Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Produksjon og visualisering av bakteriell Spheroplasts og Protoplasts for å karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering

doi: 10.3791/57904 Published: August 11, 2018

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å produsere gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts tydelig visualisere og raskt karakterisere peptid-bakterier interaksjoner. Dette gir en systematisk metode for å definere membran lokalisere og translocating peptider.

Abstract

Bruk av AC confocal mikroskopi som metode for å vurdere peptid lokalisering mønstre i bakterier er vanligvis hemmet av oppløsningen grensene for konvensjonelle lys mikroskop. Som oppløsning for en gitt mikroskopet ikke kan være lett forbedret, presenterer vi for å transformere liten stav-formet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) kalt spheroplasts eller protoplasts til større, lett fotografert sfæriske former. Denne transformasjonen kan observatører å raskt og tydelig avgjøre om peptider lodge seg i den bakterielle membranen (dvs. membran lokalisere) eller krysse membranen for å angi cellen (dvs. translocating). Med denne tilnærmingen presenterer vi også en systematisk metode for å karakterisere peptider som membran lokalisere eller translocating. Stund denne metoden kan brukes for en rekke membran-aktiv peptider og bakteriell stammer, viser vi nytten av denne protokollen ved å observere samspillet av Buforin II P11A (BF2 P11A), en antimikrobiell peptid (AMP), med E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antimikrobielle peptider (ampere) har fått oppmerksomhet potensielle bruken som alternativer til vanlig antibiotika,1,,2,,3,,4,,5. Forsterkere drepe bakterier ved enten translocating over cellemembranen og samarbeidsstil intracellular komponenter som nukleinsyrer eller permeabilizing membranen forårsaker lekkasje av cellen innholdet6. I tillegg til deres bruk som antibiotika, kan translocating forsterkere tilpasses for stoffet levering programmer fordi de kan ikke disruptively krysser den ugjennomtrengelige cellemembranen7,8. Vi derfor forsøke å forstå grunnleggende AMP virkningsmekanismer å legge grunnlaget for deres bruk i stoff design.

AC confocal mikroskopi tilbyr en måte å vurdere lokalisering mønstre av fluorescently merket ampere i bakterielle celler å gi innsikt i deres mekanisme handling9,10,11,12, 13 , 14. ved merking membran av bakterier, kan man avgjøre hvis en fluorescently merket peptid regionaliserer membran eller intracellulær løpet av en bakteriell celle. Men er denne teknikken begrenset av liten størrelse og rod form av bakterier, som kan gjøre imaging utfordrende oppløsningen grensene for konvensjonelle lys mikroskop og variabel retningen av bakterier på lysbildet15.

Målet med presentert metoden er å aktivere forbedret visualisering fluorescently merket peptid lokalisering mønstre med AC confocal mikroskopi. Visualisering er forbedret ved å slå av liten, tynn, stav-formet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) bakterier i forstørret, sfæriske former omtales som spheroplasts (for gram-negative stammer) og protoplasts (for gram-positive stammer)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts og protoplasts er enklere å bildet på grunn av både økt størrelsen og fasongen symmetrisk, som gjør retningen for en bakterie på et lysbilde irrelevante for sin imaging. I tillegg presenterer vi en systematisk tilnærming for å analysere kvantitativt AC confocal mikroskopi data for å karakterisere forsterkere som enten membran lokalisere eller translocating. Bruk disse metodene, gjør det enklere å skille fluorescently merket peptid lokalisering mønstre. Protokollene presenteres her kan brukes til å vurdere lokaliseringen av en rekke membran-aktive agenter enn forsterkere, inkludert celle-gjennomtrengende peptider.

En klar fordel av denne teknikken er at det gir innsikt i virkningsmekanismen av forsterkere på en enkelt celle-nivå, som kan avsløre celle til celle heterogenitet15, i motsetning til andre fluorescens analyser vanligvis brukes til å identifisere den virkningsmekanismer av forsterkere, som bare gir bulk estimater9,22,23,24,25. Bruk av spheroplasts og protoplasts for å vurdere AMP celleoppføring er spesielt nyttig26 fordi de er mer fysiologisk relevante15 enn andre modeller brukt for å vurdere celleoppføring, som lipid blemmer24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. løsning forberedelse

Merk: Forberede løsninger som beskrevet i trinn 1.1-1,9 og 1,8-1.11 for å produsere E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts, henholdsvis.

  1. Forberede 1 M Tris-Cl, pH 7,8 av oppløsning 10.34 g Tris HCl og 4.17 g Tris oh i 50 mL av dH2O i en 125 mL kolbe. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran og lagre i en konisk rør ved romtemperatur.
  2. Klargjør løsning (20 mM MgCl2, 0,7 M sukrose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) ved oppløsning 0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) og 11.98 g sukrose (342.3 g/mol) i 25 mL dH2O i en 125 mL kolbe. Legge til 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) og justere volumet til 50 ml passer. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran og lagre i en konisk rør ved romtemperatur.
  3. Klargjør løsning B (10 mM MgCl2, 0,8 M sukrose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) ved oppløsning 0,05 g MgCl2 (95.2 g/mol) og 13.69 g sukrose (342.3 g/mol) i 25 mL dH2O i en 125 mL kolbe. Legge til 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) og justere volumet til 50 ml passer. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran og lagre i en konisk rør ved romtemperatur.
  4. Klargjør 0,8 M sukrose ved oppløsning 13.69 g sukrose (342.3 g/mol) i 50 mL dH2O i en 125 mL kolbe. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran og lagre i en konisk rør ved romtemperatur.
  5. Forberede 5 mg/mL deoxyribonuclease jeg (DNase jeg) av oppløsende 0.015 g DNase I 3 mL dH2O i en 50 mL kolbe. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran. Aliquot løsning i microfuge rør og butikk på 20 ° C.
  6. Forberede 0.125 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), pH 8.0 av oppløsning 0.698 g EDTA disodium tørke (372.2 g/mol) til 15 mL dH2O i en 125 mL kolbe. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran og lagre i en konisk rør ved romtemperatur.
  7. Klargjør 600 µg/mL cephalexin ved oppløsning 0,03 g cephalexin hydrat (365.404 g/mol) i 50 mL av dH2O i en 125 mL kolbe. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran og lagre i en konisk rør på 4 ° C.
  8. Klargjør 5 mg/mL lysozyme ved oppløsning 0.015 g lysozyme i 3 mL av dH2O i en 50 mL kolbe. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran. Aliquot løsning i microfuge rør og butikk på 20 ° C.
  9. Klargjør 3% w/v Trypticase soya kjøttkraft (TSB) ved oppløsning 30 g TSB 1 l av dH2O i en 2 L kolbe. Aliquot løsningen i flasker som inneholder 25 mL eller 100 mL TSB brukes i utarbeidelsen av E. coli spheroplasts eller B. megaterium protoplasts, henholdsvis. Autoclave kolber å sterilisere i flytende medium. Sterilt TSB kan lagres ved romtemperatur eller 4 ° C.
  10. Klargjør løsning C (1 M sukrose 0.04 M maleate 0.04 M MgCl2, pH 6,5) ved oppløsning 34.23 g sukrose (342.3 g/mol) og 0,46 g maleic acid (116.07 g/mol) 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) i 100 mL dH2O i en 250 mL kolbe. Justere pH til 6.5. Sterilisere ved å filtrere gjennom en 25 mm sprøyte med en 0,2 µm membran og lagre i en konisk rør ved romtemperatur.
  11. Forberede 200 mL protoplast medium ved å blande 100 mL 3% w/v TSB og 100 mL løsning C i en 1 L glassflaske. Autoclave sterilisere løsningen og lagre ved romtemperatur.

2. forberedelse av natten kultur

Merk: Utføre Seksjon 2 – 4 bruke sterilt teknikker. Eventuelt en bakteriell belastning kan inneholde en plasmider for antibiotikaresistens å redusere potensielle forurensning. Hvis bruker en stamme med antibiotikaresistens, legge de nødvendige antibiotika i trinn 2.1, 3.1-3.2 og 4.1-4.4.

  1. Forberede en overnatting kultur ved å plukke en enkelt koloni av bakterier bruker et sterilt pipette tips og plassere det i en 14 mL kultur tube med 2-3 mL 3% w/v TSB. Inkuber ved 37 ° C, mens risting 16 – 21 h.

3. forberedelse av Gram-negative E. coli Spheroplasts

  1. I en 250 mL kolbe, fortynne den natten kultur 1: 100 i 25 mL volum på 3% w/v TSB og Inkuber bakteriell løsningen ved 37 ° C, mens risting for ca 2,5 timer til løsningen har nådd en optisk tetthet på 0,5-0.8 på 600 nm. Måle optisk densitet bruker et spektrofotometer.
  2. I en 250 mL kolbe, fortynne denne kultur 1:10 i 30 mL av 3% w/v TSB og ruge ved 37 ° C, mens risting for 2,5 t i nærvær av 60 µg/mL cephalexin (347.4 g/mol) å produsere enkeltcelle filamenter på ca 50-150 µm lengde , som er observerbare under 1000 X forstørrelse med lys mikroskop (figur 1B).
  3. Høste filamenter av sentrifugering bakteriell løsningen på 1500 x g, 4 ° C i 4 min. Decant og kast nedbryting, reserverer pellet.
  4. Vask filamenter ved forsiktig å legge 1 mL av 0,8 M sukrose, pass på ikke å forstyrre pellet. Inkuber for 1 min, og deretter kaste nedbryting uten å forstyrre pellet.
  5. Legge til 150 µL av 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL av 5 mg/mL lysozyme, 30 µL av 5 mg/mL DNase jeg, og 120 µL av 0.125 M EDTA i de respektive for å pellet og ruge løsningen ved romtemperatur for 10 min.
  6. Legge 1 mL løsning A gradvis over 1 min til løsningen i 3.5 bruker brønnene mens forsiktig virvlende løsningen for hånd. Inkuber løsningen for 4 min ved romtemperatur.
  7. Sett 7 mL av 4 ° C løsning B i to 15 mL konisk rør. Legge til lik mengde løsningen i 3.6 til hver av disse to rør. Sentrifuge løsningen på 1500 x g, 4 ° C i 4 min.
  8. Bruker en serologisk pipette, forsiktig fjerne alle unntatt 1-2 mL nedbryting uten å forstyrre pellet. Resuspend pellet av pipettering forsiktig opp og ned bruker P1000 brønnene. Visuelt kontrollere spheroplasts formasjon ved å observere prøven på 1000 X forstørrelse med lys mikroskop (figur 1 c).
  9. Lagre spheroplasts på-20 ° C i opptil en uke, eller til de har gått gjennom 3 fryse-Tin sykluser.

4. forberedelse av Gram-positive B. megaterium Protoplasts

  1. I en 250 mL kolbe, fortynne den natten kultur 1:1,000 i 100 mL 3% w/v TSB og ruge bakteriell løsningen ved 37 ° C, mens risting for ca 4.5 h til løsningen har nådd en optisk tetthet av 0,9-1.0 på 600 nm. Måle optisk densitet bruker et spektrofotometer.
  2. Hell væsken kulturen i to 50 mL konisk rør og sentrifuger 2000 x g, 4 ° C i 10 min.
  3. Bruker en serologisk pipette, forkaste nedbryting fra begge konisk rør. Resuspend hver pellet 2,5 mL protoplast medium og kombinerer resuspended løsningene i en konisk enkeltrør. Pipetter kombinert resuspended løsningen i en 125 mL kolbe.
  4. Legg 1 mL av 5 mg/mL lysozyme og ruge 1t ved 37 ° C, mens risting.
  5. Overvåke veksten av protoplasts under 1000 x forstørrelse med en lys mikroskop, bemerker eventuelle uregelmessigheter, som bakterier som vises som hovne stenger i stedet for kuler (figur 2). Bruke en serologisk pipette, overføre løsningen til en 15 mL konisk rør og sentrifuger 2000 x g, 4 ° C i 10 min.
  6. Dekanter nedbryting og å suspendere pellet i 5 mL protoplast medier. Lagre protoplasts på-20 ° C i opptil en uke, eller til de har gått gjennom 3 fryse-Tin sykluser.

5. forberedelse av peptid løsning og membran fargestoff for Imaging

  1. Peptid løsning
    1. I en microfuge tube innpakket i aluminiumsfolie, løses 2 mg FITC merket BF2 P11A i 800 µL dH2O. Bruk et peptid som inneholder minst én tryptofan rester for å gjennomføre protein konsentrasjon målinger.
    2. Spektrofotometrisk, måle absorbansen peptid løsningen på 280 nm i tre eksemplarer. Beregne peptid konsentrasjonen bruker molar utryddelse koeffisient for tryptofan (5700/Mcm).
    3. Fortynne peptid konsentrasjonen i dH2O til en endelig konsentrasjon av 100-200 µM. Store i et microfuge rør på 20 ° C innpakket i aluminiumsfolie å beskytte mot lyset.
  2. Membran fargestoff
    1. I et microfuge rør, Forbered en 10 mM lager av di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) ved å løse opp 5 mg di-8-ANEPPS i 843.3 µL av DMSO. Lagre på 4 ° C innpakket i aluminiumsfolie å beskytte mot lyset.
    2. I et microfuge rør, Forbered 1 mL av 0,03 mM di-8-ANEPPS ved å legge til 3 µL av 10 mM di-8-ANEPPS 997 µL DMSO. Lagre i et microfuge rør på 4 ° C innpakket i aluminiumsfolie å beskytte mot lyset.

6. visualisering av E. coli Spheroplasts og B. megaterium Protoplasts bruker AC Confocal mikroskopi

  1. Pipetter 5 µL av spheroplasts eller protoplasts på en poly-L-lysine belagt objektglass. Legg 2 µL av FITC merket AMP (100-200 µM) på lysbildet og ruge for 3 min beskyttet mot lyset.
  2. Legg 1 µL av den membran fargestoff di-8-ANEPPS (0,03 mM) på lysbildet og ruge for 3 min beskyttet mot lyset. Dekk med et glass dekkglassvæske og forsegle med på neglelakk.
  3. Slå på AC confocal mikroskop og argon laser. Justere argon laser 20% effekt og 20% overføring.
  4. Angi utslipp bølgelengde områder av 499-532 nm og 670-745 nm for FITC-merket peptid utslipp kanal og di-8-ANEPPS-merket membran fargestoff utslipp kanal, henholdsvis.
  5. Bilde protoplasts eller spheroplasts (figur 1 og figur 2) med en 63 X-målet. Bruke bilderedigeringsprogrammer for å få 8-biters, 512 x 512 sammensatt z-stakk bilder består av 0,5 µm skiver av helheten av spheroplast eller protoplast.
    Merk: Ta nøye overveielse å redusere gjennomslag mens tenkelig spheroplasts og protoplasts. Se diskusjon for detaljer.

7. karakterisering av AMP lokalisering

  1. Åpne sammensatt z stabel bildet i bildebehandlingsprogrammer. Finn den midterste del av den spheroplast eller protoplast og plassere en sirkulær område av interesse (ROI) (0,3 µm i diameter) på membranen (ROI 1), en i sentrum av spheroplast eller protoplast (ROI 2), og en fra spheroplast eller protoplast å måle bakgrunn fluorescens (ROI 3) (figur 5). Unngå inkludering av mettet piksler. Fluorescens intensiteten i hver avkastning beregnes av bildebehandlingsprogrammer.
    Merk: I tilfeller når peptid ikke Lokaliser helheten av membranen, tegne ROI 1 på et område av membranen der peptid er lokalisert.
  2. Bruk denne formelen til å bestemme forholdet mellom intracellulær peptid fluorescens intensitet til membran peptid fluorescens intensitet:
    Equation
    Merk: Fluorescens intensiteten i Avkastningen 3 trekkes fra fluorescens intensiteter i Avkastningen 2 og Avkastningen 1 for å ta hensyn til bakgrunnen fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved å forstørre bakterier og gjør dem sfærisk, kan vi enkelt skille peptider lokalisere til den bakterielle membranen eller lett translocate over den bakterielle membranen. Oppløsningen grensene for konvensjonelle lys mikroskoper gjør det utfordrende for å skille om peptid signaler oppstår fra membran eller intracellulær plass i normale bakterier fordi signaler lokalisert til membranen vises overlapper med den intracellulær plass (figur 3A). I kontrast, resulterer forstørret størrelsen på spheroplasts (2-5 µm) og protoplasts (2-3 µm) sammenlignet med normale bakterier, som er vanligvis bare 1 µm i diameter, i klar oppløsning mellom membran markøren og intracellulær plassen gjør det enklere å skille peptid lokalisering (figur 3B).

Her, brukes spheroplasts og protoplasts til å vise lokalisering mønster av N-terminal FITC merket AMP BF2 P11A. Vi observerer FITC merket BF2 P11A både lokalisere til membranen og translocate over cellen membran av E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts (Figur 4). Mens vill type BF2 har blitt observert for å translocate over E. coli og lipid vesicle membraner, er P11A mutasjon kjent for å redusere denne translokasjon13,27,28. Vi utnyttet en ikke-antibiotika resistente B. megaterium og ampicillin motstandsdyktig topp 10 E. coli (pET45B) i dataene presenteres. Den ampicillin motstandsdyktig E. coli ble dyrket i nærvær av ampicillin (349.4 g/mol) i en siste konsentrasjon i løsning av 25 µg/mL. For bildebehandling, ble etter den systematiske tilnærmingen som beskrevet i § 7, ROIs trukket på membranen, intracellulær mellomrom og bakgrunnen (figur 5B). Forholdet mellom intracellulær peptid fluorescens intensitet til peptid fluorescens intensitet på membranen ble beregnet for hver spheroplast eller protoplast samarbeidsstil BF2 P11A ved hjelp av formelen som er beskrevet i avsnitt 7.2. Figur 5A viser fordelingen av dette forholdet for alle spheroplasts og protoplast scoret. Spheroplasts og protoplasts scoret hovedsakelig falt i to grupper, med fleste av spheroplasts eller protoplasts å ha en ratio på mindre enn 0,3 eller større enn 1.

Gitt gruppene som forholdstallene faller inn, definert vi peptid lokalisering som translocating når forholdet beregnet i avsnitt 7.2 var større enn eller lik 1. Derimot ble peptid lokalisering definert som membran lokalisere når forholdet beskrevet i avsnitt 7.2 var mindre enn 1. Denne metoden av scoring vi observerte et lignende lokalisering mønster for BF2 P11A E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts med BF2 P11A lokalisere til membranen i 71% og 70% av tilfeller av E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts, henholdsvis (tabell 1).

Figure 1
Figur 1: Representant bilder av E. coli. (A) E. coli bakterier (B) E. coli slange og (C) E. coli spheroplast. Bildene ble tatt på 100 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representant bilder av B. megaterium. (A) B. megaterium bakterier og (B) B. megaterium protoplast. Bildene ble tatt på 100 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representant bilder av B. megaterium. (A) B. megaterium bakteriell cellen og (B) B. megaterium protoplast merket med membran markør di-8-ANEPPS. Bilder fra midten z-stakken vises på 100 X (A) og 63 X (B) forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representant E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts samspill med FITC merket BF2 P11A. (A) E. coli spheroplast viser BF2 P11A lokalisere til membranen. (B) E. coli spheroplast viser BF2 P11A translocating over membranen. (C) B. megaterium protoplast viser BF2 P11A lokalisere til membranen. (D) B. megaterium protoplast viser BF2 P11A translocating over membranen. E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts merket med den membran markør di-8-ANEPPS (rød) og FITC BF2 P11A (grønn). Bilder fra midten z-stakken vises på 63 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: analyse av peptid lokalisering mønstre. (A) distribusjon av forholdet mellom intracellulær fluorescens intensitet (ROI 2) til membran fluorescens intensitet (ROI 1) etter bakgrunn subtraksjon ((avkastning 2-ROI 3) / (ROI 1-ROI 3)) for E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts merket med BF2 P11A (B) E. coli spheroplast samspill med FITC merket BF2 P11A. Sirkulær områder av interesse (ROI) 0,3 µm i diameter trukket på membran (ROI 1) intracellulær plass (ROI 2) og bakgrunn (ROI 3). Fluorescens intensiteten av peptid ble kvantifisert i hver avkastning og bakgrunn fluorescens var regnskapsføres etter trekke fluorescens intensiteten i Avkastningen 3 fra fluorescens intensiteten i Avkastningen 1 og avkastning 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bakterielle belastningen nei. spheroplast eller protoplast % Membran lokalisere % Translocating
E. coli 84 71 29
B. megaterium 70 70 30

Tabell 1: lokalisering mønster av BF2 P11A samspill med E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollene presenteres her gjør det mulig for forskere raskere få større utvalgene av bakteriell bilder fordi forstørret, sfærisk bakterier er mye lettere å finne orientere og bilde. Dette styrket evne til å samle inn data er verdifulle på flere måter. Først, muliggjør en mer systematisk kvantitativ analyse av peptid lokalisering mønstre. Mens kvalitativ trender kan påvises fra mindre settene med bilder, bare et stort utvalg sett av bilder med høy kvalitet avslører mer nyansert trender i lokalisering mønstre, som andelen celler der et peptid translocates versus regionaliserer til den membran. Også muligheten til å bedre løse den interne fluorescensen fra membranen lokalisering gjør det enklere å utføre tid kurs studier for å vurdere hvor raskt peptider samhandle med bakterieceller samt hvordan lokalisering mønstre endres over tid. Forbedret oppløsning kan også forskere å vurdere trender i peptid lokalisering det ikke er mulig med mindre bakterier. For eksempel i noen av våre observert spheroplasts og protoplasts vises peptider å lokalisere til bestemte deler av membranen, dvs. peptid signalene ikke utgjør en fullstendig, sammenhengende ring rundt bakterier og i stedet vise noen vises punctate merking. I andre tilfeller peptider kan ikke distribueres helt jevnt inni den bakterielle membranen, dvs. peptid signaler ikke helt fyller indre rommet av bakterier. Mens vi ikke har fulgt disse trendene i vår nåværende analyse, blir vurderer slik lokalisering trender mulig når imaging spheroplasts og protoplasts i stedet for standard bakterielle celler. Disse fordelene ville også gjelde for å bestemme lokaliseringen av peptider enn forsterkere, for eksempel celle-gjennomtrengende peptider. Spheroplasts og protoplasts med disse metodene kan også benyttes for ikke-imaging eksperimenter som nytte økt mobilnettet størrelse, som patch-klemme elektrofysiologi målinger18,19.

En laserskanning AC confocal mikroskop ble benyttet i utviklingen av våre tenkelig protokollen, men det er viktig å optimalisere parametere for hver bestemt tenkelig system. Dette inkluderer å velge et sett med parametere som maksimerer påvisning av peptid og membran fargestoff fluorescens, samtidig minimere gjennomslag fra membranen fargestoff inn i peptid utslipp kanalen og FITC-merket peptid i membranens utslipp kanal. Gjennomslag fra peptid i membranens utslipp kanalen ble unngått ved å velge en bølgelengdeområde membranens utslipp kanal som ikke inkluderte noen del av FITCS utslipp spektrum. Gjennomslag fra membranen fargestoff, di-8-ANEPPS, i den peptid utslipp kanalen var vanskeligere å unngå fordi di-8-ANEPPS' utslipp spektrum overlapper med fleste av FITCS utslipp spektrum. Gjelder denne protokollen, gjennomslag fra membranen fargestoff inn i peptid utslipp kanalen kan føre til falsk karakterisering av forsterkere som membran lokalisert. En kan finne ut om gjennomslag av denne art er oppstått ved imaging spheroplasts eller protoplasts utelukkende merket med membran fargestoff og sjekke om fluorescensen er synlig i den peptid utslipp kanal. Ulike tenkelig parametere, inkludert bølgelengdeområde brukes til å definere den peptid utslipp kanal og gevinst og forskyvning, kan testes systematisk for å finne et sett med parametere som minimerer gjennomslag. Når et sett med parametere er opprettet, er det avgjørende å vurdere om imaging gir sterk påvisning av fluorescens signal når spheroplasts eller protoplasts merket med både peptid og membran fargestoff benyttes. Gjennom denne opprettet vi tenkelig parametere som minimert effekten av gjennomslag samtidig maksimere fluorescens deteksjon av både FITC-merket AMP og membranen fargestoff di-8-ANEPPS. Spesielt vi fant at det utslipp gjennomslag fra membranen fargestoff i peptid kanalen ble minimert bruker utslipp bølgelengde områder av 499-532 nm (peptid) og 670-745 nm (membran), og når gevinsten ble justert skal ≤800 Volt (V) (peptid) og ≤900 V (membran) og forskyvningen ble justert til ≤-10.0% (peptid, membran).

Selv om vi fokusert på E. coli og B. megaterium, kan presentert protokollene tilpasses til spheroplasts eller protoplasts fra mange ulike bakteriell stammer. For eksempel vi har kunnet kunne produsere Bacillus subtilis protoplasts som var 1 – 2 µm i diameter ved hjelp av protokollen som beskrevet i Seksjon 4, og tilpasninger av protokollen kan gjøres for å ytterligere tilpasse størrelsen. Muligheten til å observere peptid lokalisering mønstre i både gram-negative og gram-positive bakteriene er spesielt nyttig å studere forsterkere fordi forskjellene i celleveggen struktur mellom disse to klasser av bakterier kan påvirke hvordan forsterkere samhandler med mobilnettet membraner. Men mange tenkelig studier av forsterkere hittil har utelukkende fokusert på modellen E. coli stammer, og dermed gjenspeiler ikke atferden til peptider med gram-positive bakteriell stammer.

Spheroplasts og protoplasts er forskjellig fra normale bakterier, særlig i sin mangel på en ytre cellen vegg, og kan derfor ikke være gode modeller for alle eksperimentelle spørsmål. Den ytre membranen av gram-negative bakterier har for eksempel vist seg å fungere som en molekylær sil større molekyler29. Større peptider, derfor kanskje kunne translocate i spheroplasts når de ikke ville gjøre det i normale bakterier. I tillegg kan ikke detaljerte studier av samspillet av AMP bakterier cellevegg, ytre membran og cytoplasmatiske membran utføres ved hjelp av spheroplasts og protoplasts. For eksempel har siste verk fra Weisshaar Lab utnyttet imaging å merke mer nøyaktige plasseringen av peptid i CM15 og melittin mekanismer for handlingen30,31. Men krever vår tilnærming, som beskrevet her, ikke implementeringen av microfluidics til mikroskopi instrumentering for å oppnå de nødvendige oppløsning31. Selv om tidligere arbeid har vist at spheroplasts er levedyktig21,32, har de likevel sannsynligvis noen metabolske og fysiologiske forskjeller fra "normal" bakterier som potensielt kan endre membran interaksjoner i noen tilfeller. I tillegg, fordi vi ikke har vurdert levedyktigheten til spheroplast bestander, kan man skille mellom et peptid som lett kan translocate i cellemembranen i en levende celle versus et peptid som kan bare translocate over en død eller døende celle. Til tross for disse forskjellene, har vi sett lokalisering mønstre i E. coli spheroplasts for mange forsterkere som stemmer overens med kjente mekanismer handling15og resultatene for BF2 P11A med B. megaterium protoplasts presenteres her synes samsvar med andre observasjoner for at peptid13,27,28. Membran komposisjonene til spheroplasts og protoplasts er også sikkert mer fysiologisk relevant enn typiske blandinger brukes i andre modellsystemer, som lipid blemmer. I sammendraget, forbedret oppløsning og enkel bildebehandling by av spheroplasts og protoplasts, tror vi de er nyttige modeller for å visualisere membran aktive agenter, som ampere, i en rekke bakterielle stammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen konflikter av interesse er deklarert.

Acknowledgments

Forskning ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIH-NIAID) award R15AI079685.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl) Sigma T3253
Trizma base (Tris OH) Sigma T1503
Magnesium chloride Sigma M8266
Sucrose Sigma S7903
Lysozyme Sigma L6876
Deoxyribonuclease I Sigma D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma 106361 Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate Sigma C4895
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
BBL Trypticase soy broth Fisher Scientific B11768
BF2 P11A FITC NeoScientific Custom ordered
di-8-ANEPPS Biotium 61012
DMSO Sigma 34869 Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid Sigma M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane Pall Corporation 4192
Laser scanning confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 II For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Leica Microsystems For image processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20, (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24, (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19, (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80, (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8, (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4, (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40, (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838, (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29, (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9, (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818, (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39, (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4, (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107, (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43, (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25, (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111, (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32, (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39, (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128, (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114, (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819, (1), (1985).
Produksjon og visualisering av bakteriell Spheroplasts og Protoplasts for å karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).More

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter