כדורית, אנו יכולים להבחין בקלות בין אם פפטידים בתרגום קרום החיידק או translocate בקלות על פני קרום חיידקי. הגבולות ברזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי שיהיה מאתגר כדי להבחין אם אותות פפטיד מתעוררות ממברנה או שטח תאיים בחיידקים נורמלי כי אותות מקומית את הקרום יופיע כדי חפיפה עם שטח תאיים (איור 3 א). לעומת זאת, מוגדל לגודל spheroplasts (2-5 מיקרומטר) ו- protoplasts (2-3 מיקרומטר) לעומת חיידקים נורמלי, אשר בדרך כלל רק 1 מיקרומטר בקוטר, התוצאה היא החלטה ברורה בין הסמן הקרום המרחב תאיים כדי להקל הבחנה בין פפטיד לוקליזציה (איור 3B).

כאן, spheroplasts, protoplasts משמשים כדי להראות את דפוס לוקליזציה של FITC N-מסוף שכותרתו המגבר BF2 P11A. אנו מבחינים ש-FITC הנקרא P11A BF2 בתרגום כדי הקרום והן translocate על פני קרום התא של החיידק spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts (איור 4). בעוד פראי סוג BF2 נצפתה כדי translocate על פני קרום שלפוחית e. coli ו שומנים בדם, המוטציה P11A ידוע כדי להפחית את רוברטסונית13,27,28. אנחנו מנוצל, עמידים בפני אנטיביוטיקה ללא megaterium דרב ו עמיד אמפיצילין Top 10 e. coli (pET45B) בנתונים שהוצגו. אמפיצילין עמידות החיידק גדל בנוכחות אמפיצילין (349.4 g/mol)-ריכוז סופי בפתרון של 25 µg/mL. עבור הדמיה, בעקבות הגישה השיטתית המפורטים בסעיף 7, ROIs צוירו על הקרום, שטח תאיים על הרקע (איור 5B). היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית פפטיד תאיים על פפטיד עוצמת קרינה פלואורסצנטית על הקרום מחושב עבור כל spheroplast או פרוטופלאסט אינטראקציה עם BF2 P11A באמצעות המשוואה המתוארות בסעיף 7.2. איור 5A מציג את ההתפלגות של יחס זה עבור כל spheroplasts פרוטופלאסט הבקיע. Spheroplasts ואת protoplasts הבקיע במידה רבה פל לשתי קבוצות, עם הרוב של spheroplasts או protoplasts יש יחס של פחות מ 0.3 או גדול מ-1.

בהינתן קבוצות נפרדות היחס ליפול לתוך, אנחנו הגדיר פפטיד לוקליזציה translocating כאשר היחס מחושב בסעיף 7.2 היה גדול או שווה ל- 1. לעומת זאת, לוקליזציה פפטיד הוגדר ממברנה לוקליזציה כאשר היחס המתואר בסעיף 7.2 היה פחות מ- 1. בעקבות שיטת הניקוד, הבחנו לוקליזציה דפוס דומה עבור BF2 P11A e. coli spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts עם BF2 P11A לוקליזציה למוח ב- 71% ו- 70% מהמקרים של e. coli spheroplasts ו Megaterium נולד ב- protoplasts, בהתאמה (טבלה 1).

