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Biology

Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano

doi: 10.3791/57904 Published: August 11, 2018

Summary

Aquí presentamos un protocolo para producir Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) Esferoplastos y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplastos claramente visualizar y caracterizar rápidamente interacciones de péptido-bacterias. Esto proporciona un método sistemático para definir la localización de la membrana translocación de péptidos.

Abstract

Comúnmente, el uso de microscopia confocal como un método para determinar patrones de localización de péptidos dentro de las bacterias es inhibido por los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales. Como la resolución de un microscopio dado no puede ser fácilmente mejorada, presentamos protocolos para transformar la pequeña barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) en formas esféricas más grandes, fácilmente reflejadas llaman esferoplastos o protoplastos. Esta transformación permite observadores a rápidamente y claramente determinar si péptidos se alojan en la membrana bacteriana (es decir, localización de membrana) o cruzan la membrana para entrar en la célula (es decir, translocación). Con este enfoque, también presentamos un método sistemático para caracterizar péptidos como membrana de localización o translocación. Si bien este método puede utilizarse para una variedad de péptidos activos de membrana y cepas bacterianas, demostramos la utilidad de este protocolo mediante la observación de la interacción de Buforin II P11A (BF2 P11A), un péptido antimicrobiano (AMP), con e. coli Esferoplastos y protoplastos B. megaterium .

Introduction

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Péptidos antimicrobianos (AMPs) han obtenido la atención debido a su uso potencial como alternativas a los antibióticos convencionales1,2,3,4,5. Amperios de matan bacterias por translocación a través de la membrana celular e interactuando con componentes intracelulares tales como ácidos nucleicos o por permeabilizing la membrana causando fugas de contenido de la célula6. Además de su uso como antibióticos, translocación amperios puede ser adaptado para solicitudes de entrega de medicamentos porque no disruptiva puede cruzar la membrana celular impermeable7,8. Por lo tanto, buscamos comprender los mecanismos fundamentales de la AMP de acción para sentar las bases para su uso en el diseño de fármacos.

La microscopia confocal ofrece una manera para determinar patrones de localización de fluorescencia etiquetadas amperios en células bacterianas proporcionando penetraciones en su mecanismo de acción9,10,11,12, 13 , 14. al etiquetado de la membrana de las bacterias, uno puede determinar si un péptido fluorescente etiquetado localiza a la membrana o en el espacio intracelular de una célula bacteriana. Sin embargo, esta técnica está limitada por el pequeño tamaño y barra de forma de bacterias, que puede hacer difícil debido a los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales y la orientación variable de las bacterias en la diapositiva15la proyección de imagen.

El objetivo del método presentado es mejorar la visualización de los patrones de localización de péptido fluorescente etiquetado usando microscopia confocal. Visualización se ha mejorado el pequeños, finos, barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) bacterias en formas de agrandamiento, esféricas conocido como Esferoplastos (para las cepas Gram negativas) y protoplastos (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. Esferoplastos y protoplastos son más fáciles de imagen debido a su mayor tamaño y su forma simétrica, lo que hace irrelevante para la proyección de imagen de la orientación de una bacteria sobre un portaobjetos. Además, presentamos un enfoque sistemático para analizar cuantitativamente datos de microscopia confocal para caracterizar amperios como cualquier membrana de localización o translocación. Aplicación de estos métodos resulta más fácil distinguir marcada fluorescencia patrones de localización de péptido. Los protocolos aquí presentados pueden utilizarse para evaluar la localización de una variedad de agentes activos de membrana distintos amplificadores, incluyendo péptidos de penetración celular.

Una clara ventaja de esta técnica es que proporciona penetraciones en el mecanismo de acción de amp a nivel unicelular, que puede revelar la heterogeneidad celular de la célula15, frente a otros ensayos de fluorescencia se utiliza comúnmente para identificar la mecanismos de acción de amperios, que sólo proporcionan a granel estimaciones9,22,23,24,25. El uso de Esferoplastos y protoplastos para evaluar la entrada de amplificador celular es útil particular26 porque son más fisiológico relevantes15 que otros modelos utilizados para evaluar la entrada de la célula, como lípido vesículas24.

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Protocol

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1. preparación de la solución

Nota: Preparar soluciones que se describe en los pasos 1.1 – 1.9 y 1.8, 1.11 para la producción de Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos, respectivamente.

  1. Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7.8 disolviendo 10,34 g Tris HCl y 4,17 g de Tris OH en 50 mL de dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  2. Preparar la solución A (20 mM MgCl2, 0.7 M sacarosa, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) disolver 0,10 g de MgCl2 (95.2 g/mol) y 11,98 g sacarosa (342.3 g/mol) en 25 mL dH2O en un matraz de mL 125. Añadir 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) y ajustar el volumen a 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  3. Preparar la solución B (10 mM de MgCl2, sacarosa de 0,8 M, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) disolviendo 0.05 g de MgCl2 (95.2 g/mol) y 13,69 g sacarosa (342.3 g/mol) en 25 mL dH2O en un matraz de mL 125. Añadir 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) y ajustar el volumen a 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  4. Preparar 0,8 M sacarosa sacarosa g 13,69 (342.3 g/mol) en 50 mL dH2O en un matraz 125 de mL de disolución. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  5. Preparar desoxirribonucleasa de 5 mg/mL me (DNasa I) disolviendo 0,015 g DNasa I en 3 mL de dH2O en un matraz de 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2. Solución de alícuota en tubos de microcentrífuga y almacenar a-20 ° C.
  6. Preparar 0,125 M ácido etilendiaminotetracético (EDTA), pH 8.0 mediante la disolución de EDTA disódico 0,698 g deshidratar (372.2 g/mol) en 15 mL dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  7. Preparar 600 cefalexina μg/mL de disolución 0,03 g de hidrato de cefalexina (365.404 g/mol) en 50 mL de dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a 4 ° C.
  8. Preparar la lisozima 5 mg/mL lisozima 0,015 g en 3 mL de dH2O en un matraz de 50 mL de disolución. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2. Solución de alícuota en tubos de microcentrífuga y almacenar a-20 ° C.
  9. Preparar 3% w/v caldo de soya tripticasa (TSB) disolviendo 30 g de TSB en 1 L de dH2O en un matraz de 2 L. Parte alícuota de la solución en frascos que contienen 25 mL o 100 mL TSB para ser utilizado en la preparación de e. coli esferoplastos o B. megaterium protoplastos, respectivamente. Frascos de autoclave para esterilizar el medio líquido. TSB estéril puede almacenarse a temperatura ambiente o a 4 ° C.
  10. Preparar la solución C (1 M sacarosa, maleato de 0,04 M, 0,04 M de MgCl2, pH 6,5) 34,23 g sacarosa (342.3 g/mol), 0,46 g ácido maleico (116.07 g/mol) y 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) en 100 mL de dH2O en un matraz de 250 mL de disolución. Ajustar el pH a 6.5. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  11. Preparar medio de protoplasto de 200 mL por 100 mL 3% w/v TSB y 100 mL de solución C en una botella de vidrio de 1 L de mezcla. Autoclave para esterilizar la solución y almacenar a temperatura ambiente.

2. preparación de la cultura durante la noche

Nota: Realice las secciones 2-4 utilizando técnicas estériles adecuadas. Si lo desea, una cepa bacteriana puede contener un plásmido de resistencia a los antibióticos reducir la contaminación potencial. Si se utiliza una cepa con resistencia a los antibióticos, añadir los antibióticos necesarios en los pasos 2.1, 3.1, 3.2 y 4.1-4.4.

  1. Preparar una cultura de la noche a la mañana escogiendo una sola Colonia de bacterias utilizando una pipeta estéril y colocar en un tubo de cultivo de 14 mL con 2 – 3 mL de 3% w/v TSB. Incubar a 37 ° C, agitando de 16 a 21 h.

3. preparación de bacterias Gram negativas e. coli Esferoplastos

  1. En un matraz de 250 mL, diluir la cultura durante la noche 1: 100 en volumen de 25 mL de 3% w/v TSB e incubar la solución bacteriana a 37 ° C, agitando durante aproximadamente 2,5 horas hasta que la solución ha alcanzado una densidad óptica de 0.5 – 0.8 a 600 nm. Medir la densidad óptica usando un espectrofotómetro.
  2. En un matraz de 250 mL, diluir esta cultura 1:10 en 30 mL de 3% w/v TSB e incubar a 37 ° C, agitando durante 2,5 h en presencia de 60 cefalexina μg/mL (347.4 g/mol) para producir filamentos unicelulares de unos 50-150 μm de longitud , que son observables bajo 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz (figura 1B).
  3. Recoger los filamentos por centrifugación de la solución bacteriana a 1.500 x g, 4 ° C por 4 minutos, decantar y desechar el sobrenadante, el sedimento para realizar.
  4. Lave los filamentos suavemente añadir 1 mL de sacarosa de 0,8 M, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Incubar durante 1 min y luego descartar el sobrenadante sin perturbar el pellet.
  5. Añadir 150 μL de 1 M Tris-Cl (pH 7.8), 120 μl de lisozima de 5 mg/mL, 30 μl de 5 mg/mL de DNasa I y 120 μl de EDTA de 0,125 M en sus respectivos fin el perdigón e incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  6. Añadir 1 mL de solución A poco a poco más de 1 minuto a la solución preparada en 3.5 utilizando una micropipeta mientras que suavemente girando a mano la solución. Incubar la solución durante 4 min a temperatura ambiente.
  7. Colocar 7 mL de solución B de 4 º C en dos tubos cónicos de 15 mL. Añadir cantidades iguales de la solución preparada en 3.6 a cada uno de estos dos tubos. Centrifugue la solución a 1.500 x g, 4 ° C por 4 minutos.
  8. Con una pipeta serológica, retire con cuidado todo pero 12 mL de sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspender el precipitado mediante pipeteo suavemente arriba y abajo utilizando una micropipeta P1000. Visualmente Compruebe formación de Esferoplastos, observando la muestra a 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz (figura 1).
  9. Almacenar los Esferoplastos a-20 ° C hasta una semana o hasta que han pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.

4. preparación de protoplastos Gram-positiva B. megaterium

  1. En un matraz de 250 mL, diluir la noche cultura 1:1,000 en 100 mL de 3% w/v TSB e incubar la solución bacteriana a 37 ° C, agitando para aproximadamente 4.5 h hasta que la solución ha alcanzado una densidad óptica de 0.91.0 a 600 nm. Medir la densidad óptica usando un espectrofotómetro.
  2. Vierta el cultivo líquido en dos tubos cónicos de 50 mL y centrifugar a 2.000 x g, 4 º C durante 10 minutos.
  3. Con una pipeta serológica, deseche el sobrenadante de los tubos cónicos. Resuspender cada precipitado en medio del protoplasto de 2,5 mL y combinar las soluciones resuspendidas en un solo tubo cónico. Pipetear la solución combinada de resuspendidos en un matraz de 125 mL.
  4. Añadir 1 mL de lisozima de 5 mg/mL e incubar 1 h a 37 ° C, agitando.
  5. Vigilar el crecimiento de protoplastos bajo 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz, tomando nota de cualquier irregularidad, tales como bacterias que aparecen como hinchadas barras en lugar de esferas (figura 2). Mediante una pipeta serológica, transferir la solución a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 2.000 x g, 4 º C durante 10 minutos.
  6. Decantar el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en medios del protoplasto de 5 mL. Almacenar protoplastos a-20 ° C hasta una semana o hasta que han pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.

5. preparación de la solución del péptido y tinte de membrana para la proyección de imagen

  1. Solución de péptido
    1. En un tubo de microcentrífuga envuelto en papel de aluminio, disolver 2 mg de FITC etiquetado BF2 P11A en 800 μl de dH2O. uso un péptido que contiene al menos un residuo de triptófano para llevar a cabo las mediciones de concentración de proteína.
    2. Espectrofotómetro, medir la absorbancia de la solución del péptido a 280 nm por triplicado. Calcular la concentración de péptido utilizando el coeficiente de extinción molar para el triptófano (5.700/Mcm).
    3. Diluir la concentración de péptido en dH2O a una concentración final de 100 – 200 μm. Almacene en un tubo de microcentrífuga a-20 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.
  2. Tinte de membrana
    1. En un tubo de microcentrífuga, preparar un stock de 10 mM de di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) disolviendo 5 mg de di-8-ANEPPS en 843.3 μl de DMSO. Almacenar a 4 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.
    2. En un tubo de microcentrífuga, preparar 1 mL de 0,03 mM di-8-ANEPPS por agregar 3 μl de 10 mM di-8-ANEPPS a 997 de μl DMSO. Almacenar en un tubo de microcentrífuga a 4 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.

6. visualización de Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos usando microscopia Confocal

  1. Pipeta de 5 μl de esferoplastos o protoplastos en un portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-l-lisina. Añadir 2 μl de FITC etiquetado AMP (100-200 μm) a la diapositiva e incubar 3 minutos protegido de la luz.
  2. Añadir 1 μl de la membrana tinte di-8-ANEPPS (0,03 mM) a la diapositiva e incubar 3 minutos protegido de la luz. Cubrir con un cubreobjetos de vidrio y sellarlo con el esmalte de uñas.
  3. Encienda el láser confocal microscopio y argón. Ajustar el láser de argón a la salida de energía de 20% y 20% de transmisión.
  4. Establecer rangos de longitud de onda de emisión de 499-532 nm y 670-745 nm para el canal de emisión del péptido marcado con FITC y membrana di 8-ANEPPS-marcado con tinte emisión canal, respectivamente.
  5. Protoplastos de imagen o Esferoplastos (figura 1 y figura 2) con el objetivo X 63. Utilizar software tratamiento de imágenes para obtener 8 bits, imágenes de 512 x 512 compuesto z-stack compuesto de 0,5 μm rebanadas de la totalidad del spheroplast o protoplasto.
    Nota: Tomar consideración cuidadosa para reducir la emisión de repintado y protoplastos y Esferoplastos. Véase para más detalles.

7. Caracterización de la localización de la AMP

  1. Abre la imagen compuesta z-stack en software de imágenes. Localizar el centro más segmento del spheroplast o protoplasto y coloque una región circular de interés (ROI) (0,3 μm de diámetro) en la membrana (ROI 1) uno en el centro del spheroplast o protoplasto (ROI 2) y uno del spheroplast o protoplasto a medida la fluorescencia del fondo (ROI 3) (figura 5). Evitar la inclusión de píxeles saturados. La intensidad de fluorescencia en cada retorno de la inversión puede ser calculada por el software de imágenes.
    Nota: En casos cuando el péptido no localizar a la totalidad de la membrana, dibujar 1 retorno de la inversión en un área de la membrana donde se localiza el péptido.
  2. Utilice la siguiente ecuación para determinar la relación entre intensidad de fluorescencia intracelular del péptido a la intensidad de fluorescencia de péptido de membrana:
    Equation
    Nota: La intensidad de fluorescencia en retorno de la inversión 3 se resta de intensidades de fluorescencia en retorno de la inversión 2 y 1 de retorno de la inversión para explicar la fluorescencia de fondo.

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Representative Results

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Por ampliación de bacterias y haciéndolos esférico, fácilmente podemos distinguir péptidos localización a la membrana bacteriana o translocan fácilmente a través de la membrana bacteriana. Los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales hacen difícil para distinguir si el péptido señal se presenta de la membrana o espacio intracelular de las bacterias normales porque aparecerán las señales localizadas en la membrana se superponen a la espacio intracelular (Figura 3A). En contraste, el tamaño agrandado de Esferoplastos (2 – 5 μm) y protoplastos (2 – 3 μm) en comparación con las bacterias normales, que son típicamente solamente 1 μm de diámetro, da lugar a resolución claro entre el marcador de membrana y el espacio intracelular, facilitando la distinguir la localización de péptidos (figura 3B).

Aquí, Esferoplastos y protoplastos se utilizan para mostrar el patrón de localización de la N-terminal FITC etiquetado AMP BF2 P11A. Observamos que FITC etiquetado P11A BF2 para localizar a la membrana y translocan a través de la membrana celular de Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos (figura 4). Tipo salvaje BF2 se ha observado que translocan a través de membranas de vesículas de e. coli y de los lípidos, la mutación P11A se sabe para reducir esta translocación13,27,28. Utilizamos una resistencia a antibióticos no B. megaterium y ampicilina resistente Top 10 e. coli (pET45B) en los datos presentados. La ampicilina resistente e. coli fue crecido en presencia de ampicilina (349.4 g/mol) a una concentración final en la solución de 25 μg/mL. Para la proyección de imagen, siguiendo el enfoque sistemático descrito en la sección 7, ROIs fueron dibujados en la membrana, el espacio intracelular y el fondo (figura 5B). Se calcula el cociente de la intensidad de la fluorescencia del péptido intracelular a la intensidad de la fluorescencia del péptido en la membrana para cada spheroplast o protoplasto interactuando con BF2 P11A usando la ecuación descrita en la sección 7.2. Figura 5A se muestra la distribución de esta relación para todos los Esferoplastos y protoplasto anotadas. Los Esferoplastos y protoplastos marcaron en gran medida cayeron en dos grupos, con la mayoría de los esferoplastos o protoplastos con una relación de menos de 0,3 o mayor que 1.

Teniendo en cuenta los distintos grupos que los ratios caen, definimos localización péptido como translocación cuando el ratio calculado en la sección 7.2 fue mayor o igual a 1. Por el contrario, localización de péptido se definió como localización de la membrana cuando la relación que se describe en la sección 7.2 fue menos de 1. Siguiendo este método de puntuación, se observa un localización patrón similar para BF2 P11A en Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos con BF2 P11A localiza a la membrana en 71% y el 70% de los casos de e. coli Esferoplastos y Protoplastos B. megaterium , respectivamente (tabla 1).

Figure 1
Figura 1: Imágenes representativas de e. coli. Serpiente de e. coli (A) e. coli bacterias (B) y (C) e. coli spheroplast. Imágenes fueron tomadas a 100 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes representativas de B. megaterium. (A) B. megaterium bacteria y (B) B. megaterium protoplasto. Imágenes fueron tomadas a 100 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes representativas de B. megaterium. Célula bacteriana (A) B. megaterium y (B) B. megaterium protoplasto con el marcador de membrana di-8-ANEPPS. Muestran imágenes de la media pila de z 100 X (A) y el aumento de X (B) 63. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Esferoplastos de representativos e. coli y B. megaterium protoplastos interactuando con FITC etiquetan BF2 P11A. (A) demostración de e. coli spheroplast BF2 P11A localiza a la membrana. (B) demostración de e. coli spheroplast BF2 P11A translocación a través de la membrana. (C) demostración del protoplasto B. megaterium BF2 P11A localiza a la membrana. (D) demostración de B. megaterium protoplasto BF2 P11A translocación a través de la membrana. Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos están marcados con la membrana marcador di-8-ANEPPS (rojo) y FITC etiquetados P11A del BF2 (verde). Muestran imágenes de la media pila de z 63 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de los patrones de localización de péptido. (A) distribución del cociente de la intensidad de fluorescencia intracelular (ROI 2) intensidad de fluorescencia de membrana (ROI 1) después de fondo ((ROI 2-ROI 3) / (1 de retorno de la inversión-ROI 3)) de Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos con BF2 P11A (B) e. coli spheroplast interactuando con FITC etiquetado P11A del BF2. Circular las regiones de interés (ROI) 0.3 μm de diámetro dibujado en el espacio intracelular (ROI 2) de membrana (ROI 1) y fondo (ROI 3). La intensidad de la fluorescencia del péptido se cuantificó en cada retorno de la inversión y fue responsable de la fluorescencia de fondo restando la intensidad de fluorescencia en retorno de la inversión 3 de la intensidad de fluorescencia en retorno de la inversión 1 y 2 de retorno de la inversión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cepa bacteriana No. spheroplast o protoplasto Localización de membrana % Translocación de %
E. coli 84 71 29
B. megaterium 70 70 30

Tabla 1: el patrón de localización de BF2 P11A interactuar con E. coli Esferoplastos y B. megaterium protoplastos.

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Discussion

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Los protocolos aquí presentados hacen posible para los investigadores a obtener más rápidamente más grandes tamaños de muestra de imágenes bacterianas porque las bacterias ampliadas, esféricas son mucho más fáciles de ubicar, orientar y la imagen. Esta mayor capacidad para recopilar datos es valiosa en varios aspectos. En primer lugar, permite un análisis cuantitativo más sistemático de los patrones de localización de péptido. Mientras las tendencias cualitativas pueden demostrarse de pequeñas series de imágenes, muestra un conjunto de imágenes de alta calidad revelan más matizada de las tendencias en los patrones de localización, tales como el porcentaje de células en un péptido transloca versus localiza a la membrana. También, la capacidad de resolver mejor la fluorescencia interna de la localización de la membrana hace más fácil para llevar a cabo estudios para evaluar la rapidez péptidos interactúan con las células bacterianas, así como patrones de localización cambian con el tiempo tiempo. La resolución también permite a los investigadores a considerar las tendencias en la localización de péptido que no son posibles con las bacterias más pequeñas. Por ejemplo, en algunos de protoplastos y Esferoplastos observados, péptidos parecen localizar a secciones específicas de la membrana, es decir, las señales de péptido no formar un anillo completo y cohesionado alrededor de la bacteria y mostrar algunas punteadas etiquetado. En otros casos, péptidos no podrán ser distribuidos totalmente uniformemente dentro de la membrana bacteriana, es decir, el péptido señal no llene completamente el espacio interior de las bacterias. Mientras que nosotros no hemos perseguido estas tendencias en nuestro análisis actual, teniendo en cuenta estas tendencias de localización se vuelve factible cuando Imágenes Esferoplastos y protoplastos en lugar de las células bacterianas estándar. Estas ventajas también se aplicaría para determinar la localización de péptidos distintos amplificadores, como los péptidos de penetración celular. Esferoplastos y protoplastos producidos con estos planteamientos podrían utilizarse también para los experimentos de proyección de imagen no que se benefician del aumento del tamaño celular, tales como abrazadera del remiendo electrofisiología medidas18,19.

Un microscopio confocal de láser fue utilizado en la elaboración de nuestro protocolo de imagen, pero es fundamental para optimizar los parámetros de cada sistema específico de proyección de imagen. Esto incluye la selección de un conjunto de parámetros que maximicen la detección de la fluorescencia de tinte péptido y membrana, minimizando el repintado de la tintura de membrana en el canal de emisión del péptido y el péptido marcado con FITC en la membrana canal de emisión. Repintado de los péptidos en el canal de emisión de la membrana fue evitada seleccionando un rango de longitud de onda para el canal de emisión de la membrana que no incluía ninguna parte del espectro de emisión del FITC. Repintado de la tintura de membrana, di-8-ANEPPS, en el canal de emisión del péptido fue más difícil de evitar porque el espectro de emisión di 8 de ANEPPS se superpone con la mayoría del espectro de emisión del FITC. Específicas de este protocolo, repintado del tinte de la membrana en el canal de emisión del péptido puede causar la falsa caracterización de AMPs como membrana localizada. Uno puede determinar si el sangrado a través de esta naturaleza es que se producen imágenes esferoplastos o protoplastos que están etiquetados exclusivamente con el tinte de la membrana y comprobar si la fluorescencia es visible en el canal de emisión del péptido. Varios parámetros de imagen, incluyendo la gama de longitud de onda utilizada para definir el canal de emisión del péptido y los valores de ganancia y offset, se pueden probar sistemáticamente para determinar un conjunto de parámetros que minimiza el repintado. Una vez que se establece un conjunto de parámetros, es fundamental evaluar si la proyección de imagen produce fuerte detección de señal de fluorescencia cuando se utilizan esferoplastos o protoplastos con tinte péptido y membrana. A través de este enfoque, establecimos con éxito imágenes parámetros que minimizan el efecto de la purga mientras se maximiza la detección de la fluorescencia del amplificador marcado con FITC y la membrana del tinte di-8-ANEPPS. Específicamente, encontramos que el repintado de emisión desde el tinte de la membrana en el canal de péptido fue reducido al mínimo usando longitudes de onda de emisión de 499-532 nm (péptido) y 670-745 nm (membrana), y cuando la ganancia se ajustó a ser ≤800 voltios (V) (péptido) y ≤900 V (membrana) y el desplazamiento se ajustó a ≤ -10,0% (péptido, membrana).

Aunque nos enfocamos en e. coli y B. megaterium, los protocolos presentados podrían ser adaptados para producir esferoplastos o protoplastos de muchas cepas bacterianas diferentes. Por ejemplo, hemos sido capaces de producir con éxito protoplastos de Bacillus subtilis que fueron 1-2 μm de diámetro usando el protocolo descrito en la sección 4, y adaptaciones del protocolo podrían realizarse para optimizar aún más el tamaño. La capacidad de observar péptido patrones de localización en bacterias gramnegativas y grampositivas es particularmente útil para el estudio de los amplificadores debido a diferencias en la estructura de la pared celular entre estas dos clases de bacterias pueden afectar cómo interactúan con los amperios membranas celulares. Sin embargo, muchos estudios por imágenes de amperios hasta la fecha únicamente se han centrado en las cepas de e. coli de modelo y, por lo tanto, pueden no reflejar el comportamiento de los péptidos con cepas de bacterias Gram-positivas.

Esferoplastos y protoplastos difieren de las bacterias normales, sobre todo en la falta de una pared exterior de la célula y por consiguiente no pueden ser buenos modelos para todas las preguntas experimentales. Por ejemplo, la membrana externa de bacterias Gram negativas ha demostrado actuar como un tamiz molecular para moléculas más grandes29. Péptidos más grandes, por lo tanto, pueden ser capaces de translocan en Esferoplastos cuando no lo harían en las bacterias normales. Además, estudios detallados de la interacción del amplificador con la membrana citoplasmática, pared celular de las bacterias y membrana externa no se puede realizar utilizando Esferoplastos y protoplastos. Por ejemplo, trabajos recientes de laboratorio Weisshaar ha utilizado proyección de imagen para observar las posiciones más precisas del péptido en los mecanismos de acción de30,31CM15 y melitina. Sin embargo, nuestro enfoque, como se describe aquí, no requiere la aplicación de la microfluídica en la instrumentación de la microscopia para conseguir la necesaria resolución31. Aunque trabajos anteriores han demostrado que Esferoplastos son viables21,32, sin embargo, es probable que tienen algunas diferencias metabólicas y fisiológicas de las bacterias "normales" que podrían potencialmente alterar interacciones de membrana en algunos casos. Además, porque no hemos evaluado la viabilidad de las poblaciones del spheroplast, uno no puede distinguir entre un péptido que es fácilmente capaz de translocan a través de la membrana celular de una célula viva frente a un péptido que puede sólo translocan a través de un muerto o muerte de la célula. A pesar de estas diferencias, hemos visto los patrones de localización en Esferoplastos de e. coli por muchos amplificadores que son consistentes con los mecanismos conocidos de acción15y nuestros resultados para BF2 P11A con protoplastos B. megaterium presentados aquí parece consistente con otras observaciones13,de péptido27,28. Las composiciones de membrana de Esferoplastos y protoplastos son también sin duda más fisiológico las mezclas típicas utilizadas en otros sistemas modelo, como vesículas de lípidos. En Resumen, dada la mayor resolución y facilidad de la proyección de imagen de Esferoplastos y protoplastos, creemos que son modelos útiles para la visualización de la membrana agentes activos, tales como amplificadores, en una amplia gama de cepas bacterianas.

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Disclosures

No se declaran conflictos de interés.

Acknowledgments

Investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIH-NIAID) Premio R15AI079685.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl) Sigma T3253
Trizma base (Tris OH) Sigma T1503
Magnesium chloride Sigma M8266
Sucrose Sigma S7903
Lysozyme Sigma L6876
Deoxyribonuclease I Sigma D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma 106361 Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate Sigma C4895
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
BBL Trypticase soy broth Fisher Scientific B11768
BF2 P11A FITC NeoScientific Custom ordered
di-8-ANEPPS Biotium 61012
DMSO Sigma 34869 Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid Sigma M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane Pall Corporation 4192
Laser scanning confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 II For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Leica Microsystems For image processing

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Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano
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Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).More

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).

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