Figure 1
איור 1: להחליפן בתמונות של e. coli. הנחש e. coli חיידקים (B) (A) e. coli ו- spheroplast (ג) e. coli . התמונות צולמו בהגדלה X 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תמונות נציג של megaterium דרב. (א) megaterium נולד ב- חיידקים, פרוטופלאסט (B) נולד ב- megaterium . התמונות צולמו בהגדלה X 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תמונות נציג של megaterium דרב. תא החיידק (A) נולד ב- megaterium ו- (B) megaterium דרב פרוטופלאסט המסומנת את קרום סמן di-8-ANEPPS. תמונות מתוך הערימה-z האמצעי מוצגים ב 100 X (א) והגדלה X (B) 63. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נציג e. coli spheroplasts ו protoplasts megaterium נולד ב- אינטראקציה עם FITC שכותרתו BF2 P11A. (א) e. coli spheroplast מראה BF2 P11A לוקליזציה למוח. (B) e. coli spheroplast מראה BF2 P11A translocating על פני הקרום. (ג) megaterium דרב פרוטופלאסט מראה BF2 P11A לוקליזציה למוח. (ד) megaterium דרב פרוטופלאסט מראה BF2 P11A translocating על פני הקרום. E. coli spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts מסומנים בתווית את קרום סמן di-8-ANEPPS (אדום), FITC עם התווית BF2 P11A (ירוק). תמונות מתוך הערימה-z האמצעי מוצגים בהגדלה X 63. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ניתוח דפוסי לוקליזציה פפטיד. הפצה (A) של היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית תאיים (רועי 2) את עוצמת קרינה פלואורסצנטית ממברנה (רועי 1) לאחר חיסור רקע ((רועי 2-רועי 3) / (רועי 1-רועי 3)) e. coli spheroplasts, נולד ב- megaterium protoplasts המסומנת BF2 P11A spheroplast (B) e. coli אינטראקציה עם FITC הנקרא BF2 P11A. מיקרומטר אזורים של הריבית (ROI) 0.3 עגול בקוטר המצוירת על המרחב תאיים ממברנה (רועי 1) (רועי 2) ואת הרקע (רועי 3). עוצמת קרינה פלואורסצנטית פפטיד הייתה לכמת ב כל רועי, קרינה פלואורסצנטית הרקע היה מהיבול על-ידי הפחתת עוצמת קרינה פלואורסצנטית רועי 3 מן עוצמת קרינה פלואורסצנטית רועי 1 ו- ROI 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

זן חיידקי לא. spheroplast או פרוטופלאסט % ממברנה לוקליזציה % Translocating
E. coli 84 71 29
נולד ב- megaterium 70 70 30

טבלה 1: הדפוס לוקליזציה של BF2 P11A אינטראקציה עם E. coli spheroplasts, megaterium נולד ב- protoplasts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקולים המובאת כאן לעשות את זה אפשרי לחוקרים במהירות רבה יותר לקבל גודל מדגם גדול יותר של תמונות חיידקי כי החיידק מוגדלת, כדורית הם הרבה יותר קל לאתר, אוריינט של התמונה. היכולת המשופרת לאיסוף נתונים יקר במספר אופנים. ראשית, הוא מאפשר ניתוח כמותי שיטתית יותר דפוסי לוקליזציה פפטיד. בעוד מגמות איכותי ניתן להדגים מערכות קטנות יותר של תמונות, רק ערכה מדגם גדול של תמונות באיכות גבוהה לחשוף יותר דקויות מגמות דפוסי לשפות אחרות, כגון אחוז תאים איפה פפטיד translocates נגד. רגישה ממברנה. בנוסף, היכולת לפתור יותר זריחה פנימי מן ההתאמה ממברנה מקל לביצוע זמן לימודי קורס כדי להעריך כמה מהר פפטידים אינטראקציה עם תאים חיידקיים וכן כמה דפוסים לוקליזציה להשתנות עם הזמן. הרזולוציה משופר מאפשר גם חוקרים לבחון מגמות בלוקליזציה פפטיד אינן אפשריות עם חיידקים קטנים יותר. לדוגמה, בחלק של התצפיות spheroplasts שלנו protoplasts, פפטידים להופיע כדי להתאים לשפה לסעיפים ספציפיים של הקרום, קרי, האותות פפטיד לא יוצרים טבעת מלאה, מגובש סביב החיידק, במקום להראות קצת punctate תיוג. במקרים אחרים, פפטידים ולא ניתן להפיצם באופן שווה לחלוטין בתוך קרום חיידקי, קרי, פפטיד אותות לחלוטין ממלאת את החלל הפנימי של החיידקים. בעוד אנחנו לא פתחו את המגמות הללו בניתוח הנוכחי שלנו, בהתחשב מגמות לוקליזציה כזה הופך ריאלי כאשר הדמיה spheroplasts protoplasts במקום תאים חיידקיים סטנדרטיים. יתרונות אלה חלים גם קביעת ההתאמה של פפטידים חוץ מגברים, כגון פפטידים חודר לתא. Spheroplasts, protoplasts מיוצר עם גישות אלה יכול גם להיות מנוצל עבור ניסויים שאינם הדמיה הנהנים גודל הסלולר מוגברת, כגון תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה מדידות18,19.

מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר היה מנוצל בפיתוח של פרוטוקול ההדמיה שלנו, אבל זה קריטי כדי למטב את הפרמטרים עבור כל מערכת הדמיה ספציפית. זה כולל בחירת סט של פרמטרים למקסם את הגילוי של זריחה לצבוע פפטיד, קרום, תוך מזעור בליד-דרך מ לצבוע ממברנה לתוך ערוץ פליטה של פפטיד ומ -פפטיד את התווית על-ידי FITC לתוך של קרום ערוץ פליטה. בליד-דרך מ פפטיד לתוך ערוץ פליטה של הקרום היה נמנע על-ידי בחירת טווח אורך הגל לערוץ פליטה של הקרום שלא כללה חלק כלשהו של ספקטרום פליטה של FITC. בליד-דרך של לצבוע ממברנה, di-8-ANEPPS, לתוך ערוץ פליטה של פפטיד היה יותר קשה להימנע בגלל ספקטרום פליטה di-8-ANEPPS' חופף עם הרוב המכריע של ספקטרום פליטה של FITC. ספיציפית פרוטוקול זה, בליד-דרך של לצבוע ממברנה לתוך ערוץ פליטה של פפטיד יכול לגרום שווא אפיון מגברים כמו קרום לשפות אחרות. ניתן לקבוע אם הבליד-דרך מסוג זה מתרחש על-ידי הדמיה spheroplasts או protoplasts המסומנות באופן בלעדי עם ממברנה לצבוע ובדיקת כדי לראות אם קרינה פלואורסצנטית מוצגת בערוץ פליטה של פפטיד. פרמטרים הדמיה שונים, כולל טווח אורך הגל המשמש להגדרת ערכי היסט ורווח, וערוץ פליטה של פפטיד יכול להיבדק באופן שיטתי כדי לקבוע סט של פרמטרים שמקטינה בליד-דרך. לאחר סט של פרמטרים הוא הוקם, חיוני כדי להעריך אם דימות התשואות גילוי חזקה של קרינה פלואורסצנטית האות כאשר spheroplasts או protoplasts עם צבע פפטיד והן קרום תוויות מנוצלים. באמצעות גישה זו, בהצלחה הקמנו הפרמטרים הדמיה למזער את ההשפעה של הבליד-דרך תוך מיקסום זיהוי קרינה פלואורסצנטית המגבר התווית על-ידי FITC והן הקרום לצבוע di-8-ANEPPS. באופן ספציפי, מצאנו כי יישום ה-הבליד-דרך ' פליטה ' מ לצבוע ממברנה לתוך התעלה פפטיד היה ממוזער באמצעות טווחי גל פליטה של 499-532 ננומטר (פפטיד), 670 – 745 nm (ממברנה), וכאשר הרווח היה מותאם להיות ≤800 וולט (V) (פפטיד) ו ≤900 החמישי (ממברנה), ההיסט היה מותאם ≤-10.0% (פפטיד, קרום).

למרות התמקדנו e. coli ו megaterium דרב, הפרוטוקולים שהוצגו יכול להיות מותאם כדי לייצר spheroplasts או protoplasts של זנים חיידקים שונים. לדוגמה, הצלחנו לייצר בהצלחה protoplasts Bacillus subtilis שהיו 1 – 2 מיקרומטר בקוטר באמצעות פרוטוקול המתוארים בסעיף 4, עיבודים של הפרוטוקול עשוי להיות נוספים מיטוב גודל. היכולת להתבונן פפטיד לוקליזציה דפוסים חיידקים גראם שליליים וגם גראם חיוביים שימושי במיוחד במחקר של מגברים בגלל הבדלים במבנה דופן התא בין שני מעמדות אלה של חיידקים עלולים להשפיע על מה אמפר אינטראקציה עם ממברנות הסלולר. עם זאת, מחקרי הדמיה רבים של מגברים לתאריך התמקדו אך ורק דגם e. coli זנים, לפיכך, אינן משקפות בהכרח את אופן הפעולה של פפטידים עם זני חיידקים גראם חיוביים.

Spheroplasts, protoplasts נבדלים חיידקים רגילה, בעיקר בחוסר הקיר תא החיצוני, ולא כתוצאה מכך ניתן מודלים טובים עבור כל השאלות ניסיוני. לדוגמה, הממברנה החיצונית של חיידקים גראם שליליים הוכח לפעול כמו מסננת מולקולרית עבור מולקולות גדולות יותר29. פפטידים גדולים יותר, לכן, ייתכן תוכל translocate ב spheroplasts כאשר הם לא יעשה זאת בחיידקים נורמלי. בנוסף, מחקרים מפורטת של האינטראקציה של מגבר עם דופן התא של חיידקים, הממברנה החיצונית, ממברנה cytoplasmic לא ניתן לבצע באמצעות spheroplasts ו- protoplasts. לדוגמה, עבודה מן המעבדה Weisshaar ניצל הדמיה לציין את עמדות מדויקת יותר של פפטיד המנגנונים CM15 ו- melittin של פעולה30,31. עם זאת, הגישה שלנו, כפי שמתואר כאן, אינו מצריך מימוש מיקרופלואידיקה לתוך מיקרוסקופ ומכשור על מנת להשיג רזולוציה נדרשת31. למרות עבודה קודמים הראו כי spheroplasts הם קיימא21,32, בכל זאת ככל הנראה יש להם כמה הבדלים מטבוליים, פיזיולוגיים מחיידקים "נורמלי" שעלולים לשנות פוטנציאל ממברנה אינטראקציות בחלק מקרים. בנוסף, כי אנחנו לא שהערכת הכדאיות של אוכלוסיות spheroplast, לא יכול להבדיל בין פפטיד כי הוא מסוגל בקלות translocate על פני קרום התא של תא חי לעומת פפטיד זה יכול רק translocate על פני מת או למות התא. למרות הבדלים אלה, ראינו לוקליזציה דפוסים e. coli spheroplasts עבור מגברים רבים כי הם עקביים עם ידוע מנגנוני פעולה15, התוצאות שלנו BF2 P11A עם protoplasts megaterium דרב המובאת כאן נראה בקנה אחד עם תצפיות אחרים בשביל זה27,13,פפטיד28. קומפוזיציות הממברנה של spheroplasts ו- protoplasts הם גם בהחלט רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר תערובות אופייני בשימוש מערכות מודל אחרות, כגון שלפוחית השומנים. לסיכום, נתן את רזולוציה משופרת והקלות של ההדמיה המוענקת על ידי spheroplasts ו- protoplasts, אנו מאמינים שהם מודלים שימושי להמחשת ממברנה סוכנים פעילים, כגון מגברים, בטווח של זני חיידקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי עניינים מוצהרים.

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ופרס מחלות זיהומיות (NIH-NIAID) R15AI079685.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl) Sigma T3253
Trizma base (Tris OH) Sigma T1503
Magnesium chloride Sigma M8266
Sucrose Sigma S7903
Lysozyme Sigma L6876
Deoxyribonuclease I Sigma D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma 106361 Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate Sigma C4895
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
BBL Trypticase soy broth Fisher Scientific B11768
BF2 P11A FITC NeoScientific Custom ordered
di-8-ANEPPS Biotium 61012
DMSO Sigma 34869 Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid Sigma M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane Pall Corporation 4192
Laser scanning confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 II For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Leica Microsystems For image processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20, (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24, (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19, (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80, (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8, (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4, (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40, (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838, (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29, (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9, (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818, (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39, (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4, (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107, (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43, (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25, (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111, (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32, (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39, (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128, (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114, (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819, (1), (1985).
ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).More

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter